Diabetologia. 2017; 60 (8): 1502 – 1511.
Objavljeno na spletu 2017 maj 20. doi: 10.1007/s00125-017-4305-4
PMCID: PMC5491592
1Minimalizem
Cilji / hipoteze
Prenajedanje prehranskih maščob povzroči debelost pri ljudeh in glodavcih. Nedavne študije na ljudeh in glodalcih so pokazale, da ima odvisnost od maščob skupni mehanizem z zasvojenostjo z alkoholom, nikotinom in narkotiki v smislu disfunkcije sistemov nagrajevanja možganov. Izpostavljeno je bilo, da prehrana z veliko maščobami (HFD) oslabi signale dopamina D2 (D2R) v striatumu, ključnem regulatorju sistema nagrajevanja možganov, kar ima za posledico hedonsko prenajedanje. Prej smo poročali, da bioaktivna sestavina rjavega riža γ-oryzanol zmanjšuje prednost za HFD s hipotalamičnim nadzorom. Zato smo raziskali možnost, da bi γ-oryzanol moduliral delovanje sistema za nagrajevanje možganov pri miših.
Metode
Miševe miši C57BL / 6J, hranjene s HFD, smo peroralno obdelali z γ-oryzanolom in ocenili strijatalne ravni molekul, vključenih v D2R signalizacijo. Preučevali smo vpliv γ-oryzanol na metilacijo DNA promotorja D2R in poznejše spremembe v preferencah za prehranske maščobe. Poleg tega so bili raziskani učinki 5-aza-2'-deoksicitidina, močnega zaviralca DNA metiltransferaz (DNMT), na prehransko prednost, signalizacijo D2R in ravni DNMT v striatumu. In vitro so bili encimsko ovrednoteni inhibitorni učinki γ-oryzanol na aktivnost DNMT.
Rezultati
V striatumu od miši, hranjenih s HFD, se je proizvodnja D2Rs zmanjšala s povečanjem metilacije DNA v promocijskem območju D2R. Peroralna uporaba γ-oryzanola je zmanjšala ekspresijo in aktivnost DNMT-jev, s čimer je ponovno vzpostavila raven D2Rs v striatumu. Farmakološka inhibicija DNMT z 5-aza-2'-deoksicitidinom je prav tako izboljšala prednost prehranskim maščobam. V skladu s temi ugotovitvami so encimski in vitro testi pokazali, da y-oryzanol inhibira aktivnost DNMT.
Sklepi / razlaga
Dokazali smo, da γ-oryzanol ameliorati s HFD povzroča hipermetilacijo DNA promocijskega območja D2R v striatumu miši. Naša eksperimentalna paradigma izpostavlja γ-oryzanol kot obetavno snov proti debelosti z izrazito lastnostjo, da je nov epigenetski modulator.
Elektronsko dopolnilno gradivo
Spletna različica tega članka (doi: 10.1007 / s00125-017-4305-4) vsebuje strokovno pregledano, vendar nerevidirano dodatno gradivo, ki je na voljo pooblaščenim uporabnikom.
Predstavitev
Prenajedanje pri debelih osebah vsaj delno deli skupne mehanizme z zasvojenostjo z alkoholom, nikotinom in narkotiki [1]. Poleg hipotalamične in hormonske ureditve apetita je sistem nagrajevanja možganov, zlasti signalizacija receptorjev dopamina, tesno povezan z odvisnostnim ali hedonskim obnašanjem hranjenja [2]. Prejšnja raziskava na podganah je pokazala, da je odstranjevanje receptorja strijatalnega dopamina D2 (D2R) s kratkimi lasnicami, ki posredujejo z lentivirusom, motilo RNA, hitro povzročilo primanjkljaje, ki so podobni odvisnosti, in prisilno iskanje hrane [3]. Zaradi zmanjšane gostote D2R je hrbtni striatum manj odziven na nagrado s hrano v primerjavi z vitkimi kontrolnimi skupinami pri debelih ljudeh in glodavcih [3-5]. V skladu s tem pojmom TaqAlel IA za ANKK1 genski lokus (kodira DRD2 / ponovitev ankirina in kinazno domeno, ki vsebuje 1), ki zmanjšuje produkcijo strijatalnega D2R, je pri ljudeh povezan z debelim fenotipom [6], medtem ko so učinki izgube teže po bariatričnih operacijah povezani z povišano strijatalno gostoto D2R [7]. Ti podatki močno kažejo na pomen strijnega D2R kot nove terapevtske tarče za zdravljenje debelosti. Vendar so nekatera zdravila, ki so bila razvita v sistemu nagrajevanja možganov, povzročila znatne škodljive učinke, vključno z resnimi psihiatričnimi težavami, kar je povzročilo njihov morebitni umik iz klinik [8].
Epigenetske spremembe so ključne ne le za razvoj in drugačnost, temveč tudi zato, ker nastajajo kot posledica okoljskih sprememb, vključno s prehrano in življenjskim slogom [9]. Metilacija DNA je glavni epigenetski dogodek za stabilnost genske ekspresije [9]. Pri podganah materina izpostavljenost dieti z veliko maščob (HFD) medgeneracijsko spreminja metilacijo DNK v osrednjem sistemu nagrajevanja pri potomcih, kar vodi do čezmerne porabe HFD pri mladičih [10]. Zlasti DNK metiltransferaze (DNMT) igrajo kritično vlogo pri uravnavanju tako hranjenja kot telesne aktivnosti [10, 11], kar kaže, da bi lahko DNMT predstavljali obetavne terapevtske tarče za zdravljenje sindroma debelosti in sladkorne bolezni. Pomembno je, da so nekatere naravne snovi, pridobljene iz hrane, vključno s kofeinsko kislino in epigallokatehinom, ki delujejo kot zaviralci DNMT [12, 13].
Nedavno smo pokazali, da bioaktivni, rjavi riž, specifičen sestavni del γ-oryzanol, mešanica estra ferulinske kisline in več fitosterolov, zmanjšuje prednost prehranske maščobe s pomočjo zmanjšanja stresa hipotalamičnega endoplazemskega retikuluma [ER] [14]. Pri miših in zajcih se je oralno dani γ-oryzanol hitro absorbiral iz črevesja in porazdelil predvsem v možgane [15, 16]. Če združimo te ugotovitve, bi lahko bili naravni izdelki, ki izhajajo iz hrane, ki delujejo na centralni živčni sistem, alternativa varnemu izboljšanju motenj hranjenja pri debelosti. V tem kontekstu smo preizkusili hipotezo, da bi γ-oryzanol spremenil status metilacije DNA v sistemu nagrajevanja možganov, kar ima za posledico zmanjšanje prednosti za HFD pri miših.
Metode
živali
Sedem tednov starih samcev miši C57BL / 6J, pridobljenih iz Charles River Laboratories Japan (Kanagawa, Japonska), je bilo nameščenih (3–4 na kletko) v pogojih brez specifičnih patogenov pri 24 ° C pod 12 h / 12 h svetlobe / temni cikel. Po tednu aklimatizacije so bile 8 tednov stare miši usklajene s težo in razdeljene v dve ali tri skupine, da so opravile vsak poskus. Mišem je bil dovoljen prost dostop do hrane in vode. Vse poskuse na živalih je odobril Odbor za etiko poskusov na živalih Univerze v Ryukyusu (št. 5352, 5718 in 5943).
Dajanje γ-oryzanol-a in 5-aza-2'-deoxycytidine
Za oceno prednosti za HFD smo γ-oryzanol (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japonska) dajali mišem, starim v tednu 8, z gavažo med testom izbire hrane, kot je bilo prej opisano [14, 17]. Pri drugih poskusih je bil HFD (D12079B; Research Diets, New Brunswick, NJ, ZDA), ki vsebuje 0.4% γ-oryzanol kot pelete. Sestavni deli prehrane so prikazani v tabeli z dodatnimi elektronskimi materiali (ESM) 1. Po 12 tednih hranjenja so tkivo odvzeli iz striatuma in hipotalamusa. Dnevni vnos γ-orizanola, ocenjen na podlagi povprečnega vnosa hrane miši, je bil približno 320 μg / g telesne teže. Odmerke γ-orizanola smo določili, kot je opisano prej [14]. 5-aza-2′-deoksicitidin (5-aza-dC; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, ZDA) smo injicirali intraperitonealno (0.25 μg / g telesne teže) trikrat na teden 12 tednov [18].
Ocena prednosti prehranske maščobe
Za oceno preferenc do prehranske maščobe so preskusi s hrano omogočili izbiro med chow in HFD (D12450B in D12451; Research Diets), kot je bilo predhodno opisano [14]. Sestavine prehrane so prikazane v tabeli ESM 1. Na kratko je bil mišim omogočen prost dostop do chow in HFD. Vnos chow-a in HFD so merili tedensko in analizirali spremembe v preferencah glede prehranske maščobe. Preferenca HFD je bila izračunana po formuli: HFD preferenca = [(vnos HFD / skupni vnos hrane) × 100].
Zaporedje bisulfita za metilacijo DNA
DNA smo očistili z uporabo DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN, Tokio, Japonska). Raztopino DNA zmešamo s sveže pripravljenim 3 mol / l NaOH, 37 minut inkubiramo pri 15 ° C in dodamo 5.3 mol / l sečnine, 1.7 mol / l natrijevega bisulfita in 4.9 mmol / l hidrokinona. Raztopino smo podvrgli 15 ciklom denaturacije pri 95 ° C 30 s in inkubaciji 50 minut pri 15 ° C [19]. DNA, tretirana z bisulfitom, je bila očiščena z uporabo čistilnega kompleta MinElute PCR (QIAGEN) in amplificirana s PCR s pomočjo KAPA HiFi HotStart Uracil + ReadyMix PCR kompleta (KAPA Biosystems, Woburn, MA, ZDA) in prajmerjev okoli CpG mesta promocijske regije D2R . Zaporedja temeljnih premazov so bila naslednja: prednji temeljni premaz, 5 '-GTAAGAATTGGTTGGTTGGAGTTAAAA-3'; povratni temeljni premaz, 5 '-ACCCTACCCTCTAAAACCACAACTAC-3'. Nato smo dodali in očistili zaporedja adapterjev s pomočjo Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, Brea, CA, ZDA). Vzorce smo nato združili in jih naložili na GS Junior (Roche Diagnostics, Tokio, Japonska) za sekvenciranje po proizvajalčevem protokolu. Stopnja metilacije je bila izražena kot odstotek metiliranih citozinov v vseh ostankih citozinov.
DNMT test aktivnosti
Test encimske aktivnosti DNMT je bil izveden z uporabo kompleta za analizo aktivnosti / inhibicije metiltransferaze DNA EpiQuik (Epigentek Group, Brooklyn, NY, ZDA) in kompleta za testiranje metiltransferaze EPIgene (Cisbio Japan, Chiba, Japonska) v skladu s protokoli proizvajalca.
Za oceno inhibicijske aktivnosti vsake spojine na metilaciji DNA, nastanek S-adenozil-20-homocistein (SAH) smo izmerili v prisotnosti vsake spojine (XNUMX μmol / l za presejalne teste), S-adenozil metionin (SAM; 10 μmol / l) in DNMT substrat (4 ng / μl) pri 37 ° C 90 minut. Za oceno Michaelis-Mentenove kinetike smo DNMT1 (20 μmol / l) inkubirali z γ-orizanolom, SAM (5 μmol / l) in navedeno koncentracijo poli dI-dC pri 37 ° C 90 minut. DNMT3a (100 μmol / l) in DNMT3b (100 μmol / l) smo inkubirali z γ-orizanolom, SAM (5 μmol / l) in navedeno koncentracijo poli dG · dC pri 37 ° C 120 minut. Analize so bile izvedene v štirih izvodih. Ekstrahirane beljakovine (0.75 mg / ml) smo 5 minut inkubirali s SAM (5 μmol / l), poli dI-dC (5 μg / ml) in poli dG · dC (40 μg / ml) pri 120 ° C in Izmerjena je bila tvorba SAH.
Z estrogenom povezan preizkus aktivnosti receptorjev-y
Potencialno antagonistično aktivnost γ-orizanola na receptorju γ, povezanem z estrogenom (ERRγ), so ocenili z uporabo sistema za analizo gama-poročevalca gama, povezanega z estrogenom (INDIGO Bioscience, State College, PA, ZDA), v skladu s protokolom proizvajalca. Na kratko so bile nečloveške poročevalske celice sesalcev, ki konstitutivno izražajo aktivni ERRγ, izpostavljene navedenim koncentracijam vsake spojine 24 ur v treh izvodih.
Western bloting
To je bilo izvedeno, kot je bilo predhodno opisano [20] s protitelesi proti D2R (1: 500, zajec), transporter dopamina (DAT; 1: 500, zajec), tirozin hidroksilaza (TH; 1: 1000, zajec) (AB5084P, AB1591P in AB152, Merck Millipore, Billerica, MA, ZDA), pretvornik signala in aktivator transkripcije 3α (STAT3α; 1: 1000, zajec), DNMT1 (1: 1000, zajec), DNMT3a (1: 1000, zajec) (št. 8768, 5032 in 3598; Cell Signaling Technology, Tokio, Japonska), DNMT3b (1 μg / ml, zajec), ERRγ (1: 1000, zajec) in β-aktin (1: 10,000, miš) (ab16049, ab128930 in ab6276; Abcam, Cambridge, MA, ZDA).
Kvantitativni PCR v realnem času
Gensko ekspresijo smo pregledali, kot je opisano prej [14]. mRNA ravni so bile normalizirane na Rn18 (18S rRNA). Nabori temeljnih premazov, uporabljeni za kvantitativne PCR analize v realnem času, so povzeti v tabeli ESM 2.
Statistična analiza
Podatki so izraženi kot povprečje ± SEM. Kjer je bilo primerno, so bili uporabljeni enosmerni ANOVA in ponavljajoči se ukrepi ANOVA, ki jim je sledilo več primerjalnih testov (metoda Bonferroni – Dunn). Študentska t test smo uporabili za analizo razlik med dvema skupinama. Razlike so bile obravnavane kot pomembne p <0.05.
Rezultati
Farmakološka inhibicija DNMT s 5-aza-dC zmanjšuje prednost prehranske maščobe pri miših
Pri miših, hranjenih s HFD, se je metilacija DNA v promotorski regiji D2R v striatumu znatno povečala v primerjavi z mišmi, ki so hranile prehrano z zajtrkom (sl. (Sl. 1a) .1a). Po drugi strani je bila metilacija DNA v hipotalamični DNA v promotorski regiji D2R očitno višja od tiste v striatumu v skladu s prehrano z žrebom (p <0.01) (slika (Fig.1a, 1a, f) in ga HFD ni spremenil (sl. (Fig.1f) .1f). Pri miših, hranjenih s HFD, se je metilirana razširjena DNA v promotorski regiji D2R v striatumu normalizirala z zdravljenjem z 5-aza-dC, močnim zaviralcem DNMT (sl. (Sl. 1a) .1a). V nasprotju s tem metilacija DNA v promotorski regiji D2R v hipotalamusu ni bila bistveno spremenjena z zdravljenjem z 5-aza-dC (sl. (Fig.1f) .1f). V striatumu 20-tedenskih samcev miši, ki so se 12 tednov hranili s HFD, se je raven mRNA in beljakovin D2R znatno zmanjšala (sl. (Sl. 1b, 1b, k, l). V nasprotju s tem so ravni dopaminskih D1 receptorjev (D1R, kodirane s Drd1), ki delujejo nasprotno kot D2Rs na adenilil ciklazo in cAMP-posredovano medcelično signalizacijo, niso bili spremenjeni (sl. (Fig.1c) .1c). Poleg tega ni bilo sprememb v nivoju drugih molekul, povezanih z D2R signalizacijo, kot sta TH in DAT na nivoju mRNA in / ali beljakovin (sl. (Fig.1d, 1d, e, k, m). Po drugi strani pa hipotalamusa niso opazili opaznih sprememb, tudi za D2R (sl. (Slika.1g – m) .1g – m). Zlasti beljakovine D2R in TH v hipotalamusu so bile precej nižje kot v striatumu (sl. (Sl. 1l, 1l, m), ki morda odraža relativni pomen signalizacije za dopaminski receptor v sistemu nagrajevanja možganov v primerjavi s hipotalamusom.
Da bi preučili, ali bi metilacija DNA v promotorski regiji D2R spremenila prednost prehranske maščobe, smo analizirali hranjenje miši, ki so bile tretirane z 5-aza-dC. Kot smo pričakovali, je 5-aza-dC občutno zvišal nivo mRNA in beljakovin za D2R v striatumu miši, hranjenih s HFD (sl. (Sl. 1b, 1b, k, l). Po drugi strani ni bilo nobenega učinka na ravni Drd1, Th in Slc6a3 (kodiranje DAT) v striatumu ali na nivojih Drd2, Drd1, Th in Slc6a3 v hipotalamusu (sl. (Fig.1c – e, 1c –e, g – m). Medtem ko so mišje, ki so bile tretirane z vozilom, prednost pred HFD, se je prednost mišicam, ki so bile tretirane z 5-aza-dC, zmanjšala (88% vrednosti za miši, tretirane z vozilom) (sl. (Slika.1n) .1n). Posledično je zdravljenje z zdravilom 5-aza-dC zmanjšalo povečanje telesne teže (sl. (Slika.11o).
γ-oryzanol zniža raven DNMT v striatumu miši, hranjenih s HFD
Kot smo že poročali [14], peroralno dajanje γ-oryzanol mišim samicam z odmerjanjem je znatno zmanjšalo prednost za HFD (93% vrednosti za miši, obdelane z vozilom) (sl. (Sl. 2a), 2a), kar ima za posledico očitno slabljenje telesne teže (sl. (Slika.2b) .2b). Zato smo raziskali potencialni vpliv γ-oryzanol na epigenetsko modulacijo D2Rs v striatumu.
Pri sesalcih so trije glavni DNMT-DNMT1, 3a in 3b. DNMT1 deluje tako, da vzdržuje metilacijo DNK, medtem ko DNMT3a in 3b igrata vlogo pri olajšanju de novo metilacije DNA [21]. Da bi raziskali potencialni vpliv γ-oryzanol na DNMT in vivo, smo ovrednotili ravni DNMT v možganih miši, hranjenih z HFD. Čeprav HFD sam po sebi ni vplival na mRNA in beljakovine DNMT niti v striatumu niti v hipotalamusu, je dopolnilo z γ-oryzanol znatno zmanjšalo raven DNMT v striatumu, ne pa tudi v hipotalamusu (sl. (Fig.2c – e, 2c – e, g – i, k – n). Ti podatki povečujejo možnost, da bi γ-oryzanol lahko reguliral ravni DNMT na striatum-specifičen način. Na podoben način je 5-aza-dC občutno znižal nivo mRNA DNMT3a in 3b prednostno v striatumu (ESM Fig. 1a – d).
Na podlagi predhodne študije, ki kaže, da je nivo mRNA DNMT1 vsaj deloma pozitivno uravnaval jedrski receptor ERRγ [22], preučili smo potencialni učinek γ-oryzanol na aktivnost ERRγ. V celicah sesalcev razen človeka, ki konstitutivno izražajo aktivni ERRγ, je 4-hidroksi tamoksifen, močan inverzni agonist ERRγ, izrazito zmanjšal aktivnost ERRγ. Opozarjamo, da je γ-oryzanol delno zmanjšal aktivnost ERRγ (približno 40% zmanjšanje prirojene vrednosti) (sl. (Sl. 3a) .3a). Pomembno je, da se je ERRγ močno izrazil v striatumu, ne pa tudi v hipotalamusu (sl. (Slika.3b – d) .3b – d). V nasprotju s situacijo za striatum je γ-oryzanol znatno povečal raven beljakovin DNMT1 samo v hipotalamusu (sl. (Sl. 2k, 2k, l). Te rezultate bi lahko vsaj deloma razložili z našo ugotovitvijo, da je STAT3α, pozitivni regulator nivoja DNMT1 [23], je bil obilno izražen v hipotalamusu, ne pa tudi v striatumu (sl. (Slika.33e – g).
Za nadaljnjo oceno vpliva γ-oryzanol na aktivnost DNMT in vivo je bila ocenjena tvorba SAH, stranskega produkta metilacije DNK in tudi močnega zaviralca DNMT, ki so bile krmljene s HFD, tretirane z y-oryzanol. V tvorbi SAH niti v striatumu niti v hipotalamusu med mišmi, ki so bile hranjene z HFD in hranjenimi z gonilom, ni bilo pomembnih sprememb (sl. (Sl. 2f, 2f, j). Opazno je γ-oryzanol znatno zmanjšal tvorbo SAH v striatumu (sl. (Slika.2f) 2f) vendar ne v hipotalamusu (sl. (Sl. 2j), 2j), kar kaže na to, da lahko γ-oryzanol pri miših, hranjenih s HFD, zavira aktivnost DNMT na striatum specifičen način.
Encimatske analize inhibicijskih lastnosti γ-oryzanol za DNMT in vitro
Nato smo ocenili vpliv γ-oryzanol na aktivnost DNMT in vitro. Ocenjeni so bili inhibitorni potenciali γ-oryzanol-a, ferulinske kisline, 5-aza-dC, haloperidola (reprezentativni antagonist D2R), kvinpirola (reprezentativni agonist D2R) in SAH proti DNMT-jem. Kot pozitiven nadzor je SAH močno zmanjšal aktivnosti DNMT na odmerek odvisen način (Sl. (Slika.4a – f) .4a – f). Po pričakovanjih haloperidol in kvinpirol nista vplivala na aktivnosti DNMT (ESM Fig. 2). Opazno je γ-oryzanol znatno zaviral aktivnosti DNMT1 (IC50 = 3.2 μmol / l), 3a (IC50 = 22.3 μmol / l) in 3b (največja inhibicija 57%) (sl. (Slika.4d – f) .4d – f). V nasprotju s tem je bila inhibitorna aktivnost ferulinske kisline, presnovka γ-oryzanola, precej nižja od aktivnosti γ-oryzanol (sl. (Slika.44d – f).
Nadalje smo raziskali inhibitorne lastnosti γ-oryzanol na DNMT. Nastajanje SAH je bilo izmerjeno za oceno inhibicijske aktivnosti γ-oryzanol na DNMT in vitro. Podatki o tvorbi SAH med metilacijo DNK, posredovane z DNMT, kažejo nasičen vzorec kinetike Michaelis-Menten tako za prisotnost kot odsotnost γ-oryzanol (sl. (Slika.4g – i) .4g – i). V metilaciji DNK, posredovane z DNMT1, je analiza Eadie-Hofstee pokazala, da γ-oryzanol ni pokazal učinkov na V max nastajanja SAH (vehikel, 597 pmol / min; γ-orizanol 2 μmol / l, 619 pmol / min; γ-orizanol 20 μmol / l, 608 pmol / min), medtem ko je γ-orizanol očitno povečal K m (vehikel, 0.47 μg / ml; γ-orizanol 2 μmol / l, 0.67 μg / ml; γ-orizanol 20 μmol / l, 0.89 μg / ml) (sl. (Sl. 4j) .4j). Ti rezultati kažejo, da γ-oryzanol vsaj delno na konkurenčen način zavira DNMT1. Po drugi strani je za metilacijo DNKT3a- in 3b-posredovanega DN-a γ-oryzanol zmanjšal V max nastajanja SAH (DNMT3a: vehikel, 85.3 pmol / min; γ-orizanol 2 μmol / l, 63.1 pmol / min; γ-orizanol 20 μmol / l, 42.5 pmol / min; DNMT3b: vozilo, 42.3 pmol / min; γ -orizanol 2 μmol / l; 28.0 pmol / min, γ-orizanol 20 μmol / l, 15.0 pmol / min) in podobno K m za to reakcijo (DNMT3a: vehikel, 0.0086 μg / ml; γ-orizanol 2 μmol / l, 0.0080 μg / ml; γ-orizanol 20 μmol / l, 0.0058 μg / ml; DNMT3b: nosilec, 0.0122 μg / ml; γ- orizanol 2 μmol / l, 0.0097 μg / ml; γ-orizanol 20 μmol / l, 0.0060 μg / ml) (sl. (Sl. 4k, 4k, l). Ti rezultati kažejo, da γ-oryzanol vsaj delno na nekonkurenčen način zavira DNMT3a in 3b.
γ-oryzanol poveča ravni D2R v striatumu miši, hranjenih s HFD
Nato smo preizkusili možnost, da bi γ-oryzanol z inhibicijo DNMT povečal vsebnost progastega D2R. Pri miših, hranjenih s HFD, je oralno dajanje γ-oryzanol znatno zmanjšalo metilacijo strijatalne DNA v promotorski regiji D2Rs (sl. (Sl. 5a), 5a), medtem ko to ni storil v hipotalamusu (sl. (Fig.5f) .5f). V skladu s temi ugotovitvami so se vrednosti mRNA in beljakovin D2R vzajemno povečale (sl. (Sl. 5b, 5b, g, k, l). Podobno kot pri podatkih o zdravljenju z zdravilom 5-aza-dC (sl. (Sl. 1), 1) ni bilo očitnih učinkov na RNA in ravni beljakovin Drd1, Th in Slc6a3 (DAT) v striatumu, brez vplivov na ravni Drd1, Th in Slc6a3 v hipotalamusu (sl. (Fig.5c – e, 5c – e, h – k, m).
Prejšnje raziskave so pokazale, da ravni D2R in DNMT1 vsaj delno prek NF-κB uravnavajo ER-stres in vnetje [17, 24, 25]. Zato smo preučili ravni genov, povezanih z ER, povezanih s stresom in vnetjem. Kot je že bilo prikazano [26], HFD poveča ekspresijo genov, ki kodirajo TNF-α (Tnfa), monocitni kemoatraktantni protein – 1 (MCP-1) (Ccl2), C / EBP homologni protein (Sesekljajte), ER-lokaliziran DnaJ 4 (ERdj4) (Dnajb9) in zlepljeno obliko X-box vezave proteina 1 (Xbp1) v hipotalamusu, ne pa v striatumu (sl. (Sl. 6) .6). Zlasti je dopolnjevanje HFD z γ-oryzanol znatno zmanjšalo povečano izražanje Ccl2, Sesekljajte, Dnajb9 in Xbp1 izključno v hipotalamusu, ne pa v striatumu (sl. (Slika.66).
Razprava
Glavna ugotovitev v tej študiji je, da γ-oryzanol deluje kot močan zaviralec DNMT v striatumu miši, s čimer vsaj deloma oslabi prednost za HFD s pomočjo epigenetske modulacije progastega D2R. V striatumu pri miših, hranjenih s HFD, so se vrednosti D2R znatno zmanjšale, medtem ko se vrednosti D1R, TH in DAT niso spremenile (sl. (Sl. 1b – e, 1b –e, k –m). Ti podatki so v skladu s predstavo, da ima disregulacija strijnega D2R kritično vlogo pri dojemanju nagrade za hrano, kadar je to HFD, kar vodi do hedonske prekomerne porabe HFD pri debelih živalih [3]. V tej študiji je zdravljenje miši, hranjenih z HFD, z 5-aza-dC znatno povečalo ravni strijatalnega D2R (sl. (Sl. 1b, 1b, k, l) mogoče z znižanjem ravni metilacije DNA v promotorski regiji D2R (sl. (Sl. 1a), 1a) in posledično zmanjšala prednost prehranskim maščobam (sl. (Slika.1n) .1n). Ta ugotovitev prav tako podpira kritično vlogo strijatalnih D2R pri dojemanju nagrade za hrano, ko ste na HFD.
Naš in vitro test je pokazal, da je bila inhibitorna aktivnost γ-oryzanola proti DNMTs očitno močnejša kot njegova metabolita ferulinska kislina (sl. (Sl. 4d – f), 4d – f), kar kaže na pomen celotne strukture γ-oryzanol za njegovo zaviralno delovanje na DNMT. Pri miših, hranjenih s HFD, naše študije kažejo, da γ-oryzanol po peroralni uporabi doseže možgane kot celovito strukturo in zniža raven in aktivnost DNMT prednostno v striatumu, s posledičnim zmanjšanjem metilacije DNA v promotorski regiji D2R v striatumu. Poleg tega so naše in vitro študije pokazale, da γ-oryzanol deluje kot delni antagonist proti ERRγ, ki služi predvsem kot pozitiven regulator za proizvodnjo DNMT1 [22] in posledično zmanjšala aktivnost DNMT1 (sl. (Sl. 3a) .3a). Omenimo, da je bil ERRγ močno izražen v striatumu, ne pa tudi v hipotalamusu pri miših (sl. (Slika.3b) .3b). Ti podatki kažejo, da lahko γ-oryzanol vsaj delno zniža nivo mRNA DNMT1 z inhibicijo ERRγ. V nasprotju s striatumom γ-oryzanol ni pokazal vpliva na raven D2R v hipotalamusu pri miših, hranjenih s HFD (sl. (Fig.5g, 5g, k, l).
Po drugi strani smo pokazali, da je γ-oryzanol znatno zvišal ravni DNMT1 v hipotalamusu, ne pa tudi v striatumu (sl. (Sl. 2k, 2k, l). Pokazalo se je, da STAT3 poveča vsebnost DNMT1 v celicah malignih limfomov T [23]. Zlasti smo že pred tem dokazali, da je γ-oryzanol znatno povečal fosforilacijo, ki jo povzroča leptin, STAT3 v hipotalamusu pri miši, hranjenih z HFD [14]. Upoštevati je treba tudi, da se je STAT3α v glavnem izrazil v hipotalamusu, ne pa v striatumu na miših (sl. (Sl. 3e – g) .3e – g). Ti podatki nas spravljajo v domnevo, da se lahko navidezna razlika v učinku γ-oryzanol na ravni DNMT1 med hipotalamusom in striatumom vsaj deloma pripiše vsebnosti STAT3α in ERRγ, specifičnih za regijo, v možganih miši ( Sl. (Slika.3b – g) .3b – g). Zdi se, da obstaja očitni vzorec izražanja ERRγ in STAT3α med striatumom in hipotalamusom pri miših. Na podlagi naših rezultatov je zato smiselno ugibati, da lahko v striatumu, kjer je proizvodnja ERRγ obilna, γ-oryzanol prednostno zniža nivo mRNA in encimsko aktivnost DNMT1 kot negativni regulator ERRγ. Nasprotno lahko v hipotalamusu, kjer prevladuje proizvodnja STAT3α, γ-oryzanol prednostno poveča ravni DNMT1.
Nedavna študija je pokazala, da oslabitev strijatalne D2R signalizacije, ki jo povzroči HFD, neregulira vedenje hranjenja [3], kar kaže na potencialni pomen inhibicije progastih DNMT za zdravljenje debelosti. Po drugi strani pa je prejšnja študija pokazala možnost, da lahko status metilacije gena receptorja 4 melanokortizma, izraženega v specifičnih hipotalamičnih jedrih, modulira transgeneracijske oblike debelosti pri agutih, sposobnih za preživetje rumenih miši [27]. Čeprav so utemeljene nadaljnje študije za razjasnitev osnovnih mehanizmov, te študije kažejo na pomen metilacije DNA, ki je odvisna od tkiva, gena in zaporedja v patofiziologiji debelosti, povzročene s HFD.
Pred kratkim smo poročali, da je HFD zvišal nivo D2R v otočkih trebušne slinavke miši [17, 24]. Verjetno je, da takšno povečanje vsaj deloma posreduje stres ER in vnetje prek NF-κB, ker je v promotorski regiji D2R več odzivnih NF-κB elementov [17, 24]. Poleg tega je nedavna raziskava pokazala, da TNF-α in IL-1β povečujeta raven in aktivnost DNMT1 v maščobnem tkivu pri miši, hranjenih s HFD [25]. Pomembno je, da je ta študija pokazala, da HFD povzroča ER stres in vnetje prednostno v hipotalamusu, ne pa v striatumu (sl. (Sl. 6) .6). Poglobljeni mehanizmi metilacije in demetilacije DNK v tkivih, regijah in lokacijah v naši eksperimentalni paradigmi morajo čakati na nadaljnjo preiskavo.
Skupaj z našim prejšnjim poročilom, ki kaže, da γ-oryzanol zmanjšuje prednost za HFD s pomočjo hipotalamične regulacije ER-stresa pri miših [14], γ-oryzanol predstavlja tudi edinstveno lastnost izboljšanja hedonske in presnovne motnje hranjenja. Ker je znano, da nekatera zdravila, ki so bila razvita, povzročajo kritične škodljive učinke [8] pričakuje se naravni pristop k hrani do sistema nagrajevanja možganov za varno zdravljenje sindroma debelosti in sladkorne bolezni [16]. V tej paradigmi je γ-oryzanol obetaven kandidat za boj proti debelosti z izrazito lastnostjo, da je epigenetski modulator.
Priznanja
S. Okamoto (Univerza Rjukjus, Japonska) smo hvaležni za pregled rokopisa. Zahvaljujemo se M. Hirata, H. Kaneshiro, I. Asato in C. Noguchi (Univerza v Ryukyusu, Japonska) za tajniško pomoč.
Okrajšave
| 5-aza-dC | 5-aza-2'-deoksicitidin |
| D1R | Dopaminski receptor D1 |
| D2R | Dopaminski receptor D2 |
| DAT | Prenosnik dopamina |
| DNMT | DNA metiltransferaza |
| ER | Endoplazemski retikulum |
| ERR | Z estrogenom povezan receptor |
| HFD | Dieta z veliko maščobami |
| SAH | S-Adenozil-1-homocistein |
| SAM | S-Adenozil metionin |
| STAT3α | Signalni pretvornik in aktivator transkripcije 3α |
| TH | Tirozin hidroksilaza |
Opombe
Razpoložljivost podatkov
Nabori podatkov, ustvarjeni in / ali analizirani med trenutno študijo, so na voljo pri ustreznih avtorjih na razumne zahteve.
Financiranje
Delo je deloma podprlo Grants in-Aid iz Japonskega združenja za promocijo znanosti (JSPS; KAKENHI Grant Numbers 15K19520 in 24591338), Svet za znanost, tehnologijo in inovacije (CSTI), medresorski strateški program za spodbujanje inovacij. (SIP) „Tehnologije za ustvarjanje kmetijstva, gozdarstva in ribištva naslednje generacije“, Fundacija Lotte, Japonska fundacija za uporabno enzimologijo, Nova organizacija za razvoj energije in industrijske tehnologije (NEDO), Projekt za oblikovanje mreže znanosti o življenju (farmacevtsko področje ) (Prefektura Okinawa, Japonska) in promocijski projekt medicinskega grozda v prefekturi Okinawa na Japonskem, skupaj z nepovratnimi sredstvi Prefekture Okinawa za promocijo napredne medicine (Okinawa Prefecture, Japan).
Dvojnost zanimanja
Avtorji izjavljajo, da s tem rokopisom ni dvojnega zanimanja.
Izjava o prispevku
CK in HM sta zasnovala raziskavo. CK in TK sta izvedla poskuse in analizirala podatke. TK, CS-O, CT, MT, MM in KA so prispevali k interpretaciji podatkov. CK in HM sta rokopis napisala. Vsi avtorji so prispevali k interpretaciji podatkov. Vsi avtorji so se pridružili pregledu rokopisa in odobrili njegovo končno različico. HM je porok tega dela, popoln dostop do vseh podatkov in prevzema polno odgovornost za celovitost podatkov in natančnost analize podatkov.
Opombe
Elektronsko dopolnilno gradivo
Spletna različica tega članka (doi: 10.1007 / s00125-017-4305-4) vsebuje strokovno pregledano, vendar nerevidirano dodatno gradivo, ki je na voljo pooblaščenim uporabnikom.
Reference
;