Insulin izboljša sproščanje dopamina s strijatacijo z aktiviranjem holinergičnih interneuronov in s tem signalizira nagrado (2015).

 

Melissa A. Stouffer,

Catherine A. Woods,

Jyoti C. Patel,

Christian R. Lee,

Paul Witkovsky,

Li Bao,

Robert P. Machold,

Kymry T. Jones,

Soledad Cabeza de Vaca,

Maarten EA Reith,

Kenneth D. Carr

& Margaret E. Rice

Pripadnosti

Prispevki

Ustrezni avtor

Nature Communications

6,

Številka artikla:

8543

doi: 10.1038 / ncomms9543

Prejeto

 

02 junij 2015

sprejeto

 

02 september 2015

objavljeno

 

  

Minimalizem

Inzulin aktivira inzulinske receptorje (InsRs) v hipotalamusu, da signalizirajo sitost po obroku. Vendar naraščajoča pojavnost debelosti, ki ima za posledico kronično povišano raven insulina, pomeni, da lahko inzulin deluje tudi v možganskih centrih, ki uravnavajo motivacijo in nagrajevanje. Tu poročamo, da lahko inzulin poveča posredno delovanje, ki je od potencialno odvisnega sproščanja dopamina (DA) v jedru jedra (NAc) in kaudata-putamen, ki vključuje strijatalne holinergične internevrone, ki izražajo insR. Poleg tega dve različni kronični prehrani pri podganah, omejevanje hrane (FR) in obesogena (OB) prehrana nasprotno spreminjata občutljivost strijatalnega sproščanja DA na inzulin z izboljšano odzivnostjo pri FR, izgubo odzivnosti pa pri OB. Študije vedenja kažejo, da so vrednosti nepoškodovanega insulina v lupini NAc potrebne za pridobitev prednosti za okus parne raztopine glukoze. Ti podatki skupaj kažejo, da strijatalno inzulinsko signaliziranje poveča sproščanje DA, da vpliva na izbiro hrane.

Na pogled

Številke

levo

  1. Povečana od insulina povečana vrednost [lsqb] DA [rsqb] o zahteva InsRs in PI3K.
    Slika 1
  2. Za inzulinsko odvisno regulacijo strijnega DA se zahteva ACh od ChI.
    Slika 2
  3. Povečanje evociranega [lsqb] DA [rsqb] o zaradi inzulina se poveča za FR in se izgubi pri OB.
    Slika 3
  4. Z mikroinjekcijo InsAb v lupino NAc se zmanjšajo prednostne okuse.
    Slika 4

 

 

Predstavitev

Znano je, da trajno povečanje insulina v plazmi med obrokom in po njem aktivira inzulinske receptorje (InsRs) v hipotalamusu, kar daje negativne povratne informacije apetitnim vezjem, kar zmanjšuje nadaljnje prehranjevanje1, 2, 3. Možganski inzulin izhaja predvsem iz β celic trebušne slinavke, z aktivnim transportom iz plazme v možgane na krvno-možganski pregradi4, 5, 6, 7, 8Čeprav je vse več dokazov za sintezo in sproščanje nevronskega insulina1, 9. Zlasti izražanje InsR ni omejeno na hipotalamus, čeprav funkcija ekstrahipotalamičnih InsR ostane nerešena1, 2, 3. Glede na naraščajočo pojavnost debelosti in sladkorne bolezni tipa II, pri katerih se raven inzulina v obtoku večno poveča, prenašanje in preobčutljivost receptorjev na možgane pa se zmanjša3, 8, 10, 11, je ključno razumeti delovanje inzulina v možganskih regijah, ki uravnavajo motivacijo in nagrajevanje. Posebno pomembne možganske regije vključujejo nukleus accumbens (NAc), ki posreduje koristne učinke tako hrane kot zdravil12, 13in kaudata-putamen (CPu), ki igra vlogo pri navadnem vedenju in hrepenenju13. InsRs so izraženi v teh regijah, najvišja gostota pa se pojavlja v NAc3, 14; InsRs se izrazijo tudi z nepami dopamina (DA) v srednjem možganu, vključno z nevroni v ventralnem segmentu (VTA) in substantia nigra pars compacta (SNc)15. Ravni inzulina v možganih so sorazmerne s koncentracijo insulina v plazmi in telesno maščobo6, 7, 8, kar vodi k hipotezi, da lahko insulin v teh možganskih regijah deluje na InsR in vpliva na nagrado s hrano3, 16, 17.

Prejšnje študije strijatalnih sinaptosomov, heterolognih celic, možganskih rezin in vivo so pokazali, da inzulinska aktivacija InsR povzroči povečanje vnosa DA s transporterjem DA (DAT)18, 19, 20, 21, 22, 23. Ta postopek vključuje pot signalizacije kinaze PI319, 20in ima za posledico vstavljanje DAT v plazemsko membrano19. Cirkuliranje ravni inzulina dinamično modulira strijatalno DAT aktivnost, z zmanjšanim vnosom DA in površinsko izražanje DAT, opaženo pri živalskih modelih sladkorne bolezni in po omejitvi hrane (FR)20, 21. Pokazalo se je, da povečanje DAT aktivnosti, ki je odvisna od insulina, zmanjšuje izzvano koncentracijo zunajcelične DA ([DA]o) v VTA23, kar odraža spremembo ravnovesja med sproščanjem in zaužitjem DA. V skladu z ugotovljeno vlogo inzulina v sitosti lahko akutna mikroinjekcija insulina v VTA zmanjša nagrado za hrano23, 24, ker miši, ki nimajo insRs v VTA in SNc DA nevronih, kažejo na povečan vnos hrane in postanejo debele25. Čeprav lahko inzulin sproži dolgotrajno depresijo ekscitatornega vnosa v nevrone VTA DA24, spet skladno z vlogo v sitosti, izpostavljenost insulinu lahko poveča tudi stopnjo izgorevanja nevrona DA, po možnosti z zmanjšanjem sproščanja DA in inhibicijo, ki jo posreduje avtooreceptor.25. Neto učinek inzulina na strijatalno sproščanje DA je zato težko predvideti. Rezultati študij o vplivu insulina na strijatalno sproščanje DA v ex vivo rezine19 in učinek lokalne mikroinjekcije inzulina v NAc na nagrado za hrano26 se zdijo nasprotujoči si. Da bi to odpravili, smo ovrednotili sproščanje in privzem aksonskega DA v nedotaknjenem mikrookolišču NAc in CPu v ex vivo strijalne rezine z uporabo hitro ciklične ciklične voltammetrije (FCV) in določil učinke insulinskega signalizacije v NAc na nagrajevalno vedenje vivo.

Naše študije kažejo, da je glavni učinek inzulina na NAc in CPu izboljšanje sproščanja DA, kljub hkratnemu povečanju vnosa DA. Ta dinamična regulacija sproščanja DA vključuje od insulina odvisno povečanje ekscitabilnosti strijatalnih kolinergičnih internevronov (ChI), kar vodi do povečanega sproščanja DA z aktiviranjem nikotinskih acetilholinskih (ACh) receptorjev (nAChRs). Vpliv insulina na ChI in sproščanje DA posredujejo InsR. Zlasti je učinek insulina na sproščanje DA okrepljen v rezinah FR podgan, vendar jih podgane pri obesogeni (OB) dieti. Ti podatki kažejo na razširitev sproščanja DA v ex vivo rezine inzulina vodijo do napovedi, da bi lahko inzulin deloval kot nagradni signal vivo. Dejansko vzporedne vedenjske študije dokazujejo vlogo insulina v lupini NAc pri pripravi za okus. Te ugotovitve skupaj kažejo na novo vlogo inzulina kot nagradnega signala, ki lahko vpliva na izbiro hrane

 

 

Rezultati

Insulin, ki deluje na insRs, povečuje sproščeno strijatalno sproščanje DA

Začetni pregled lokalno evociranega [DA]o spremlja se z FCV v ex vivo strijatalne rezine podgan s ad libitum (AL) dostop do hrane in vode je razkril nepričakovano ugotovitev, da je akutna uporaba insulina v različnih fiziološko pomembnih koncentracijah1, 4 povečan enojni impulz [DA]o (Slika 1a – c), z insulinom EC50 vrednosti (koncentracija, pri kateri je bil učinek pol največji) 2 – 12 nM (Slika 1b). Povečan povzročen [DA]o je bilo še posebej presenetljivo, saj je to spremljalo znatno povečanje najvišje stopnje (Vmax) za prevzem, ki ga posreduje DAT, v vsaki podregiji (Tabela 1), kar bi privedlo do konkurenčnega zmanjšanja evociranih [DA]o, kot smo že poročali22, 23. Namesto tega smo ugotovili, da je prišlo do [DA]o je bil maksimalno ojačan 20 – 55% z insulinom 30 nM; regija z največjim sorazmernim učinkom je bila lupina NAc, ki je strijska podregija z najvišjim izražanjem InsR1, 14. Rezine, ki so bile izpostavljene insulinu 30 nM pod enakimi pogoji, niso pokazale spremembe vsebnosti progastega DA (Dodatna slika 1a), kar pomeni, da inzulin spreminja regulacijo dinamičnega sproščanja, ne pa zgolj povečevanja sinteze DA. Zlasti vpliv insulina na izzvan [DA]o se je izgubil pri suprafizioloških koncentracijah ≥100 nM (Slika 1b). To ni posledica povečanega delovanja DAT, ki prehiteva sproščanje, kot vpliv insulina na Vmax se je tudi pri teh koncentracijah izgubila (Tabela 1). Na splošno ti podatki kažejo, da v nepoškodovanem progastem mikrookruženju prevladuje vpliv insulina na izzvan [DA]o je povečati sproščanje, kljub hkratnemu povečanju vnosa DA.

Slika 1: Povečanje povzročeno od insulina [DA]o zahtevajo InsR in PI3K.
  

Povečana od insulina povečana vrednost [lsqb] DA [rsqb] o zahteva InsRs in PI3K.   

(a) Povprečni sproženi en impulz [DA]o v lupini NAc, jedru NAc in CPu pred in po insulinu (Ins), prikazanem za 30 nM; vrstice napak izpuščene, vendar glej (b); puščice označujejo čas dražljaja. Povečan inzulin [DA]o v lupini (za 55 ± 10%), jedru (za 37 ± 5%) in CPu (za 20 ± 4%) (***P<0.001). (b) Učinek insulina je bil odvisen od koncentracije v fiziološkem območju (1 – 30 nM) v lupini (n= 22 – 24, F5,133= 14.471, P<0.001), jedro (n= 36 – 76, F5,308= 16.318, P<0.001) in CPu (n= 30 – 62, F5,253= 13.763, P<0.001), vendar izgubil pri ≥100 nM (c) Reprezentativni posnetki najvišje evocirane [DA]o v primerjavi s časom na enem mestu v jedru NAc v odsotnosti uporabe zdravila (Con), med uporabo insulina (30 nM) ali kadar je bil inzulin uporabljen v prisotnosti zaviralca InsR HNMPA (5 µM). (d) Povprečna največja vrednost [DA]o podatki, ki kažejo preprečevanje učinka insulina (30 nM) s HNMPA, antagonistom InsR S961 (1 μM) in zaviralcem PI3K LY294002 (1 μM), ne pa z zaviralcem IGF-1R PPP (1 μM) (n= 29 – 76; P> 0.9 v primerjavi z samo insulinom). Za Slika 1a – d, n= število mest na podregiji pri podganah 3 – 6 za vsako zdravilo ali koncentracijo insulina; enosmerna ANOVA, Tukey iskren pomen pomembnosti (HSD). Glej Dopolnilna slika 1b, c za podatke lupine NAc in CPU.

 

 

Tabela 1: Inzulin v fizioloških koncentracijah (30 nM) narašča Vmax za vnos v strijnih rezinah, ki jih posreduje DAT.
  

 

 

Ker lahko inzulin deluje tudi na receptorje 1 za rastni faktor, ki so podobni insulinu (IGF-1Rs), čeprav v koncentracijah, ki presegajo 100 nM (ref. 1), poskušali smo potrditi, da je povečan učinek insulina na evociran [DA]o je bil odvisen od InsR. To se je izkazalo, saj je učinek preprečil intracelularni inhibitor InsR, hidroksi-2-naftalenilmetilfosfonska kislina (HNMPA) in antagonist InsR, S961, ne pa selektivni zaviralec IGF-1Rs, picropodophyllin24 (PPP; Sl. 1c, d in Dopolnilna slika 1b, c). Nato smo preučili vpletenost kinaze PI3, ki sproži signalno pot, odgovorno za inzulinsko odvisno regulacijo DAT19. Pri koncentraciji 1 μM sam P13K zaviralec LY249002 ni vplival na največje evociranje [DA]o or Vmax (n= Mesta 29 – 76 (jedro NAc) na zdravilo, P> 0.05, enosmerna analiza variance (ANOVA); podatki niso prikazani), vendar je preprečil učinek insulina na izzvani [DA]o v vseh striatalnih podregijah (Slika 1d in Dopolnilna slika 1b, c).

Lokalizacija InsR-jev na DA-jevih in ChI-jih

Opaženo povečanje v Vmax za vnos DA s fiziološkimi nivoji insulina pomeni prisotnost InsR na aksonih DA, prav tako kot prejšnji rezultati pri različnih striatalnih pripravkih18, 19, 20, 21, 22. Čeprav je bila dokazana funkcionalna ekspresija InsR na nevronih srednjega možganov15, 23, 24, 25, O izražanju InsR na strijatalnih DA aksonih niso poročali. Tega smo obravnavali z uporabo imunohistokemije. Gosta imunoreaktivnost InsR v celotnem striatumu je bila omejena kvantitativna ocena lokalizacije InsR na aksonih DA, ki so bili identificirani z imunoreaktivnostjo za encim, ki sintetizira DA, tirozin hidroksilazo (TH). Zato smo sprejeli predhodno prijavljeni protokol27, ki je vključeval štetje InsR puncta, ki se je prekrivalo s TH + profili v običajnem pogledu slike, in ponovno štetje, potem ko se je slika InsR vrtela samo za 90 °. Če navidezno prekrivanje profilov InsR in TH + ni bilo specifično, bi moral ta postopek dati statistično podobna števila, normalna ali 90 ° zunaj faze. Vendar pa je ta analiza pokazala zmanjšanje prekrivanja InsR puncta s TH + profili 14 ± 9% (n= Polja 42, P<0.01, seznanjen dvostranski t-test; podatki niso prikazani), kar potrjuje prisotnost InsR na aksonih DA. Še bolj zanimivo pa je, da je imunsko označevanje striatumov InsR razkrilo izrazito InsR ekspresijo na velikih celičnih telesih, ki so bila identificirana kot progasti ChI s so-imuno označevanjem za holin acetiltransferazo (ChAT), primarnim encimom, potrebnim za sintezo ACh. Uporaba elektrofizioloških meril28 da bi v predhodnih študijah beleženja celotnih celic ugotovili ChI, smo več nevronov napolnili z biocitinom in nato obdelali v imunohistokemijo; vsi ti (4 / 4) imunopozitivni tako za InsR kot za ChAT (Slika 2a). Naknadna ocena ko-lokalizacije InsR in ChAT v NAc je potrdila, da skoraj vsi ChAT + nevroni izražajo InsR (96%; n= 27 / 28 nevroni v štirih oddelkih od dveh podgan).

Slika 2: Za inzulinsko odvisna regulacija strijatalnega sproščanja DA je potreben ACh od ChI.
  

Za inzulinsko odvisno regulacijo strijnega DA se zahteva ACh od ChI.   

(a) ChI, napolnjen z biocitinom, nato imuno označen za ChAT, in InsR (predstavnik XI 4 / 4, napolnjenih z biocitinom); združena slika prikazuje sokalizacijo; lestvica lestvice, 10 μm. (b-e) Odziv strijatalnih ChIs na niz depolarizirajočih tokovnih impulzov (trajanje 3-s; 200, 300 in 400 pA; intervali 120-s) pred in po insulinu (30 nM). (b) Prilagoditev frekvence spike pri ChI (zgornji) se kaže v izgubi akcijskega potenciala (AP) pri izbrizganju trenutnega injiciranja, medtem ko spiking vztraja skozi trenutni impulz insulina (spodnji); celotni niz podatkov, prikazan v d. (c) Reprezentativni časovni potek povečanja števila AP, ki ga povzroča insulin, z vsakim trenutnim korakom za ChI v b. (d) Povzetek številke AP med trenutnimi impulzi, oddanimi pred in ob največjem učinku izpostavljenosti insulinu (n= 21 seznanjena stimulacija, 7 nevroni, 5 podgane) (e) Srednji odzivi, ki kažejo učinek insulina (+ ins) pod kontrolnimi pogoji (Con; n= 21 seznanjena stimulacija, 7 nevroni, ***P<0.001, seznanjen dvostranski t-test), v prisotnosti HNMPA (5 μM) (n= 12 seznanjena stimulacija, 4 nevroni, 4 podgane, P>0.05, seznanjen dvorezen t-test) in v prisotnosti PPP (1 μM) (n= 18 seznanjena stimulacija, 6 nevroni, 6 podgane, **P<0.01, Wilcoxon par, ki se je podpisal s preizkusom ranga). (f) Povprečni sproženi en impulz [DA]o v jedru NAc pred in po inzulinu (30 nM) v mekamilaminu (Mec; 5 μM) ali DHβE (1 μM), normaliziranem na najvišjo vrednost nadzora 100% (n= Mesta 20 – 40 na podregijo na pogoj podgan 3 – 4, P> 0.05 v primerjavi s kontrolo, nepar t-test). (g) Povprečni sproženi en impulz [DA]o v rezinah sprednjih možganov iz heterorozne kontrole (Het) in ČAT KO miši pred in po inzulinu (30 nM), normalizirano na 100% najvišjega nadzora. Povečan inzulin [DA]o pri heteroroznih miših s 190 ± 23% v lupini NAc, 140 ± 8% v jedru NAc in 137 ± 12% v CPu (n= 15 – 25 mesta na podregiji od miši 3 – 4 na genotip, **P<0.01, ***P<0.001 v primerjavi s kontrolno skupino t-test), vendar ni imel vpliva na izzvano [DA]o v kateri koli striatalni podregiji v ČAT KO miši (P> 0.1).

 

 

Inzulin povečuje ekscitabilnost ChI

Za testiranje funkcionalnosti InsR-jev na strijatalnih ChI-jev smo s pomočjo snemanja s celotenicnimi tokovnimi sponkami preučili vpliv insulina na ChI ekscitabilnost. Razdražljivost ChI je bila ocenjena z uporabo serije depolarizirajočih tokovnih impulzov 3 s, da bi sprožili vlak akcijskih potencialov, ki je zanesljivo pokazal prilagajanje frekvence spike (Slika 2b), pogosto z izgubo špikanja do konca trenutnega impulza. Presenetljivo je, da je oslabljena frekvenčna prilagoditev insulina (30 nM) povzročila postopno povečanje števila akcijskih potencialov (Slika 2c), z največjim povečanjem (Sl. 2d, e) običajno opazimo med 20 in 50 min izpostavljenosti insulinu. Ker insulina ni bilo, kontrolni ChI niso pokazali sprememb v številu evociranih akcijskih potencialov (P> 0.05, seznanjen dvostranski t-test; podatki niso prikazani); v primerjavi s kontrolnimi nevroni, ki jih spremljamo v istem časovnem intervalu, so nevroni, izpostavljeni insulinu, pokazali bistveno večjo spremembo števila evociranih akcijskih potencialov (kontrola n= Spodbujevalni pari 12 iz štirih nevronov, inzulin n= Spodbujevalni pari 21 iz sedmih nevronov, F1,25= 5.63, P<0.05, mešani dvosmerni ANOVA; podatki niso prikazani). Vpliv insulina na povečanje potencialnega števila akcij je preprečil HNMPA, ne pa tudi selektivni zaviralec IGF-1R PPPSlika 2e), kar dokazuje, da je bila povečana ekscitabilnost ChI zaradi insulina posredovana z insR.

Povečanje insulina [DA]o zahteva nAChRs in ACh

Prejšnje študije so pokazale, da ChIs in ACh potencialno uravnavata sproščanje striatalnega DA preko nAChRs na DA aksonih29, 30, 31, 32, 33, 34. Obilna izraženost InsR na ChI in povečanje ekscitabilnosti ChI, opaženo pri akutni izpostavljenosti insulinu, kažejo, da bi lahko bili ti nevroni nova tarča inzulina, kar bi lahko vodilo do povečanega sproščanja DA. Da bi to preizkusili, smo preučili učinek inzulina v prisotnosti mekamilamina, neselektivnega antagonista nAChR ali dihidro-β-eritroidina (DHβE), selektivnega antagonista za β2 podenoto, ki vsebuje (β2 *) nAChR, obogatene na DA aksoni35. Povzeto [DA]o je bil hitro odkrit v prisotnosti teh antagonistov, čeprav sta obe zdravili zmanjšali amplitudo evociranega z enim impulzom [DA]o (na primer z 13 – 26% v jedru NAc), kot smo že poročali29, 30, 31, 32. V podporo vlogi ACh in nAChRs je vpliv insulina na evociran [DA]o je preprečil bodisi mekamilamin ali DHβE (Slika 2f). Za potrditev vpletenosti strijatalne ACh signalizacije v sproščanje DA, ki je okrepljeno z insulinom, smo preučili vpliv insulina v ex vivo strijaste rezine miši, pri katerih je bila ekspresija ChAT genetsko izločena v strukture prednjih možganov (sprednji možgan ČAT KO miši), vključno s striatumom32. Čeprav so ChI v teh miši nepoškodovani, se sinteza ACh ukine, kar vodi do zmanjšanja, vendar še vedno zlahka zaznanega evokacije z enim impulzom [DA]o, kot je opisano prej32. Pri kontrolnih heteroroznih stebričkih odpadkov se je zvišala koncentracija inzulina (30 nM) [DA]o v lupini in jedru NAc ter v CPu s 37 – 90% (Slika 2g), ki presega ojačanje, prikazano v striatumu podgane (npr. Slika 1). Vendar pa učinek inzulina na izzvan [DA]o je bil odsoten po celotnem striatalnem kompleksu v sprednjem mozgu ČAT KO miši, ki dokazujejo, da za povečanje sproščanja DA, ki ga povzroča inzulin, potrebujejo progasti ACh, vendar ne sočasno sproščeni oddajniki ChI, kot je glutamat36.

Vpliv insulina na evocirani [DA]o je odvisna od prehrane

Plazemske in možganske koncentracije inzulina so sorazmerne z telesno prizadetostjo6, 7, 8in lahko privede do kompenzacijskih sprememb občutljivosti možganov na inzulin. Zato smo preizkusili hipotezo, da prehrana vpliva na sposobnost insulina, da pospeši sproščanje DA, z uporabo strijnih rezin podgan, ki se vzdržujejo bodisi na kronični FR bodisi na OB dieti v primerjavi z nadzorom AL. Kot je bilo pričakovano, so bili nivoji insulina v plazmi povezani s telesno maso, nižjim insulinom v FR kot pri podganah AL ali OBSlika 3a in Tabela 2). Kljub tem razlikam v obtoku insulina je povzročil največjo vrednost [DA]o v NAc lupini in jedru, CPu pa je bil bistveno nižji v ex vivo strijske rezine obeh prehranskih skupin v primerjavi z AL (Slika 3b in Dopolnilna slika Sl. 2 a, b), kar pomeni, da dejavniki poleg insulina zagovarjajo absolutno povzročeno [DA]o. Vsebnost črtastega DA se ni razlikovala med skupinami prehrane, kar kaže na spremembo uravnavanja sproščanja kot v sintezi DA (Dopolnilna slika 2c). V skladu s spremembo dinamične regulacije je bila občutljivost strijnega sproščanja DA na inzulin izrazito odvisna od prehrane. Pri podganah FR so bile koncentracije insulina ≤1 nM, ki niso imele učinka na AL (Slika 1b), povečano povzročeno [DA]o (Slika 3c), kar odraža povečano občutljivost za inzulin, z EC50 vrednosti v striatumu FR (0.4 – 0.6 nM), ki so bile približno za vrstni red nižje od vrednosti AL (primerjajte Figs 1b in 3c). V presenetljivem nasprotju se je pri OB striatumu izgubil učinek inzulina; celo 30 nM inzulin, ki je imel maksimalen učinek v AL striatumu (Slika 1b), ni imel vpliva na OB (Slika 3c).

Slika 3: Povečanje evociranega inzulina [DA]o so okrepljeni s FR in izgubljeni v OB.
  

Povečanje evociranega [lsqb] DA [rsqb] o zaradi inzulina se poveča za FR in se izgubi pri OB.   

(a) Koncentracija insulina v plazmi je pozitivno povezana s telesno maso v vseh skupinah s hranjenjem (R= 0.76). (b) Povprečni sproženi en impulz [DA]o v jedru NAc (gl Dodatna slika 2a, b za NAc lupino in CPu) je bil nižji pri FR (38 ± 4%) in OB (25 ± 4%) v primerjavi z AL (n= Mesta 50 – 60 od podgan 5 – 6 na prehransko skupino, F2,156= 23.337, enosmerna ANOVA, Tukey HSD; ***P<0.001); OB v primerjavi s FR (P<0.08). (c) Občutljivost sprožene [DA]o inzulin se je povečal v FR, izgubil pa v OB (n= Mesta 21 – 49 na podregijo na koncentracijo iz podgan 2 – 4 na prehransko skupino, enosmerna ANOVA, Tukey HSD), z večjo občutljivostjo v primerjavi z podganami AL v vseh podregijah (P<0.001 za vsako regijo; dvosmerna ANOVA; CPu: F(konc × dieta; 3,286)= 10.253; jedro: F(konc × dieta; 3,353)= 6.166; lupina: F(konc × dieta; 3,195)= 10.735).

 

 

Tabela 2: Končna telesna teža, sprememba teže, vrednosti plazme inzulina in glukoze v krvi pri podganah z AL, OB ali FR.
  

 

 

Ti podatki nakazujejo obratno razmerje med strijistično občutljivo InsR in telesno prizadetostjo. Vendar pa lahko te razlike, ki so odvisne od prehrane, odražajo spremenjeno občutljivost za nAChR. Iz vsake prehranske skupine smo zato določili odziv na koncentracijo na nikotin v jedru NAc. Nikotin povzroča desenzibilizacijo nAChR, kar je mogoče količinsko določiti s primerjanjem razmerja [DA]o sproženi s kratkim vlakom petih impulzov pri 100 Hz do evociranega enega impulza [DA]o (5 p: razmerje 1 p) kot indeks aktivacije / desenzibilizacije nAChR30, 31. S tem pristopom nismo ugotovili razlik med skupinami prehrane v občutljivosti na nAChR v jedru NAc (Dopolnilna slika 3a – c). Poleg tega se kontrolno razmerje 5 p: 1 p ni razlikovalo med skupinami prehrane v jedru NAc (Dopolnilna slika 3d) ali CPu (ni prikazano), kar pomeni, da prehrana ne spreminja predpisov o sproščanju DA, odvisnih od nAChR. Tako se zdi, da je občutljivost na strijatalni InsR pri FR podgan pri AL podganah odsotna, odsotna pri OB podganah pa z izgubo regulacije strijnega sproščanja DA pri fizioloških koncentracijah insulina.

NAc lupina inzulin modulira prednost pogojenih okusov

Preferenc za hrano ustvarjajo tako pred- kot po zaužitju dejavniki; mehanizmi za vsakega niso popolnoma razrešeni, vendar trenutni dokazi vključujejo signalizacijo NAc DA v obeh37, 38. Glede na to, da se raven insulina v plazmi in cerebrospinalni tekočini (CSF) hitro dvigneta po perifernem zvišanju glukoze6in da lahko zaznamo povečanje insulina v striatumu v roku 5 min povišanja insulina v plazmi7, logično je domnevati, da lahko periferno sproščanje inzulina med obrokom poveča sproščanje NAc DA in prispeva k mehanizmu nagrajevanja po zaužitju. Prilagodili smo predhodno opisani protokol za izbiro okusa37 z raztopinami sladkane saharina pri podganah za testiranje hipoteze, da blokiranje učinka endogenega insulina z lokalno uporabo insulinskega protitelesa (InsAb) v NAc zmanjša prednost pred parjenim okusom. Učinkovitost zdravila InsAb za preprečevanje učinkov inzulina je bila testirana v in vitro preizkus vnosa DA v strijatalne sinaptosome. Inzulin (30 nM) je povzročil znatno povečanje Vmax v sinaptosomih iz NAc ali CPu (Dodatna slika 4), skladno z našim Vmax podatki iz strij rezin (Tabela 1) in s prejšnjimi študijami18, 19, 20, 21, 22, 23. Ker insulina ni bilo, niti InsAb niti kontrolni protitelesni imunoglobulin G (IgG) nista spremenila Vmax za prevzem DA glede na nadzor. V prisotnosti IgG je insulin še vedno povzročil znatno povečanje Vmax; vendar učinek inzulina na Vmax se je izgubil v prisotnosti InsAb (Dodatna slika 4).

Da bi zmanjšali poškodbe tkiva in ohranili občutljivost tkivne tarče, smo testirali dve skupini preiskovancev, pri katerih smo intrainjekcijo mikroinjiciranja intra-NAc izmenično izvajali s postopkom posmehljive mikroinjekcije, namesto da bi uporabili eno skupino preiskovancev in združili eno aromatizirano raztopino z InsAb in drugo z vozila. Posledično je med sejami za kondicioniranje z eno steklenico eksperimentalna skupina prejemala mikroinjekcije InsAb, seznanjene z enim od dveh arom, na nadomestnih sejah pa so se posmehovale mikroinjekcijam, ki so povezane z drugim okusom (Slika 4a, levo). Kontrolna skupina je prejemala močne mikroinjekcije, ki so se izmenjevale z mikroinjekcijami fiziološko raztopine s fosfati (PBS) ali IgG. Obe aromatizirani raztopini sta med kondicioniranjem vsebovali glukozo. Pri skupini, ki nadzoruje mikro injektiranje, ni bilo pričakovati razlike med prednostnimi okusi, medtem ko naj bi se prednost preusmerila na mock aromo, ki je v paru z mikroinjekcijo, v skupini InsAb-mikroinjektirani.

Slika 4: Z mikroinjekcijo InsAb v lupino NAc se zmanjša prednost za okus.
  

Z mikroinjekcijo InsAb v lupino NAc se zmanjšajo prednostne okuse.   

(a) Diagram, ki prikazuje kondicioniranje z eno steklenico (levo) in preskus z dvema steklenicama (desno). (b) Porabljena količina (ml) med kondicioniranjem v eni plastenki. Prišlo je do pomembne interakcije med infuzijsko kondicijsko sejo in zdravljenjem z mikroinjekcijo (n= 19 – 20 podgan na skupino, F(3,111)= 3.088, P<0.05, 2 × 4 mešane ANOVA s ponovljenimi ukrepi na seji za kondicioniranje). Mikroinjekcija InsAb je znatno zmanjšala porabo v primerjavi s kontrolo med tretjim (t(40) = 3.026, **P<0.01) in četrto (t(40) = 3.052, **P<0.01, zaščiteno enostransko t-testi) infuzije. Mock injekcije niso vplivale na porabo v nobeni skupini (F3,111= 1.110, 2 × 4 je mešala ANOVA s ponavljajočimi se ukrepi za sejo kondicioniranja). (c) Prostornina, porabljena med testom za prednostno aromo v dveh steklenicah. Med kondicioniranjem je prišlo do pomembne interakcije med obdelavo okusa in mikroinjekcije (F1,37= 5.36, P<0.05, dvosmerna mešana ANOVA s ponavljajočimi se meritvami okusa). Skupina InsAb je zaužila bistveno manj okusa, seznanjenega z InsAb, v primerjavi z lažnim okusom (t(18) = 2.82, ** P<0.01, zaščiteno enostransko t-test); kontrolna skupina ni pokazala nobene arome (t(19) = 0.803, P> 0.05, zaščiteno t-test). V primerjavi s skupinami so podgane InsAb popile bistveno manj arome z infuzijskim parom (t(40) = 1.96, *P<0.05) in bistveno več lažno seznanjenega okusa (t(40) = 1.77, *P<0.05, zaščiteno enostransko t-test) kot kontrole.

 

 

Med sejami za kondicioniranje z enim stekleničkam je InsAb mikroinjekcija znatno zmanjšala porabo v primerjavi z vozilom med tretjo in četrto infuzijo (Slika 4b). Nasprotno pa sta obe skupini zaužili isto količino raztopine med vsemi štirimi sejami injekcije (F3,111= 0.127, P>0.05, mešana dvosmerna ANOVA) (Slika 4b). Po skupno osmih sejah kondicioniranja je bila presoja okusov ocenjena v testu z dvema steklenicama, v katerem so podgane imele dostop do obeh aromatiziranih raztopin hkratiSlika 4a). Statistična analiza je pokazala pomembno interakcijo med okusom in mikroinjekcijsko obdelavo, ki smo jo dobili med kondicioniranjemSlika 4c). Skupina InsAb je zaužila občutno manj okusa, povezanega z InsAb, v primerjavi z okusom, ki je povezan z mockom (Slika 4c), medtem ko skupina vozil ni pokazala nobene arome (Slika 4c), kar pomeni, da je nepoškodovana inzulinska signalizacija prispevala k izbiri sladke kalorične raztopine. V primerjavi z vozilom so podgane, ki jih vbrizgava InsAb, popile bistveno manj arome z infuzijskim parom in bistveno več okusa, ki je bil podvržen injekciji.Slika 4c). Mikroinjekcija IgG (t(9) = 0.792. P>0.05, zaščiten t-testov) ali PBS (t(9) = 0.442. P>0.05, zaščiten t-testi) niso vplivali na preferenco okusa (podatki niso prikazani) in zagovarjali so možnost, da nespecifični učinek mikroinjekcije InsAb zmanjša porabo ali prednost pred okusi. Prav tako je treba opozoriti, da prednost skupine InsAb pri preskusu ni prednost manj novemu okusu, saj ni bilo nobene interakcije med sejo in vrsto seje (dejanska infuzija proti mock infusion) za skupino InsAb (F3,54= 1.584, P> 0.05, dvosmerna ANOVA). To pomeni, da skupina InsAb ni zaužila več lažne arome, združene z infuzijo, v primerjavi z aromo, ki je seznanjena z infuzijo; Namesto tega so se razlike med zdravljenimi skupinami pojavile le med sejami za kondicioniranje infuzije. Na splošno ti podatki kažejo, da ima inzulin v NAc vlogo pri krepitvi naklonjenosti aromi, ki signalizira glikemično obremenitev.

 

 

  

Razprava

  

Tu poročamo, da inzulin povečuje strijatalno sproščanje DA na način, odvisen od nAChR, s spreminjanjem ChI ekscitabilnosti prek InsR. Naši rezultati kažejo, da lahko inzulin poleg svoje uveljavljene vloge pri signalizaciji sitosti služi kot nagradni signal. Zlasti vpliv insulina na sproščanje DA je odvisen od prehrane, z izrazito povečano občutljivostjo na inzulin po FR, vendar s popolno izgubo regulacije, ki jo inzulin okrepi pri prehrani OB. Zdi se, da te spremembe odražajo spremembe občutljivosti za InsR, ki so obratno povezane s koncentracijo insulina v obtoku, glede na to, da je bilo ugotovljeno, da je raven insulina v plazmi odvisna od prehrane, vendar občutljivost na nAChR ni bila. Nazadnje, naše študije o preferencah okusa na vedenju do živali kažejo, da insulinsko signaliziranje v lupini NAc vpliva na prehrano, ki ne vključuje samo insulina pri učenju hrane, ampak tudi potrjuje njegovo vlogo kot nagrajevalni signal.

Neto [DA]o odraža ravnovesje med sproščanjem DA in vnosom DA prek DAT. Prejšnji dokazi, ki kažejo, da lahko insulin uravnava aktivnost DAT18, 19, 20, 21, 22, 23 privedlo do napovedi, da naj bi povečanje inzulina povzročilo neto zmanjšanje evociranega [DA]o s povečanim vnosom DA. Vendar smo ugotovili, da je v striatumu učinek inzulina bolj zapleten kot ta. Čeprav se je izpostavljenost insulinu povečala Vmax pri DAT je bil primarni učinek insulina na sproščanje DA, ne na vnos DA, ob stalnem povečanju evociranega [DA]o v fiziološkem območju koncentracij insulina v lupini in jedru NAc ter v CPu. Čeprav je povečanje povzročeno [DA]o se je vrnil na kontrolne ravni pri suprafiziološki koncentraciji 100 nM, Vmax je bil nespremenjen tudi od nadzora, kar je odpravilo prevladujoč učinek na DAT kot razlago. Namesto tega izguba učinka na vnos in sproščanje pomeni desenzibilizacijo insR ali znižanje signalne poti na nižji stopnji pri visokih koncentracijah inzulina. Dejansko so insR-ji podvrženi hitri endocitozi in razgradnji po vezavi inzulina v perifernih tkivih1z novimi dokazi za izgubo občutljivosti nevronskih InsR po kratkotrajni izpostavljenosti visokim nivojem insulina ali visokokaloričnim dietam10, 11, 39.

Tu prevladujoči učinek insulina za povečanje strijatalnega sproščanja DA je v nasprotju z rezultati dveh drugih nedavnih ex vivo rezine študije. Prvič, inzulin je povzročil zmanjšanje električno povzročenega preliva [3H] DA iz progastih rezin, čeprav povečan [3H] DA je bil zaznan, ko je bil DAT zaviran22. Glede na izpust [3H] DA mora preprečiti prevzem, ki ga posreduje DAT, skozi celotno tkivo, ki ga zazna v superfuzni raztopini, ta protokol je še posebej občutljiv na regulacijo DAT. Naši rezultati, ki kažejo, da inzulin povečuje sproščanje DA prek ChI-jev in aktivacijo nAChR, bi poleg izboljšanja vnosa, ki ga posreduje DAT, pojasnili navidez paradoksalno povečanje inzulina, okrepljenega [3H] Preliv DA, opažen, ko so bili konkurenčni učinki na DAT blokirani22. Druga študija je uporabila FCV za direktno odkrivanje sproščanja somatodendritičnega DA v VTA, vendar je ugotovila tudi prevladujoč učinek inzulina na vnos DA, kar se kaže v zmanjšanju evociranega [DA]o (ref. 23). Razlike v številnih dejavnikih, od lokalnega mikrocirkurije do somatodendritskih in aksonskih mehanizmov sproščanja DA40, lahko prispeva k tej regionalni razliki. Kot je opisano v nadaljevanju, pa bo verjetno vloga insulina, ki je odvisna od regije, komplementarna in ne kontradiktorna.

Pred tem se je domnevalo, da je bila vsaka vloga insulinsko odvisne regulacije signalizacije DA posredovana z neposredno aktivacijo InsR na DA nevronih. Tukaj pokažemo, da se InsR izražajo tudi na strijatalnih ChI in da inzulin modulira ChI ekscitabilnost, da poveča strijatalno sproščanje DA, kar ima lahko ključno vlogo pri vplivu insulina na prehrano. Strialni ChI-ji prejmejo projekcije nevronov intralaminarnih jeder talamusa, ki kažejo strelsko odstranjevanje kot odziv na vidne senzorične dražljaje in pomagajo pri vzbujanju vzorcev razpok-pavze v ChI-jih, ki so pomembni za usmerjanje pozornosti, okrepitve in asociativnega učenja41. Zato bi lahko delovanje insulina na insRs na progaste ChI povečalo učinek senzorične prehrane na odzivnost strijcev na talamični ogenj, kar bi prispevalo k večji percepciji vrednosti nagrade za zaužitem obroku. Neposredno spodbujanje strijnega sproščanja DA z aktivacijo ChI je vodilo do domneve, da bodo imeli dejavniki, ki spodbujajo ChI, privilegirano vlogo kot sprožilci sproščanja DA33. Naši podatki so prvi dokazi za to, saj z inzulinsko okrepljeno ChI-jevo razburljivostjo in ACh signalizacijo povzročajo dinamična povečanja sproščanja DA.

Povečano sproščanje DA v prisotnosti insulina prav tako nasprotuje povečanju ACh signalizacije do te mere, da povzroči desenzibilizacijo nAChR ali aktivacijo muskarinskega ACh receptorja (mAChR), pri čemer kateri koli od njih lahko zavira z enim impulzom [DA]o (ref. ref 29, 30, 31, 42). Tako se tukaj opisani mehanizmi razlikujejo od ACh aktivacije mAChRs, kar je povezano z odklonostjo in sitosti43.

Eno-impulz [DA]o pri podganah FR in OB je bil nižji kot pri podganah AL; čeprav so ti rezultati skladni s prejšnjimi poročili44, 45, 46, naše študije zagotavljajo prvo sistematično primerjavo treh strij podregij v obeh prehranskih skupinah v nenehnem časovnem okviru. Mehanizmi, ki so odvisni od prehransko odvisnih sprememb sproščanja DA, niso bili razjasnjeni in presegajo obseg pričujočih študij. Toda glede na to, da se raven inzulina v plazmi nasprotno spreminja z dietami FR in OB, ni verjetno, da bi se zmanjšala koncentracija inzulina [DA]o v obeh skupinah je posledica prehranjene ravni insulina.

Po drugi strani pa spremembe v občutljivosti na InsR pri prehrani in posledično od prehrane odvisne ravni insulina v plazmi zagotavljajo najverjetnejšo razlago za povečano občutljivost na inzulin pri FR in izgubo odzivnosti na insulin pri OB. Ni dokazov za alternativno razlago spremenjene občutljivosti na nAChR pri podganah FR ali OB v primerjavi z AL. Čeprav so naše ugotovitve med prvimi, ki kažejo na povečano striralno občutljivost za INR s FR18, lahko izgubo teže spremlja znižana raven inzulina v CSF7, kar bi prispevalo k večji občutljivosti sproščanja DA na inzulin v FR. Nasprotno pa je izguba odzivnosti na inzulin pri podganah skladna s prejšnjimi dokazi za zmanjšano občutljivost na možgansko insulino, povzročeno s povečanjem telesne mase ali OB prehrano3, 10, 11.

naše ex vivo Podatki o rezinah podpirajo hipotezo, da lahko inzulin signalizira nagrado in sitost. To hipotezo smo preizkusili z blokiranjem učinka endogenega insulina z dvostransko mikroinjekcijo InsAb v lupini NAc med kondicioniranjem po okusu. Skladno z vlogo pri nagrajevanju blokira učinek inzulina, zmanjša se prednost za okus parne raztopine, ki vsebuje glukozo, in okusa, povezanega s nepoškodovanim inzulinskim signalizacijo. Blokiranje inzulina v lupini NAc je tudi zmanjšalo porabo seznanjene raztopine med kondicioniranjem v eni steklenici, medtem ko posnemajoče ali nadzorne mikroinjekcije niso vplivale na porabo. Ti podatki kažejo, da ima inzulin v lupini NAc vlogo pri preferenci hrane. Dosedanje študije so pokazale, da je nepoškodovana DA signalizacija v NAc potrebna za pridobivanje arome37, 38, ki potrjuje vlogo NAc DA pri posredovanju okrepitvenih učinkov hranilnih raztopin. V tej luči daje prednost raztopini glukoze v kombinaciji z nedotaknjeno razpoložljivostjo insulina nasprotovanje primarnemu učinku insulina na vnos DA, ki ga posreduje DAT v lupini NAc, saj naj bi se to zmanjšalo [DA]o in s tem zmanjšajte porabo arome, ki jo je mogoče nadzorovati. Naši rezultati so skladni tudi s tistimi iz prejšnje študije, v kateri je mikroinjekcija inzulina v lupini NAc povečala čas, ko so se živali ukvarjale s peroralno samo-aplikacijo saharoze, ob mejnem povečanju uživanja saharoze26, kar je bilo nasprotno od pričakovane posledice povečanega vnosa DA. Na splošno so ti vedenjski podatki skladni s predvidenim vplivom insulina na strijatalni ChI in izboljšanim sproščanjem DA. Vendar pa ti rezultati ne izključujejo vključitve drugih elementov progaste mikrocirkurije v nadzorovano vedenje, glede na razširjeno izražanje InsR v celotnem striatumu1, 14.

Študije, o katerih so poročali, prinašajo prve dokaze, da ima insulin sporočilno vlogo pri sporočanju kalorične vrednosti in s tem na koristne učinke obroka, kar ima pomembne posledice za vpliv insulina tako pri prenizki telesni kot pri debelih osebah. Številne študije kažejo, da učinki hrane po zaužitju hrane ne glede na to, ali so poti transdukcije okusa nedotaknjeni47, povečajo sproščanje NAc DA in pozitivno krepitev vedenja37, 47. Tako lahko post-absorptivni odziv insulina kodira glikemični donos obroka in prispeva k krepitvi prehranskih preferenc in vedenj, ki omogočajo uživanje. Vendar pa bi lahko imele ekstremne spremembe v obtoku ravni insulina in osrednja občutljivost za InsR pomembno vlogo pri nenormalnem in prilagodljivem vedenju. Na primer, hipoinsulinemija in kompenzacijska regulacija občutljivosti na InsR pri osebah z FR bi lahko bila dejavnik pri njihovi nagnjenosti k popivanju48. Nasprotno pa bi lahko centralna neobčutljivost za inzulin pri diabetesu tipa II ali debelosti, ki se zrcali pri podganah OB, prispevala k zmanjšanju občutka nagrade po zaužitju, zaužitju zaužite hrane z visokim glikemičnim indeksom kot nadomestilo49, 50. Zato lahko povečanje ali zmanjšanje občutljivosti na strizni inzulin prispeva k patološkemu prehranjevanju, kar ima za posledico prejedanje in / ali debelost.

Na splošno naše ugotovitve razkrivajo novo vlogo inzulina kot nagradnega signala. Taka vloga je v nasprotju z njegovo znano funkcijo signala sitosti, vključno z nedavnimi ugotovitvami, da lahko injiciranje inzulina v VTA zmanjša hedonsko hranjenje in naklonjenost znakom, povezanim z nagrado za hrano23, 24. To postavlja vprašanje, kako navidezno nasprotne vloge inzulina pri teh funkcijah, odvisnih od DA, lahko uskladimo. Odgovor je lahko, da se ti učinki dopolnjujejo in ne nasprotujejo. Sedanji rezultati kažejo, da inzulin v striatumu sporoča vrednost nagrade za zaužitem obroku. Dvojna vloga pri signaliziranju sitosti lahko preprosto omogoči insulinu, da služi pomembnemu namenu dokončanja obroka, hkrati pa vzpostavi spomin na njegove prehranske in s tem nagradne lastnosti in tako okrepi ponavljanje zaužitnega vedenja.

 

 

  

Metode

  

Ravnanje z živalmi

Postopki na živalih so bili v skladu s smernicami NIH in jih je odobril Odbor za nego in uporabo živali Šole medicine NYU. Vse živali so bile na svetlobi 12 h: temen cikel, prižgane so luči od 06: 00 do 18: 00; ex vivo rezine smo pripravili med 08: 00 in 12: 00. Leta 2004 so izvedli mehanske študije na podganah in miših AL ex vivo rezine živali, ki so bile nameščene v parih, podgane pa so bile ločeno nameščene za vse primerjave prehrane in za vedenjske študije.

Režim prehrane pri podganah

Odrasli moški Sprague – Dawley podgane (Taconic) so bili na začetku tednov 8 – 10 stari 21 – 30. Podgane so bile naključno razvrščene v prehranske skupine: preiskovanci so bili razvrščeni po začetni teži, nato pa je bil vsak zaporedni trio podgan naključno razporejen med prehranske skupine. Podgane AL so imele prost dostop do podgane dojenčka v istem obdobju kot parne podgane na dietah FR ali OB. Vse podgane so imele prost dostop do vode. Omejitev hrane je bila izvedena kot prej51; na kratko so podgane prejemale 40 – 50% AL-ov vnos običajnih podganjih paprik na dan, dokler se telesna teža ni zmanjšala za 20%, nakar je bila hrana titrirana za vzdrževanje te teže. Podgane OB so imele brezplačen dostop do podgane in čokolade Ensure, zelo prijetne tekočine z zmerno veliko maščob in sladkorja52.

Sprednji možgan ČAT knockout miši

Miške s pogojno zvitim alelom ČAT (ČATflox) so bili križani z a Nkx2.1Cre transgena linija za nastanek miši, pri katerih je ablacija sinteze ACh omejena na sprednji možgan32. Transgenični odpadki, ki niso bili mutirani, so bili kontrola; njihovi genotipi Cre+;ČATflox / + in Cre-;ČATflox / flox se imenujejo "heterozigoti". Imeli so odrasli moški miši, ki so jih uporabljali za študije rezin ad libitum dostop do črevesja in vode.

Ex vivo priprava rezin in fiziološke raztopine

Podgane ali miši so bile globoko anestezirane z 50 mg kg-1 pentobarbital (intraperitonealno (ip)) in obglavljeno. Za voltammetrijo so koronalne rezine sprednjega možganov (debelina 300 – 400-μm) rezale na mikrotomu z vibrirajočim rezilom Leica VT1200S (Leica Microsystems; Bannockburn, IL) v ledeno hladnem umetnem CSF (aCSF), ki vsebuje (v mM): NaCl (120); NaHCO3 (20); glukoza (10); HEPES kislina (6.7); KCl (5); Natrijeva sol HEPES (3.3); CaCl2 (2); in MgSO4 (2), uravnoteženo z 95% O2/ 5% CO2. Rezine so nato vzdrževali v tej raztopini pri sobni temperaturi 1 h pred poskusom30, 32, 53. Za elektrofiziologijo so po anesteziji podgane transkardno perfugirali z ledeno hladno raztopino, ki vsebuje (v mM): saharozo (225); KCl (2.5); CaCl2 (0.5); MgCl2 (7); NaHCO3 (28); NaH2PO4 (1.25); glukoza (7); askorbat (1); in piruvat (3) in uravnotežen z 95% O2/ 5% CO2. Rezine so bile razrezane v tej raztopini in nato prenesene v rekuperacijsko komoro v spremenjenem aCSF, ki vsebuje (v mM): NaCl (125); KCl (2.5); NaH2PO4 (1.25); NaHCO3 (25); MgCl2(1); CaCl2 (2); glukoza (25); askorbat (1); piruvat (3); in myo-inositol (4), uravnotežen z 95% O2/ 5% CO2; ta raztopina je bila sprva pri 34 ° C, nato pa se je pustila postopoma ohladiti na sobno temperaturo54. Vsi eksperimenti z voltammetrijo in fiziologijo so bili izvedeni v potopni komori za snemanje pri 32 ° C, ki je bila superfundirana pri 1.5 ml min-1 z aCSF, ki vsebuje (v mM): NaCl (124); KCl (3.7); NaHCO3 (26); CaCl2 (2.4); MgSO4 (1.3); KH2PO4 (1.3); in glukozo (10) ter goveji serumski albumin (BSA, 0.05 – 0.1 mg ml-1) uravnoteženo z 95% O2/ 5% CO2; rezine smo pustili, da se v tem okolju uravnotežijo 30 min pred poskusom.

Hitro skenirana ciklična voltammetrija

Študije sproščanja DA so bile izvedene z uporabo FCV v možganskih rezinah32, 53 pripravljeni iz samcev podgan oz ČAT prednje možgane izločanje miši in heterozygote (5 – 8 tedni). Študije v ČAT miši, ki so bile izločene, so bile oslepene, toda skupine s prehrano podgan so imele očitne fenotipe, ki so preprečevali slepoto. Voltammetrične meritve so bile narejene z Millar Voltammeter (na voljo na posebno zahtevo dr. Julian Miller iz St Bartholomew's in Royal London School of Medicine and Dentistry, University of London). Za FCV je bila uporabljena običajna valovna oblika trikotnika z razponom skeniranja od –0.7 do + 1.3 V (v primerjavi z Ag / AgCl), hitrost skeniranja 800 V s-1in interval vzorčenja 100 ms30, 32, 53. Podatki so bili pridobljeni s pomočjo digitalne plošče DigiData 1200B A / D, ki jo nadzira programska oprema Clampex 7.0 (Molekularne naprave). Sprostitev DA je bila sproščena z uporabo koncentrične stimulirajoče elektrode; amplituda impulznega impulza je bila 0.4 – 0.6 mA, trajanje pa 100 μs30, 32, 53. V jedru NAc in CPu smo uporabili lokalno en-impulzno stimulacijo; vendar je bil uporabljen kratek visokofrekvenčni impulzni vlak (pet impulzov pri 100 Hz) za ojačanje evociranega [DA]o v lupini NAc. Obe spodbujevalni paradigmi izzivata sproščanje DA, ki je akcijski potencial in Ca2+ odvisen, nanj ne vplivata sočasno sproščeni glutamat in GABA42, 55in omogočeno s sočasno sproščenim ACh29, 30, 31, 32, 33, 34. Za količinsko opredelitev izzvanega [DA]o, elektrode smo umerili z znanimi koncentracijami DA pri 32 ° C po vsakem poskusu v aCSF in v prisotnosti vsakega zdravila, uporabljenega v določenem poskusu53.

Voltammetrični eksperimenti za oceno učinka insulina na evocirani [DA]o so bili pridobljeni z uporabo katerega koli od dveh protokolov. Začetni poskusi za določitev časovnega poteka učinka insulina (Sigma, I5523) so bili izvedeni s spremljanjem sproženih [DA]o vsakih min 5 na enem mestu. Inzulin je bil uporabljen po doslednem povzročanju [DA]o dobljeno (običajno meritve 4 – 5); učinek insulina je bil največji po 50 – 60 min, nato pa je povzročil [DA]o ostal na tej ravni ves čas poskusa (običajno 90 min celotne izpostavljenosti insulinu; Slika 1c). Nato smo učinek inzulina ocenili s snemanjem povzeto [DA]o na diskretnih mestih 4 – 5 v rezinah (+ 1.5 mm od bregme) v vsaki od treh strijatalnih podregij pod kontrolnimi pogoji (aCSF ali aCSF plus zdravilo) in spet v času največjega insulinskega učinka (vzorčenje preko 60 – 80 min), nato ti vzorci so bili povprečeni za vsako podregijo. Učinek insulina se je s časom po pripravi rezin zmanjšal; da zmanjšate čas ex vivo in za optimizacijo uporabe živali so ponavadi hkrati testirali dve rezini določene živali v snemalni komori. Zdravila, ki se uporabljajo za izzivanje učinka insulina, so aplicirali 15 min pred insulinom prek superfuzije aCSF, vključno s trisacetoksimetil ester HNMPA (HNMPA-AM3; Enzo Life Sciences), S961 (Novo Nordisk), LY294002 (Sigma), picropodophyllotoxin (PPP; Tocris), mekamilamin (Tocris) in DHβE (Tocris). Kot je opisano v rezultatih, smo morebitno spremenjeno občutljivost nikotinskih ACh receptorjev med prehranskimi skupinami preizkusili s primerjanjem razmerja najvišje vrednosti [DA]o povzročeno s 5 p (100 Hz) in z vzponom z 1 p evoked (razmerje 5 p: 1 p)30, 31 v jedru NAc v prisotnosti nikotina 0 – 500 nM (Sigma).

Določitev V max od evoked [DA]o prehodne v strijčastih rezinah

Za oceno sprememb, ki jih povzroča inzulin pri vnosu DA, posredovanega z DAT, se je sprožil začetni del faze upada [DA]o krivulje smo postavili v enačbo Michaelis – Menten za ekstrahiranje Vmax (največja konstantna hitrost privzema)56. Km (kar je obratno povezano z afiniteto DAT za DA) je bilo določeno na 0.2 μM in je znano, da je podobno v striatalnih podregijah57 in nanj ne vpliva inzulin (gl Dodatna slika 4 napis).

Snemanje v celotni celici

Možganske rezine so bile pripravljene od samic podgan 29 do 35; pogoji snemanja so bili enaki kot pri študijah sproščanja DA. Celocelični tokovni posnetki so se uporabljali po običajnih metodah54. Striatal ChIs smo vizualizirali z Olympusovim BX51WI mikroskopom (Olympus America, Center Valley, PA) z infrardečo optiko diferencialnih motenj kontrasta in × 40 ciljem potopitve vode. Vsebina pipete vsebuje (v mM): K-glukonat (129); KCl (11); HEPES (10); MgCl2 (2); EGTA (1); Na2-ATP (2); Na3-GTP (0.3); in s KOH prilagodili na pH 7.2 – 7.3. Za posnete nevrone, ki jih je treba oceniti na imunoreaktivnost ChAT, smo v raztopino pipete vključili 0.3% biocitina in nevrone na kratko (~ 5 min) zmanjšali redčenje znotrajcelične vsebine. Odpornost pipete je bila ~ 3 – 5 MΩ. Posnetki so bili dobljeni z ojačevalnikom Axopatch 200B (Molecular Devices, Sunnyvale CA) in filtriranim nizkim prehodom pri 2 kHz. ChIs smo identificirali z uveljavljenimi elektrofiziološkimi merili28; večina je bila na začetku tonsko aktivna, aktivnost pa se je po popravilu spreminjala. Vendar pa je bila odzivnost na trenutno injekcijo sčasoma na splošno močna in dosledna, zato so jo uporabili za raziskovanje vpliva insulina na ChI ekscitabilnost (glejte rezultate). V eksperimentih za preučevanje vloge InsR in IGF-1R v tem odgovoru smo uporabili bodisi HNMPA bodisi PPP vsaj 20 min, preden se je ChI zakrpal. Največji učinki samo insulina so bili običajno opaženi po ~ 16 min izpostavljenosti, čeprav v nekaterih celicah povečanje ni bilo največje do 50 min ali dlje. Poleg tega je v štirih od šestih nevronov, zabeleženih v PPP, inzulin povzročil začetno zmanjšanje števila konic, preden se je okreval na in presegel začetno število trnov. Posledično smo v vseh poskusih količinsko opredelili učinek insulina, tako da smo primerjali največji učinek na število konic s številom konic, ki se sprožijo tik pred uporabo insulina. Navidezna razlika v času doseganja največjega učinka lahko odraža številne dejavnike, vključno z globino zapisane celice v rezini. Izvlečeni potencialni učinki so bili zabeleženi tudi pri ChI, če ni bilo insulina v primerljivih časovnih točkah.

Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti

Vsebnost DA v podpornih rezinah podgane (debelina 400-μm) je bila določena z uporabo visokozmogljive tekočinske kromatografije z elektrokemijskim odkrivanjem58. Pari rezin so bili uravnoteženi za 30 min pri 32 ° C v aCSF, nato pa eno rezino na par inkubirali za nadaljnji min 60 pri 32 ° C v aCSF, drugo pa inkubirali v aCSF z 10 ali 30 nM insulinom. Za primerjave prehranskih skupin je bilo odvzeto tkivo med 30 – 60 min po obnovitvi. Po inkubaciji je bil odvečen aCSF previdno odstranjen iz rezin, vzorec progastega tkiva (7 – 10 mg) stehtali, zamrznili na suhem ledu in ga nato shranili pri –80 ° C. Na dan analize smo vzorce sonicirali v ledeno hladnem, eluentu, deoksigeniziranem z argonom58, vrtelo se je v mikrocentrifugi 2 min in supernatant injiciral neposredno na HPLC kolono (BAS, West Lafayette, IN); detektor je bila steklena ogljikova elektroda, nastavljena na 0.7 V v primerjavi z Ag / AgCl.

Imunohistokemija

Za imunohistokemijsko označevanje so podgane anestezirali z natrijevim pentobarbitalom (50 mg kg-1, ip), nato perkardno perfundirano s PBS (154 mM NaCl v 10 mM fosfatnem puferju, pH 7.2), ki mu sledi 4% paraformaldehid v tem PBS; možgani so bili odstranjeni in koronalni odseki (20 μm) so bili razrezani in obdelani na konvencionalni način27, 59. Imunofluorescenčne slike so bile pridobljene z konfokalnim mikroskopom Nikon PM 800, opremljenim z digitalnim fotoaparatom, ki ga nadzira programska oprema Spot (Diagnostic Instruments Inc.) in z uporabo × 100 cilja (številčna zaslonka = 1.4) ali z konfokalnim mikroskopom Zeiss LSM 510 z uporabo X63 cilj (numerična odprtina = 1.2). Laserji so bili Argon (488 nm), He / Ne (543 nm) in He / Ne (633 nm). Programska oprema za konfokalni mikroskop je izbrala ustrezne filtre za vsak laser. Velikost luknje se spreminja glede na uporabljeni cilj in debelino preseka v z-stack generacija; izbrali smo optimalno vrednost luknje, ki jo navaja programska oprema (običajno 30 μm). Digitalne datoteke smo analizirali s programsko opremo za dekonvolucijo (AutoQuant Imaging), končne slike pa smo obdelali s programom Adobe Photoshop 7.0. Vse slike so bile prilagojene glede na svetlost in kontrast; take prilagoditve so bile narejene enakomerno na vseh delih slike. Striatal DA aksoni so bili identificirani z uporabo dveh TH protiteles: poliklonalni AB152 kunčji anti-TH (1: 800) in monoklonski MAB318 mišji anti-TH (1: 500) (oba iz skupine Chemicon). Uporabljena so bila tri protitelesa InsR: sc-57342 in sc-09 (1: 100; Santa Cruz) in PP5 (darilo Pfizerja). Specifičnost vsakega je bila že dokazana60, 61in je bilo v sedanjih študijah potrjeno z odsotnostjo imunoznačevanja s protitelesi sc-57342 ali PP5 v prisotnosti ustreznega blokirnega peptida. Protitelo ChAT je bilo AB144 (1: 200; Millipore), biotin pa iz vektorja (1: 200). Uporabljena sekundarna protitelesa so bili osla in zajec Alexa 488 (Invitrogen) ali osla, zajec Cy2 (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME), osel proti kozličkom Cy3 (Jackson) in osel anti-miš Cy5 (Jackson).

Za oceno kokalizacije lokacij InsR v TH + aksonih smo uporabili prej opisane metode za ugotavljanje prisotnosti Kir6.2, podenote, ki tvori pore ATP občutljive K+ kanalov v aksonih DA27. Punkte, ki predstavljajo InsR, so bile razporejene po prilagojenih slikah, kar kaže, da se lahko superpozicija z imunoreaktivnostjo TH do neke mere pojavi slučajno. Da bi preizkusili to domnevo, smo prešteli InsR / TH namige v 42 neodvisnih poljih v treh NAc imuno označenih odsekih dveh podgan. Digitalne datoteke InsR so nato zasukale 90 ° v smeri urinega kazalca in štetja se ponavljajo; Z vrtenjem se je zmanjšalo število InsR puncta, ki so se v večini polj sokalizirale s TH (glejte Rezultati). Zmanjšanje števila namigov z vrtenjem27 je navedel delež InsR puncta v vsakem striatalnem polju, povezanem z aksoni DA.

Glukoza v krvi in ​​insulin ELISA

Trnovska kri je bila odvzeta v času obglavljanja za študije na rezinah. Krvna glukoza je bila takoj določena s standardnim merilnikom glukoze v krvi. Za insulin je bila odvzeta dodatna kri v epruvetah, ki vsebujejo EDTA, in centrifugirana pri 1,500g za 15 min; supernatant (plazma) je bil zbran in shranjen pri –80 ° C do obdelave s kompletom ALPCO Rat Insulin ELISA.

Postavitev kanile in histološko preverjanje

Štirideset odraslih samcev podgan Sprague – Dawley (Taconic in reka Charles), ki so prvotno tehtali 350 – 425 g, so bili anestezirani s ketaminom (100 mg kg-1, ip) in ksilazin (10 mg kg-1, ip) in stereotaksično implantirano z dvema kronično nameščenima vodilnima kanilama (merilnik 26), ki sta bili dvostransko 2.0 mm dorzalni do infuzijskih mest v medialni lupini NAc.62 (1.6 mm spredaj do bregme; 2.1 mm bočno od sagittalnega šiva, konice pod kotom 8 ° proti sredini, 5.8 mm navpično do površine lobanje). Podgane so dobile banamin (2.0 mg kg)-1, subkutano) kot pooperativni analgetik po okrevanju iz anestezije in po jutru po. En teden po operaciji so podgane postavili na FR (opisano zgoraj) in jih v preostalem delu študije vzdrževali na 80% njihove teže po okrevanju. Postavitev kanile je bila določena histološko po zaključku vedenjskih testov. Vsaka podgana je bila ubita s CO2, odsekali glavo in možgane odstranili in fiksirali v 10% puferiranem formalinu za> 48 ur. Zamrznjeni koronalni odseki (debeline 40 μm) so bili rezani na Reichert-Jung Cryostat, odmrznjeni na steklenih stekelcih, prevlečenih z želatino, in obarvani s krezil vijolično. Podatki dane podgane so bili uporabljeni le, če sta bili obe kanili znotraj medialne lupine NAc62 (vključno z mejo lupine / jedra ali lupine / vohalnega tuberkla) (Dodatna slika 5); na podlagi teh meril sta bili dve podgani iz končne analize izključeni.

Predizpostavitev kondicioniranja z okusom

Podgane so prejele eno noč (v domači kletki) in šest 30 min na dan sej pred izpostavljenostjo (v preskusnih komorah) 0.2% natrijevega saharina (Sigma) v vodi z intervalom 48-h med sejami. Podgane so nato prejele dve seji 5 na dan izpostavljenosti 0.2% natrijevega saharina v 0.05% nesladkanem grozdju ali češnji Kool-Aid (Kraft Foods) v vodi. Za prvo sejo pred izpostavitvijo Kool-Aid je polovica podgan prejela raztopino z višnjevim okusom, druga polovica pa raztopino z aromo grozdja. Okusi so bili obrnjeni na drugi seji pred izpostavitvijo Kool-Aid, da so zagotovili, da so vse podgane vzorčile vsako aromo. Vnos je bil izmerjen za vse seje pred izpostavitvijo. Preskusne komore so bile prozorne plastične kletke s svežo posteljnino. Podgane so imele na vseh sejah pred izpostavitvijo dostop do iste raztopine na obeh straneh komore. Razen čez sejo pred izpostavitvijo so bile vse seje izvedene v sobi z vedenjskimi postopki, z obdobjem navade 30-min pred vsakim treningom ali testiranjem.

Kondicioniranje z eno steklenico

Prejšnje študije so pokazale, da mikroinjekcija InsAb v ventromedialni hipotalamus lahko blokira učinek inzulina na vedenje hranjenja in izločanje glukagona63, 64. Tu smo uporabili ta pristop za oceno možne vloge inzulina pri okrepitvi izbire hrane. Podgane so bile naključno razporejene glede na povprečno količino vnosa pred izpostavitvijo v dve skupini, kontrolno ali poskusno (InsAb). V kontrolni skupini so podgane prejele vehikel (mikroinjekcijski PBS; 137 mM NaCl in 2.7 mM KCl v 10 mM fosfatnem puferju) ali IgG (Abcam ab81032; 0.5 μg μl-1 v PBS, kot je prejel) mikroinjekcijo v lupini NAc, preden zaužijemo eno od dveh aromatiziranih raztopin, in pred tem zaužijemo drugo aromatizirano raztopino. V eksperimentalni skupini so podgane prejele mikrocrinjenje luske NAc lupine InsAb (Abcam ab46707; 0.5 μl 1 μg μl-1 v PBS, kot je bil sprejet) pred izpostavljenostjo eni aromatizirani raztopini, pred drugo izpostavitvijo drugi pa se posmehite mikroinjekciji. Uporabljena sta bila dva sklopa oseb z izmeničkami med mikroinjekcijo tekočine in mock mikroinjekcijo, tako da je bilo skupno število mikroinjekcij omejeno na štiri, kar je zmanjšalo možno poškodbo tkiva in izgubo občutljivosti na mestu mikroinjekcije65. Za mikroinjekcijo tekočine je bila kontrolna raztopina ali InsAb naložena v dve 30-cm dolžine cevi PE-50, pritrjene na enem koncu na 5 μl Hamilton brizge, napolnjene z destilirano vodo, na drugem koncu pa na kasete injektorja 31, ki so podaljšale 2.0 mm onstran vsadljenih vodnikov. Količine infuzije 0.5 μl smo oddali v 90 s s hitrostjo 0.005 μl s-1; injektor je bil pusti na mestu za ~ 60 s, da je pustil čas za difuzijo, nato je bil injektor zamenjan s stiletom.

Podgane so prenesli neposredno v vedenjske komore v roku 2 min po zaključku mikroinjekcije ali predrugačiti mikroinjekcijo. Kondicionirne raztopine so vsebovale 0.2% natrijevega saharina, 0.05% nesladkanega grozdja ali češnje Kool-Aid in 0.8% glukozo. Dostop do rešitve je bil omejen na 30 min na sejo. V vsaki skupini so bili naključno razporejeni parni okus in stran komore z dostopom do pitja. Interval med mikroinjekcijami je bil najmanj 72 h, izmenično med infuzijami in posnetki pa skupno osem sej kondicioniranja.

Preferenčni test z dvema steklenicama

Osemindvajset ur po zadnjem sestanku priprave so podgane postavili v preskusne komore s hkratnim dostopom do obeh kondicionirajočih arom; raztopine so bile 0.2% natrijevega saharina v 0.05% grozdja ali češnjevega Kool-Aida, brez glukoze. Testiranje je potekalo v dnevih 2 (60 min na dan). Položaj epruvete za pitje, ki vsebuje mock ali infuzijsko raztopino, je bil spremenjen, da se zagotovi, da je bila vsaka podgana testirana na porabo vsake raztopine na obeh straneh kletke. Vnos vsake aromatizirane raztopine je bil povprečno določen za dva preskusna dneva, da smo določili prednost.

[3H] Vnos DA v strijatalne sinaptosome za oceno učinkovitosti InsAb

Strijatalni sinaptosomi21, 66 so bile pripravljene iz AL podgan (samcev, 350 – 400 g), z NAc (lupina in jedro) in CPu secirajo in pripravijo ločeno. Tkivo iz vsake regije smo homogenizirali v količinah 15 ledene raztopine saharoze 0.32 M v steklenem homogenizatorju z motornim teflonskim pestičem; po izpiranju in centrifugiranju smo končni pelet ponovno suspendirali v ledeno hladni saharozi 0.32 M21, 66. Preden začnete s [3H] Test prevzema DA66, sinaptosomske alikvote v skupni prostornini 180 μl prevzemnega pufra inkubiramo v stresalniku 15 min pri 30 ° C v prisotnosti ali odsotnosti inzulina 30 nM, v vozilu (PBS) ali v InsAb (končno redčenje 1: 500) , v IgG (končno razredčenje 1: 500) ali v vozilu. Vsebujoč pufer (v mM): NaCl (122); Na2HPO4 (3); NaH2PO4 (15); KCl (5); MgSO4 (1.2); glukoza (10), CaCl2 (1); nialamid (0.01); tropolon (0.1); in askorbinska kislina (0.001), pH 7.4. Sprejem [3H] DA je bil sprožen s hitrim odvajanjem 20 μl vsake sinaptosomske suspenzije v plošče z vdolbinico 96 z različnimi koncentracijami DA (0.003 – 1.0 μM) in [3H] DA (5 nM); po 5 min v stresalniku plošče pri 25 ° C je bil vnos končan s hladno, hitro vakuumsko filtracijo66. Število vdolbinic smo pretvorili v pmole in jih nato popravili na mg celotnega beljakovine na minuto. Vsi testi so bili izvedeni v treh izvodih in ponovljeni vsaj štirikrat; Vmax in Km smo izračunali z uporabo programske opreme Biosoft Kell Radlig (Cambridge, Velika Britanija).

Statistična analiza

Podatki so navedeni kot sredstva ± sem; Pomembnost je bila ocenjena s pomočjo seznanjenih ali neparskih Student's t-testov ali ANOVA, razen če ni drugače navedeno. Za podatke o voltammetriji n je število snemalnih mest, glede na to, da je spremenljivost med posameznimi območji znotraj strijčne podregije večja od spremenljivosti med živalmi ali med rezino30, 32, 55, 56; živalska številka je zapisana za vsak nabor podatkov. ES50 za učinek inzulina in nikotina na največje evociranje [DA]o smo izračunali s pomočjo Prism 6.0 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Za elektrofiziološke podatke smo statistično pomembnost ocenili s pomočjo seznama t-testov ali Wilcoxonovega testa v Prism 6.0 ali mešane dvosmerne ANOVA v SAS 9.3 (SAS Institute Inc., Cary, NC). Za oceno vpletenosti inzulina v kondicioniranje po okusu sta bili opravljeni dve popolni študiji z uporabo protokolov, ki so bili enaki, razen uporabe uporabljenega vozila. V prvi študiji so podgane 10 prejemale infuzije PBS, 9 pa infuzijo zdravila InsAB. V drugi študiji so podgane 10 prejele infuzijo vozil IgG, 10 pa infuzijo zdravila InsAb. Med dvema skupinama vozil (PBS ali IgG) med sejami kondicioniranja z infuzijo ni bilo pomembne razlike (F19= 0.619, mešana dvosmerna ANOVA) z večkratnimi ukrepi na seji za infuzijsko kondicioniranje) ali na testu (F19= 0.012, dvosmerna mešana ANOVA z večkratnimi ukrepi za aromo). Posledično sta bila oba eksperimenta združena za analizo. Za to analizo je bila uporabljena 2 × 4 mešana ANOVA (s ponovljenimi ukrepi na dan kondicioniranja z infuzijo) za določitev učinkov mikroinjekcijskega zdravljenja med kondicioniranjem, ki mu sledi zaščiten t-testov (en, ki je določen, da bi ugotovili, v katerih sestankih kondicioniranja se je mikroinjekcijsko zmanjšanje vnosa zmanjšalo). Ista analiza je bila zaključena tudi za posmeh kondicioniranja. Za določitev učinka kondicioniranja med preskusom preferenc okusa z dvema stekleničkoma smo podatke analizirali z mešano dvostransko ANOVA (s ponavljajočimi se ukrepi za aromo), ki ji sledi zaščita t-testov (eden je narejen tako, da preizkusi hipotezo, da bi InsAb znižal prednost).

 

 

  

Dodatne informacije

  

Kako citirati ta članek: Stouffer, MA sod. Inzulin povečuje sproščanje strijatalnega dopamina z aktiviranjem holinergičnih intervrovronov in s tem signalizira nagrado. Nat. Komun. 6: 8543 doi: 10.1038 / ncomms9543 (2015).

 

 

  

Reference

  

  1. Schulingkamp, ​​RJ, Pagano, TC, Hung, D. in Raffa, RB Insulinski receptorji in delovanje insulina v možganih: pregled in klinične posledice. Nevrosci. Biobehav. Rev. 24, 855–872 (2000).
  2. Gerozissis, K. homeostaza možganov, energija in glukoza; geni, okoljske in presnovne patologije. EUR. J. Pharmacol. 585, 38 – 49 (2008).
  3. CAS
  4. PubMed
  5. Člen
  6. Prikaži kontekst
  7. CAS
  8. PubMed
  9. Člen
  10. Prikaži kontekst
  11. CAS
  12. PubMed
  13. Člen
  14. Prikaži kontekst
  15. CAS
  16. PubMed
  17. Člen
  18. Prikaži kontekst
  19. CAS
  20. ISI
  21. PubMed
  22. Člen
  23. Prikaži kontekst
  24. ISI
  25. PubMed
  26. Člen
  27. Prikaži kontekst
  28. CAS
  29. PubMed
  30. Člen
  31. Prikaži kontekst
  32. Prikaži kontekst
  33. CAS
  34. ISI
  35. PubMed
  36. Člen
  37. Prikaži kontekst
  38. CAS
  39. ISI
  40. PubMed
  41. Člen
  42. Prikaži kontekst
  43. CAS
  44. ISI
  45. PubMed
  46. Prikaži kontekst
  47. ISI
  48. PubMed
  49. Člen
  50. Prikaži kontekst
  51. CAS
  52. ISI
  53. PubMed
  54. Člen
  55. Prikaži kontekst
  56. CAS
  57. ISI
  58. PubMed
  59. Člen
  60. Prikaži kontekst
  61. Prikaži kontekst
  62. CAS
  63. ISI
  64. PubMed
  65. Člen
  66. Prikaži kontekst
  67. CAS
  68. ISI
  69. PubMed
  70. Člen
  71. Prikaži kontekst
  72. CAS
  73. ISI
  74. PubMed
  75. Člen
  76. Prikaži kontekst
  77. PubMed
  78. Člen
  79. Prikaži kontekst
  80. Prikaži kontekst
  81. CAS
  82. PubMed
  83. Člen
  84. Prikaži kontekst
  85. ISI
  86. PubMed
  87. Člen
  88. Prikaži kontekst
  89. CAS
  90. ISI
  91. PubMed
  92. Člen
  93. Prikaži kontekst
  94. CAS
  95. ISI
  96. PubMed
  97. Člen
  98. Prikaži kontekst
  99. CAS
  100. PubMed
  101. Člen
  102. Prikaži kontekst
  103. Prikaži kontekst
  104. CAS
  105. ISI
  106. PubMed
  107. Člen
  108. Prikaži kontekst
  109. CAS
  110. ISI
  111. PubMed
  112. Člen
  113. Prikaži kontekst
  114. CAS
  115. ISI
  116. PubMed
  117. Člen
  118. Prikaži kontekst
  119. CAS
  120. ISI
  121. PubMed
  122. Člen
  123. Prikaži kontekst
  124. PubMed
  125. Člen
  126. Prikaži kontekst
  127. CAS
  128. ISI
  129. PubMed
  130. Člen
  131. Prikaži kontekst
  132. CAS
  133. PubMed
  134. Člen
  135. Prikaži kontekst
  136. CAS
  137. ISI
  138. PubMed
  139. Člen
  140. Prikaži kontekst
  141. CAS
  142. PubMed
  143. Člen
  144. Prikaži kontekst
  145. ISI
  146. PubMed
  147. Člen
  148. Prikaži kontekst
  149. Prikaži kontekst
  150. Prikaži kontekst
  151. CAS
  152. ISI
  153. PubMed
  154. Člen
  155. Prikaži kontekst
  156. CAS
  157. ISI
  158. PubMed
  159. Člen
  160. Prikaži kontekst
  161. CAS
  162. ISI
  163. PubMed
  164. Člen
  165. Prikaži kontekst
  166. CAS
  167. ISI
  168. PubMed
  169. Člen
  170. Prikaži kontekst
  171. CAS
  172. ISI
  173. PubMed
  174. Prikaži kontekst
  175. CAS
  176. ISI
  177. PubMed
  178. Člen
  179. Prikaži kontekst
  180. PubMed
  181. Člen
  182. Prikaži kontekst
  183. CAS
  184. ISI
  185. PubMed
  186. Člen
  187. Prikaži kontekst
  188. CAS
  189. ISI
  190. PubMed
  191. Člen
  192. Prikaži kontekst
  193. CAS
  194. ISI
  195. PubMed
  196. Člen
  197. Prikaži kontekst
  198. CAS
  199. ISI
  200. PubMed
  201. Člen
  202. Prikaži kontekst
  203. Prikaži kontekst
  204. CAS
  205. ISI
  206. PubMed
  207. Prikaži kontekst
  208. Prikaži kontekst
  209. Prikaži kontekst
  210. Prikaži kontekst
  211. CAS
  212. ISI
  213. PubMed
  214. Člen
  215. Prikaži kontekst
  216. CAS
  217. PubMed
  218. Člen
  219. Prikaži kontekst
  220. CAS
  221. ISI
  222. PubMed
  223. Prikaži kontekst
  224. Prikaži kontekst
  225. CAS
  226. PubMed
  227. Člen
  228. Prikaži kontekst
  229. ISI
  230. PubMed
  231. Člen
  232. Prikaži kontekst
  233. Prikaži kontekst
  234. ISI
  235. PubMed
  236. Člen
  237. Prikaži kontekst
  238. Prikaži kontekst
  239. CAS
  240. ISI
  241. PubMed
  242. Člen
  243. Prikaži kontekst
  244. Prikaži kontekst
  245. Vogt, MC in Bruning, JC CNS signalizacija inzulina pri nadzoru energijske homeostaze in metabolizma glukoze - od zarodka do starosti. Trendi Endokrinol. Metab. 24, 76–84 (2013).
  246. Havrankova, J., Schmechel, D., Roth, J. in Brownstein, M. Identifikacija insulina v možganih podgan. Proc. Natl Acad. Sci. ZDA 75, 5737–5741 (1978).
  247. King, GL & Johnson, S. Prenos inzulina preko endotelijskih celic s pomočjo receptorjev. Science 227, 1583–1586 (1985).
  248. Strubbe, JH, Porte, D. Jr & Woods, SC Odzivi insulina in ravni glukoze v plazmi in cerebrospinalni tekočini med postom in ponovnim hranjenjem pri podganah. Physiol. Obnašaj se. 44, 205–208 (1988).
  249. Banks, WA & Kastin, AJ Diferencialna prepustnost krvno-možganske pregrade za dva peptida trebušne slinavke: inzulin in amilin. Peptidi 19, 883–889 (1998).
  250. Banks, WA Vir cerebralnega insulina. EUR. J. Pharmacol. 490, 5 – 12 (2004).
  251. Nemoto, T. sod. Nova spoznanja o sintezi inzulina in njegovem izločanju v hipokampusu in možganski skorji podgane: znižanje ravni proinzulina z glikogen sintaza kinazo-1β, ki ga povzroča amiloid-β42-3. Celični signal. 26, 253 – 259 (2014).
  252. De Souza, CT sod. Uživanje diete, bogate z maščobami, aktivira vnetni odziv in povzroči odpornost na inzulin v hipotalamusu. Endokrinologija 146, 4192 – 4199 (2005).
  253. Anthony, K. sod. Slabljenje reakcij, povzročenih z insulinom v možganskih mrežah, ki nadzorujejo apetit in nagrajujejo inzulinsko rezistenco: možganska osnova za oslabljen nadzor nad vnosom hrane pri presnovnem sindromu? Diabetes 55, 2986 – 2992 (2006).
  254. Kelley, AE in Berridge, KC Nevroznanost naravnih nagrad: pomen drog, ki povzročajo odvisnost. J. Neurosci. 22, 3306–3311 (2002).
  255. Koob, GF in Volkow, ND Nevrocirkuitrija odvisnosti. Nevropsychopharmacology 35, 217–238 (2010).
  256. Werther, GA sod. Lokalizacija in karakterizacija inzulinskih receptorjev pri uporabi možganov in hipofize podgane in vitro avtoradiografija in računalniška denzitometrija. Endokrinologija 121, 1562 – 1570 (1987).
  257. Figlewicz, DP, Evans, SB, Murphy, J., Hoen, M. in Baskin, DG Izražanje receptorjev za inzulin in leptin v ventralnem tegmentalnem območju / substantia nigra (VTA / SN) podgane. Brain Res. 964, 107–115 (2003).
  258. Daws, LC sod. Inzulinska signalizacija in odvisnost. Nevrofarmakologija 61, 1123 – 1128 (2011).
  259. Figlewicz, DP & Sipols, AJ Energy regulativni signali in nagrada za hrano. Pharmacol. Biochem. Obnašaj se. 97, 15–24 (2010).
  260. Patterson, TA sod. Odvzem hrane zmanjšuje mRNA in aktivnost prenašalca dopamina podgane. Nevroendokrinologija 68, 11 – 20 (1998).
  261. Carvelli, L. sod. PI 3-kinazna regulacija vnosa dopamina. J. Neurochem. 81, 859 – 869 (2002).
  262. Williams, JM sod. Hipoinsulinemija uravnava povratni transport dopamina, ki ga povzroča amfetamin. PLOS Biol. 5, e274 (2007).
  263. Zhen, J., Reith, MEA & Carr, KD Kronična omejitev hrane in prenos dopamina v striatumu podgan. Brain Res. 1082, 98–101 (2006).
  264. Schoffelmeer, AN sod. Inzulin modulira funkcijo prenašalcev monoamina na kokain in impulzivno vedenje. J. Nevrosci. 31, 1284 – 1291 (2011).
  265. Mebel, DM, Wong, JC, Dong, YJ & Borgland, SL Insulin v ventralnem tegmentalnem območju zmanjša hedonsko hranjenje in z večjim ponovnim privzemom zavira koncentracijo dopamina. EUR. J. Neurosci. 36, 2336–2346 (2012).
  266. Labouebe, G. sod. Insulin povzroča dolgotrajno depresijo dopaminskih nevronov ventralnega tegmentalnega območja prek endokanabinoidov. Nat. Nevrosci. 16, 300 – 308 (2013).
  267. Konner, AC sod. Vloga za inzulinsko signalizacijo v kateholaminergičnih nevronih pri nadzoru energijske homeostaze. Celični metab. 13, 720 – 728 (2011).
  268. Figlewicz, DP, Bennett, JL, Aliakbari, S., Zavosh, A. & Sipols, AJ Insulin deluje na različnih mestih osrednjega živčevja, da zmanjša akutni vnos saharoze in samo-dajanje saharoze pri podganah. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Komp. Physiol. 295, R388 – R394 (2008).
  269. Patel, JC, Witkovsky, P., Coetzee, WA & Rice, ME Podsekunda regulacije sproščanja striatalnega dopamina s presinaptičnim KATP kanalov. J. Neurochem. 118, 721 – 736 (2011).
  270. Tepper, JM & Bolam, JP Funkcionalna raznolikost in specifičnost neostriatalnih internevronov. Curr. Mnenje. Nevrobiol. 14, 685–692 (2004).
  271. Zhou, FM, Liang, Y. in Dani, JA Endogena nikotinska holinergična aktivnost uravnava sproščanje dopamina v striatumu. Nat. Nevrosci. 4, 1224–1229 (2001).
  272. Rice, ME & Cragg, SJ Nikotin v striatumu ojača dopaminske signale, povezane z nagrado. Nat. Nevrosci. 7, 583–584 (2004).
  273. Zhang, H. in Sulzer, D. Frekvenčno odvisna modulacija sproščanja dopamina z nikotinom. Nat. Nevrosci. 7, 581–582 (2004).
  274. Patel, JC, Rossignol, E., Rice, ME & Machold, RP Nasprotujoča si regulacija sproščanja dopamina skozi striat in raziskovalno motorično vedenje s holinergičnimi vložki prednjega in možganskega debla Nat. Obče. 3, 1172 (2012).
  275. Threlfell, S. sod. Strijatalno sproščanje dopamina sproži sinhrono delovanje v holinergičnih intervrovronih. Nevron 75, 58 – 64 (2012).
  276. Cachope, R. sod. Selektivna aktivacija holinergičnih internevronov poveča akumbalno fazno sproščanje dopamina: nastavitev tona za predelavo nagrade. Rep. Celic 2, 1 – 9 (2012).
  277. Jones, IW, Bolam, JP & Wonnacott, S. Presinaptična lokalizacija imunoreaktivnosti podenote nikotinskega acetilholinskega receptorja beta2 v nigrostriatalnih dopaminergičnih nevronih podgan. J. Comp. Nevrol. 439, 235–247 (2001).
  278. Higley, MJ sod. Kolinergični internevroni posredujejo hiter od VGluT3 odvisen glutamatergični prenos v striatumu. PLOŠI ENO 6, e19155 (2011).
  279. Touzani, K., Bodnar, R. in Sclafani, A. Aktiviranje dopamin D1 podobnih receptorjev v nucleus accumbens je ključnega pomena za pridobivanje, ne pa tudi za izražanje preferenc okusa, odvisnih od hranil, pri podganah. EUR. J. Neurosci. 27, 1525–1533 (2008).
  280. Sclafani, A., Touzani, K. in Bodnar, RJ Dopamin in naučene prehrambene nastavitve. Physiol. Obnašaj se. 104, 64–68 (2011).
  281. Mayer, CM & Belsham, DD Centralno signaliziranje insulina se oslabi z dolgotrajno izpostavljenostjo insulinu s serinsko fosforilacijo substrata-1 insulinskega receptorja, proteasomsko razgradnjo in razgradnjo lizosomskega insulinskega receptorja. Endokrinologija 151, 75–84 (2010).
  282. Rice, ME, Patel, JC & Cragg, SJ Sproščanje dopamina v bazalnih ganglijih. Nevroznanost 198, 112–137 (2011).
  283. Smith, Y., Surmeier, DJ, Redgrave, P. in Kimura, M. Thalamic prispevki k preoblikovanju in okrepitvi bazalnih ganglijev. J. Neurosci. 31, 16102–16106 (2011).
  284. Threlfell, S. sod. Strijatalni muskarinski receptorji spodbujajo odvisnost aktivnosti prenosa dopamina prek različnih podtipov receptorjev na holinergične internevrone v ventralnem nasproti dorzalnem striatumu. J. Nevrosci. 30, 3398 – 3408 (2010).
  285. Hoebel, BG, Avena, NM & Rada, P. Akumulira ravnovesje dopamin-acetilholina pri pristopu in izogibanju. Curr. Mnenje. Pharmacol. 7, 617–627 (2007).
  286. Pothos, EN, Creese, I. & Hoebel, BG Omejeno prehranjevanje z izgubo teže selektivno zmanjša zunajcelični dopamin v jedru in spremeni odziv dopamina na amfetamin, morfij in vnos hrane. J. Neurosci. 15, 6640–6650 (1995).
  287. Geiger, BM sod. Primanjkljaji nevrotransmisije mezolimbičnega dopamina pri prehranski debelosti podgan. Nevroznanost 159, 1193 – 1199 (2009).
  288. Morris, JK sod. Inzulinska rezistenca poslabša delovanje nigrostriatalnega dopamina. Exp Nevrol. 231, 171 – 180 (2011).
  289. De Araujo, IE sod. Nagrada za hrano, če ni signala za receptorje okusa. Nevron 57, 930 – 941 (2008).
  290. Stice, E., Spoor, S., Bohon, C. & Small, DM Razmerje med debelostjo in odtujenim striatnim odzivom na hrano moderira alel TaqIA A1. Znanost 322, 449–452 (2008).
  291. Wang, GJ sod. Možganski dopamin in debelost. Lancet 357, 354 – 357 (2001).
  292. Johnson, PM & Kenny, PJ Dopaminski receptorji D2 pri odvisnosti podobni disfunkciji nagrajevanja in kompulzivnem prehranjevanju pri debelih podganah. Nat. Nevrosci. 13, 635–641 (2010).
  293. Carr, KD, Kim, G.-Y. & Cabeza de Vaca, S. Nagrajevanje in aktiviranje lokomotornih učinkov neposrednih agonistov dopaminskih receptorjev povečuje kronično omejevanje hrane pri podganah. Psihofarmakologija (Berl.) 154, 420–428 (2001).
  294. Levin, BE in Keesey, RE Obramba različnih nastavljenih vrednosti telesne teže pri debelih in odpornih podganah, ki jih povzroča prehrana. Am. J. Physiol. 274, R412-R419 (1998).
  295. Patel, JC & Rice, ME Spremljanje sproščanja aksonskega in somatodendritičnega dopamina z uporabo hitro skenirane ciklične voltametrije v možganskih rezinah. Metode Mol. Biol. 96, 243–273 (2013).
  296. Lee, CR, Witkovsky, P. in Rice, ME Regulacija substantia nigra pars reticulata GABAergične nevronske aktivnosti s H2O2 preko kanalov, občutljivih na flufenamsko kislino in KATP kanalov. Spredaj. Syst. Nevrosci. 5, 14 (2011).
  297. Chen, BT, Moran, KA, Avshalumov, MV & Rice, ME Omejena regulacija sproščanja somatodendritičnega dopamina z napetostno občutljivim Ca2+ kanali v nasprotju z močno regulacijo sproščanja aksonskega dopamina. J. Neurochem. 96, 645 – 655 (2006).
  298. Li, X. sod. Izboljšan strijatalni prenos dopamina in motorične zmogljivosti s prekomerno ekspresijo LRRK2 pri miših odpravljamo družinske mutacije Parkinsonove bolezni G2019S. J. Nevrosci. 30, 1788 – 1797 (2010).
  299. Wu, Q., Reith, MEA, Wightman, RM, Kawagoe, KT & Garris, PA Določanje parametrov sproščanja in prevzema iz električno sprožene dinamike dopamina, merjene s pomočjo voltametrije v realnem času. J. Neurosci. Metode 112, 119–133 (2001).
  300. Chen, BT, Avshalumov, MV & Rice, ME H2O2 je nov, endogeni modulator sinaptičnega sproščanja dopamina. J. Nevrofiziol. 85, 2468 – 2476 (2001).
  301. Witkovsky, P., Patel, JC, Lee, CR & Rice, ME Imunocitokemijska identifikacija proteinov, ki sodelujejo pri sproščanju dopamina iz somatodendritičnega oddelka nigralnih dopaminergičnih nevronov. Nevroznanost 164, 488–496 (2009).
  302. Sugimoto, K. sod. Inzulinski receptor v perifernem živcu podgane: njegova lokacija in alternativno zlepljeni izoformi. Diabetes Metab. Res. Rev. 16, 354 – 363 (2000).
  303. Sanchez-Alavez, M. sod. Inzulin povzroča hipertermijo z neposrednim zaviranjem toplotno občutljivih nevronov. Diabetes 59, 43 – 50 (2010).
  304. Paxinos, G. in Watson, C. Mozak podgan v stereotaksičnih koordinatah 6. edn Academic (2007).
  305. Strubbe, JH & Mein, CG Povečano hranjenje kot odgovor na dvostransko injiciranje protiteles proti insulinu v VMH. Physiol Behav. 19, 309–313 (1977).
  306. Paranjape, SA sod. Vpliv insulina v ventromedialnem hipotalamusu na izločanje glukagona trebušne slinavke vivo. Diabetes 59, 1521 – 1527 (2010).
  307. Wise, RA & Hoffman, DC Lokalizacija mehanizmov nagrajevanja zdravil z intrakranialnimi injekcijami. Synapse 10, 247-263 (1992).
  308. Zhen, J., Maiti, S., Chen, N., Dutta, AK & Reith, MEA Interakcija med hidroksipiperidinskim analogom 4- (2-benzhidriloksi-etil) -1- (4-fluorobenzil) piperidina in aspartata 68 v transporter človeškega dopamina. EUR. J. Pharmacol. 506, 17–26 (2004).

Prenesite reference

 

 

  

Priznanja

  

Te študije so bile podprte s štipendijami NIH DA033811 (MER, KDC in MEAR), NS036362 (MER), DA03956 (KDC) in NARSAD neodvisno preiskovalno nagrado (KDC). S961 je bil velikodušno darilo dr. Laugea Schafferja, Novo Nordisk. PP5 protitelo je bilo velikodušno darilo Pfizerja. Dr Charles Charles Nicholson, NYU School of Medicine, se zahvaljujemo za programsko opremo za odvzem Vmax vrednosti iz podatkov FCV.

 

 

  

Podatki o avtorju

  

Opombe avtorjev

  1. Ti avtorji so enako prispevali k temu delu.

    • Catherine A. Woods &
    • Jyoti C. Patel

Pripadnosti

  1. Oddelek za nevroznanost in fiziologijo Medicinske fakultete na Univerzi v New Yorku, 550 First Avenue, New York, New York 10016, ZDA

    • Melissa A. Stouffer,
    • Li Bao &
    • Margaret E. Rice
  2. Oddelek za nevrokirurgijo Medicinske fakultete Univerze v New Yorku, 550 First Avenue, New York, New York 10016, ZDA

  3. Melissa A. Stouffer,
  4. Jyoti C. Patel,
  5. Christian R. Lee,
  6. Li Bao &
  7. Margaret E. Rice
  8. Catherine A. Woods
  9. Paul Witkovsky
  10. Robert P. Machold
  11. Kymry T. Jones,
  12. Soledad Cabeza de Vaca,
  13. Maarten EA Reith &
  14. Kenneth D. Carr
  15. Maarten EA Reith &
  16. Kenneth D. Carr
  17. Center za nevroznanost, Univerza v New Yorku, 4 Washington Place, New York, New York 10003, ZDA

  18. Oddelek za oftalmologijo Medicinske fakultete Univerze v New Yorku, 550 First Avenue, New York, New York 10016, ZDA

  19. Program Smilow Neuroscience, Medicinska šola Univerze v New Yorku, 550 First Avenue, New York, New York 10016, ZDA

  20. Oddelek za psihiatrijo Medicinske fakultete na Univerzi v New Yorku, 550 First Avenue, New York, New York 10016, ZDA

  21. Oddelek za biokemijo in molekularno farmakologijo Medicinske fakultete na Univerzi v New Yorku, 550 First Avenue, New York, New York 10016, ZDA

Prispevki

MAS, MER in KDC so zasnovali celotno študijo in izdelali rokopis; vsi avtorji so prispevali k končnemu rokopisnemu besedilu; MAS je izvedel eksperimente voltammetrije in analizo podatkov s prispevki LB in JCP; JCP je prispeval k oblikovanju eksperimentov z voltammetrijo ter zagotavljal programsko opremo in analiziral Vmax podatki; PW je pridobil vse imunohistokemijske slike in zagotovil kvantitativno analizo teh podatkov; CRL je oblikoval elektrofiziološke protokole in pridobil nevrone, napolnjene z biocinom; CRL in JCP sta izvedla elektrofiziološke študije in opravila vso povezano analizo podatkov; RPM je razvil in zagotovil sprednji možgan ČAT KO miši; CAW in MAS sta v sodelovanju s KDC in SCdV zasnovala študije vedenja; te je izvajala predvsem CAW; SCdV je prispeval tudi k statistični analizi vedenjskih podatkov; KTJ in MEAR sta zasnovala in analizirala eksperimente privzema DA v sinaptosomih za oceno učinkovitosti InsAb; KTJ je izvedla poskuse.