PLoS One. 2014 julij 29; 9 (7): e102524. doi: 10.1371 / journal.pone.0102524. eCollection 2014.
Minimalizem
Izpostavljenost kroničnemu kokainu pri odvisnikih od človeka in pri modelih odvisnosti od glodalcev zmanjšuje prefrontalno kortikalno aktivnost, ki posledično moti proces nagrajevanja in izvršilno funkcijo višjega reda. Neto učinek tega oslabljenega preoblikovanja vedenja je povečana ranljivost zaradi ponovitve. Prej smo pokazali, da je povečanje možganskega nevrotrofnega faktorja (BDNF), povzročenega s kokainom, v medialnem prefrontalnem korteksu (PFC) nevroadaptivni mehanizem, ki ojača učinkovitost kokaina. Ker je BDNF znano, da vpliva na preživetje nevronov in sinaptično plastičnost, smo preizkusili hipotezo, da bi abstinenca zaradi samo-dajanja kokaina povzročila spremembe v nevronski morfologiji in sinaptični gostoti v PFC. Z uporabo nove tehnike, matrične tomografije in Golgijevega barvanja smo analizirali morfološke spremembe v podganah PFC po 14 dneh samoupravljanja kokaina in 7 dni prisilne abstinence. Naši rezultati kažejo, da sta v podganah PFC občutno zmanjšana celotna dendritična razvejanost in skupna sinaptična gostota. V nasprotju s tem se gostota tankih dendritičnih trnov bistveno poveča na piramidnih nevronih plasti V PFC. Te ugotovitve kažejo, da se med kokainsko abstinenco pojavijo dinamične strukturne spremembe, ki lahko prispevajo k opaženi hipoaktivnosti PFC pri posameznikih, ki so odvisni od kokaina.
Predstavitev
Spremembe strukturne plastičnosti v nagradnem krogu se predlagajo kot ključni mehanizmi, ki prispevajo k močni sposobnosti kokaina, da ohranja vedenje pri iskanju drog (pregledano v [1]). Prejšnje študije so pokazale povečanje dendritične arborizacije in gostote hrbtenice v nucleus accumbens (NAc). [2]-[4], ventralno tegmentalno območje [5]in prefrontalni korteks (PFC) [6] izpostavljenosti kokainu. Medtem ko se je večina študij osredotočila na strukturne spremembe, povezane z disfunkcionalno dejavnostjo NAc, je precej manj študij preučilo spremembe v PFC. Več dokazov dokazuje disfunkcijo PFC po kronični izpostavljenosti kokainu pri obeh odvisnikih [7], [8] in pri modelih odvisnosti od glodalcev [9], [10]. Zato je za opredelitev strukturnih sprememb, ki se pojavljajo v PFC, pomembno razumevanje molekularnih dogodkov, ki so podlaga za zasvojenost.
PFC uravnava nadzor impulzov in odločanje in tako igra pomembno vlogo pri posameznikovi sposobnosti obvladovanja vedenja, zlasti pri odvisnosti od drog [8], [11]. Na primer, pri osebah, ki so odvisne od kokaina, je zmanjšana aktivacija prefrontalnega korteksa povezana z odvzemom drog in motenimi odzivi izvršilcev [7], [8], ki lahko povečajo ranljivost zaradi ponovitve. Pri glodalcih je povečana aktivnost nevronov v PFC povezana z uživanjem kokaina [9], [10], kompulzivno vedenje za iskanje drog [12]in vrnitev kokaina po umiku [13]-[15]. Poleg tega se membranska bistabilnost ukine v PFC po kronični aplikaciji kokaina [16]. Končno, presnovna aktivnost, povzročena z zdravilom, je pri podganah, ki so dobivale izzivno injekcijo, umaknili med odvzemom kokainske samouprave. [9], [17]. Te študije skupaj kažejo, da kronični kokain povzroča globoke funkcionalne spremembe v PFC, ki so lahko povezane s povečanjem števila inhibitornih sinaps in / ali zmanjšanjem ekscitatornih sinaps v PFC. Vendar pa morfološke spremembe, ki se pojavijo v PFC po kronični uporabi drog, niso pojasnjene.
V tej študiji smo poskušali preveriti, ali abstinenca zaradi kokaina povzroča strukturne spremembe v PFC. Morfološke spremembe so bile pregledane s tradicionalno metodo, Golgijevim barvanjem, pa tudi z novo tehniko, matrično tomografijo. Array tomografija je edinstvena metoda, ki združuje ultra tanko sekcijo tkiv z imunofluorescenco in rekonstrukcijo tridimenzionalne slike, da se omogoči natančna kvantifikacija skupne in podtipov specifične gostote sinapse [18], [19]. Z uporabo teh metod so naši rezultati pokazali znatno plastičnost pri podganah PFC kot odziv na abstinenco iz kokaina.
Materiali in metode
Živali in stanovanja
Samci podgan Sprague-Dawley (Rattus norvegicus) s težo 250–300 g so bili pridobljeni iz Taconic Laboratories (Germantown, NY). Živali so bile individualno nastanjene s hrano in vodo, ki so bile na voljo ad libitum v njihovi domači kletki. Vsi eksperimentalni protokoli so bili v skladu s smernicami, ki jih je izdal ameriški Nacionalni inštitut za zdravje, odobrila pa jih je Medicinska šola Perelman na Univerzi v Pensilvaniji in Odbor za institucionalno oskrbo in uporabo živali Univerze v Pensilvaniji.
Surgery
Pred operacijo so podgane anestezirali z 80 mg / kg ketamina in 12 mg / kg ksilazina (ip; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). V desno jugularno veno smo vstavili notranji silastni kateter (notranji premer 0.33 mm, zunanji premer 0.64 mm) in ga namestili na mesto. Kateter je bil nato subkutano prenesen preko lopatice in preusmerjen na mrežasto platformo (CamCath, Cambridge, UK), ki je bila šivana pod kožo neposredno nad lopatico. Katetre smo dnevno splaknili z 0.3 ml antibiotika Timentin (ticarcilin dinatrijev / kalijev klavulanat, 0.93 mg / ml; Henry Schein, Melville, NY), raztopljenega v heparinizirani fiziološki raztopini (10 U / ml). Katetri so bili zaprti s plastičnimi obturatorji, ko niso bili v uporabi.
Samoupravljanje kokaina
Podganam je bilo dovoljeno 7 dni, da si opomorejo po operaciji, preden se je začela kokainska samouprava. Podgane so bile naključno razporejene v eno od dveh skupin: živalim, ki so se samodejno aplicirali s kokainom, in kontrolnimi kontrolami soljene soli. Vsaka podgana, ki je bila usposobljena za odzivanje na kontingentne kokainske infuzije, je bila seznanjena s podvrženim subjektom, ki je dobil enako število in časovni vzorec infuzij, kot jih je sam dajal parni kokain-poskusni podgana. Ročni stisk za podgane s solno raztopino ni imel načrtovanih posledic.
Najprej so podgane s kokainskim poskusom namestili v modularne operantne komore (Med Associates, St. Albans, VT) in jim dovolili, da pritisnejo za intravenske infuzije kokaina (0.25 mg kokain / 59 µl slanica, infuzija preko 5 s) na fiksni razmerje 1 (FR1). Ko je kokain-poskusni podgana dosegel vsaj infuzijo kokaina 20 v eni sami operantni seji po urniku FR1, je bila zahteva po odzivu zamenjana z urnikom armature FR5. Za odzivanje na oba časovna obdobja s fiksnim razmerjem je bilo največje število infuzij kokaina omejeno na 30 na dnevni odmerek samoiniciacije, časovno obdobje 20 pa je sledilo vsaki infuziji kokaina, v tem času pa so tabelirani odzivi aktivnega vzvoda, vendar niso imeli načrtovanih posledic . Dnevne 2 h operantne seje (7 dni / teden) so bile izvedene za skupno število dni 14. Odgovori na neaktivni ročici, ki niso imeli načrtovanih posledic, so bili zabeleženi tudi v treningih FR1 in FR5.
Po 14th dnevno operantno sejo, kontrolne podgane s kokainom in eksperimentalno potiskano slanico smo vrnili v svoje domače kletke, kjer so preživeli 7 dni prisilne abstinence. Na 7th dan abstinence kokaina, so bili odstranjeni možgani in PFC je bil razrezan na ledu. Sedem dni abstinence kokaina je bilo izbranih, da bi pritegnili neposredne primerjave z našo predhodno objavljeno študijo, ki je proučevala spremembe v PFC BDNF, ki jih povzroča kokain. [20].
Perfuzija
Podgane anesteziramo (100 mg / kg, ip natrijev pentobarbital) in perfundiramo z ledeno hladnim 4% paraformaldehidom v 0.1 M PB, pH 7.4 (PFA). Ena hemisfera iz vseh možganov je bila uporabljena za golgi barvanje in druga hemisfera za matrično tomografijo. Polovice matriksov so bile fiksirane v 4% PFA z 2.5% saharozo za 2 ur in Golgi poloble so bile fiksirane za 48 h v 4% PFA.
Array Tomografija
Array tomografski poskusi so bili izvedeni, kot je opisano prej [19], [21]. Na kratko, PFA fiksno tkivo je bilo vstavljeno v smolo in koronalne (70 nm) sekcije na ravni mPFC, ki so bile razrezane in zbrane kot trak. Trakovi so bili hidrirani v 50 mM glicinu v Tris in blokirani v blokirni raztopini (0.05% Tween / 0.1% goveji serumski albumin v Tris pufru (50 mM Tris / 150 mM NaCl, pH 7.6). Chemicon), PSD65 (celična signalizacija) ali synaptophysin (Abcam), v blokirni raztopini preko noči pri 95 ° C. Trakovi so bili oprani s Tris pufrom in obarvani s sekundarnimi protitelesi na 450 v blokirni raztopini (kozja anti-mišična Alexa-moka 488 in kozji anti-kunčji cy3 ali oslovski anti-kunčji cy5). Trakovi so bili obarvani z DAPI, da bi olajšali iskanje istih mest na vsakem odseku. Podobe skeniranja ploščic smo zbrali z epifluorescenčnim mikroskopom Zeiss AxioImager Z2. Slike iz istega mesta na vsakem serijskem razdelku 20 – 30 na trak so bile pridobljene pri 63x z avtomatiziranimi programi, specializiranimi za matrično tomografijo.
Analiza matrične tomografije
Serijske slike vsakega traku so bile zaporedno odprte, pretvorjene v sklad in poravnane z vtičniki MultiStackReg in StackReg (zahvaljujoč B. Busseju na Univerzi Stanford in [21], [22]. Polja za pridelavo (19.5 µmx19.5 µm) so bila uporabljena za izbiranje interesnih območij (ROI) v nevropilu za kvantifikacijo. Izbira je morala izključiti nevronska celična telesa ali druge motne lastnosti. Za avtomatizirano analizo slike so bile zanimive posevke (ali ROI) za sinaptofizin, dekarboksilazo glutaminske kisline-65 (GAD65) in PSD95 avtomatizirane algoritme v ImageJ. Pridelki so bili kodirani in analiza je bila slepa za stanje. Uporabljen je bil samodejni program za odkrivanje praga, ki temelji na mejnih vrednostih, za količinsko opredelitev števila točk, ki so bile identificirane kot pozitivne sinapse. [23]. Gostote presinaptičnih terminalov, ekscitatornih postsinaptičnih terminalov in odstotka GAD-pozitivnih (inhibitornih) sinaps so izračunali iz povprečja vzorčnih mest 75 na žival, zbranih iz dveh različnih tkivnih blokov iz PFC (n).=Živali, zdravljene s kokainom 5, ki so bile zdravljene s fiziološko raztopino zdravila 5), za skupino 29,154 postsinaptične punkta in 53,565 presinaptično punkto iz mest vzorčenja 818 na živalih, zdravljenih s slano zdravilom 5, ter na presinaptičnih punktah 29,662 in 17,034. Izračunane so bile mediane za sinapso gostoto in odstotek inhibitornih sinaps na žival in t-testi tečejo z uporabo mediane živali, da se preveri, ali obstaja razlika med skupinskimi sredstvi.
Metoda Rapid-Golgi
Barvanje z enim delom Golgija je bilo izvedeno, kot je opisano prej [24], [25]. Na kratko, mPFC iz ene hemisfere vsake živali smo razrezali v koronalne sekcije 100 um in po fiksiranju v 1% osmijevem tetraoksidu, sledili pa so ji trije izpirki v 0.1 M PB, pH 7.4. Ostanke inkubiramo v 3.5% kalijevem dikromatu čez noč, na kratko speremo in infiltriramo z 1.5% srebrovim nitratom po sendvič metodi. [25]. Sekcije so bile nameščene na stekelce, prevlečene z želatino, z saharozo 20% in dehidrirane skozi vrsto koncentracij alkohola, ki mu je sledilo odvajanje maščobe v ksilenu in prekrivanje.
Golgijeva analiza
Golgijevi diapozitivi so bili kodirani in analizirani slepi za stanje in vsi so jih analizirali isti eksperimentator. Nevronske slike in sledi ter reprezentativne slike dendritičnih trnov so bili zbrani z uporabo pokončnega mikroskopa BX51 Olympus z integriranim motoriziranim odrom (Prior Scientific, Rockland, MA) z 20 × 0.7 NA ciljem. Za analizo dendritične vejice so bili za analizo na žival izbrani nevroni 7. Z makroi NeuronJ in Advanced Sholl Analysis smo merili neuritsko dolžino in kompleksnost. Izmerili smo število presečišč (točk vej) v koncentričnih krogih v polmerih med 5 – 250 µm (vključno z bazalnimi in apikalnimi dendriti) in jih primerjali med skupinami. Za analizo gostote hrbtenice so bili segmenti 4 – 5 z dolžino vsaj 20 µm dolžine od bazalnih dendritov tretjega reda analizirani na nevron iz nevronov 5 – 7 na žival z epifluorescenčnim mikroskopom Zeiss AxioImager Z2 z objektivom 63x olje. Morfologija hrbtenice je bila razvrščena, kot je opisano prej [26]. Linearna gostota hrbtenice za vsak dendritični segment in morfologijo hrbtenice (tanko, debelo, gobasto, v obliki skodelice) vsake hrbtenice smo primerjali med skupinami. Odprtokodna programska oprema National Institutes of Health (ImageJ) je bila uporabljena za analizo podatkov Golgi in podatkovne tomografije.
Rezultati
Abstinenca zaradi kokaina zmanjša skupno gostoto sinapse
Array tomografija je bila uporabljena za merjenje sprememb v vzbujevalnih in inhibitornih sinapsah, da bi določili specifične morfološke spremembe, ki se pojavijo v PFC kot odziv na abstinenco pri samoupravljanju s kokainom. Array tomografija je visoko zmogljiva metoda, ki omogoča natančno kvantifikacijo celotnih, inhibitornih in ekscitacijskih sinaps v strukturah, ki so premajhne, da bi jih lahko pravilno identificirali ali lokalizirali s tradicionalnimi konfokalnimi mikroskopskimi metodami. [19]. Kot zaviralni in ekscitatorni sinapsi sta bistveni sestavini vezja za nagrado za zdravila [13], [27], [28] uporabili smo to novo metodologijo za oceno morfoloških sprememb v PFC med abstinenco zaradi kokaina. Sedemdeset nm delcev PFC iz ene možganske poloble podganjih podgan z 5-ovimi solmi in 5, ki so imeli kokain, so obarvali s protitelesi proti PSD95, postsinaptičnim ekscitatornim markerjem, sinaptofizinom, presinaptičnim markerjem in GAD65, ki so označevali inhibitorne nevrone in sinapse. Gostota sinapse in odstotek inhibitornih sinaps je bila določena v kortikalni plasti V (Slika 1A in 1B). Naši rezultati kažejo, da se je med abstinenco zaradi kokaina pojavila znatno zmanjšanje gostote sinaptofizina (Slika 1C), ki meri vse presinaptične terminale [t (7)]=2, p <0.05]. Gostote ekscitacijskih sinaps ni prišlo do pomembnega zmanjšanja [t (8)=0.48, str=0.32], izmerjeno s štetjem PSD95 puncta (Slika 1D). Zanimivo je, da ni bilo pomembnega trenda do povečanja odstotka zaviralnih sinaps, pozitivnih na GAD65 [t (8)].=-1.39, str=0.9] (Slika 2E).
Abstinenca zaradi kokaina zmanjšuje dendritično razvejanost, medtem ko prehodno povečuje gostoto hrbtenice v PFC
Golgijeva metoda je bila uporabljena za preučevanje sprememb v veji nevronov in gostote dendritičnih hrbtenic, da bi potrdili ultrastrukturne spremembe, opažene v gostoti sinapse (Slika 1). Opravili smo enojno hitro impregnacijo Golgija na podskupini nevronov v PFC iz drugih hemisfer istih živali, ki smo jih uporabili za matematične tomografske študije. Ocenjeni so bili dendritični razcep, štetje dendritične hrbtenice in morfologija hrbtenice. Dva reprezentativna piramidna nevrona iz PFC-ja kontrolne skupine s kokainom in s kokainom podgane sta prikazana v Slika 2A. Šolska ploskev je izmerila število sečišč (točk vej) v koncentričnih krogih v polmerih med 5 – 250 µm. Naši rezultati kažejo, da se je po 7 dneh prisilne abstinence zaradi samo-dajanja kokaina znatno zmanjšala dendritična kompleksnost (Slika 2B). Analiza ANOVA dvosmernih ponavljajočih se meritev podatkov o šolski ploskvi je pokazala pomembne glavne učinke zdravljenja(1,738)=30.59, p <0.0001] in polmer [F(245, 738)=289.6, p <0.0001] (Slika 2B), ki potrjuje izgubo dendritov, ki se strinjajo z izgubo sinapse, izmerjenih v matričnih študijah (Slika 1C). Analiza bazilarnih dendritov drugega in tretjega reda je pokazala znatno povečanje dendritičnih bodic po 7 dneh abstinence kokaina [t (6)]=-3.12, p <0.05] (Slika 2D). Natančneje, abstinenca zaradi izpostavljenosti kokainu je povečala število tankih podtipov hrbtenice, ne da bi pomembno vplivala na druge podvrste hrbtenice (Slika 2E), kar se je pokazalo z dvosmernimi ponovljenimi merami ANOVA z glavnimi učinki zdravljenja [F(1,30)=11.9, str=0.0017], podtip hrbtenice [F(4,30)=57.7, p <0.0001], in pomembno interakcijo x interakcija podtipa hrbtenice [F(1, 4, 30)=8.8, p <0.0001].
Razprava
V tej študiji smo pokazali, da so izrazito strukturne in sinaptične spremembe v sloju V PFC po 7 dneh prisilne abstinence zaradi samo-dajanja kokaina. Natančneje, pomembno je zmanjšanje dendritične razvejenosti piramidnih nevronov in splošna izguba gostote sinapse, kot je bila izmerjena z zmanjšano gostoto celotnih presinaptičnih boutonov, označenih s sinaptofizinom. Kljub izgubi presinaptične gostote so se bazalni dendriti piramidnih nevronov sloja V povečali z dendritično gostoto hrbtenice, zlasti tanke, plastične bodice. Ker nismo zaznali pomembnih sprememb v gostoti PSD95, lahko predvidevamo, da je zmanjšanje presinaptičnih terminalov, vendar povečanje gostote hrbtenice lahko posledica povečanja števila multi-sinaptičnih boutonov. Poleg tega je treba omeniti, da smo opazili trend povečanja zaviralnih sinaps v PFC. Ker so v plastičnost vpletene tanke bodice [29], povečanje teh spines bi lahko predstavljalo kompenzacijsko plastičnost za vzdrževanje sinaptičnih vnosov na teh denerviranih nevronih, ki so izgubili dendritične veje.
Prejšnje študije so pokazale, da kokain poveča dendritično arborizacijo in gostoto hrbtenice v NAc [2]-[4]. Nedavno sta Dumitriu et al., 2012 [30] pokazala, da kokain dinamično spreminja proksimalne bodice v jedru in lupini NAc. Natančneje, v lupini je umik iz kokaina povečal tanke bodice, medtem ko se je zmanjšala gostota glave hrbtenice v lupini NAc. [30]. V nasprotju s študijami NAc obstaja le nekaj študij, ki so preučevale učinke kokaina na nevronsko morfologijo v PFC [6], [31]. Naši podatki so skladni z nedavno raziskavo, ki dokazuje, da kokain povzroča povečanje gostote hrbtenice v PFC [31]. Mišice, ki so imele večje povečanje obstojnih in stabilnih hrbtenic, tj. Hrbtenice, predstavljajo 3 dni po odvzemu, na apikalnih dendritih so pokazali višje rezultate, ki so bili pogojeni s kokainom, in kokainsko povzročeno hiperaktivnost. [31]. Prejšnja študija na podganah PFC plasti II-III nevronov je poročala o vrednostih približno 3 bodic na µm dendrita na apikalnem in bazalnem dendritu, presenetljivo gosto raven bodic, ki jo je mogoče spremeniti s stresom [32]. Naše vrednosti pri kontrolnih podganah UM2 spines / 10 µm dendritičnih segmentov so nižje, kar je lahko posledica različnih analiziranih nevronskih populacij (bazalni dendriti iz plasti V) ali razlike v slikovni tehniki. V tej študiji smo uporabili metodo hitrega Golgija za posamično sekcijo, medtem ko so Jonotophoretic injekcije Luciferjevega rumenega barve skupaj s konfokalnim slikanjem uporabljali Radley in njegovi sodelavci. [32] za vizualizacijo nevronske in dendritične morfologije. Naše ugotovitve prav tako poudarjajo pomen trajanja abstinence pred samo-dajo kokaina, ki vodi do strukturnih sprememb v možganih. Predhodno objavljeno poročilo je pokazalo povečanje dendritične arborizacije po dolgotrajnem (24 – 25 dni) odtegnitvi kokaina pri ženskah podgan. [6]v nasprotju z našim zmanjšanjem po 7 dneh prisilne abstinence pri samcih podgan. Kljub tem metodološkim razlikam in razlikam v podatkih o razvejanosti so v obeh študijah opazili povečano število hrbtenic, kar potrjuje obsežno reorganizacijo vezij med kokainsko abstinenco. Prihodnje študije bodo razjasnile časovni potek teh dogodkov, da bi ugotovili, ali so te strukturne spremembe prehodne ali dolgotrajne.
Naše ugotovitve kažejo, da prisilna abstinenca zaradi samo-dajanja kokaina povzroča dinamične strukturne spremembe in povzroča sinaptično reorganizacijo v PFC. Ti rezultati lahko pojasnijo hipo aktivnost v PFC, ki se pojavi zaradi ponavljajoče se izpostavljenosti kokainu [8], [33]. Poleg tega naše ugotovitve podpirajo prejšnje študije, ki prikazujejo deaktivacijo PFC [7], [8]in povečano zunajcelično GABA v medialnem PFC med odvzemom kokaina [34]. Tako so mehanizmi, ki upoštevajo PFC hipo aktivnost po kronični izpostavljenosti kokainu [8], [10] lahko vključuje (1) povečanje GABAergičnega (2) zmanjšanja glutamatergičnega in / ali (3) zmanjšanja dopaminergičnega sinaptičnega vnosa v PFC. Ta študija dokazuje, da abstinenca zaradi kokaina bistveno zmanjša splošno gostoto sinapse, kar kaže zmanjšanje števila sinaptičnih punktov, pozitivnih na sinaptofizin. Ti podatki kažejo na zmanjšanje post-sinaptične odzivnosti v PFC, ki je lahko posredovana z zmanjšanim vnosom glutamata ali dopamina. Dejansko obstajajo študije, ki kažejo, da kokain povzroča zmanjšanje glutamatergičnega tona [35], [36]. Vendar smo z uporabo Golgijeve metode opazili povečanje števila tankih dendritičnih bodic na bazalnih dendritih piramidnih nevronov, kar kaže na povečanje ekscitatornega vnosa v PFC na preostale nevrite. Ti navidezno nasprotujoči si podatki lahko odražajo splošno izgubo sinaps, ki je povezana z veliko izgubo dendritov, ki jih opazimo s kompenzacijskim odgovorom, ki je morda posredovan s povečanim BDNF, kot je prikazano v naših prejšnjih ugotovitvah. [20], za povečanje gostote dendritičnih bodic na preostalih nevritih.
Naše ugotovitve skupaj kažejo dinamično reorganizacijo v PFC med abstinenco kokaina. Natančneje, pomembno je zmanjšanje sinaptične povezanosti, izguba dendritičnih razvejanosti in povečanje števila tankih hrbtenic v podganah PFC po 7 dneh prisilne apstinence zaradi kokainske samouprave. Ti rezultati lahko zagotovijo strukturno osnovo za opaženo hipo aktivnost, ki jo opazimo pri PFC pri kroničnih uživalcih kokaina, in morda pojasnjujejo izgubo kognitivnega nadzora, ki se pojavi med odvisnostjo od kokaina.
Priznanja
Avtorji se želijo zahvaliti Gavinu Sangreyju za pomoč pri pripravi vdelanih kapsul.
Izjava o financiranju
To delo so podprli dotacije NIDA DA22339 in DA033641 (RCP & GSV) in DA18678 (RCP). HDS je podprla posamezna nagrada K01 (DA030445). Finančniki niso imeli nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranju in analizi podatkov, odločitvi o objavi ali pripravi rokopisa.
Reference