Induksioni DeltaFosB në korteksin orbitofrontal fuqizon ndjeshmërinë e locomotor pavarësisht zbutjes së mosfunksionimit njohës të shkaktuar nga kokaina. (2009)

2. metodat

Të gjitha eksperimentet janë kryer në përputhje të plotë me Udhëzuesin për Kujdesin dhe Përdorimin e Kafshëve Laboratorike të NIH dhe janë miratuar nga Komiteti Institucional i Kujdesit dhe Përdorimit të Kafshëve në UT Southwestern.

2.5. Kuantifikimi i ARNi

Rats mori injeksione intra-OFC të AAV-GFP ose AAV-ΔFosB, e ndjekur nga injeksione 21 dy herë në ditë të kripës ose kokainës, saktësisht siç përshkruhet për eksperimentet e sjelljes. Kafshët janë përdorur 24 h pas injektimit të fundit të kripës ose kokainës. Rats u vranë nga decapitation. Truri u nxorrën me shpejtësi dhe u arritën dy dhëmbëzime 1 mm të trasha 12 të NAc dhe menjëherë të ngrira dhe ruheshin në -80 ° C deri në izolimin e ARN. Grushta nga OFC u hoqën gjithashtu për analizë nga microarray e ADN-së që konfirmoi transferimin e suksesshëm të gjeneve të ndërmjetësuara me virale në këtë rajon (shih (Winstanley et al., 2007) për rezultate më të hollësishme). ARN u nxjerrë nga mostrat NAc duke përdorur reagentin RNA Stat-60 (Teltest, Houston, TX) sipas udhëzimeve të prodhuesit. Kontaminimi i ADN-së është hequr me trajtimin e DNase (ADN-Free, katalogun # 1906, Ambion, Austin TX). ARN i pastruar u transkriptoi në mënyrë të kundërt në cDNA (Superstrip First Strand Synthesis, Katalogu # 12371-019; Invitrogen). Transkriptet për gjenet e interesit u quantifikuan duke përdorur qPCR në kohë reale (SYBR Green, Applied Biosystems, Foster City, CA) në një Stratagene (La Jolla, CA) Mx5000p 96-well thermocycler. Të gjitha abetaret u sintetizuan me porosi nga Operon (Huntsville, AL, shih Tabela 1 për sekuenca) dhe të validuara për linearitet dhe specifikë para eksperimenteve. Të gjitha të dhënat e PCR u normalizuan në nivele gliceraldehidi-3-fosfat dehidrogjenazë (GAPDH), i cili nuk u ndryshua nga trajtimi i kokainës, sipas formulës së mëposhtme: ΔC_t =C_t(gjen i interesit) - C_t (GAPDH). Nivelet e rregulluara të shprehjes për të dy rats AAV-ΔFosB dhe AAV-GFP të cilat kanë marrë kokainë, dhe rats AAV-ΔFosB që kanë marrë kripë kronike, u llogaritën më pas në krahasim me kontrollet (grupi AAV-GFP i dhënë kripë kronike) si vijon: ΔΔC_t = ΔC_t - ΔC_t (grup kontrolli). Në përputhje me praktikën e rekomanduar në terren (Livak dhe Schmittgen, 2001), nivelet e shprehjes në lidhje me kontrollet u llogaritën pastaj duke përdorur shprehjen e mëposhtme: 2^-ΔΔCt.

  

Tabela 1

Sekuenca e primereve të përdorur për të përcaktuar sasitë e cDNA nëpërmjet PCR në kohë reale.

3. rezultatet

Eksperto 1

Administrimi kronik i kokainës prodhon sensibilizimin ndaj efekteve hyperlocomotor të kokainës akute e cila është imituar nga ΔFosB

Siç pritej, sensibilizimi i fortë i lokomotoreve u vërejt në kafshët e kontrollit pas ekspozimit kronik të kokainës, me kafshët e trajtuara kronikisht me kokainë duke treguar hiperaktivitet në rritje në përgjigje të sfidës akute të kokainës (Fig. 1A, trajtim kronik: F_1,34 = 4.325, p<0.045). Kafshët mbi-shprehin ΔJunD, një mutant negativ dominant i JunD që vepron si një antagonist ΔFosB (Zachariou et al., 2006), në OFC ishin të padallueshme nga kafshët e kontrollit (Fig. 1C, GFP vs ΔJunD, grupi: F_{1, 56} = 1.509, NS). Megjithatë, kafshët mbi-shprehur ΔFosB në OFC të cilat kishin marrë injeksione të përsëritura të kripës u shfaqën "të para-sensibilizuara": ato treguan një përgjigje të zgjatur lokomotore ndaj kokainës akute e cila ishte e padallueshme nga reagimi i sensibilizuar i homologëve të tyre të trajtuar me kokainë kronikeFig. 1B, GFP vs kirurgji ΔFosB × trajtim kronik: F_{1, 56} = 3.926, p<0.052; Vetëm ΔFosB: trajtim kronik: F_1,22 = 0.664, NS). Kafshët ΔFosB ishin paksa hiperaktive brenda minorit 15 e parë të vendosjes në kutitë lokomotore (GFP vs ΔFosB, operacioni: F_1,56 = 4.229, p <0.04), por nivelet e aktivitetit lëvizës ishin të krahasueshme me kontrollet në 15 min para administrimit të kokainës (operacioni: F_{1, 56} = 0.138, NS).

  

Fig 1

Sensibilizimi i lokomotoreve ndaj kokainës. Kokaina akute prodhoi rritje më të madhe në aktivitetin lokomotor në kafshët e kontrollit të trajtuara kronikisht me kokainë kundrejt kripës (paneli A). Në kafshët mbi-shprehur ΔFosB (paneli B), ato që kanë dhënë kripëra të përsëritura (me shume…)

Duke marrë parasysh se, kur jepet kokainë gjatë 5CSRT, të njëjtat kafshë treguan një aftësi relativisht të zgjeruara për të mos mbajtur përgjigje motorike të parakohshme, kjo hiperaktivitet shfaqet specifik për lokomotivën ambulatore, pra lloji i lëvizjes i cili regjistrohet tipikisht në studimet e sensibilizimit të lokomotoreve. Megjithëse aktiviteti i shtuar në përgjigje të barnave stimuluese mund të reflektojë një profil anxiogjenik, shprehja intra-OFC e ΔFosB nuk rrit ankthin e matur duke përdorur labirintin e ngritur ose testin e hapur (të dhënat nuk tregohen). Kafshët ishin gjithashtu të përshtatshme për injeksione IP, dhe injeksione kripur nuk ndryshuan performancën e tyre kognitive (Winstanley et al., 2007), prandaj ky efekt motorik nuk mund t'i atribuohet një përgjigjeje të përgjithshme për një injeksion IP. Në përfundim, këto rezultate tregojnë se induksioni i ΔFosB në OFC është i mjaftueshëm (por jo i domosdoshëm) për lokomotorin e sensibilizuar që i përgjigjet kokainës, edhe pse ΔFosB në të njëjtin rajon shkakton tolerancë ndaj efekteve të kokainës mbi motivimin dhe impulsivitetin (Winstanley et al., 2007).

3.1. ΔFosB / FosB

Nivelet e ARNi FOSB në NAc nuk u ndryshuan nga trajtimi kronik i drogës (Fig. 2A, droga: F_1,14 = 1.179, ns) ose shprehja e ΔFosB në OFC (operacioni: F_{1, 14} = 0.235, ns). Megjithatë, nivelet e ΔFosB ishin dukshëm më të larta në kafshët e trajtuara kronikisht me kokainë në përputhje me raportet e mëparshme (Chen et al., 1997); Fig. 2B, droga: F_1,14 = 7.140, p<0.022). Interesante, sasia e ΔFosB mARN në NAc të kafshëve të kripura të trajtuara ishte më e ulët në ato në të cilat ky faktor i transkriptimit ishte shprehur tepër në OFC (ilaç: F_1,14 = 9.362, p<0.011). Sidoqoftë, mungesa e një ndërveprimi të operacionit të ilaçeve × tregon që trajtimi kronik i kokainës po kishte të njëjtin efekt në të dy grupet e trajtuara me AAV-GFP dhe AAV-ΔFosB, duke rritur në mënyrë proporcionale nivelet ΔFosB në një masë të ngjashme (kirurgjia e ilaçeve: F_{1, 14} = 0.302, ns).

  

Fig 2

Ndryshimet në ARNi brenda NAc të kafshëve mbi-shprehur ose GFP ose ΔFosB në OFC, dhe trajtohen kronikisht me ose kripur ose kokainë. Të dhënat tregojnë ndryshimet lineare dele në shprehje si një proporcion i vlerave të kontrollit. Të dhënat e paraqitura janë (me shume…)

4. diskutim

Këtu tregojmë se mbi-shprehja e ΔFosB në minjtë sensibilizues të OFC ndaj veprimeve nxitëse lokomotore të kokainës, duke imituar veprimet e administrimit kronik të kokainës. Ne kemi treguar më parë se performanca e këtyre kafshëve të njëjta në 5CSRT dhe paradigma vonuese-zbritëse është më pak e prekur nga kokaina akute dhe se një efekt i ngjashëm me tolerancën është vërejtur pas ekspozimit të përsëritur të kokainës. Kështu, sensibilizimi dhe toleranca ndaj veprimeve të ndryshme të kokainës mund të vërehen në të njëjtat kafshë, me të dy përshtatjet e ndërmjetësuar nëpërmjet molekulës së njëjtë, ΔFosB, që vepron në të njëjtin rajon të trurit. Fakti që të dyja fenomenet mund të nxiten njëkohësisht duke imituar një nga veprimet e kokainës në një vend të vetëm frontokortik thekson rëndësinë e rajoneve kortikale në pasojat e marrjes kronike të drogës. Për më tepër, këto të dhëna sugjerojnë se toleranca dhe ndjeshmëria pasqyrojnë dy aspekte të dukshme të kundërta, por ende të lidhura ngushtë me përgjigjen ndaj drogave problematike.

Duke pasur parasysh se rritja e shprehjes ΔFosB në NAc është e përfshirë në mënyrë kritike në zhvillimin e sensibilizimit të lokomotoreve, një hipotezë e besueshme do të kishte qenë që tejpërcaktimi i ΔFosB në OFC para-sensibilizon kafshët në kokainë duke rritur nivelet e ΔFosB në NAc. Sidoqoftë, u gjetën rezultati i kundërt: nivelet e ΔFosB në NAc ishin dukshëm më të ulëta në kafshët e mbi-shprehur ΔFosB në OFC. Pasojat e sjelljes së kësaj rënieje të NAc ΔFosB janë të vështira për t'u interpretuar, pasi që pengimi i veprimeve të ΔFosB përmes tej-shprehjes së ΔJunD në këtë rajon redukton shumë nga efektet e kokainës në minj (Peakman et al., 2003). Ekzistojnë paralele të caktuara midis këtyre vëzhgimeve dhe atyre të bëra në lidhje me sistemin e dopaminës. Për shembull, sosje e pjesshme dopamine në NAc mund të çojë në hiperaktivitet ashtu si mund të aplikojë direkt agonistët e dopaminës në këtë rajon (Bachtell et al., 2005; Costall et al., 1984; Parkinson et al., 2002; Winstanley et al., 2005b). Gjithashtu, fakti që rritja e niveleve kortizale të ΔFosB mund të zvogëlojë shprehjen subkortike, i ngjan gjetjes së konstatuar se një rritje në transmetimin prefrontal dopaminergjik shoqërohet shpesh me një rënie reciproke në nivelet e dopaminës striatale (Deutch et al., 1990; Mitchell dhe Gratton, 1992). Si një mekanizëm i tillë i reagimit mund të funksionojë për molekulat sinjalizuese intra-qelizore është momentalisht i paqartë, por mund të pasqyrojë ndryshimet në aktivitetin e përgjithshëm të disa rrjeteve nervore të shkaktuara nga një ndryshim në transkriptimin e gjeneve. Për shembull, rritja e ΔFosB në OFC çon në një ngritje të aktivitetit frenues lokal, siç dëshmohet nga një rritje në nivelet e GABA_A receptori, receptori mGluR5 dhe substanca P, siç zbulohet nga analiza me mikroarra (Winstanley et al., 2007). Ky ndryshim në aktivitetin e OFC mund të prekë aktivitetin në zona të tjera të trurit, gjë që mund të çojë në një ndryshim lokal në shprehjen e ΔFosB. Nëse nivelet e ΔFosB reflektojnë ndryshime relative në aktivitetin e dopaminës është një çështje që kërkon hetime të mëtejshme.

Të gjitha kafshët treguan një rritje të ndjeshme në nivelet e ARNi të ARM në NAc pas trajtimit kronik të kokainës, në përputhje me raportet e mëparshme të rritjes së niveleve të proteinave (Chen et al., 1997; Hope et al., 1992; Nye et al., 1995). Megjithatë, një raport i kohëve të fundit zbuloi se nivelet e ARN mRNA ΔFosB nuk ishin më në rritje të konsiderueshme të 24 h pas trajtimit kronik të amfetaminës, megjithëse rritjet e konsiderueshme u vunë re 3 h pas injektimit përfundimtar (Alibhai et al., 2007). Kjo mospërputhje mund të jetë për shkak të dallimit në drogën psikostimuluese të përdorur (kokaina kundrejt amfetaminës), por duke pasur parasysh gjysmën e jetës së kokainës, do të ishte e arsyeshme të pritej që efektet e saj mbi shprehjen e gjeneve të normalizoheshin më shpejt se ato të amfetaminës, dhe jo anasjelltas. Një arsye më e besueshme për këto rezultate të ndryshme është se kafshët në studimin aktual janë injektuar me një dozë të moderuar të drogës dy herë në ditë për ditët 21 në krahasim me një injeksion të vetëm të dozës së lartë për ditët 7 (Alibhai et al., 2007). Regjimi më i zgjeruar i trajtimit mund të kishte rezultuar në ndryshimet më të theksuara të vërejtura këtu.

Megjithëse ndryshimet në shprehjen e gjeneve të vërejtura në NAc pas kokainës kronike janë në përgjithësi pajtim me gjetjet e raportuara më parë, madhësia e efekteve është më e vogël në studimin aktual. Një arsye e mundshme për këtë është se kafshët u sakrifikuan vetëm nga 24 h pas injektimit të fundit të kokainës, ndërsa shumica e studimeve kanë përdorur indin e marrë dy javë që nga ekspozimi i fundit i drogës. Studimet që eksplorojnë rrjedhën kohore të sensibilizimit të lokomotorëve tregojnë se ndryshimet më të theksuara në sjelljen dhe në gjenet / shprehjet e proteinave janë vërejtur në këtë pikë më vonë. Edhe pse ne raportojmë një rritje të lehtë të ARNi për dopamin D₂ receptor në NAc, konsensusi i përgjithshëm është se nivelet e shprehjes së D₂ ose D₁ receptor nuk ndryshohen përgjithmonë pas zhvillimit të sensibilizimit të lokomotoreve, edhe pse rritet dhe zvogëlohet në D₂ numri i receptorit është raportuar pak pas përfundimit të regjimit të sensibilizimit (shih (Pierce dhe Kalivas, 1997) për diskutim). Vëzhgimi ynë që ARNi GluR1 dhe GluR2 ishin të pandryshuara pas trajtimit kronik të kokainës në këtë kohë të hershme është po ashtu në përputhje me një raport të mëparshëm (Fitzgerald et al., 1996), megjithëse një rritje e ARNi GluR1 është zbuluar në pikat e mëvonshme pas ndërprerjes së trajtimit kronik psikostimulues (Churchill et al., 1999).

Megjithatë, ne kemi vërejtur një rritje të vogël të ARNi PSD95 në NAc të kafshëve të trajtuara kronikisht me kokainë. PSD95 është një molekulë skela, dhe është një nga proteinat kryesore brenda dendësisë postinaptike të sinapave nxitëse. Ajo ankoron disa receptorë glutamate dhe proteinat sinjalizuese të lidhura me të në synaps, dhe një rritje në shprehjen PSD95 mendohet të pasqyrojë rritjen e aktivitetit sinaptik dhe rritjen e futjes dhe stabilizimit të receptorëve të glutamatit në synapse (van Zundert et al., 2004). Një rol për PSD95 në zhvillimin e sensibilizimit lokomotor është sugjeruar më parë (Yao et al., 2004).

Rritjet në shprehjen Arc janë gjithashtu të lidhura me rritjen e aktivitetit synaptik. Megjithatë, ndërsa një rritje në shprehjen Arc në NAc është vërejtur 50 min pas injektimit me amfetaminë (Klebaur et al., 2002), të dhënat tona tregojnë se administrimi kronik i kokainës nuk e rregullon Arc në NAc më përgjithmonë, megjithëse rritjet në Arc janë vërejtur 24 h pas dozimit kronik me ilaçe antidepresive (Larsen et al., 2007) dhe amfetaminës (Ujike et al., 2002). Një rritje në fosforilimin e CREB është vërejtur gjithashtu në NAc pas administrimit akute të kokainës dhe amfetaminës (Kano et al., 1995; Konradi et al., 1994; Vetë et al., 1998), por ndoshta nuk është e çuditshme që asnjë rritje në ARMR-CREB nuk është vërejtur pas administrimit kronik të kokainës. Sinjalizimi përmes rrugës CREB mendohet të jetë më i rëndësishëm në fazat fillestare të marrjes së medikamenteve, me faktorët e transkriptimit si ΔFosB që vijnë për të dominuar si progresi i varësisë (McClung dhe Nestler, 2003). Edhe pse CREB është përfshirë në efektet e dobishme të kokainës (Carlezon et al., 1998), nuk ka pasur raporte që rritja e ekspresionit të CREB ndikon në sensibilizimin e lokomotoreve, megjithëse rritjet e ndërmjetësuara nga virusi në antagonistin endogjen negativ dominues të CREB, proteina të shtypjes së hershme cAMP të induktueshme ose ICER, rrit hiperaktivitetin e shkaktuar nga një injektim akut i amfetaminësGreen et al., 2006).

Në përmbledhje, megjithëse shumica e ndryshimeve të nxitura nga droga që kemi vërejtur përputhen me parashikimet nga literatura, nuk kemi gjetur ndonjë ndryshim në shprehjen e gjeneve brenda NAc që mund të shpjegojë reagimin e lokomotoreve të sensibilizuar ndaj kokainës të vrojtuar në kafshët naivë të mjekuar me intra-OFC AAV-ΔFosB. Kjo ngre mundësinë që rritja e ΔFosB në OFC nuk mund të ndikojë në sensibilizimin e motorëve nëpërmjet NAc, megjithëse mund të përfshihen shumë gjene të tjera, që nuk janë studiuar këtu. Dëshmitë e konsiderueshme sugjerojnë se modulimi i korteksit paralëndror mesatar (mPFC) mund të ndryshojë aktivitetin striatal dhe në këtë mënyrë të kontribuojë në sensibilizimin e sjelljes ndaj psikostimulantëve (Steketee, 2003; Steketee dhe Walsh, 2005), edhe pse më pak është e njohur për rolin e rajoneve prefrontale më të vogla si OFC. NAc merr disa parashikime nga OFC (Berendse et al., 1992). Megjithatë, një studim më i fundit dhe i detajuar identifikoi shumë pak projeksione të drejtpërdrejta OFC-NAc: etiketimi i paktë i pjesës më anësore të shell NAc u vëzhgua pas injektimeve të gjurmuesit anterografik në zonat anësore dhe ventrolaterale të OFC dhe OFC më të barkut rajoni dërgon parashikime minimale për bërthamën e AKK-së (Schilman et al., 2008). Kauza qendrore-putamen merr innervation shumë të dendura. Në dritën e kësaj dëshmi anatomike, shumica e indeve NAc të analizuara në reaksionet tona të PCR nuk do të ishin incizuar direkt nga OFC, duke ulur shanset që çdo ndryshim në shprehjen e gjeneve do të zbulohej me sukses.

OFC projektohet shumë në rajonet të cilat vetë janë të lidhura fort me NAc, të tilla si mPFC, amygdala basolaterale (BLA), bërthamë caudate dhe bërthamë subthalamic (STN). Nëse ndryshimet në OFC mundë në mënyrë indirekte të rregullojnë funksionimin e AKK-së përmes ndikimit të saj në këto fusha është një pyetje e hapur. Është treguar se aktiviteti në BLA ndryshohet pas lezioneve të OFC dhe kjo kontribuon në mënyrë të konsiderueshme në deficitet e mësimit të kthimit të shkaktuar nga dëmtimet e OFC (Stalnaker et al., 2007), por çdo efekt brenda zonave të tilla si NAc ende nuk është raportuar. Mund të jetë më produktive të përqendrohet vëmendja në fusha të tjera më të forta të lidhura me OFC dhe të cilat gjithashtu janë shumë të implikuara në kontrollin motorik. STN është një objektiv veçanërisht premtues, pasi jo vetëm që lezionet e STN dhe OFC prodhojnë efekte të ngjashme në impulsivitetin dhe mësimin Pavlovian (Baunez dhe Robbins, 1997; Chudasama et al., 2003; Uslaner dhe Robinson, 2006; Winstanley et al., 2005a), por ndjeshmëria e locomotorit të nxitur nga psikostimulanti shoqërohet me një rritje në shprehjen c-Fos në këtë rajon (Uslaner et al., 2003). Eksperimentet e ardhshme të dizajnuara për të hetuar se si ndryshimet e nxitura nga droga në shprehjen e gjeneve brenda OFC ndikojnë në funksionimin e zonave në drejtim të rrymës si STN janë të garantuara. OFC gjithashtu dërgon një projekt të vogël në zonën tegmentale të barkut (Geisler et al., 2007), një rajon i njohur për t'u përfshirë në mënyrë kritike në zhvillimin e sensibilizimit të lokomotoreve. Është e mundur që mbi-shprehja e ΔFosB në OFC mund të ndikojë ndjeshëm në locomotor përmes kësaj rruge.

Natyra e saktë e marrëdhënies midis ndryshimeve të detyrueshme të drogës në funksionin kognitiv dhe sensibilizimit të locomotoreve është i paqartë dhe deri tani jemi fokusuar në OFC. Duke pasur parasysh këto rezultate, është e mundur që ndryshimet në shprehjen e gjeneve të shoqëruara me zhvillimin e ndjeshmërisë locomotore në rajonet e trurit mund të kenë ndonjë ndikim në reagimin kognitiv ndaj kokainës. Eksperimentet të cilat eksplorojnë bashkëveprimin midis zonave kortikale dhe nënkortike pas administrimit të drogave me varësi mund të hedhin dritë të re mbi atë se si gjenerohet dhe mirëmbahet shteti i varur dhe rolet interaktive të sensibilizimit dhe tolerancës në këtë proces.

Referencat