(HUMAN) Përgjigjet sjellëse dhe strukturore ndaj kokainës kronike Kërkojnë një loop të avancuar që përfshin ΔFosB dhe kalcium / Calmodulin-Dependent Protein Kinase II në Nucleus Accumbens Shell (2013)

Faktori i transkriptimit ΔFosB dhe proteinuria kinazë II e varur nga truri (kalcium / calmodulin) (CaMKIIα) nxiten në nucleus accumbens (NAc) nga ekspozimi kronik i kokainës ose i drogave të tjera psikostimuluese të abuzimit, në të cilat dy proteina ndërmjetësojnë reagimet e ndjeshme ndaj drogës . Megjithëse ΔFosB dhe CaMKIIα rregullojnë shprehjen e AMPA receptorit glutamate dhe funksionojnë në NAc, formimi i shtyllës së dendritit në neuronet e mesme (NAs) dhe sensitizimi lokomotor ndaj kokainës, asnjë lidhje direkte midis këtyre molekulave deri më tani nuk është hulumtuar. Këtu, ne demonstrojmë se ΔFosB është fosforiluar nga CaMKIIα në Ser27 që stabilizon proteinat dhe se CaMKII është e nevojshme për akumulimin e ΔFosB të ndërmjetësuar nga kokaina në NAc të miellit.

Në anën tjetër, ne tregojmë se ΔFosB është edhe e nevojshme dhe e mjaftueshme për induksionin e kokainës të shprehjes së gjeneve të CaMKIIα in vivo, një efekt selektiv për D₁-type MSN në nënregionin e shell NAc.

Për më tepër, induksioni i spines dendritic në MSNs NAc dhe rritjen e përgjegjshmërisë ndaj sjelljes ndaj kokainës pas overexpression NAc të ΔFosB janë të dy varur nga CaMKII.

E rëndësishmja, ne demonstrojmë për herë të parë induksionin e ΔFosB dhe CaMKII në NAc të të varur nga kokaina njerëzore, duke sugjeruar synime të mundshme për ndërhyrje terapeutike të ardhshme. Këto të dhëna përcaktojnë se ΔFosB dhe CaMKII angazhohen në një lak pozitiv pozitiv të veçantë të tipit qelizor dhe të trurit si një mekanizëm kyç për rregullimin e qarkut të shpërblimit të trurit në përgjigje të kokainës kronike.

Prezantimi

Rritja e dëshmive mbështet pikëpamjen se ndryshimet në shprehjen e gjeneve kontribuojnë në mekanizmat e varësisë nga droga (Robison dhe Nestler, 2011). Një ndërmjetës i rëndësishëm i këtyre ndryshimeve është ΔFosB, një faktor i transkriptimit të familjes Fos (Nestler, 2008). Administrimi kronik i pothuajse çdo droge të abuzimit shkakton akumulimin afatgjatë të ΔFosB në nucleus accumbens (NAc), një rajon limbic thelbësor për sjelljet shpërblim. Sinduksioni uch shfaqet specifik për klasën e neuronit të mesëm (MSN) që shfaq shprehjen dopamin receptorët D1. Zmadhimi i Inducible i ΔFosB në këto Dsnumx-lloj NAc MSNs rrit lokomotor dhe përgjigjet e dobishme për kokainë dhe morfinë (Kelz et al., 1999; Zachariou et al., 2006), duke përfshirë rritjen e vetë-administrimit të kokainës (Colby et al., 2003). Për më tepër, bllokada gjenetike ose virale e aktivitetit transkripcional të ΔFosB redukton efektet e dobishme të këtyre barnave (Zachariou et al., 2006), duke treguar se ky induksion i qëndrueshëm i ΔFosB është një ndërmjetës kritik i ndryshimeve të qëndrueshme të shkaktuara në NAc nga administrimi kronik i drogës.

Stabiliteti i pazakontë i ΔFosB (në krahasim me të gjitha proteinat e tjera të familjes Fos) është si një pronë e brendshme e molekulës, për shkak të prerjes së degoneve të pranishme në FosB (Carle et al., 2007) dhe një proces të rregulluar. ΔFosB është fosforiluar vitro in vivo në Ser27, dhe ky reagim stabilizon më tej ΔFosB, ~ 10-fish, në kulturën qelizore dhe NAc in vivo (Ulery-Reynolds et al., 2009). Megjithëse Ser27-ΔFosB është treguar të jetë një substrat për kazeinë kinase-2 vitro (Ulery et al., 2006), mekanizmi i saj i in vivo fosforilimi mbetet i panjohur.

Proteina kinazë II e varur nga kalciumi / kalmodulin (CaMKII) është një serinë / threonine kinase e shprehur shumë e lartë, forma e α dhe β e të cilëve formojnë homo- dhe hetero-holoenzime dodekamerike in vivo, dhe janë esenciale për forma të shumta të neuroplasticitetit (Lisman et al., 2002; Colbran dhe Brown, 2004). CaMKIIα është induktuar selektivisht në shell NAc nga amfetamina kronike (Loweth et al., 2010), dhe bllokadën farmakologjike të aktivitetit CaMKII në shell NAc redukton sensibilizimin e sjelljes në amfetaminën (Loweth et al., 2008) dhe kokaina (Pierce et al., 1998), ndërkohë që ekspresioni viral i CaMKIIα në këtë nënregion NAc rrit sensibilizimin e lokomotoreve dhe vetë administrimin e amfetaminës (Loweth et al., 2010). CaMKIIα mund të ndikojë në sjelljet e shpërblimit nëpërmjet modulimit të nënkomunive të receptorit të glutamatit AMPA (Pierce et al., 1998), pasi aktiviteti CaMKIIα ka qenë prej kohësh i lidhur me funksionin e receptorit AMPA dhe synaptic-targeting në disa forma të neuroplasticity (Malinow dhe Malenka, 2002).

Kjo literaturë demonstron disa paralele midis ΔFosB dhe CaMKII: të dyja janë të domosdoshme dhe të mjaftueshme për efektet e shumta të sjelljes të drogave të abuzimit, të dyja rregullojnë spines dendritike në lloje të ndryshme qelizash neurone in vivo (Jourdain et al., 2003; Maze et al., 2010), dhe të dyja të ushtrojnë të paktën disa nga efektet e tyre të sjelljes përmes modulimit të receptorëve AMPA (Kelz et al., 1999; Malinow dhe Malenka, 2002; Vialou et al., 2010). Pavarësisht nga këto paralele, nuk dihet asnjë lidhje funksionale midis ΔFosB dhe CaMKII. Këtu vendosim rregullim reciprok midis ΔFosB dhe CaMKII dhe demonstrojmë se të dy proteinat formojnë një lak specifik të tipit D1 të tipit MSN të avancuar në shell NAc që nxitet nga kokaina dhe rregullon një sërë reagimesh ndaj kokainës in vivo.

Shko tek:

Materialet dhe Metodat

Eksperiment 1: iTRAQ Analiza e Proteomik e Shellit dhe Core të NAc pas Trajtimit të Kokainës (Fig 1A)

Të rritur (8 javë) minjtë meshkuj administronin 20 mg / kg kokainë ose mjetin e kripur IP një herë në ditë për shtatë ditë. 24 orë pas injektimit të fundit, shell NAc dhe core ishin microdissected (Fig 1A) dhe flash të ngrira. Analizat iTRAQ u kryen siç u përshkrua më parë (Ross et al., 2004; Davalos et al., 2010).

Figura 1

Induksioni specifik i Shell-it për CaMKII në NAc nga kokaina

Eksperimenti 2: Kuantimi i Ndryshimeve të Proteinës në Rat Core dhe Shell Mbas Trajtimit të Kokainës (Fig 1B-D)

Të rritur (8 javë) rats meshkuj administronin 10 mg / kg kokainë ose mjetin e kripës IP një herë në ditë për shtatë ditë në dhomat e regjistrimit lokomotor. Përgjigjet e lokomotoreve në një injeksion të vetëm të kokainës (5 mg / kg IP) janë regjistruar në ato kafshë të trajtuara më parë me kokainë (të quajtur "kronik") dhe një pjesë të atyre që trajtohen me kripur (të quajtur "akute") dhe përgjigjet lokomotore ndaj kripës vetëm u regjistrua në kafshët e mbetura kronike të trajtuara me kripë (të quajtur "kripur"). Testet e aktivitetit të lokomotoreve janë kryer siç përshkruhet (Hiroi et al., 1997). Shkurtimisht, minjtë meshkuj të rritur u vendosën në 18 "× 24" PAS kuti për regjistrim në fushë të hapur (San Diego Instruments) për 30 min për t'u habitur, iu dha një injeksion i vetëm i kripës dhe u monitorua për një min shtesë 30 min. injektimi i vetëm IP i kokainës 5 mg / kg dhe monitoruar për 30 min.

24 pas kësaj injeksioni përfundimtar, minjtë ishin të prerë pa anestezi për të shmangur efektet e anestetikëve në nivelet proteine ​​neuronale dhe fosfo-shtete. Trurit u rreshtuan në mënyrë seriale në një matricë 1.2 mm (Braintree Scientific) dhe indeksi i synuar u hoq në frenuesit frenues të fosfateve të kripës që përmban proteazën (Roche) dhe fosfatazën (Sigma Aldrich) duke përdorur një grusht 14 për core AKc dhe një grusht 12 të mbetjeve indet për shell NAc (Shih Fig 1A) dhe menjëherë të ngrira në akull të thatë. Mostrat u homogjenizuan me sonication dritë në tampon RIPA modifikuar: bazë 10 mM Tris, 150 mM klorid natriumi, 1 mM EDTA, 0.1% sodium dodecyl sulfate, 1% Triton X-100, 1% deoxycholate natriumi, pH 7.4, inhibitorët protease dhe fosfataze si më sipër. Pas shtimit të tamponit Laemmli, proteinat u ndanë në xhelozë gradient 4-15% polyacrylamaide (Criterion System, BioRad) dhe Western blotting u krye duke përdorur sistemin Odyssey (Li-Cor) sipas protokolleve të prodhuesit.

Eksperiment 3: Quantifying Ndryshimet e Protein në Rat Core NAc dhe Shell Pas Tërheqjes Kokaina (Fig 1E)

Të rritur (8 javë) minjtë meshkuj administronin 10 mg / kg kokainë ose mjetin e kripur IP një herë në ditë për shtatë ditë. (14d WD) ose një injeksion i vetëm i kokainës ( quajtur "14d WD Chal" për sfidë). Një orë pas injektimit përfundimtar, kafshët u dekapituan dhe Western blotting u kryen si në Eksperto 2.

Eksperimenti 4: Shifrimi i ndryshimeve të proteinave në krahun kryesor dhe Shell të NAc Pas vetë-administrimit të kokainës (Fig 2A-C)

Rats janë trajnuar për të vetë-administruar 0.5 mg / kg / infuzion të kokainës në seanca një-orë nën një orar të caktuar të raportit 1 për nëntë ditë. Pas nëntë seancave bazë, minjtë u ndanë në dy grupe të balancuara nga futja e kokainës në dy seancat e fundit. Një grup i minjve u lejua të administrojë kokainë (0.5 mg / kg / infuzion) në seanca një-orëshe (aksesi i shkurtër, ShA) ndërsa grupi tjetër i minjve vetë-administroi kokainë në seanca gjashtë-orëshe (aksesi i gjatë, LgA ) për dhjetë ditë shtesë (seancat e përshkallëzimit).

Seksionet e trurit janë përpunuar për imunohistokimikë siç përshkruhet (Perrotti et al., 2004). Trurit janë perfunduar me 18-24 orë pas ekspozimit të fundit ndaj drogës, duke rezultuar në degradimin e ndonjë proteine ​​FosB të mbetur të plotë, kështu që e gjithë imunotaktësia e mbetur pasqyron ΔFosB. Kjo degradim u konfirmua nga blotting Western, e cila nuk tregoi njollë të rëndësishme me një antitrup të drejtuar kundër C terminusit të FosB plotë-gjatësi që nuk njeh ΔFosB (të dhënat nuk tregohen). Pas ndarjes në seksionet XMUMX μm, numri i qelizave imunopozitive ΔFosB u quantifikua nga një vëzhgues i verbuar në dy seksione përmes NAc të secilit miu dhe vlerat mesatare për 35 × fushë u llogaritën pastaj sipas rajonit për secilën kafshë. Çdo kafshë u konsiderua si një vëzhgim individual për analiza statistikore. Rajonet e interesit u identifikuan duke përdorur Paxinos dhe Watson (Paxinos dhe Watson, 2007).

Kuantifikimi i imunoreaktivitetit të CaMKIIα është kryer duke përdorur një sistem Licor siç përshkruhet (Covington et al., 2009). Intensitetet e integruara të CaMKII dhe GAPDH janë përcaktuar me software Odyssey. Rezultatet janë paraqitur si vlera të intensitetit të integruar për mm² dhe janë paraqitur si mjete ± sem (n = 4-10 për grup). Vlerat për GAPDH janë përdorur si referencë për të normalizuar intensitetin e CaMKII për trashësinë dhe kushtet e fetëve.

Figura 2

Induksioni i CaMKII në guaskë NAc të rats vetë-administruar dhe të droguarve të kokainës njerëzore

Eksperimenti 5: Niveli i sasisë së proteinave në njerëzit që varen nga kokaina (Fig 2D)

Procedurë

Indet e trurit të njeriut të Postmortemit u morën nga Banka e Vetëvrasjeve në Quebec (Instituti i Universitetit të Shëndetit Mendor Douglas, Montreal, Quebec, Kanada). Ruajtja e indeve vazhdoi në thelb siç përshkruhet (Quirion et al., 1987). Shkurtimisht, pasi nxirret, truri vendoset në akull të lagësht në një kuti me polisterol dhe nxiton në objektet e Bankës Qëndrore të Kërçovës. Hemisferat ndahen menjëherë nga një prerje sagittale në mes të trurit, rrjedhës së trurit dhe cerebelës. Enët e gjakut, gjëndra pineale, plexus choroid, gjysmë cerebellum dhe rrjedhin gjysmë truri janë dissected tipikisht nga hemisferën e majtë e cila është prerë koronale në feta 1 cm trashë para ngrirjes. Gjysma e dytë cerebellum është prerë sagittally në 1cm-feta trashë para ngrirjes. Indet janë të ngrira në 2-methylbutane në -40 ° C për ~ 60 sec. Të gjitha indet e ngrira mbahen veçmas në qese plastike në -80 ° C për ruajtje afatgjatë. Rajonet specifike të trurit janë dissected nga feta koronare të ngrirë në një pjatë çeliku inoks me akull të thatë të gjithë rreth për të kontrolluar temperaturën e mjedisit. Western blotting është kryer siç përshkruhet në Eksperto 2.

Grup

Grupi ishte i përbërë nga 37 meshkuj dhe 3 femra, duke filluar nga mosha midis viteve 15-66. Të gjithë subjektet vdiqën papritur pa një gjendje të zgjatur agonal ose sëmundje të zgjatur mjekësore. Në secilin rast, shkaku i vdekjes u konstatua nga zyra e Koronerëve në Quebec dhe një ekran toksikologjik u krye me mostrat e indeve për të marrë informacion mbi mjekimin dhe përdorimin e substancave ilegale në kohën e vdekjes. Grupi i lëndës përbëhej nga individë 20 që plotësuan kriteret SCID-I për varësinë nga kokaina. Grupi i kontrollit përbëhej nga lëndë 20 pa histori të varësisë nga kokaina dhe nuk kishte diagnoza të mëdha psikiatrike. Të gjithë subjektet vdiqën papritmas nga shkaqe që nuk kishin ndikim të drejtpërdrejtë në indet e trurit. Grupet u përputheshin me moshën mesatare, vonesën e ftohjes dhe pH. Për të gjitha subjektet, autopsitë psikologjike janë kryer siç është përshkruar më parë (Dumais et al., 2005), duke na lejuar që të kemi qasje në informacione të detajuara të rastit mbi historinë psikiatrike dhe mjekësore, si dhe të dhëna të tjera relevante klinike dhe sociodemografike. Shkurtimisht, një intervistues i trajnuar drejtoi Intervistë e strukturuar klinike për DSM-IV Çrregullime psikiatrike (SCID-I) me një ose më shumë informatorë të të ndjerit. Një panel i klinikëve shqyrtoi vlerësimet e SCID-I, raportet e rasteve, shënimet e mjekut dhe shënimet mjekësore për të marrë diagnoza psikiatrike të konsensusit.

Eksperimenti 6: imunoprotektimi i kromatinës për Rat NAc (Fig 3A-C)

Të rritur (8 javë) minjtë meshkuj administronin 10 mg / kg kokainë ose mjetin e kripur IP një herë në ditë për shtatë ditë. 24 orë pas injektimit të fundit, shell NAc dhe thelbi ishin microdissected. Implantacioni i kromatinës (ChIP) u krye duke grumbulluar grusht dypalësh NAc të guaskës ose bërthamës nga shtatë rats për grup në grupet e përgjithshme 14 (totalin e kafshëve 98, pishinat e kokainës 7, pishinat e kripës 7). Indet u kryqëzuan, lanë dhe ruheshin në -80 ° C deri në prerjen e kromatit me sonikim. Kromatina e prerë u inkubua brenda natës me antitrupa të lidhura më parë me rruaza magnetike (Dynabeads M-280, Invitrogen). IgG jo-imune është përdorur si një kontroll. Pas ndërlidhjes së kundërt dhe pastrimit të ADN-së, qPCR u përdor për të matur nivelet e ADN-së të promotorit të CaMKIIa. Primerët janë projektuar për të amplifikuar një rajon që përmban një sekuencë konsensusi AP-1 që gjendet në ~ 450 bp përpara faqes së fillimit të transkriptimit (Forward: ACTGACTCAGGAAGAGGGATA; Reverse: TGTGCTCCTCAGAATCCACAA).

Figura 3

Induksioni ΔFosB i tipit qelizor dhe rajonit të CaMKIIα in vivo

Eksperiment 7: Matja e Transkriptit CaMKII dhe shprehjes së proteinave me specifikë të tipit qelizor-specifik ΔFosB Overexpression (Fig 3D)

Minjtë bitransgjenikë meshkuj që rrjedhin nga NSE-TTA (vija A) × TetOp-ΔfosB (linja 11) dhe NSE-TTA (vija B) × TetOp-FLAG-ΔfosB (linjë 11) minj (Chen et al., 1998; Kelz et al., 1999; Werme et al., 2002; Zachariou et al., 2006) janë konceptuar dhe rritur në 100 μg / ml doxycycline për të shtypur shprehjen ΔFosB gjatë zhvillimit. Bashkëshortët e ndarjes u ndanë në ndarjen e tyre: gjysma mbeti në doksiciklin dhe gjysma u ndërrua në ujë, dhe kafshët u përdorën 8 në 11 javë më vonë, kur efektet transkripsionale të ΔFosB janë maksimale (Kelz et al., 1999; McClung dhe Nestler, 2003). Për analiza transkriptiale, minjtë u dekapituan me shpejtësi, dhe truri u hoq dhe u vendos në akull. Disseksionet e NAc u morën me një grusht gjilpërë 14-gauge dhe shpejt të ngrira në akull të thatë deri në nxjerrjen e ARN. RNA izolimi, qPCR, dhe analiza e të dhënave u kryen siç përshkruhet më parë (LaPlant et al., 2009). Shkurtimisht, ARN u izolua me reagentin TriZol (Invitrogen), më tej u pastrua me mikro kit RNAeasy nga Qiagen dhe u kontrollua për cilësinë me Bioanalyzer Agilent. Transkriptimi i kundërt u krye duke përdorur iScript (BioRad). qPCR u realizua me një sistem PCR me Sistem 7900HT RT Biosystems me parametrat e mëposhtëm të ciklit: 10 min në 95 ° C; Ciklet 40 të 95 ° C për 1 min, 60 ° C për 30 sec, 72 ° C për 30 sek; nxehtësia e graduar në 95 ° C për të gjeneruar kthesa disocciente për konfirmimin e produkteve të vetme të PCR. Analizat imunohistokemike të shprehjes së proteinave ΔFosB dhe CaMKIIα janë kryer siç përshkruhet në Eksperto 4.

Eksperimenti 8: Efektet e Antagonistëve të receptorëve dopaminë D1 dhe D2 në ndryshimet e proteinave të ndërmjetësuar nga kokaina (Fig 3H)

Të rritur (8 javë) minjtë meshkuj administronin 10 mg / kg kokainë ose mjetin e kripur ("automjeti") IP një herë në ditë për shtatë ditë. (30 mg / kg, grupi "D1 Ant"), ose etiklopridi antagonist i receptorit D23390 (0.5 mg / kg, grupi "D1 Ant"), minjtë 2 min para çdo injeksioni të kokainës, , ose një injeksion kontrolli kripur ("kokainë" grup). 0.5 orë pas injektimit përfundimtar, kafshët u dekapituan dhe proteinat u quantifikuan nga Western blotting si per Eksperto 2.

Eksperiment 9: Efektet e AAV-mediated ΔFosB overexpression mbi shprehjen e proteinave (Fig 4 A-C)

Kirurgjia stereotaksike u krye në minjtë meshkuj të rritur (javët 8) për të injektuar AAV-GFP (proteina jeshile fluoreshente) ose AAV-GFP-ΔFosB (Maze et al., 2010). Gjilpërë me matës 33 (Hamilton) u përdorën për të gjitha operacionet, gjatë të cilave 0.5 μl e virusit të titrave të lartë të pastruar u infuzion dy herë gjatë një periudhe min kohore 5, pasuar nga një periudhë pushimi shtesë 5 min pas infuzionit. Të gjitha distancat maten në krahasim me Bregma: 10 ° kënd, AP = + 1.7 mm, Lat = 2.5 mm, DV = -6.7 mm. 14 ditë pas operacionit, kafshëve iu dha një injeksion i vetëm i 10 mg / kg kokainë në dhomat e monitorimit të lokomotoreve për të vlerësuar efektet e sjelljes të mbipërfaqësimit ΔFosB. 24 orë pas kësaj injeksioni përfundimtar, minjtë ishin të prerë si pas Eksperto 2, dhe mikrodiseksioni i indeve u krye nën drejtimin mikroskopik të ndriçimit fluoreshent për të marrë indin GCF-pozitiv të NAc. Blotting Western ishte kryer pastaj si per Eksperimentoni 2.

Figura 4

ΔFosB është edhe e nevojshme dhe e mjaftueshme për induksionin CaMKIIα të varur nga receptori D1 të ndërmjetësuar nga kokaina në shell NAc

Eksperiment 10: Efektet e AAV-Mediated ΔJunD Overexpression mbi Kokaina-Dependent Protein Shprehje (Fig 4 D-F)

Injeksioni stereotakular i AAV-GFP ose AAV-GFP-ΔJunD është kryer sipas per Eksperimentoni 8. 14 ditë pas operacionit, kafshëve u administruan 10 mg / kg kokainë ose mjetin e kripës IP një herë në ditë për shtatë ditë në dhomat e regjistrimit lokomotor. Përgjigjet e lokomotoreve për një injeksion të vetëm të kokainës (5 mg / kg IP) ose fiziologjinë u regjistruan. 24 orë pas kësaj injeksioni përfundimtar, minjtë u kryqëzuan, indet e korrur, dhe blotet perëndimore u kryen si në Eksperimentoni 9.

Experiment 11: In Vitro Testet e proteinave kinaze (Fig 5A-D)

Recombinant CaMKIIα dhe ΔFosB u pastruan nga qelizat e insekteve (Brickey et al., 1990; Jorissen et al., 2007), dhe testet e protein kinazës u kryen (Colbran, 1993), siç përshkruhet më parë. Shkurtimisht, CaMKII ishte para-inkubuar në akull me 2.5 μM (ose përqendrim të treguar) të ΔFosB, 1 mM Ca²⁺, 40 mM Mg²⁺, 15 μM calmodulin, dhe 200 mM HEPES pH 7.5. Fosforilimi u iniciua me shtimin e 200 μM ATP me ose pa [γ-³²P] ATP dhe lejohet të vazhdojë për 10 min në temperaturën e dhomës (Fig 5A & B) ose 2 min në akull (Fig 5C & D). Produktet u zgjidhën me thithjen e Western (Fig 5A & B) ose me autoradiogram dhe numërimin e scintillation (Fig B-D).

Figura 5

ΔFosB është një substancë e fuqishme për CaMKIIα

Eksperiment 12: Identifikimi i Phosphorylation Ser27 ΔFosB (Fig 5E)

In vitro testet kinase u kryen sipas Eksperto 11, proteinat u ndanë nga SDS-PAGE, dhe brezat që korrespondojnë me ΔFosB u prenë dhe iu nënshtruan spektrometrisë masive në tandem. Caktimet m / z të fragmenteve ion përkatëse në të gjitha panelet janë etiketuar në majë të majave të joneve. Jo të gjitha jonet e fragmenteve janë etiketuar për shkak të kufizimeve hapësinore. Në përgjithësi, teksti për etiketat e fragmente të fragmenteve ngjyrosen me ngjyrë të zezë, përveç kur ata konfirmojnë ose shtojnë dëshmi të drejtpërdrejtë për praninë e vendeve të interesit të fosforilimit, në të cilin rast ato shënohen me ngjyrë të kuqe. Dëshmitë për produktet e fragmentimit të shtyllës janë paraqitur në leximin e sekuencës së fosfopeptidit me vendin e zbuluar të mbetjeve fosforiluese të treguara në të kuqe me një emër të vetëm të aminoacideve. Përshkrimi numerik i joneve të fragmenteve të vëzhguara gjithashtu shënohen në sekuencën peptide si b dhe y. Faktorët e zmadhimit për seksionet e boshtit m / z për të treguar jonet e fragmenteve me intensitet më të ulët janë shënuar në krye të çdo spektri masiv të fragmenteve. Iionet e fragmenteve të paraqitura në panelin H konfirmojnë praninë e serumNHMOz fosforiluar, megjithatë, brenda një përzierjeje të izoformave të tjera të fosforilizuara në vendet Ser27, Ser28, Ser31 dhe Thr34. Prania e pa37, pa5-P, pb5, dhe pb5-P joneve konfirmojnë në mënyrë unike fosforilimin e mbetjeve Ser5.

Eksperiment 13: Kuantifikimi i fosforilimit Ser27 (Fig 5F)

Peptidet standarde janë projektuar duke imituar format e fosfo dhe jo-fosfo të Ser27 ΔFosB. Pas sintezës dhe pastrimit, çdo peptid "i rëndë" idiotipik u shpërbë në një tampon 50 / 50 acetonitrili / uji dhe u dërgua për analiza aminoacidike për të përcaktuar përqendrimin absolut në zgjidhjen e aksioneve peptide sintetike. Secili peptid "i rëndë" u fut në mënyrë të drejtpërdrejtë në spektrometrin 4000 QTRAP (MS) për të përcaktuar energjinë më të mirë të përplasjes për fragmentimin MS / MS dhe dy deri në katër tranzicion MRM. Tjetra, peptidet e rënda "të rënda" iu nënshtruan LCMS në QTRAP 4000 për të siguruar ndarjen e peptideve. Instrumenti u zhvillua në mënyrë të trefishtë katërkëndësh, me Q1 vendosur në vlerën specifike të precursorit m / z (Q1 nuk është skanim), dhe Q3 vendosur në vlerën specifike m / z që korrespondon me një fragment specifik të atij peptidi. Në regjimin MRM, një sërë reaksionesh të vetme (tranzicioni i prekursorëve / fragmenteve joneve ku energjia e përplasjes është akorduar për të optimizuar intensitetin e joneve të fragmentit të interesit) janë matur në mënyrë sekuenciale dhe cikli (zakonisht 1-2 sec) gjithë kohën e ndarjes HPLC. Kalimet MRM u përcaktuan nga spektri MS / MS i peptideve ekzistuese. U përzgjodhën dy transizione për peptide, që korrespondojnë me jonet e fragmenteve me intensitet të lartë, dhe energjia e përplasjes optimizohet për të maksimizuar forcën e sinjalit të tranzicionit MRM duke përdorur softuerin e automatizimit. Majat që rezultojnë nga peptidet standarde dhe mostrat ΔFosB të ekspozuara ndaj CaMKII ose kontrollit janë krahasuar më pas për të përcaktuar bollëkun absolut të çdo forme peptidi në reaksion. Analiza e të dhënave mbi të dhënat LC-MRM kryhet duke përdorur softuerin AB Multiquant 1.1.

Eksperimenti 14: Induksioni i ΔFosB në CaMKII Overexpressing Mice (Fig 5G & H)

Minj transgjenike që mbizoterojnë T286D CaMKII (Mayford et al., 1996; Kourrich et al., 2012) dhe emrat e tipit të egër të mbetjeve u rritën në mungesë të doksiciklinës për të lejuar shprehjen e transgjeneve. Minj të rritur u administruan 20 mg / kg kokainë ose IP kripur një herë në ditë për ditët 14. 24 orë pas injektimit përfundimtar, kafshët u dekapituan dhe imunohistokimi dhe kuantifikimi i shprehjes ΔFosB u krye si në Eksperto 4.

Eksperiment 15: Efektet e HSV-mediated ΔFosB overexpression dhe inhibimin CaMKII në NAc spines dendritic (Fig 6A-E)

Minj meshkuj të rritur (javë 8) u injektuan stereotaksi në NAc me HSV-GFP, HSV-GFP-ΔFosB (Olausson et al., 2006), HSV-GFPAC3I, ose HSV-GFPAC3I-ΔFosB. Në këto konstruksione, AC3I, një inhibitor i aktivitetit CaMKII i bazuar në peptide, është i shkrirë në C-terminalin e GFP. GFPAC3I u klonua nga PCR duke përdorur vektorin pMM400 që përmban GFPAC3I si një model me këto primera: GFP-AC3I-F: 5 'CC GCTAGC GCCGCCACC ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGT 3' (clampNheIKozakmet); GFP-AC3I-R: 5 'CC TCCGGA TTACAGGCAGTCCACGGCCT 3' (clampBspEIstop). Produkti PCR që rezulton u fut në vektorët p1005 + dhe p1005 + -Δ FosB duke përdorur faqet NheI dhe BspEI. Ndërtimi u vërtetua me renditje. Kordinatat steretereaktive ishin: kënd 10 °, AP = + 1.6 mm, Lat = + 1.5 mm, DV = -4.4 mm (Barrot et al., 2002). Perfuzioni dhe seksionet e trurit u kryen sipas Eksperto 4.

Analiza e shtyllës kurrizore është kryer siç përshkruhet (Christoffel et al., 2011). Shkurtimisht, segmentet dendritike 50-150 μm larg nga soma u përzgjodhën rastësisht nga qelizat e infektuara me HSV që shprehin GFP. Imazhet u blenë në një LSM 710 confocal (Carl Zeiss) për analizë morfologjike duke përdorur NeuronStudio me algoritmin rayburst. NeuronStudio klasifikon spines si hollë, kërpudha, ose stubby bazuar në vlerat e mëposhtme: (1) raport aspekt, (2) raport kokë-qafe, dhe (3) diametër kokë. Spines me një qafë mund të klasifikohen si të hollë ose kërpudha, dhe ato pa një qafë të rëndësishme janë klasifikuar si stubby. Spines me një qafë janë etiketuar si të hollë ose kërpudha bazuar në diametër kokë.

Figura 6

Bllokadat e aktivitetit CaMKII parandalojnë efektet morfologjike dhe sjelljen e ΔFosB në NAc

Eksperimenti 16: Efektet e HSV-mediated ΔFosB overexpression dhe inhibimin CaMKII në përgjigjet e kokainës (Fig 6F)

Minjtë meshkuj të rritur u injektuan me viruse sipas Eksperto 15, dhe përgjigjet lokomotore në një injeksion të vetëm 5 mg / kg të kokainës është matur sipas Eksperimentoni 9. Të dhënat e lokomotoreve shprehen si thyerje totale të rrezeve mbi 30 min pas injektimit të kokainës.

informacion shtese

Strehimi Kafshe

Mashkull rats Sprague Dawley (250-275 g; Charles River Laboratories) ishin vendosur me palë. Tetë javë të vjetër C57BL / 6J minj meshkuj (Laboratori Jackson) ishin grupi i vendosur me një maksimum prej pesë kafshëve për kafaz. Të gjitha kafshët u përdorën në objektin e kafshëve për ≥1 javë para manipulimeve eksperimentale dhe vendoseshin në dhomat e kontrolluara me klimë (23-25 ° C) në një cikël 12 hr / light (dritat në 7: 00 AM) me qasje në ushqim dhe ujë ad libitum. Eksperimentet u zhvilluan në përputhje me udhëzimet e Shoqatës për Neuroscience dhe komitetin institucional të kujdesit dhe përdorimit të kafshëve (IACUC) në Malin Sinai.

Droga

Droga u administrua IP dhe u shpërnda në kripinë sterile, duke përfshirë kokainën (5-20 mg / kg për 10 μl për minjtë, për 1 ml për minjtë, NIDA) dhe SCH23390 ose etikloprid hidrokloride (0.5 mg / kg për 1 ml, Tocris) . Për kirurgji stereotakse, minjtë u anestezuan me një "koktej" të ketamines (100 mg / kg) dhe xilazinë (10 mg / kg) (Henry Schein) në kripërat sterile.

antitrupat

CaMKIIα (gjithsej): Upstate 05-532, 1: 5,000

CaMKII fosfo-Thr286: Promega V111A, 1: 1,000

ΔFosB (total): Sinjalizimi i qelizave 5G4, 1: 250

ΔFosB fosfo-Ser27: Phosphosolutions, 1: 500

GluA1 (gjithsej): Abcam, Ab31232, 1: 1,000

GluA1 fosfo-Ser831: Millipore N453, 1: 1,000

GluA1 fosfo-Ser845: Chemicon Ab5849, 1: 2,000

GluA2: Millipore 07-598, 1: 2,000

NR2A: Sigma HPA004692, 1: 2,500

NR2B: Millipore Ab1557P, 1: 1,000

Analiza statistikore

Të gjitha analizat statistikore janë kryer duke përdorur paketën software Prism 6 (GraphPad). T-testet e nxënësve u përdorën për të gjitha krahasimet me palë (tregohet në rezultatet ku vlera e t është dhënë), dhe ANOVA me një drejtim janë përdorur për të gjitha krahasimet e shumëfishta (tregohet në seksionin e rezultateve ku vlera F është dhënë).

Shko tek:

Rezultatet

Kokaina kronike shkakton CaMKII në Shell NAc

Shumë studime kanë treguar se MSN-të në shell dhe thelbin e NAc kanë përgjigje të ndryshme biokimike dhe fiziologjike ndaj ekspozimit kronik ndaj drogave të abuzimit (Kourrich dhe Thomas, 2009; Loweth et al., 2010) dhe se të dy nën-rajonet rregullojnë ndryshe sjelljet e kërkimit të drogës (Ito et al., 2004). Për të përcaktuar efektet diferenciale të kokainës në përbërësit e proteinave të shell NAc vs core, ne përdorëm Multiplexed Tagging Isobaric (iTRAQ) dhe spektroskopi në masë tandem (MS / MS). Rats me meshkuj te rritur jane injektuar IP me kokaina (20 mg / kg) ose me kripur ditore per dite 7; 24 orë pas injektimit të fundit, shell NAc dhe core ishin microdissected (Fig 1A) dhe flash të ngrira. Proteinat në këto mostra u quantifikuan pastaj duke përdorur iTRAQ. Të katër formulat e CaMKII shfaqën rritje të mëdha në shprehje pas trajtimit të kokainës që ishin specifike për shellin NAc krahasuar me thelbin. Disa fosfataze proteina, duke përfshirë nën-njësitë katalitike dhe rregullatore PP1 dhe PP2A, të cilat më parë kanë qenë të lidhura me substrate të ndryshme CaMKII në sisteme të tjera (Colbran, 2004), ndoqën një model të ngjashëm. Këto gjetje ofruan dëshmi të reja dhe të paanshme që rruga sinjalizuese e CaMKII është e rregulluar në mënyrë të dukshme nga kokaina në NAc në një mënyrë specifike shell.

Për të vërtetuar këtë gjetje më shumë sasiore, ne trajtuam rats si më sipër me kokainë (në doza të ndryshme) ose me kripë dhe reagimet e matura lokomotore në një kokainë (5 mg / kg) ose dozë sfiduese të kripës. Ekspozimi i përsëritur ndaj kokainës 10 mg / kg rezultoi në modelin tipik të sensibilizimit të lokomotoreve (Fig 1B). Studimet e mëtejshme me këtë regjim dozimi zbuluan, duke përdorur blotting Western, se kokaina përsëritet CaMKIIα selektive në shell NAc shell 24 orë pas injektimit përfundimtar të kokainës (Fig 1C dhe D; p = 0.0019; F = 7.943; DF = 29). Përveç kësaj, fosforilimi i substancës kanonike CaMKII Ser831 të nën-njësisë GluA1 të receptorit AMPA u rrit ndjeshëm në shell NAc dhe jo në bazë (p = 0.0261; F = 4.208; df = 28), ndërsa autophosphorylation CaMKIIα Thr286 kishte një të fortë, por jo tendencë e dukshme drejt induksionit vetëm në shell (Fig 1D). Disa receptorë të tjerë të glutamatit ishin të paprekura. Në kontrast me këto matje të CaMKII, të njëjtat mostra të indeve shfaqën indukimin e ΔFosB në të dy shell (p = 0.0260; F = 4.189; df = 29) dhe thelbi (p = 0.0350; F = 3.807; df = 29) (Fig 1C dhe D), në përputhje me gjetjet e mëparshme (Perrotti et al., 2008).

Meqë disa studime të mëparshme të rregullimit të kokainës nga receptorët AMPA analizuan kafshët pas ~ 14 ditëve të tërheqjes nga kokaina kronike (shih diskutimin), ne përsëritëm këto analiza biokimike në këtë moment kohor. Ne kemi gjetur se, 14 ditë pas injektimit përfundimtar të kokainës, ΔFosB mbetet ngritur në NAc (p = 0.0288; F = 4.258; df = 22), ndërkohë që as CaMKII as fosforilimi i GluA1 Ser831 mbetet i rritur (Fig 1E). Megjithatë, 1 orë pas një dozë të vetme të kokainës 10 mg / kg, nivelet e totalit të CaMKII (p = 0.0330; F = 3.947; df = 26) dhe GluA1 Ser831 (p = 0.0213, F = 4.509, df = 27) fosforilimi janë ngritur në një shkallë të ngjashme me atë të gjetur pas ekspozimit fillestar kronik të kokainës (Fig 1E). Këto të dhëna tregojnë se neuronet shell shell NAc janë primed për induksion CaMKII gjatë periudhave të zgjatura të abstinencës, ndoshta përmes mbushjes së drejtpërdrejtë të promotorit të gjenit CaMKII (shih Diskutim). Për më tepër, fakti që induksioni ΔFosB është më i qëndrueshëm se induksioni CaMKII sugjeron ekzistencën e mekanizmave shtesë, qofshin me bazë kromatin ose ndryshe, që ushtrojnë një "frenim" në rregullimin e CaMKII, siç mbulohet në Diskutim.

Për të forcuar më tej këto vëzhgime, ne hulumtojmë modelet e vetë-administrimit të kokainës, të cilat përfshijnë marrjen vullnetare të drogës. Rats të rriturve meshkuj iu është dhënë ose qasje e shkurtër ose e gjatë në kokainë; siç pritej (Ahmed dhe Koob, 1998), vetëm kushtet e gjata të qasjes çuan në rritjen e vetë-administrimit të drogës (Fig 2A). ΔFosB është nxitur në një masë më të madhe nga shumë kohë vs qasje të shkurtër në kokainë në të dy shell NAc (p = 0.0011, F = 11.12, df = 17) dhe thelbi (p = 0.0004, F = 13.86, df = 17). Në të kundërt, CaMKIIα është nxitur në shell NAc vetëm me akses të gjatë ndaj kokainës (Fig. 2B dhe C; p = 0.0236; F = 4.957; DF = 16). Është interesante të krahasohet marrja mesatare e përditshme e kokainës në kafshë me qasje të shkurtër (~ 12 mg / kg IV), kafshë me qasje të gjatë (~ 70 mg / kg IV) dhe kafshë të administruara me eksperimente (10 mg / kg); pyesni pse këto të fundit nxjerrin induksion të fuqishëm të ΔFosB dhe CaMKII ndërsa qasja e shkurtër nuk. Kjo mospërputhje ka të ngjarë për shkak të ndryshimeve në nivelet e kokainës së pikut (kokaina e administruar në eksperiment është dhënë si një bolus IP i vetëm, ndërsa kokaina e vetë-administrohet nëpërmjet disa dozave të IV), ose nga dallimet në gjatësinë e ekspozimit të drogës (ditë 7 për experimenter administratë, ditë 19 për vetë administrim).

Përkundër literaturës së madhe për ΔFosB dhe CaMKII në veprim të kokainës, nuk ka studime të këtyre proteinave në përdoruesit e kokainës njerëzore. Këtu paraqesim dëshminë e parë që nivelet e të dyjave ΔFosB (p = 0.0316; t = 1.921; df = 34) dhe CaMKII (p = 0.0444; t = 1.755; df = 32) janë rritur në NAc të njerëzve të varur nga kokainaFig 2D, Tabela 1). Këto të dhëna tregojnë se ekzaminimi ynë i induksionit ΔFosB dhe CaMKII nga kokaina në barkëtarin NAc është klinikisht e rëndësishme për varësinë e kokainës njerëzore.

Tabela 1

Karakterizimi i mostrave nga personat e varur nga kokaina dhe grupi kontrollues i përputhshëm

ΔFosB rregullon Transkriptin CaMKII Selektive në D1-Type MSNs të NAc Shell

Konstatim se si CaMKII dhe ΔFosB janë rregulluar nga kokaina në NAc brejtësit na çuan për të përcaktuar nëse ΔFosB mund të rregullojë transkriptimin e gjenit CaMKII. Ne kishim raportuar më parë CaMKIIα si një objektiv të mundshëm për ΔFosB në një analizë të paanshme të microarray të NAc (McClung dhe Nestler, 2003), por ky konstatim nuk u vlerësua më tej në atë studim. Ne kemi përdorur për herë të parë ChIP sasiore (qChIP-ChIP ndjekur nga PCR sasiore) për të përcaktuar nëse ΔFosB lidhet me promotorin e gjenit të CaMKIIα në NAc të minjve meshkuj të rritur, dhe gjeti se ky lidhës është rritur ndjeshëm, nga administrimi kronik i kokainës në shell p = 0.0133; t = 2.901; df = 12), por jo thelbi, nënregjioni (Fig 3A). Për të kuptuar më tej mekanizmat që lidhen me këtë diferencën specifike të subregionit në ΔFosB që lidhet me promotorin e CaMKIIα, ne kemi përdorur qChIP për të karakterizuar gjendjen e modifikimeve histone në këtë rajon gjenomik. Studimet e mëparshme treguan induksion kokainë të acetylation H3 në promotor CaMKIIa në miun total NAc (Wang et al., 2010). Në të kundërt, kemi gjetur se kokaina zvogëlon acetylation H3 në promotor CaMKIIα selektivisht në thelbin NAc (Fig 3B; p = 0.0213; t = 2.726; df = 10), pa ndonjë ndryshim të dukshëm në shell, në përputhje me ndryshimet e kromatinës specifike të nën-rajonit përtej lidhjes ΔFosB. qChIP për markën shtypëse, dimetilizuar H3 lysine 9 (H3K9me2), zbuloi tendencat për zvogëlime në të dy nëngrupe shell dhe thelbësore (Fig 3C).

Për të përcaktuar nëse ΔFosB rregullon transkriptimin e CaMKIIα in vivo, ne shfrytëzuam dy linja bitransgjenike të miut që mbizotëronin dukshëm ΔFosB në mënyrë specifike në D1 vs D2-lloj MSNs në një mënyrë të kontrolluar nga administrimi doksikiklinë në ujë të pijshëm (Chen et al., 1998; Kelz et al., 1999; Werme et al., 2002). Mice meshkujsh të rritur që ekspresonin ΔFosB vetëm në D1-lloj MSNs kishin nivele të rritura në mënyrë të konsiderueshme të ARNi-së CaMKIIα në NAc (p = 0.0337; t = 1.996; df = 13), një efekt që nuk shihet në minj që ekspresionon ΔFosB kryesisht në llojin e tipit D2Fig 3D). Rritja e mRNA CaMKIIα, e nxitur nga shprehja ΔFosB në MSNs tipit D1, u shoqërua nga një rritje e njëkohshme e proteinës CaMKIIα në të dy shell NAc (p = 0.0030, t = 3.578, df = 14) dhe bërthama (p = 0.0392; = 2.275; df = 14; Fig 3E dhe F). Këto të dhëna tregojnë se ΔFosB është i aftë të nxisë shprehjen e gjeneve të CaMKIIα në MSNS të tipit D1 në të dy nënrajonet, edhe pse Figura 3B sugjeron se ndryshimet e kromatit të ndërmjetësuara nga kokaina në promotorin e CaMKIIa (p.sh., acetilatimi i reduktuar) parandalojnë ΔFosB nga rritja e rregullimit të CaMKII në nënregionin thelbësor pas kokainës.

Meqenëse të dhënat tona transgjenike të miut treguan se induktimi i ΔFosB i shprehjes së gjenit CaMKII është specifik për MSN të tipit D1 në NAc, më tej kërkuam të përcaktojmë nëse rregullimi i CaMKII i varur nga kokaina kërkon aktivizimin e receptorit të dopaminës D1. Minjtë e rritur meshkuj u administruan kokainë ose kripë kronike si më parë, por 30 min para çdo injeksioni, minjve në grupin e kokainës iu dha IP injeksion i kripur, antagonisti D1 SCH 23390 (0.5 mg / kg), ose anticonisti i receptorit D2 eticlopride (0.5 mg / kg). Kafshët u analizuan 24 orë pas injektimit të fundit të kokainës. Njollja perëndimore zbuloi se D1, por jo D2, antagonisti bllokoi plotësisht rritjen e ΔFosB të ndërmjetësuar nga kokaina (p <0.0001; F = 18.96; df = 18), siç është raportuar më parë (Nye et al., 1995), si dhe në CaMKII (p = 0.0005; F = 10.99; df = 18; Fig 3G dhe H). Këto të dhëna mbështesin hipotezën se kokaina angazhohet në një rritje të ndërmjetësimit të ΔFosB në shprehjen e gjeneve të CaMKII në mënyrë specifike në MSNs tipit D1 të shell NAc. Do të ishte e rëndësishme në studimet e ardhshme që të demonstronin drejtpërdrejt këtë efekt specifik të qelizave të kokainës në shprehjen e CaMKII brenda këtij rajoni të trurit.

ΔFosB është e domosdoshme dhe e mjaftueshme për induksionin e kokainës së CaMKII në NAc Shell

Për të plotësuar përdorimin e minjve bitransgenic, ne në vijim studioi rolin e ΔFosB në ndërmjetësimin e induksionit të kokainës të CaMKIIα duke përdorur transferimin e gjenit të ndërmjetëm viral në minjtë. Ne bëmë në mënyrë bilaterale injeksionet e grimcave virale (AAV) të adeno-shoqëruara në shellin e NAc të minjve të rritur (ku guacka mund të drejtohet në mënyrë selektive) për të ekspresuar vetëm ΔFosB plus GFP ose GFP vetëm. Pastaj, kafshëve iu dha një injeksion i vetëm i 10 mg / kg kokainë. Kafshët që ekspresionojnë ΔFosB / GFP treguan një rritje të përgjigjes lokomotore në krahasim me kafshët që ekspresonin vetëm GFP (Fig 4A). 24 orë pas injektimit të vetëm të kokainës, indeksi GFP-pozitiv i NAc u excizua nga këto kafshë me diseksionin nën një burim fluoreshent të dritës. Bluarja perëndimore e këtij indi (Fig. 4B dhe C) ka shfaqur ekspozim të fortë të ΔFosB si dhe një rritje të konsiderueshme të proteinës totale të CaMKIIα në krahasim me kafshët e GFP (p = 0.0070; t = 2.894; df = 30), ngjashëm me induksionin e parë me administrimin kronik të kokainës. Përveç kësaj, autofosforilimi i CaMKIIα në Thr286 (indikator i aktivizimit të enzimës) u rrit nga ekspresioni i ΔFosB (p = 0.0330; t = 2.243; df = 28), siç ishte fosforilimi i substratit CaMKII, Ser831 e GluA1 (p = 0.0540; 2.012; df = 28), duke imituar përsëri veprimet e kokainës kronike (Fig 1C dhe D). Taken së bashku, këto të dhëna ofrojnë dëshmi të mëtejshme se shprehja ΔFosB në shell NAc është e mjaftueshme për sensibilizimin e lokomotoreve ndaj kokainës dhe për induksionin dhe aktivizimin e CaMKII në këtë nën-rajon.

Ne kemi përdorur një qasje të ngjashme për të përcaktuar nëse ΔFosB është gjithashtu e nevojshme për induksionin e ndërmjetësuar nga kokaina të CaMKIIα në shell NAc. AAV u përdor për të ekspresuar një proteinë të fragmentuar JunD, e quajtur ΔJunD, e cila është një rregullator negativ i aktivizimit transkripcional të ΔFosB (Winstanley et al., 2007) plus GFP ose GFP vetëm. Dy javë më vonë, kur ekspresioni i transgjeneve është maksimal, kafshët u janë dhënë kokainë (10 mg / kg) ose kripur për ditë për 7 dhe testohen për përgjigjet lokomotore në një sfidë të kokainës (5 mg / kg) 24 orë pas injektimit të fundit kronikFig 4D). ΔJunD overexpression parandaluar sensibilizimin lokomotor të kokainës, dhe gjithashtu penguar indukimin dhe aktivizimin CaMKIIα në shell NAc (Fig 4E dhe F; p = 0.0437; F = 2.997; total df = 38), duke treguar se aktiviteti transkripsion i ΔFosB është i domosdoshëm për induksionin e ndërmjetësuar nga kokaina e CaMKIIα në këtë nën-rajon. Interesante, ne kemi gjetur se ΔJunD zvogëloi nivelet e ΔFosB në kushte të trajtuara me kripë dhe kokainë (p = 0.0004; F = 8.110; df = 35), duke rritur mundësinë novatore që ΔFosB varet nga aktiviteti AP-1 për nivelet e veta të shprehjes.

Phosphorylates CaMKII ΔFosB në Ser27

Përdorim vitro proteina kinazë, ne përcaktuam se ΔFosB i pastruar është një substrat i fuqishëm për CaMKIIa. Inkubacioni i Tij₆-ΔFosB me CaMKIIα dhe ATP shkaktoi një zhvendosje në rritje në lëvizjen elektroforetike të ΔFosB (Fig 5A); grupet e ndryshme që rezultuan sugjeruan vende të shumta të fosforilimit. I ngjashëm vitro kinase duke përdorur [γ-³²P] ATP tregoi inkorporimin e fosfatit të radioaktivizuar në brezat e zhvendosur ΔFosB (Fig 5B), duke demonstruar fosforilim të drejtpërdrejtë të proteinës. Ne krijuam një antitrup të fosfo-specifik ndaj Ser27 të karakterizuar më parë të ΔFosB (Ulery et al., 2006). Përderisa ky antitrup nuk prodhon një sinjal kundër ekstrakteve të trurit që përmbajnë Ser27-phosphorylated ΔFosB (të dhënat nuk janë treguar), ne kemi qenë në gjendje të zbulojmë fosforilimin Ser27 në vitro kinazës duke përdorur CaMKII (Fig 5B). Analizat kinetike të fosforilimit të CaMKII të ΔFosB tregojnë se ajo është një substrat i fuqishëm për kinazën (Fig 5C), me një K të dukshme_M e 5.7 ± 2.0μM dhe K_CAT e 2.3 ± 0.3min^-1. Këto rezultate janë të krahasueshme me shumë të karakterizuar mirë in vivo substancat e CaMKII (Colbran dhe Brown, 2004). Përveç kësaj, ne kemi përcaktuar se CaMKII phosphorylates ΔFosB me një stoichiometry e 2.27 ± 0.07 mol / mol (Fig 5D), duke treguar se ka të paktën tre vende të fosforilimit CaMKII brenda tij₆-AFosB protein, në marrëveshje me Fig 5A.

Për të hetuar vendet individuale të fosforilimit, ne kemi përdorur analiza MS të mostrave nga tonë vitro kinazë. Fig 5E demonstron fosforilimin ΔFosB në Ser27 të karakterizuar më parë dhe në disa vende shtesë (të dhënat nuk tregohen). Duke pasur parasysh karakterizimin e mëparshëm funksional të Ser27, ne u përqendruam në këtë faqe duke gjeneruar peptide sintetike të etiketuar që imitonin gjendjet fosfo- dhe jofosfo-serike të Ser27, pastaj përdorën sasitë e njohura të këtyre peptideve si standarde në analizat MRM të ΔFosB para dhe pas vitro fosforilimi nga CaMKII. Caktimi i mëvonshëm (Fig 5F) konfirmon se Ser27 është një substancë e fuqishme për CaMKII. Këto rezultate tregojnë se, midis shumë mbetjeve të fosforilizuara brenda ΔFosB, Ser27 është një substrat veçanërisht efektiv për CaMKII.

CaMKII ndërmjetëson akumulimin e kokainës së ΔFosB në Shell NAc

Meqë CaMKII mund të fosforilojë ΔFosB vitro në një vend që në mënyrë dramatike rrit stabilitetin e saj vitro in vivo (Ulery et al., 2006; Ulery-Reynolds et al., 2009), ne përcaktuam nëse aktiviteti i CaMKII kontrollon nivelet e ΔFosB në NAc in vivo. Për të adresuar këtë pyetje, ne së pari përdornim një vijë të miut që overexpressing një mutant të CaMKIIα (T286D) të pavarur nga kalciumit në rajonet e shumta të trurit duke përfshirë NAc (Mayford et al., 1996; Kourrich et al., 2012). Ne kemi injektuar meshkuj meshkujsh të maturuar të moshës dhe të kafshëve të egra me 20 mg / kg kokainë ose kripur një herë në ditë për 14 ditë, pastaj analizuan kafshët një ditë pas injektimit përfundimtar. Ne kemi gjetur se nivelet basal të ΔFosB janë rritur në kafshët mutante në shell NAc (p = 0.0001; F = 9.207; df = 37), por jo thelbësore (Fig 5G dhe H). Çuditërisht, induksioni i varur nga kokaina i ΔFosB u bllokua në kafshët mutante si në shell ashtu edhe në bërthamë, duke sugjeruar që megjithëse CaMKII mund të rregullojë drejtpërdrejt Stabilitetin ΔFosB në shell NAc, ajo gjithashtu mund të qëndrojë në rrjedhën e sipërme të ΔFosB në rrugët e aktivizuara me kokainë në të dy nënregionet e NAc .

Aktiviteti i CaMKII është i nevojshëm për plasticitetin strukturor dhe sjellës të ndërmjetësuar nga FosB

Induksioni i kokainës së spines dendriti në NAc MSNs është një nga përshtatjet më të mira të krijuara nga droga në këtë rajon të trurit, dhe induksioni i tillë i shtyllës kurrizore është korreluar me reagimet sensibilizuese të sjelljes ndaj drogës (Robinson dhe Kolb, 2004; Russo et al., 2010) dhe raportohet të jenë selektive për MSN-të të tipit D1 (Lee et al., 2006). Ne kemi demonstruar kohët e fundit se induksioni i kokainës në shtyllat dendriti në NAc është i varur nga ΔFosB dhe programi i tij transkripsion i rrjedhës së poshtme (Maze et al., 2010). Megjithëse ka një literaturë të gjerë në lidhje me përfshirjen e CaMKII në morfologjinë dhe induksionin e shtyllës kurrizore të dendritit në rajonet tjera të trurit dhe në sistemet eksperimentale (Jourdain et al., 2003; Penzes et al., 2008; Okamoto et al., 2009), roli i saj në formimin e shtyllës kurrizore MSN NAc nuk është studiuar. Prandaj, ne kemi përcaktuar nëse aktiviteti CaMKII është i nevojshëm për induksionin ΔFosB të ndërmjetësuara të spinave dendritike të MSN duke shfrytëzuar ovekseksionin e ndërmjetëm të HSV-së të peptidit frenues CaMKII AC3I shkrirë në GFP, një konstrukt i treguar më parë për të penguar aktivitetin e CaMKII in vivo (Zhang et al., 2005; Klug et al., 2012) Mbishprehja virale e ΔFosB në guaskën NAc të minjve të rritur shkaktoi një rritje të konsiderueshme të densitetit të shpinës dendritike MSN (p <0.0001; F = 8.558; df = 59; Fig 6A dhe B) siç është raportuar më parë (Maze et al., 2010), dhe kjo rritje është nxitur kryesisht nga llojet e shtyllës së hollë (p = 0.0027; F = 5.319; df = 59) dhe stubby (p = 0.0378; F = 2.988; df = 59)Fig 6C-E). Asnjë efekt nuk u pa në spines më të pjekura, kërpudha. Megjithatë, kur GFP-AC3I ishte koexpressed, ΔFosB induksion i spines u shfuqizua plotësisht (Fig 6A-E), duke treguar se aktiviteti CaMKII është i nevojshëm për induksion ΔFosB të shtyllave dendriti në shell NAc.

Në vijim përdorëm të njëjtat vegla virale për të përcaktuar nëse aktiviteti i CaMKII kërkohet për efektet e ΔFosB në ndjeshmërinë e sjelljes ndaj kokainës. 72 orë pas injektimit viral në shell NAc, kafshëve iu dha një injeksion i vetëm i kokainës 5 mg / kg dhe aktiviteti i tyre lokomotor u regjistrua. Siç është treguar më parë me shprehjen më të zgjeruar AAV të ΔFosB (Fig 4A), Ekspresioni i lartë i ΔFosB i ndërmjetësuar nga HSV ka rritur ndjeshmërinë e locomotorit ndaj kokainës (p = 0.0002; F = 8.823; df = 37; Fig 6F). Ashtu si me indukimin e spines dendriti, ndalimi i aktivitetit CaMKII nga koexpression i GFP-AC3I bllokuar plotësisht rritjen e ndjeshme ndërmjet ndjeshmërisë kokainës ΔFosB, duke treguar që aktiviteti CaMKII është e nevojshme për ndryshimet e shkaktuara nga ΔFosB në efektet e sjelljes së kokainës.

Shko tek:

Diskutim

Ky studim përshkruan një mekanizëm të ri të ushqyerit përpara ku kokaina shkakton ΔFosB në NAc, e cila rregullon transkriptimin e gjenit të CaMKIIα selektivisht në shellin NAc. CaMKIIa më pas phosphorylates dhe stabilizes ΔFosB çon në akumulim më të madh ΔFosB dhe për të më tej induksion CaMKIIα (Fig 6G). Nivelet bashkë-përshkallëzuese të të dy proteinave gjatë ekspozimit kronik ndaj kokainës më pas kontribuojnë në mënyra thelbësore për reagimet sensibilizuese të sjelljes ndaj drogës. Kjo është një hipotezë veçanërisht tërheqëse pasi që të dyja ΔFosB dhe CaMKII kanë qenë të demonstruar që më parë të kërkohen për përgjigje në rritje të sjelljes ndaj kokainës (Pierce et al., 1998; Peakman et al., 2003), dhe ne e përsërisim këtë gjetje për ΔFosB në shell NAc në mënyrë specifike duke përdorur një qasje virale (Figs 4 and66).

Megjithëse tejpërhapja transgeniale e ΔFosB në llojin D1 të tipit MSN mund të nxisë induksionin CaMKII në të dy shellat e NAc dhe bërthamën e kafshëve kokainë-naive, në kontekstin e kokainës, akumulimi i ΔFosB endogjene, që ndodh në të dy nënrajonet, nxit indukimin e CaMKII në mënyrë specifike në shell NAc . Ky ndryshim mund të lidhet me nivelet më të larta të ΔFosB të shkaktuara në modelin tonë bitransgjenik, megjithatë, ai gjithashtu mund të pasqyrojë aftësinë e kokainës për të ndryshuar në mënyrë të diferencuar promotorin e CaMKIIα në predhë vs bërthamë për të promovuar ΔFosB detyruese në të parën ose për ta përjashtuar atë në nënregionin e fundit. Në të vërtetë, të dhënat tona ChIP, të cilat zbulojnë një dekacilitim të histoneve të ndërmjetësuar nga kokaina në promotorin e gjenit të CaMKIIα vetëm në thelbin e NAc, mbështesin përfshirjen e mundshme të një mekanizmi të kromatinës. Në përputhje me këtë hipotezë, ekspresioni i ΔFosB në llojin D1 të tipit MSNs ishte në gjendje të nxiste induksionin CaMKIIα në thelbin e NAc në mungesë të kokainës (Fig 3F), duke sugjeruar që ka modifikime aktive të promotorit të CaMKIIα që parandalojnë këtë induksion gjatë ekspozimit kronik të kokainës. Rregullimi i pejsazhit të kromatinës në promotorin e CaMKII mund të shpjegojë gjithashtu pse CaMKII është nxitur nga një dozë sfiduese e kokainës në guaskë NAc të krimeve kronike tërheqëse të kokainës (Fig 1E), por jo të kafshëve naivë të drogës (Fig 1D). Kjo mund të paraqesë një efekt epigenetik të "gjenit të gjeneve" të ΔFosB (Robison dhe Nestler, 2011) dhe mund të jetë kështu një mekanizëm molekular i inkubacionit të dëshirës së kokainës (Pickens et al., 2011). Megjithatë, për këtë ndryshim të kromatinit të lidhet kauzalisht me inkubimin e dëshirës, ​​do të duhej të rritet me kalimin e kohës. Do të jetë interesante të përcaktohet nëse ky është rasti, dhe të studiohet nëse gjenet e tjera tregojnë rregullimin e veçantë të sub-rajonit nga AFP-ja, nga kokaina. Është gjithashtu e rëndësishme të theksohet se loop-feed-forward ne përshkruaj nuk të çon në një akumulim të pafund të CaMKII ose ΔFosB (Fig 1E); zbulimi i "frenave" molekulare përgjegjëse për këtë është një objektiv i rëndësishëm i studimeve të ardhshme.

Funksionet e njohura të ΔFosB dhe CaMKII në disa sisteme eksperimentale dhe rajone të trurit konvergojnë në shumë nivele (Fig 6F). Të dy molekulat janë të lidhura ngushtë me rritjen e shtyllës së dendritit: CaMKII ndërvepron me actin cytoskeleton (Okamoto et al., 2009), rregullon madhësinë e kokës së shtyllës (Matsuzaki et al., 2004), dhe është e nevojshme dhe e mjaftueshme për rritjen e plasticitetit të shtresave të filopodisë dhe sinapsit në kulturat e fetë organotypike hippocampale (Jourdain et al., 2003), wqë ΔFosB është e nevojshme dhe e mjaftueshme për formimin e shtyllës së dendritit të shkaktuar nga kokainë në MSN-të e NAc (Maze et al., 2010). Përveç kësaj, të dy molekulat janë shoqëruar me rregullimin e receptorëve AMPA glutamate. CaMKII nuk rregullon nivelet e përgjithshme të nënkomunave të receptorit AMPA, por drejton futjen e receptorëve të AMPA në synapse dhe rrit performancën e kanalit AMPA duke fosforiluar GluA1 në Ser831 në neuronet piramidale hippocampale në kulturë dhe in vivo (shqyrtuar në (Malinow dhe Malenka, 2002; Colbran dhe Brown, 2004)). Trafikimi i tillë i shtuar i GluA1 në sinapsi është përfshirë në veprimin kronik të kokainës (Boudreau dhe Wolf, 2005). Për më tepër, përgjigjet e sjelljes ndaj aktivizimit të receptorit AMPA në NAc rriten nga overexpression CaMKIIα në një D1 dopamin receptor-varur mënyrë (Singer et al., 2010). Ekzeksioni i tejzgjatur i D1-ve afatgjatë i ΔFosB ka treguar të nxisë transkriptimin e GluA2 në NAc (Kelz et al., 1999), e cila zbut përgjigjet e AMPA-s të ndërmjetësuar nëpërmjet GluA1, ndërkohë që ne tregojmë këtu se ekspozimi më i shkurtër i ΔFosB-së, si dhe ekspozimi më i shkurtër i kokainës-nuk kanë efekt në këtë nën-njësi (Fig 1). Sidoqoftë, ne kemi gjetur kohët e fundit se shprehja afatshkurtër e ΔFosB tejkalon përgjigjet AMPA në MSNs të tipit D1 në NAc (Grueter et al., 2013). Këto të dhëna sugjerojnë mekanizma të përkohshëm të përkohshëm që mund të përbëjnë një seri të kohës të varur të neuroadaptimeve ndaj kokainës që janë në themel aspekte të ndryshme të progresionit të varësisë që ende nuk kuptohen mirë. Në nivelin e sjelljes, si CaMKII dhe ΔFosB janë të nevojshme për sensibilizimin e lokomotoreve ndaj kokainës (shih më sipër), dhe të dyja janë të nevojshme për vetë-administrimin e qëndrueshëm të kokainës në brejtës (Colby et al., 2003; Wang et al., 2010), duke sugjeruar se dy proteinat janë të rëndësishme për përshtatjet afatshkurtë dhe afatgjata të sjelljes ndaj ekspozimit të drogës, megjithëse përmes mekanizmave pjesërisht të dallueshëm. Me sa duket, ΔFosB dhe CaMKII rregullojnë përshtatjet e tilla komplekse të sjelljes përmes ndryshimeve në funksionin sinaptik NAc, edhe pse shumë punë të mëtejshme nevojiten për të lidhur drejtpërdrejt fenomenet sinaptike me ndryshimin e sjelljes.

Holoenzim CaMKII në të njëjtën kohë bashkëvepron me një shumëllojshmëri proteinash të lidhur me sinapsin (Robison et al., 2005) të cilat mendohet të rregullojnë synimin e saj ndaj densitetit postsinaptik (PSD), një fenomen që sugjerohet të jetë i rëndësishëm për plasticitetin synaptik. Në veçanti, ndërveprimi i CaMKII me nën-njësinë GluN2B të receptorit të glutamatit të llojit NMDA u shfaq kohët e fundit për të rregulluar si plasticitetin synaptik dhe të mësuarit (Halt et al., 2012). Ndërsa peptidi AC3I imiton domenin autoinhibitor të CaMKII, dhe kështu pengon aktivitetin katalitik të enzimës, ajo gjithashtu bllokon ndërveprime të shumta proteina-proteina (Strack et al., 2000; Robison et al., 2005). Kështu, efektet e sjelljes dhe morfologjike të HSV-GFP-AC3I të raportuara këtu mund të ndodhin nëpërmjet fosforilimit të reduktuar të proteinave të targetuara CaMKII, ndryshimeve në targetimin e CaMKII, ose një ndryshimi në rolin strukturor të propozuar të CaMKII në synapseLisman et al., 2002).

Kufizimi i lakit të propozuar ΔFosB-CaMKII në shell NAc është me rëndësi të veçantë, pasi puna e kohëve të fundit ka treguar disa dallime fiziologjike midis shell shell dhe core në përgjigje të administrimit të kokainës, një nocion konfirmuar nga të dhënat tona të paanshme iTRAQ (Tabela S1) . MSNs në shell NAc tregojnë një depresion në aftësinë e qitjes pas kokainës kronike që është mbështetur për javë, ndërsa MSN qendrore nga të njëjtat kafshë shfaqin një rritje të përkohshme (1-3 ditë) në kapacitetin e qitjes që kthehet në nivele bazë brenda 2 javëveKourrich dhe Thomas, 2009). Përveç kësaj, proteina të shumta sinaptike janë rregulluar në mënyrë të diferencuar në shell NAc vs thelbi i kafshëve të ekspozuara ndaj kokainës kronike, përfshirë GluA2 (Knackstedt et al., 2010). Meqenëse amfetamina kronike shkakton CaMKIIa në mënyrë specifike në shell NAc (Loweth et al., 2010), nuk është për t'u habitur që ne gjejmë një efekt të ngjashëm me kokainën. Megjithatë, si ΔFosB është shkaktuar në të dy shell NAc dhe thelbi nga kokaina kronike (Perrotti et al., 2008), dhe meqë tregojmë se indukimi i CaMKIIα në predhë është i varur nga ΔFosB, gjetjet tona ofrojnë dëshmi të reja për mekanizma të dallueshëm transkripsion në promotorin e CaMKIIα ndërmjet këtyre dy nënrajoneve, të cilat janë përgjegjëse për induksionin selektiv të CaMKIIα në predhë.

Një pjesë e madhe e punës së kohëve të fundit është përqendruar në përcaktimin e dallimeve midis DsNUMX dhe D1 të tipit NAc MSNs. Edhe pse të dy receptorët D2 dhe D1 janë përfshirë në efektet e dobishme të kokainës (Vetë, 2010), puna e kohëve të fundit tregon se aktivizimi optogjenetik i MSN-ve të tipit D1 rrit përgjigjet e sjelljes ndaj kokainës, ndërsa aktivizimi i D2-it të tipit MSN ka efekt të kundërt (Lobo et al., 2010). Në përputhje me këto gjetje, minjtë e eliminuar të receptorit D1 janë të mangët në blerjen e vetë-administrimit të kokainës (Caine et al., 2007), ndërsa knockouts D2 nuk janë (Caine et al., 2002). Administrimi agonist D1 drejtpërdrejt në NAc shkakton sjelljen e kërkimit të kokainës në paradigmat e rivendosjes (Vetë, 2010). Interesante, ky efekt kërkon rritje të varur nga receptori D1 në aktivitetin e CaMKII në shell NAc, por jo thelbësore (Anderson et al., 2008), një rezultat që përputhet bukur me D1- dhe shell-specifike ΔFosB-CaMKII loop propozuar këtu.

Ne kemi raportuar më parë se Ser27 në ΔFosB mund të phosphorylated nga kazeinë kinase-2 (Ulery et al., 2006), megjithatë, ne vendosim këtu se CaMKII phosphorylates ΔFosB në këtë dhe vende të tjera me kinetikë dhe stoichiometry shumë më të madhe dhe mund të përsëris M më të lartë të dukshme_r vërejtur për ΔFosB (Fig 5A) me ekspozimin e kokainës in vivo (Nestler, 2008). Ne tashmë e dimë që fosforilimi i Ser27 rrit stabilitetin e ΔFosB dhe aktivitetin transkripcional (Ulery et al., 2006; Ulery dhe Nestler, 2007; Ulery-Reynolds et al., 2009). Puna e ardhshme tani do të fokusohet në identifikimin dhe pasojat funksionale të vendeve të reja të phosphorylation ΔFosB treguar nga studimi aktual.

Kruaji i avancuar i përshkruar këtu siguron një mekanizëm të re bindës, sipas të cilit administrimi i përsëritur i kokainës shkakton anomalitë progresive në NAc. Si i tillë, ky rrugë biokimike mund të sigurojë një objektiv të rëndësishëm për ndërhyrjen e ardhshme terapeutike në çrregullime problematike. Sepse CaMKII është i pranishëm dhe kërkohet për shumë funksione bazike neuronale dhe të sjelljes, përdorimi i drejtpërdrejtë i inhibitorëve të CaMKII është shmangur si një trajtim i varësisë. Të dhënat tona sugjerojnë se synimi më i hollë i mekanizmit të induksionit CaMKII, i cili është specifik për një tip qelizash individuale dhe nënregion të qarkut të shpërblimit të trurit, mund të sigurojë një objektiv terapeutik që do të shmangte ndërlikimet e frenimit sistemik të CaMKII.

Shko tek:

Mirënjohje

Kjo punë u mbështet nga grantet e Institutit Kombëtar për Abuzimin e Drogës (EJN), Qendrës Mbrojtëse të NIDA-Yale-it DA018343 (AJR dhe EJN) dhe Hartwell Foundation (AJR). Autorët do të donin të falënderonin Gabby Rundenko për dhuratën bujare të ΔFosB dhe Roger Colbran të pastruar për dhuratën bujare të CaMKIIα të pastruar.

Shko tek:

Referencat

1. Ahmed SH, Koob GF. Tranzicioni nga marrja e medikamenteve në drogë: Ndryshimi në pikën hedonike. Shkenca. 1998; 282: 298-300. [PubMed]
2. Anderson SM, KR i famshëm, Sadri-Vakili G, Kumaresan V, Schmidt HD, Bass CE, Terwilliger EF, Cha JH, Pierce RC. CaMKII: një urë biokimike që lidh akumulimin e dopamines dhe sistemeve të glutamatit në kërkimin e kokainës. Nat Neurosci. 2008; 11: 344-353. [PubMed]
3. Boudreau AC, Wolf ME. Sensibilizimi i sjelljes ndaj kokainës është i lidhur me rritjen e shprehjes së sipërfaqes së receptorit AMPA në bërthamën accumbens. J Neurosci. 2005; 25: 9144-9151. [PubMed]
4. Brickey DA, Colbran RJ, Fong YL, Soderling TR. Shprehja dhe karakterizimi i alfa-subunitit të Ca2 + / kinodin II të varur nga kollodulina duke përdorur sistemin e shprehjes bakulovirus. Biochem Biophys Res Commun. 1990; 173: 578-584. [PubMed]
5. Roli i receptorëve të ngjashëm me dopamine D2 në vetë-administrimin e kokainës: studime me minj mutante të receptorit D2 dhe një receptor i ri D2 antagoniste. J Neurosci. 2002; 22: 2977-2988. [PubMed]
6. Caine SB, Thomsen M, Gabriel KI, Berkowitz JS, Gold LH, Koob GF, Tonegawa S, Zhang J, Xu M. Mungesa e vetëadministrimit të kokainës në receptorët e D1 dopamine. J Neurosci. 2007; 27: 13140-13150. [Artikulli i lirë i PMC] [PubMed]
7. Carle TL, Ohnishi YN, Ohnishi YH, Alibhai IN, Wilkinson MB, Kumar A, Nestler EJ. Mekanizmat e varur nga proteasome dhe të pavarur për destabilizimin e FosB: identifikimi i FosB degron domains dhe implikimet për stabilitetin DeltaFosB. Eur J Neurosci. 2007; 25: 3009-3019. [PubMed]
8. Chen J, Kelz MB, Zeng G, Sakai N, Steffen C, Shockett PE, Picciotto MR, Duman RS, Nestler EJ. Kafshët transgjenike me shprehje indicibile të gjenit në tru në tru. Mol Pharmacol. 1998; 54: 495-503. [PubMed]
9. Christoffel DJ, Golden SA, Dumitriu D, Robison AJ, Janssen WG, Ahn HF, Krishnan V, Reyes CM, Han MH, Ables JL, Eisch AJ, Dietz DM, Ferguson D, Neve RL, Greengard P, Kim Y, Morrison JH , Russo SJ. IkappaB kinase rregullon humbjen sociale të stresit të shkaktuar nga synaptika dhe plasticiteti i sjelljes. J Neurosci. 2011; 31: 314-321. [Artikulli i lirë i PMC] [PubMed]
10. Colbran RJ. Inaktivimi i Ca2 + / proteinat kinazë II të varur nga kalmodulin nga autofosforilacioni bazal. J Biol Chem. 1993; 268: 7163-7170. [PubMed]
11. Colbran RJ. Fosfatazat e proteinave dhe plasticiteti synaptik i varur nga kalciumi / kelodulin-i varur nga proteina kinaza II. J Neurosci. 2004; 24: 8404-8409. [PubMed]
12. Colbran RJ, Brown AM. Kalciumi / kinodina II e varur nga kalmodulin dhe plasticiteti synaptik. Curr Opin Neurobiol. 2004; 14: 318-327. [PubMed]
13. Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, Vetë DW. Zmadhimi i tepërt i tipit qelizor striatoz të DeltaFosB rrit nxitjen për kokainë. J Neurosci. 2003; 23: 2488-2493. [PubMed]
14. Covington HE, 3rd, Maze I, LaPlant QC, Vialou VF, Ohnishi YN, Berton O, Fass DM, Renthal W, Rush AJ, 3rd, Wu EC, Ghose S, Krishnan V, Russo SJ, Tamminga C, Haggarty SJ, Nestler EJ. Veprimet kundër depresionit të inhibitorëve të histon-deacetilase. J Neurosci. 2009; 29: 11451-11460. [Artikulli i lirë i PMC] [PubMed]
15. Davalos A, Fernandez-Hernando C, Sowa G, Derakhshan B, Lin MI, Lee JY, Zhao H, Luo R, Colangelo C, Sessa WC. Proteomika sasiore e proteinave të rregulluara nga caveolin-1: karakterizimi i polimerazës i dhe faktorit të çlirimit të transkriptimit / CAVIN-1 IN qelizat endoteliale. Mol Cell Proteomics. 2010; 9: 2109-2124. [Artikulli i lirë i PMC] [PubMed]
16. Faktorët e rrezikut për përfundimin e vetëvrasjeve në depresion të madh: një studim i rastit të sjelljeve impulsive dhe agresive në burra. Am J Psikiatria. 2005; 162: 2116-2124. [PubMed]
17. Grueter BA, Robison AJ, Neve RL, Nestler EJ, Malenka RC. ΔFosB diferencialisht modulon funksionin e drejtpërdrejtë dhe indirekt të bërthamës accumbens. Proc Natl Acad Sci USA. 2013 në shtyp. [Artikulli i lirë i PMC] [PubMed]
18. Halt AR, Dallapiazza RF, Zhou Y, Stein IS, Qian H, Juntti S, Wojcik S, Brose N, Silva AJ, Hell JW. Lidhja CaMKII me GluN2B është kritike gjatë konsolidimit të kujtesës. EMBO J. 2012; 31: 1203-1216. [Artikulli i lirë i PMC] [PubMed]
19. Hiroi N, Brown JR, Haile CN, Ye H, Greenberg ME, Nestler EJ. Minj mutantë FosB: humbja e induksionit kronik të kokainës të proteinave të lidhura me Fos dhe ndjeshmëria e shtuar ndaj efekteve psikomotorike dhe shpërblyese të kokainës. Proc Natl Acad Sci US A. 1997; 94: 10397–10402. [Artikulli i lirë i PMC] [PubMed]
20. Ito R, Robbins TW, Everitt BJ. Kontrolli i diferencuar mbi sjelljen e kërkuar nga kokaina nga bërthama dhe predha e nucleus accumbens. Nat Neurosci. 2004; 7: 389-397. [PubMed]
21. Jorissen HJ, Ulery PG, Henri L, Gourneni S, Nestler EJ, Rudenko G. Dimerizimi dhe vetitë e lidhjes DNA të faktorit të transkriptimit DeltaFosB. Biokimi. 2007; 46: 8360-8372. [PubMed]
22. Jourdain P, Fukunaga K, Muller D. Kalciumi / kinodina II e varur nga kalmodulin kontribuon në rritjen e filopodisë dhe formimin e shtyllës spinale. J Neurosci. 2003; 23: 10645-10649. [PubMed]
23. Kelz MB, Chen J, Carlezon WA, Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, Vetë DW, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Nestler EJ. Shprehja e faktorit të transkriptimit deltaFosB në tru kontrollon ndjeshmërinë ndaj kokainës. Nature. 1999; 401: 272-276. [PubMed]
24. Klug JR, Mathur BN, Kash TL, Wang HD, Matthews RT, Robison AJ, Anderson ME, Deutch AY, Lovinger DM, Colbran RJ, Winder DG. Ndalimi gjenetik i CaMKII në Neurons Spiny Medium Striatal Dorsal Reduces Synapses Funksional Excitatory dhe përmirëson Excitability Intrinse. PLoS Një. 2012, 7: e45323. [Artikulli i lirë i PMC] [PubMed]
25. Knackstedt LA, Moussawi K, Lalumiere R, Schwendt M, Klugmann M, Kalivas PW. Trajnimi i zhdukjes pas vetë-administrimit të kokainës shkakton plasticitet glutamatergik për të penguar kërkimin e kokainës. J Neurosci. 2010; 30: 7984-7992. [Artikulli i lirë i PMC] [PubMed]
26. Kourrich S, Thomas MJ. Neuronet e ngjashme, përshtatjet e kundërta: përvoja psikostimuluese ndryshon në mënyrë të ndryshueshme pronat e qitjes në thelbin e akumulimeve kundrejt predhë. J Neurosci. 2009; 29: 12275-12283. [Artikulli i lirë i PMC] [PubMed]
27. Kourrich S, Klug JR, Majford M, Thomas MJ. AMPAR-Efekti i Pavarur i AlfaCaMKII Striatal Promovon Sensibilizimin e Shpërblimit të Kokainës. J Neurosci. 2012; 32: 6578-6586. [Artikulli i lirë i PMC] [PubMed]
28. LaPlant Q, Chakravarty S, Vialou V, Mukherjee S, Koo JW, Kalahasti G, Bradbury KR, Taylor SV, Maze I, Kumar A, Graham A, Birnbaum SG, Krishnan V, Truong HT, Neve RL, Nestler EJ, Russo SJ . Roli i faktorit bërthamor kappaB në hypersensitivity stresit të ndërmjetësuar me hormon ovarian në minj femra. Biol Psikiatria. 2009; 65: 874-880. [Artikulli i lirë i PMC] [PubMed]
29. Lee KW, Kim Y, Kim AM, Helmin K, Nairn AC, Greengard P. Prodhimi i shtyllës së dendritit të shkaktuar nga kokaina në receptorët e D1 dhe D2 që përmbajnë receptorët dopaminë që përmbajnë neuronet e mesme të mprehtë në nucleus accumbens. Proc Natl Acad Sci USA A. 2006; 103: 3399-3404. [Artikulli i lirë i PMC] [PubMed]
30. Lisman J, Schulman H, Cline H. Baza molekulare e funksionit CaMKII në kujtesën sinaptike dhe të sjelljes. Nat Rev Neurosci. 2002; 3: 175-190. [PubMed]
31. Lobo MK, Covington HE, 3rd, Chaudhury D, Friedman AK, Sun H, Damez-Werno D, DM Dietz, Zaman S, Koo JW, Kennedy PJ, Mouzon E, Mogri M, Neve RL, Deisseroth K, Han MH, Nestler EJ. Humbja specifike e tipit qelizor të sinjalizimit BDNF imiton kontrollin optogenetik të shpërblimit të kokainës. Shkenca. 2010; 330: 385-390. [Artikulli i lirë i PMC] [PubMed]
32. Loweth JA, Baker LK, Guptaa T, Guillory AM, Vezina P. Ndalimi i CaMKII në shell nucleus accumbens zvogëlon futje të shtuar të amfetaminës në rats të sensibilizuar. Neurosci Lett. 2008; 444: 157-160. [Artikulli i lirë i PMC] [PubMed]
33. Loweth JA, Singer BF, Baker LK, Wilke G, Inamine H, Bubula N, Alexander JK, Carlezon WA, Jr, Neve RL, Vezina P. Zmadhim i tejdukshëm i proteins kinazës II të alfa-Ca2 + / kollodulinu të varur në shell nucleus accumbens rrit sjelljen duke iu përgjigjur amfetaminës. J Neurosci. 2010; 30: 939-949. [Artikulli i lirë i PMC] [PubMed]
34. Malinow R, Malenka RC. Trafikimi i receptorëve AMPA dhe plasticiteti synaptik. Annu Rev Neurosci. 2002; 25: 103-126. [PubMed]
35. Matsuzaki M, Honkura N, Ellis-Davies GC, Kasai H. Baza strukturore e fuqizimit afatgjatë në shtyllat e vetme dendrite. Nature. 2004; 429: 761-766. [PubMed]
36. Mayford M, Bach ME, Huang YY, Wang L, Hawkins RD, Kandel ER. Kontrolli i formimit të memories nëpërmjet shprehjes së rregulluar të një transgene CaMKII. Shkenca. 1996; 274: 1678-1683. [PubMed]
37. Mehmeti E, Neve RL, Haggarty SJ, Ren Y, Sampath SC, Hurd YL, Greengard P, Tarakhovsky A, Schaefer A, Nestler EJ. Roli thelbësor i histone methyltransferase G3a në plasticitetin e nxitur nga kokaina. Shkenca. 9; 2010: 327-213. [Artikulli i lirë i PMC] [PubMed]
38. McClung CA, Nestler EJ. Rregullimi i shprehjes së gjeneve dhe shpërblimi i kokainës nga CREB dhe DeltaFosB. Nat Neurosci. 2003; 6: 1208-1215. [PubMed]
39. Nestler EJ. Shqyrtim. Mekanizmat transkripcionalë të varësisë: roli i DeltaFosB. Philos Trans R Soc Lond Biol Sci. 2008; 363: 3245-3255. [Artikulli i lirë i PMC] [PubMed]
40. Nye HE, Hope BT, MB Kelz, Iadarola M, Nestler EJ. Studime farmakologjike për rregullimin e induksionit antigjen kronik të FOS nga kokaina në striatum dhe nucleus accumbens. J Pharmacol Exp Ther. 1995; 275: 1671-1680. [PubMed]
41. Okamoto K, Bosch M, Hayashi Y. Rolet e CaMKII dhe F-actin në plasticitetin strukturor të spines dendritike: një identitet molekular i mundshëm i një etiketi synaptik? Fiziologjia (Bethesda) 2009; 24: 357-366. [PubMed]
42. Olausson P, Jentsch JD, Tronson N, Neve RL, Nestler EJ, Taylor JR. DeltaFosB në bërthamë accumbens rregullon sjelljen instrumentale dhe motivimin e ushqimit të përforcuar. J Neurosci. 2006; 26: 9196-9204. [PubMed]
43. Paxinos G, Watson C. Truri i miut në koordinatat stereotak. Edicioni 6th. Amsterdam; Boston: Press Akademik / Elsevier; 2007.
44. Peakman MC, Colby C, Perrotti LI, Tekumalla P, Carle T, Ulery P, Chao J, Duman C, Steffen C, Monteggia L, Allen MR, Stock JL, Duman RS, McNeish JD, Barrot M, Self DW, Nestler EJ , Schaeffer E. Inducible, shprehja specifike e rajonit të trurit të një mutanti dominant negativ të c-Jun në minjtë transgenic zvogëlon ndjeshmërinë ndaj kokainës. Brain Res. 2003; 970: 73-86. [PubMed]
45. Penzes P, Cahill ME, Jones KA, Srivastava DP. Konvergentet e sinjaleve CaMK dhe RacGEF kontrollojnë strukturën dhe funksionimin e dendritit. Trendet Cell Biol. 2008; 18: 405-413. [PubMed]
46. Perrotti LI, Hadeishi Y, Uleri PG, Barrot M, Monteggia L, Duman RS, Nestler EJ. Induksioni i deltaFosB në strukturat e trurit të lidhura me shpërblimin pas stresit kronik. J Neurosci. 2004; 24: 10594-10602. [PubMed]
47. Perrotti LI, Weaver RR, Robison B, Renthal W, Maze I, Yazdani S, Elmore RG, Knapp DJ, Selley DE, Martin BR, Sim-Selley L, Bachtell RK, Vetë DW, Nestler EJ. Modele të dallueshme të induksionit DeltaFosB në tru nga drogat e abuzimit. Synapse. 2008; 62: 358-369. [Artikulli i lirë i PMC] [PubMed]
48. Pickens CL, Airavaara M, Theberge F, Fanous S, Hope BT, Shaham Y. Neurobiologjia e inkubacionit të drogës. Trendet Neurosci. 2011; 34: 411-420. [Artikulli i lirë i PMC] [PubMed]
49. Pierce RC, Quick EA, Reeder DC, Morgan ZR, Kalivas PW. Transmetuesit e dytë të ndërmjetësuar nga kalciumi e rregullojnë shprehjen e sensibilizimit të sjelljes ndaj kokainës. J Pharmacol Exp Ther. 1998; 286: 1171-1176. [PubMed]
50. Quirion R, Robitaille Y, Martial J, Chabot JG, Lemoine P, Pilapil C, Dalpe M. Autoradiografi i trurit të trurit të njeriut duke përdorur seksionet e hemisferës së tërë: një metodë e përgjithshme që minimizon artefaktet e indeve. Synapse. 1987; 1: 446-454. [PubMed]
51. Robinson TE, Kolb B. Plastika strukturore e lidhur me ekspozimin ndaj drogave të abuzimit. Neuropharmacology. 2004; 47 (Suppl 1): 33-46. [PubMed]
52. Robison AJ, Nestler EJ. Mekanizmat transkripcionalë dhe epigjenetikë të varësisë. Nat Rev Neurosci. 2011; 12: 623-637. [Artikulli i lirë i PMC] [PubMed]
53. Robison AJ, Bass MA, Jiao Y, MacMillan LB, Carmody LC, Bartlett RK, Colbran RJ. Ndërveprimet multivalente të proteins kinazës II të varur nga kalciumi / kalmodulina me proteinat e densitetit postinaptik NR2B, densin-180, dhe alfa-aktinin-2. J Biol Chem. 2005; 280: 35329-35336. [PubMed]
54. Ross PL, Huang YN, Marchese JN, Williamson B, Parker K, Hattan S, Khainovski N, Pillai S, Dey S, Daniels S, Purkayastha S, Juhasz P, Martin S, Bartlet-Jones M, Pappin DJ. Shumëzimi i sasisë së proteinave në Saccharomyces cerevisiae duke përdorur reagentë etiketues isobarik amine-reaktive. Mol Cell Proteomics. 2004; 3: 1154-1169. [PubMed]
55. Russo SJ, DM Dietz, Dumitriu D, Morrison JH, Malenka RC, Nestler EJ. Synapsi i varur: mekanizmat e plasticitetit synaptik dhe strukturor në nucleus accumbens. Trendet Neurosci. 2010; 33: 267-276. [Artikulli i lirë i PMC] [PubMed]
56. Vetë DW. Në: Receptorët e dopaminës. Neve KA, redaktor. Nju Jork: Humana Press; 2010. f. 479-524.
57. Singer BF, Loweth JA, Neve RL, Vezina P. Zmadhimi i tepërt i virusit i ndërmjetëm i proteins kinazës II alfa-kalcium / kollodulinë në shell nucleus accumbens çon në përmirësimin funksional të alfa-amino-3-hidroksil-5 -metil-4-izoksazole-propionate: receptori i tipit dopamin 1 dhe varësia protein kinazës A. Eur J Neurosci. 2010; 31: 1243-1251. [Artikulli i lirë i PMC] [PubMed]
58. Strack S, McNeill RB, Colbran RJ. Mekanizmi dhe rregullimi i proteins kinazës II të varur nga kalciumi / kalmodulin, duke u fokusuar në nënnënën NR2B të receptorit N-metil-D-aspartat. J Biol Chem. 2000; 275: 23798-23806. [PubMed]
59. Ulery-Reynolds PG, Castillo MA, Vialou V, Russo SJ, Nestler EJ. Fosforila e DeltaFosB ndërmjetëson stabilitetin e saj në vivo. Neuroscience. 2009; 158: 369-372. [Artikulli i lirë i PMC] [PubMed]
60. Ulery PG, Nestler EJ. Rregullimi i aktivitetit transkripcional të DeltaFosB nga fosforilimi i Ser27. Eur J Neurosci. 2007; 25: 224-230. [PubMed]
61. Ulery PG, Rudenko G, Nestler EJ. Rregullimi i stabilitetit të DeltaFosB nga fosforilimi. J Neurosci. 2006; 26: 5131-5142. [PubMed]
62. Vialou V, et al. DeltaFosB në qarqet e shpërblimit të trurit ndërmjetëson elasticitetin ndaj stresit dhe përgjigjeve kundër depresionit. Nat Neurosci. 2010; 13: 745-752. [Artikulli i lirë i PMC] [PubMed]
63. Wang L, Lv Z, Hu Z, Sheng J, Hui B, Sun J, Ma L. Aktivizimi kronik i kokainës H3 dhe aktivizimi transkripcional i CaMKIIalpha në bërthamë accumbens është kritik për motivimin për përforcimin e ilaçeve. Neuropsychopharmacology. 2010; 35: 913-928. [Artikulli i lirë i PMC] [PubMed]
64. Werme M, Messer C, Olson L, Gilden L, Thoren P, Nestler EJ, Brene S. Delta FosB rregullon drejtimin e rrotave. J Neurosci. 2002; 22: 8133-8138. [PubMed]
65. Winstanley CA, LaPlant Q, Theobald DE, Green TA, Bachtell RK, Perrotti LI, DiLeone RJ, Russo SJ, Garth WJ, Vetë DW, Nestler EJ. Induksioni DeltaFosB në korteksin orbitofrontal ndërmjetëson tolerancën ndaj mosfunksionimit njohës të kokainës. J Neurosci. 2007; 27: 10497-10507. [PubMed]
66. Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchman T, Berton O, Sim-Selley LJ, Dileone RJ, Kumar A, Nestler EJ. Një rol esencial për DeltaFosB në bërthamë accumbens në veprim morfinë. Nat Neurosci. 2006; 9: 205-211. [PubMed]
67. Zhang R, Khoo MS, Wu Y, Yang Y, Grueter CE, Ni G, Çmimi EE, Jr, Thiel W, Guatimosim S, Këngë LS, Madu EC, Shah AN, Vishnivetskaya TA, Atkinson JB, Gurevich VV, Lederer WJ, Colbran RJ, Anderson ME. Ndalimi Calmodulin kinase II mbron nga sëmundjet strukturore të zemrës. Nat Med. 2005; 11: 409-417. [PubMed]