Ј Неуросци. 2006 May 10;26(19):5131-42.
Улери ПГ, Руденко Г, Нестлер ЕЈ.
извор
Одсјек за психијатрију, Центар за основну неурознаност, Универзитет у Тексасу, југозападни медицински центар, Даллас, Тексас КСНУМКС-КСНУМКС, САД.
Апстрактан
Фактор транскрипције ДелтаФосБ (који се такође назива ФосБКСНУМКС или ФосБ [кратка форма]) је важан посредник дуготрајне пластичности индуковане у мозгу хроничним излагањем неколико типова психоактивних стимуланса, укључујући дроге злоупотребе, стрес и електроконвулзивне нападе . Посебна карактеристика ДелтаФосБ-а је да, једном када је индукована, перзистира у мозгу релативно дуго времена у одсуству даље стимулације. Механизми на којима се заснива ова привидна стабилност, међутим, остају непознати. Овде показујемо да је ДелтаФосБ релативно стабилан фактор транскрипције, са полуживотом од приближно КСНУМКС х у култури ћелија. Даље, показали смо да је ДелтаФосБ фосфопротеин у мозгу и да га фосфорилација високо конзервираног серинског остатка (СерКСНУМКС) у ДелтаФосБ штити од протеасомалне деградације. Нудимо неколико линија доказа који указују да је ова фосфорилација посредована казеин киназом КСНУМКС. Ови налази представљају први доказ да је ДелтаФосБ фосфорилисан и да показују да фосфорилација доприноси њеној стабилности, која је у сржи њене способности да посредује у дуготрајним адаптацијама у мозгу.
увод
Фактор транскрипције ΔФосБ, такође означен као ФосБКСНУМКС или ФосБ [кратка форма], је Ц-терминално скраћена варијанта споја непосредног раног гена фосб (Добразански ет ал., КСНУМКС; Накабеппу и Натханс, КСНУМКС; Иен ет ал., КСНУМКС). Као ФосБ пуне дужине, ΔФосБ има ДНК везујући основни домен и леуцински затварач кроз који се димеризује са Јун протеинима да формира активатор протеин-КСНУМКС (АП-КСНУМКС) комплекси транскрипционог фактора, који регулишу експресију многих гена (Морган и Цурран, КСНУМКС; Рилски и Кацзмарек, КСНУМКС). Упркос недостатку дела трансактивационог домена који се налази у Ц терминалу ФосБ, ΔФосБ функционише и као снажан транскрипциони активатор и репресор у култивисаним ћелијама иу мозгу (Добразански ет ал., КСНУМКС; Накабеппу и Натханс, КСНУМКС; Цхен ет ал., КСНУМКС; МцЦлунг и Нестлер, КСНУМКС; Кумар ет ал., КСНУМКС).
ΔФосБ се индукује до високих нивоа у региону специфичног начина у мозгу након хроничног, али не и акутног, излагања различитим психоактивним стимулансима, укључујући стрес, одређене лезије, антипсихотичне и антидепресивне лекове, злоупотребе дрога и природне награде. (Хопе ет ал., КСНУМКСб; Хирои и Граибиел, КСНУМКС; Мораталла ет ал., КСНУМКС; Бинг ет ал., КСНУМКС; Манделзис ет ал., КСНУМКС; Келз ет ал., КСНУМКС; Верме ет ал., КСНУМКС; Андерссон ет ал., КСНУМКС; Цолби ет ал., КСНУМКС; Пеакман ет ал., КСНУМКС; Перротти ет ал., КСНУМКС; Зацхариоу ет ал., КСНУМКС). Индукција ΔФосБ је директно повезана са функционалним ефектима неколико ових стимулуса на мозак. Перзистентност ΔФосБ чак иу одсуству додатне стимулације разликује је од свих других транскрипционих фактора породице Фос, који се брзо индукују као одговор на акутне стимулансе, назадују у базалне нивое у року од неколико сати, и генерално показују десензибилизацију након хроничне стимулације (Хопе ет ал., КСНУМКС; Даунаис ет ал., КСНУМКС; Персицо ет ал., КСНУМКС; Хирои и Граибиел, КСНУМКС; Перротти ет ал., КСНУМКС). Ово ΔФосБ чини атрактивним кандидатом за посредовање неких дуготрајних промена у експресији гена које су основа стабилних неуронских адаптација изазваних одређеним хроничним стимулусима.
Због тога што се продужено присуство ΔФосБ јавља у одсуству даље индукције његове мРНК (Цхен ет ал., КСНУМКС), спекулисали смо да, за разлику од ФосБ пуне дужине и свих других протеина породице Фос, који су интринзично нестабилни, ΔФосБ може бити неуобичајено стабилан фактор транскрипције (Хопе ет ал., КСНУМКСб; Цхен ет ал., КСНУМКС; Нестлер ет ал., КСНУМКС; МцЦлунг ет ал., КСНУМКС). Штавише, имуноблотинг анализа акутног у односу на хронично стимулисано мождано ткиво сугерише да се ΔФосБ помера у очигледним Mr (молекулска маса) од НКСНУМКС кДа у акутном стању до НКСНУМКС – КСНУМКС кДа током хроничног лечења (Хопе ет ал., КСНУМКСа; Цхен ет ал., КСНУМКС). Будући да нема доказа за постојање додатних мРНК које би могле кодирати ове различите изоформе, даље смо спекулисали да је ΔФосБ модификован посттранслационо и да то можда доприноси његовој необичној стабилности. До данас, међутим, нису забележене биохемијске анализе промета или посттранслацијских модификација ΔФосБ. Циљ ове студије је био да се утврди да ли је ΔФосБ фосфопротеин и да ли фосфорилација игра улогу у њеној стабилности.
Материјал и метод
Станичне линије сисара и ДНК конструкти.
ПЦКСНУМКС ћелије (Цлонтецх, Моунтаинвиев, ЦА) су култивисане у ДМЕМ са високим садржајем глукозе који садржи л-глутамин (Л-Глн) и допуњен са КСНУМКС% феталним говеђим серумом (ФБС), КСНУМКС% коњским серумом (оба од Инвитроген, Царлсбад, ЦА) , КСНУМКС У / мл пеницилина, и КСНУМКС μг / мл стрептомицина (оба из Сигма-Алдрицх, Ст. Лоуис, МО). ХеЛа ћелије (Америцан Типе Цултуре Цоллецтион, Манассас, ВА) су култивисане у ДМЕМ са високим садржајем глукозе који садржи Л-Глн и допуњен са КСНУМКС% ФБС, пеницилином и стрептомицином. Обе ћелијске линије су одржаване на КСНУМКС ° Ц у влажном КСНУМКС% ЦО2 атмосфера.
За пролазне трансфекције са ДНК, ПЦКСНУМКС или ХеЛа ћелије су засијане на плоче са шест лежишта (обложене колагеном И за ПЦКСНУМКС ћелије) како би се постигао КСНУМКС-КСНУМКС% конфлуенција следећег дана и затим трансфектоване помоћу Липофецтамине КСНУМКС (Инвитроген). У неким експериментима (види Фигс. КСНУМКС⇓⇓⇓⇓⇓-7), ΔФосБ је пролазно експримиран у ПЦКСНУМКС ћелијама путем инфекције рекомбинантним херпес симплек вирусом (ХСВ).
ΔФосБ и ФосБ цДНА су добијени из наших сопствених пТетоп-конструката (Цхен ет ал., КСНУМКС), и субклониран у пцДНАКСНУМКС вектор (Инвитроген). Ови пцДНАКСНУМКС-ΔФосБ / ФосБ конструкти су коришћени за експресију у ћелијама сисара и као шаблон за мутагенезу усмерену на место. Рекомбинантни ХСВ-ΔФосБ је припремљен као што је претходно описано (Неве ет ал., КСНУМКС), а препарат је имао титар КСКСНУМКС × КСНУМКС8 пфу / мл.
Експерименти пулсне потјере.
Приближно КСНУМКС х након инфекције / трансфекције, ћелије (ПЦКСНУМКС или ХеЛа) у плочама са шест лежишта су испране два до три пута са КСНУМКС мл ПБС и инкубиране на КСНУМКС ° Ц за кКСНУМКС х у КСНУМКС мл Цис / Мет-фрее ДМЕМ (Инвитроген) допуњен са КСНУМКС% дијализованим ФБС (Хицлоне, Логан, УТ) да би се исцрпили интрацелуларни базени Мет и Цис. На крају овог периода "изгладњивања" додани су лекови (ако су ћелије лечене) и ћелије су означене (пулсне) са КСНУМКС – КСНУМКС μЦи од 35С Протеин Лабелинг Мик \ тПеркинЕлмер, Веллеслеи, МА) за КСНУМКС х на КСНУМКС ° Ц да би се обележили сви нови синтетизовани протеини. Радиоактивна ознака је затим уклоњена испирањем ћелија два до три пута са КСНУМКС мл ПБС, и 35Пратили су протеине означене са С (цхасе) заменом медијума са "хладним" (нерадиоактивним) медијумом допуњеним са КСНУМКС% ФБС и сакупљањем ћелија у различитим временским тачкама. Третмани ћелија су одржавани током читаве хајке. Све бројке ових експеримената показују сличне почетне количине различитих протеина да би се оптимизовале поређења њихових брзина флуктуације.
Животиње и хронично лијечење епруветама.
Одрасли Спрагуе Давлеи мушки пацови (КСНУМКС-КСНУМКС г; Цхарлес Ривер Лабораториес, Кингстон, РИ) су третирани једном дневно електроконвулзивним нападајима (ЕЦС) за КСНУМКС-КСНУМКС д. ЕЦС је изведен као што је претходно описано (Хопе ет ал., КСНУМКСа) користећи Уго Басиле (Цомерио ВА, Италија) ЕЦС јединица са следећим подешавањима: фреквенција, КСНУМКС импулса / с; пулс с, КСНУМКС мс; трајање шока, КСНУМКС с; и струја, КСНУМКС мА. Лажне контролне животиње су паралелно третиране наношењем електрода за ушну шкољку без електричне струје.
32 П метаболичко означавање.
За обележавање резова мозга, пацови су одсечени главе, мозгови су брзо сецирани, а КСНУМКС μм фронтални кортикални резови су припремљени са ДСК микросликерима (Тед Пелла, Реддинг, ЦА). Резови су инкубирани у пластичним епруветама у КСНУМКС мл вештачког ЦСФ (АЦСФ) дефицијентног са фосфатима и одржавани на КСНУМКС ° Ц под константним благим мешањем са О2/ ЦО2 смеша (Хеммингс ет ал., КСНУМКС). Резови (две кришке по епрувети) су обележени са КСНУМКС мЦи за КСНУМКС-КСНУМКС х у присуству или одсуству окадаичне киселине (КСНУМКС нг / мл). На крају ове инкубације, кришке су испране најмање три пута са хладним АЦСФ и затим хомогенизоване соникацијом у КСНУМКС μл хладног радиоимунопреципитационог теста (РИПА) пуфера [ПБС, пХ КСНУМКС, КСНУМКС мм НаЦл, КСНУМКС% (в / в) ) Игепал, КСНУМКС% (в / в) натријум деоксихолат, КСНУМКС% (в / в) СДС, КСНУМКС мм ЕДТА] допуњен пре употребе са СДС до КСНУМКС%, инхибитор протеазе за ћелије сисара (користи се на КСНУМКС μл / мл; Сигма-Алдрицх), коктели инхибитора фосфатазе И и ИИ (који се користе на КСНУМКС: КСНУМКС; Сигма-Алдрицх), КСНУМКС мм ПМСФ и КСНУМКС% глицерол. Хомогенати су затим кувани током КСНУМКС мин и очишћени центрифугирањем на КСНУМКСк g за КСНУМКС мин. Концентрација протеина у добијеним супернатантима је процењена коришћењем БЦА протеина (Пиерце, Холмдел, Њ).
За 32П обележавање култивисаних ћелија, КСНУМКС х након инфекције / трансфекције, ћелије су испране два до три пута медијумом без фосфата и инкубиране у овом медијуму за КСНУМКС х. После овог периода гладовања, КСНУМКС – КСНУМКС мЦи од 32ПХ3PO4 (ПеркинЕлмер) су додаване свакој јажици, и ћелије су означене за КСНУМКС – КСНУМКС х, у зависности од врсте експеримента (видети слике КСНУМКС – КСНУМКС за спецификације). Ћелије су затим три пута испране са ПБС и лизиране на леду за КСНУМКС мин са КСНУМКС μл допуњеног РИПА пуфера. Лизати су сакупљени стругањем и пропуштени су КСНУМКС пута кроз иглу КСНУМКС га да би се смрвила ДНА, прокувана КСНУМКС мин, и центрифугирана на КСНУМКС рпм за КСНУМКС-КСНУМКС мин на КСНУМКС ° Ц. Очишћени лизати (супернатанти) су пребачени у нову епрувету и изведен је БЦА тест протеина (Пиерце). Све слике ових експеримената показују сличне количине укупног дивљег типа (ВТ) и СКСНУМКСА ΔФосБ протеина за оптимизацију поређења њихових релативних нивоа фосфорилације.
Хемикалије и третмани ћелијске културе.
Окадаична киселина (ОА; Сигма-Алдрицх) је растворена у етанолу и коришћена у коначној концентрацији КСНУМКС нг / мл. КСНУМКС-Дихлоро-КСНУМКС-п-д-рибофуранозил-бензимидазол (ДРБ; Биомол, Плимоутх Меетинг, ПА) је растворен у диметил сулфоксиду (ДМСО; Сигма-Алдрицх) и коришћен у култури ћелија при коначној концентрацији КСНУМКС μм. Спермин (Сигма-Алдрицх) је растворен у води и коришћен у коначној концентрацији КСНУМКС μм. Цалпхостин-Ц (Биомол) је растворен у ДМСО и коришћен на КСНУМКС μм, док је форбол КСНУМКС-миристат КСНУМКС-ацетат (ПМА; Промега, Мадисон, ВИ) растворен у ДМСО и коришћен на КСНУМКС μм. инхибиторни пептид који је везан за миристилирани аутокамтид-КСНУМКС (м-АИП; Биомол) је растворен у води и коришћен у коначној концентрацији КСНУМКС и КСНУМКС μм. Инхибитори протеин-киназе широког спектра Х-КСНУМКС и Х-КСНУМКС (Биомол) су растворени у води и коришћени у коначној концентрацији КСНУМКС и КСНУМКС μм, респективно. МГКСНУМКС (Цалбиоцхем, Сан Диего, ЦА) и епоксомицин (Пептидес Интернатионал, Лоуисвилле, КИ) су оба растворена у ДМСО и коришћена у коначној концентрацији КСНУМКС и КСНУМКС μм, респективно. У свим експериментима, ДМСО (носач) је додаван ћелијама како је неопходно да се одржи константна количина ДМСО преко третмана. За 32П експерименти обележавања, лекови су додавани непосредно пре етикете и чувани током преосталог периода обележавања. За експерименте са пулс-хајком, лекови су додавани у време Цис / Мет "гладовања", чувани кроз период обележавања, и затим додани назад у медиј за хватање. Протеазомски инхибитори су нагомилани на сваки КСНУМКС-КСНУМКС х током читаве хајке да би се компензовао брзи обрт ових пептида.
ΔФосБ имунопреципитација, имуноблотинг и ауторадиографија.
За имунопреципитацију, лизати су разблажени КСНУМКС: КСНУМКС са обичном РИПА да би се концентрација СДС спустила на КСНУМКС% пре настављања са имунопреципитацијом (ИП). Да би се ограничило неспецифично везивање, лизати су прво очишћени имунопреципитацијом са неимуним ИгГ и протеином Г-Сепхаросе (Сигма-Алдрицх) најмање КСНУМКС х. ОсФосБ је затим имунопреципитиран из очишћених лизата употребом козјег поликлонског антитела које препознаје унутрашњи епитоп присутан у оба ФосБ и ΔФосБ (СЦ-КСНУМКСГ; Санта Цруз Биотецхнологи, Санта Цруз, ЦА) на КСНУМКС-КСНУМКС μг ИгГ по КСНУМКС μг лизат протеина (КСНУМКС – КСНУМКС μг укупног протеина) у укупној запремини КСНУМКС мл. ИП су пажљиво мешани на КСНУМКС ° Ц на ротору за најмање КСНУМКС х и затим је додан КСНУМКС μл протеина Г-Сепхаросе и ИП су помешани најмање још са КСНУМКС х. ИП адресе су пелетиране са КСНУМКС × g за КСНУМКС – КСНУМКС мин на КСНУМКС ° Ц, испере се три пута са КСНУМКС мл хладне обичне РИПА и два пута са хладним ПБС који садржи КСНУМКС% Твеен КСНУМКС. ИП-ови су затим ресуспендирани у КСНУМКС мл хладног ПБС-а, пренесени, пелетирани у нову епрувету, а имунопреципитирани протеини су затим елуирани додавањем КСНУМКС-КСНУМКС μл КСНУМКС × редукујућег Лаеммли пуфера за узорке протеина. Овај ИП протокол резултирао је специфичним и ефективним таложењем практично свих ΔФосБ у лизату. Имунопреципитирани протеини су подвргнути СДС-ПАГЕ пуњењем целог ИП на КСНУМКС% Трис-ХЦл Критеријумском гелу (Био-Рад, Херцулес, ЦА), а затим пренесени на ПВДФ или нитроцелулозу. После преноса, мембрана је осушена на ваздуху и 32П- и 35С-радиоактивно обележене протеинске траке су посматране помоћу ауторадиографије користећи Кодак (Роцхестер, НИ) ауторадиографски филм, као и фосфоримагинг коришћењем Сторм (Амерсхам Биосциенцес, Писцатаваи, Њ) ПхоспхорИмагер. Укупни (нефосфорилисани и фосфориловани) ΔФосБ у ћелијским лизатима или хомогенатима мозга откривени су имуноблотирањем било имунопреципитираног протеина (користећи исту мембрану која се користи за детекцију 32П-обележеног протеина), или једнаких количина лизат / хомогенат протеина подвргнутог СДС-ПАГЕ и пребаченог на ПВДФ или нитроцелулозу. Мембрана је прво блокирана инкубацијом са КСНУМКС% (в / в) немасним сувим млеком (Био-Рад) у ПБС допуњеном са КСНУМКС% (в / в) Твеен КСНУМКС (Сигма) за КСНУМКС х на КСНУМКС ° Ц. Мембрана је затим имуноблотирана преко ноћи на КСНУМКС ° Ц са нашим сопственим зечјим анти-ФосБ поликлонским антителом створеним против амино киселина КСНУМКС-КСНУМКС из ФосБ / ΔФосБ (коришћеног у КСНУМКС: КСНУМКС). Након примарне инкубације, мембране су испране четири пута за КСНУМКС мин са блокирајућим пуфером, а затим инкубиране на КСНУМКС ° Ц за КСНУМКС х са козјим анти-зечјим ИгГ коњугованим са пероксидазом хрена (користи се у КСНУМКС: КСНУМКС у блокирајућем пуферу, из Вецтор Лабораториес, Бурлингаме, ЦА). Мембране су затим испране три пута за КСНУМКС мин са блокирајућим пуфером и једном за КСНУМКС мин са ПБС. Укупне ΔФосБ протеинске траке су визуализоване на Кодак МР филму појачаном хемилуминесценцијом (Пиерце) и / или детекцијом флуоресценције коришћењем ЕЦЛ-Плус реагенса (Амерсхам Биосциенцес) и Сторм ПхоспхорИмагер-а.
Прекомерна експресија и пречишћавање рекомбинантног ΔФосБ из ћелија инсеката.
ΔФосБ је прекомерно експримиран у СфКСНУМКС ћелијама инсеката као Н-терминални хекса-Хис-означени протеин (Н-Хис (КСНУМКС) ΔФосБ) користећи Бац-то-Бац систем експресије бацуловируса (Инвитроген) и следећи упутства произвођача. Укратко, ΔФосБ цДНА (остаци КСНУМКС-КСНУМКС) којој је претходио афинитетни Н-терминални таг МГХХХХХХАГ је субклониран у пФАСТБацТМКСНУМКС вектор, који је коришћен за генерисање рекомбинантног бакуловируса. СфКСНУМКС ћелије су инфициране са рекомбинантним вирусом, и Н-Хис (КСНУМКС) ΔФосБ је пречишћен из ћелијских лизата помоћу неколико хроматографских корака укључујући афинитетну хроматографију користећи колону никла (Киаген, Валенциа, ЦА), ањонску измену помоћу моно-К колоне (Амерсхам) Биосциенцес), и искључивање величине помоћу колоне за гел-филтрацију (Амерсхам Биосциенцес).
Ин витро студије фосфорилације.
Ин витро Реакције фосфорилације за временски ток и стехиометријску анализу изведене су у запремини КСНУМКС μл која садржи КСНУМКС μм супстрат (Н-Хис (КСНУМКС) ΔФосБ или позитивни контролни супстрат), КСНУМКС μм АТП и КСНУМКС μЦи / μл [и-32П] АТП, пуфер који је обезбеђен од произвођача киназе, и једна од следећих киназа: ЦККСНУМКС (КСНУМКС нг / μл; Упстате, Цхарлоттесвилле, ВА), ЦаМКИИ (КСНУМКС нг / μл; Упстате), ПКЦ (КСНУМКС нг / μл; Цалбиоцхем) или пКСНУМКССКСНУМКСК (КСНУМКС мУ / μл; Упстате). Реакције током времена изведене су уклањањем аликвота КСНУМКС μл из реакционог раствора у назначеним временским тачкама и додавањем једнаке запремине КСНУМКС × редукујућег Лаеммли протеина пуфера за узорке. Кинетички параметри Мицхаелис-Ментена за реакцију ЦККСНУМКС одређени су под емпиријски дефинисаним линеарним стационарним условима. Ове реакције су извршене за КСНУМКС мин у запремини КСНУМКС μл који садржи ензим КСНУМКС нг / μл, КСНУМКС μм АТП, КСНУМКС μЦи / μл [γ-32П] АТП, и Н-Хис (КСНУМКС) ΔФосБ концентрације у распону од КСНУМКС-КСНУМКС μм. Све реакције су изведене на КСНУМКС ° Ц у воденом купатилу. Након СДС-ПАГЕ и бојења гела са Био-Сафе Цоомассие (Био-Рад), гел је осушен, и 32Инкорпорација П-фосфата је процењена помоћу фосфоримаге анализе (види доле, Квантификација података, калкулације и статистике).
Дводимензионална мапа фосфопептида и анализа фосфоамино киселине.
Обе ове анализе су изведене како је описано Плоегх и Дунн (КСНУМКС). Укратко, суви фрагменти гела који садрже 32П-обележен ΔФосБ (било од ин витро реакције или из имунопреципитата метаболички обележених ћелија), су исечене, рехидратисане, испране и подвргнуте пробави. Супернатант који садржи продукте пробавног триптика је лиофилизован и лиофилат је испран неколико пута и ресуспендован у КСНУМКС μл пуфера за електрофорезу, пХ КСНУМКС. Узорак (КСНУМКС μл) је уочен на плочи танкослојне кроматографије (ТЛЦ) на целулози (Аналтецх, Неварк, ДЕ) и раздвојен у једној димензији електрофорезом, а друга димензија узлазном ТЛЦ. Добијене мапе фосфопептида су визуелизоване помоћу ауторадиографије и фосфоризовања. За анализу фосфоамино киселине, КСНУМКС μл триптичних дигестија који су ресуспендовани у пуферу за електрофорезу су даље одцепљени хидролизом ХЦл на КСНУМКС ° Ц за КСНУМКС мин у КСНУМКС м ХЦл под Н2 атмосфера. Реакција је заустављена са шестоструким разблаживањем у води и смеша је лиофилизована. Лиофилат је ресуспендован у КСНУМКС μл електрофорезног пуфера, пХ КСНУМКС, и нанесен на ТЛЦ плочу целулозе, заједно са фосфо-Сер, -Тхр и -Тир стандардима. Електрофореза је изведена преко половине дужине ТЛЦ плоче употребом електрофорезног пуфера, пХ КСНУМКС, а затим је плоча пребачена у пХ КСНУМКС пуфер, и извршена је електрофореза до завршетка. Стандарди фосфоамино киселине су визуализовани распршивањем ТЛЦ плоче са КСНУМКС% (в / в) раствором нинхидрина у ацетону, и 32П-обележени аминокиселински узорци су визуализовани и ауторадиографијом и фосфоримагингом.
сиРНА-индукован ЦККСНУМКСα кноцк-довн.
Користили смо РНА методу интерференције за селективно снижавање нивоа ЦККСНУМКС (Ди Маира ет ал., КСНУМКС). ПЦКСНУМКС ћелије су засијане на колагене И-обложене плоче са шест лежишта да би се постигао енцеКСНУМКС – КСНУМКС% конфлуентност следећег дана, када су пролазно трансфициране са КСНУМКС нм (коначна концентрација) или нонтаргетске сиРНА или сиРНА усмерене ка мРНА каталитичког α подјединица Рат ЦККСНУМКС, користећи КСНУМКС μл средства за трансфекцију СилентФецтин (Био-Рад) и пратећи упутства произвођача. Приближно КСНУМКС х касније, ћелије су пролазно трансфициране са ΔФосБ плазмидом, као што је горе наведено. Приближно КСНУМКС х касније (НКСНУМКС х након трансфекције сиРНА), ћелије су биле подвргнуте или 32П метаболичко обележавање или пулсно-хајка анализа као што је горе описано. Следећа четири ЦККСНУМКСа сиРНА су коришћена са сличним резултатима: КСНУМКС′П-ЦАААЦУАУААУЦГУАЦАУЦУУКСНУМКС ′, КСНУМКС УП-УЦААЦУЦАУААУЦУУЦЦГУУКСНУМКС Кс (Дхармацон, Лафаиетте, ЦО). Као негативну контролу користили смо Силенцер негативна контрола #КСНУМКС сиРНА из Амбиона (Аустин, ТКС). Степен ЦККСНУМКС кноцк-довн је праћен имуноблотирањем коришћењем анти-ЦККСНУМКС поликлонског антитела (каталог # КСНУМКС-КСНУМКС из Упстате) преко ноћи на КСНУМКС: КСНУМКС разблажењу. П-Тубулин је коришћен као контрола пуњења и детектован са моноклонским антителом (каталог # КСНУМКС-КСНУМКС из Упстате) преко ноћи на КСНУМКС: КСНУМКС разблажењу.
Сите-усмјерена мутагенеза.
Мутација СерКСНУМКС у Ала или Асп је постигнута коришћењем комплета за мутагенезу са брзом променом места (Стратагене, Ла Јолла, ЦА) и следећи упутства произвођача. Да би се увеле мутације СерКСНУМКС у мишјем ΔФосБ протеину, коришћени су следећи прајмери мутагенезе. СерКСНУМКС до Ала: (реверсе пример) КСНУМКС′ГЦЦГААГГАГТЦЦАЦЦГАAGCЦАГГТАЦТГАГАЦТЦГГЦГГАГГГКСНУМКС ′. СерКСНУМКС то Асп (форвард пример) КСНУМКС′ЦЦЦТЦЦГЦЦГАГТЦТЦАГТАЦЦТГGATТЦГГТГГАЦТЦЦТТЦГГЦКСНУМКС ′. Мутиране базе су подебљане, а кодон СерКСНУМКС је у курзиву.
Биоинформатика.
Потенцијална места фосфорилације и киназе за ΔФосБ су претраживане слањем протеинске секвенце миша у специјализоване базе података укључујући и ПроСите (http://www.expasy.org/prosite/), ПредицтПротеин (Рост ет ал., КСНУМКС), и НетПхосК (Блом и др., КСНУМКС).
Квантификација података, калкулације и статистике.
Количина протеина присутна у ПВДФ или нитроцелулозној мембрани је квантификована коришћењем Сторм ПхоспхорИмагер и пратећег ИмагеКуант софтвера (Амерсхам Биосциенцес / Молецулар Динамицс). У студијама фосфорилације култура ћелија и мозга, добијене вредности за 32П-обележени протеин је затим подељен са вредностима добијеним за укупни ΔФосБ, и изражен као однос. Ин тхе ин витро студије фосфорилације, количина 32П-обележен ΔФосБ по молу ΔФосБ (стехиометрија) израчунат је како је претходно описано (Сахин ет ал., КСНУМКС). Сва мерења су вршена у опсегу линеарности коришћеног инструмента. Кинетички параметри су израчунати коришћењем Мицхаелис-Ментен модела, при чему V = VМакс[S] / ([S]+KM) и VМакс = k2[Eукупан]. Полуживот (t1/2) ΔФосБ и ФосБ процијењени су из дијаграма пулсне хајке (користећи нелинеарну регресију која најбоље одговара точкама података) и одговарају времену у којем је количина преосталог протеина КСНУМКС% од оригинала. На свим цифрама, приказани резултати су репрезентативни за најмање два до три независна експеримента. У свим графовима приказани подаци су просјеци ± СЕМс (КСНУМКС ≤ n ≤КСНУМКС). Статистичка значајност разлика процењена је коришћењем неспареног t тест, коригован за вишеструка поређења, и означавају звездице p ≤ КСНУМКС.
Резултати
ΔФосБ је необично стабилан фактор транскрипције
Иако смо раније спекулисали да је ΔФосБ релативно стабилан фактор транскрипције (Нестлер ет ал., КСНУМКС), није извршена директна анализа профила промета протеина. Да бисмо одговорили на ово питање, спровели смо експерименте са пулсном хајком употребом ПЦКСНУМКС ћелија, које су се у великој мери користиле као неуронска ћелијска линија, у којој је ΔФосБ пролазно експримиран путем инфекције рекомбинантним херпес симплек вирусом (ХСВ-ΔФосБ). Новосинтетисани протеини су метаболички обележени 35С-Мет / Цис, и модел деградације 35С-означено ΔФосБ (35С-ΔФосБ) је праћен имунопреципитацијом из ћелијских лизата добијених у различитим временским тачкама након уклањања радиообележених амино киселина. Анализа имунопреципитата помоћу СДС-ПАГЕ и ауторадиографије показала је да је полу-живот ΔФосБ у ПЦКСНУМКС ћелијама НКСНУМКС х (Сл. КСНУМКС). Ови резултати показују да је полу-живот ΔФосБ већи него код већине индуцибилних транскрипционих фактора (види дискусију), укључујући ФосБ у пуној дужини, чији је полу-живот у култури ћелија забележен као НКСНУМКС мин (Добразански ет ал., КСНУМКС; Царле ет ал. КСНУМКС). Поред тога, вреди напоменути да деградација ΔФосБ не одговара експонентној кризи распада првог степена, већ је бифазнија, почевши са споријом стопом деградације. Ово сугерише постојање више од једне ΔФосБ врсте и / или више од једног пута деградације.
Прикажи већу верзију:
Слика КСНУМКС.
ΔФосБ је необично стабилан фактор транскрипције. Полуживот ΔФосБ је ∼КСНУМКС х у култури ћелија. ΔФосБ је експримиран у ПЦКСНУМКС ћелијама било инфекцијом са ХСВ-ΔФосБ или пролазном трансфекцијом са ΔФосБ-садржавајућим плазмидом, и ћелије су биле подвргнуте експериментима са пулсном потезом као што је описано у Материјали и методе. Еквивалентни резултати су добијени без обзира на метод који је коришћен за преекспресију ΔФосБ. На слици је приказан временски ток (и репрезентативни ауторадиограм) деградације ΔФосБ. Уцртани подаци су просечни ± СЕМ од најмање КСНУМКС појединачних тачака података добијених из најмање пет независних експеримената. За поређење, индикован је полу-живот ФосБ-а пуне дужине.
ΔФосБ је фосфопротеин у мозгу
Претпоставили смо да посттранслацијска модификација ΔФосБ може допринијети његовој привидној стабилности. Пошто се показало да фосфорилација модулира активност транскрипционих фактора на много начина, укључујући њихову стабилност (за преглед, види Дестерро ет ал., КСНУМКС; Вхитмарсх и Давис, КСНУМКС), испитали смо да ли је ΔФосБ фосфопротеин. У том смислу, експресија ΔФосБ индукована је у мозгу пацова коришћењем хроничне ЕЦС, третмана за који се зна да индукује високе нивое ΔФосБ, посебно у фронталном кортексу (Хопе ет ал., КСНУМКСа). Један дан после последњег ЕЦС третмана, када су ΔФосБ нивои високи, припремљени су танки фронтални кортикални резови и метаболички обележени 32П-ортофосфат. Паралелни скуп резова није био радиообележен, и они су коришћени за детекцију укупних ΔФосБ нивоа. После имунопреципитације са специфичним анти-ФосБ / ΔФосБ антителом и одвајањем имунопреципитираних протеина помоћу СДС-ПАГЕ, фосфорилисаних 32П-обележени ΔФосБ детектован је ауторадиографијом, док је укупни ΔФосБ детектован имуноблотингом. Ова анализа је открила да је ΔФосБ фосфорилисан у мозгу, што доказује специфичан 32П-обележена трака НКСНУМКС кДа која је присутна у хронично третираним узорцима мозга, али је практично немогуће детектовати у контролним контролама (Сл. КСНУМКСA). Ово је у складу са чињеницом да, у одсуству хроничне стимулације, базални ниво ΔФосБ је веома низак. Специфичност реакције имунопреципитације је илустрована недостатком сигнала у неимунском талогу ИгГ.
Прикажи већу верзију:
Слика КСНУМКС.
ΔФосБ је фосфопротеин у мозгу. AΔФосБ је фосфорилисан у мозгу. Ендогени ΔФосБ је индукован у мозгу пацова хроничним ЕЦС третманом као што је описано у Материјали и методе. Фронтални кортикални резови су метаболички обележени 32ПХ3PO4 неколико сати. После хомогенизације пресека, ΔФосБ је имунопреципитиран и фосфорилисан ΔФосБ (32П-ΔФосБ) детектован је ауторадиографијом (горњи панел). Укупни ΔФосБ у нонрадиоактивним имунопреципитатима детектован је имуноблотингом (доњи панел). Као негативне контроле, приказани су имунопреципитат лажно третираних животиња и неимуних ИгГ. B, Места кандидата за фосфорилацију и киназе са одговарајућим резултатима предвиђања за мишју ΔФосБ секвенцу протеина су добијене биоинформатичком анализом. Мјеста кандидата са вишим резултатима предвиђања су истакнута у секвенци протеина и наведена у табели. ДНК-везујући (основни) домен и леуцински затварач су подебљани у протеинској секвенци. C, DΔФосБ фосфорилација је повећана са Сер / Тхр фосфатазним инхибитором ОА. C, 32Нивои П-ΔФосБ у имунопреципитатима са фронталних кортикалних резова обележених у одсуству (Цтр) или присуство КСНУМКС нг / мл ОА (граф и горњи панел) детектовани су ауторадиографијом. Доњи панел приказује укупни ΔФосБ детектован у имунопреципитатима из необиљежених резова имуноблотингом. D, ПЦКСНУМКС ћелије су инфициране са ХСВ-ΔФосБ или ХСВ-ЛацЗ (вектор) и метаболички обележене 32ПХ3PO4 у одсуству (Цтр) или присуству КСНУМКС нг / мл ОА. 32Нивои П-ΔФосБ у имунопреципитатима детектовани су ауторадиографијом (граф, горњи панел). Доњи панел приказује укупни ΔФосБ детектован у ћелијским лизатима имуноблотингом.
Као први корак ка разјашњењу које киназе (е) и место (а) су укључени у ΔФосБ фосфорилацију, подвргли смо њену аминокиселинску секвенцу неколико биоинформатских анализа. Ово је открило да, иако ΔФосБ не садржи Тир фосфорилациона места кандидата, он садржи неколико Сер / Тхр киназа консензус локација, укључујући три ЦаМКИИ места, три ЦККСНУМКС места, и два ПКЦ места са веома високим резултатима предвиђања фосфорилације (Сл. КСНУМКСB). Ако је, као што је предвиђено путем биоинформатике, ΔФосБ само фосфорилисан на Сер или Тхр остацима, онда би његова фосфорилација требала бити значајно модулирана активностима Сер / Тхр фосфатаза. Да бисмо тестирали ову хипотезу, означили смо фронталне кортикалне резове 32П-ортофосфат у присуству или одсуству ОА, инхибитора Сер / Тхр протеин фосфатазе. Као што је приказано у Слика КСНУМКСC, ОА је изазвао велико повећање (НКСНУМКС-фолд) 32П-ΔФосБ. Такође је изазвао мали пораст укупних ΔФосБ нивоа, што је у складу са претходним извештајима који повезују карциногене ефекте ОА са његовом способношћу да индукује неколико раних раних гена укључујући Фос протеине (Миллер ет ал., КСНУМКС; Цхое ет ал., КСНУМКС). Нето резултат је значајно повећање (∼КСНУМКС%) у нивоима фосфорилисаних ΔФосБ.
Затим смо истражили да ли је у ПЦКСНУМКС ћелијама, које су више подложне експерименталној манипулацији, ΔФосБ показао узорак фосфорилације сличан ономе који се види у мозгу. Изразили смо ΔФосБ у ПЦКСНУМКС ћелијама путем инфекције са ХСВ-ΔФосБ и метаболички обележили ћелије са 32П-ортофосфат у присуству или одсуству ОА. Успешна експресија и имунопреципитација протеина из ХСВ-ΔФосБ-инфицираних ћелија приказана је присуством у имуноблоту (Сл. КСНУМКСD, доњи панел) и ауторадиограф (горњи панел) КСНУМКС кДа опсега, који нису присутни у ћелијама инфицираним вектором. Као што је уочено у мозгу, ОА је узроковала мали пораст укупних ΔФосБ нивоа, али много већи (приближно двоструки) пораст 32П-ΔФосБ, што доводи до значајног (УМКСНУМКС%) нето повећања ΔФосБ фосфорилације. Поред тога, у складу са биоинформатичким предвиђањима, третман ПЦКСНУМКС ћелија са Тир фосфатазним инхибитором није довео до значајних промена у 32Нивои П-ΔФосБ (подаци нису приказани). Заједно, ови резултати су открили да је ΔФосБ фосфорилисан на Сер и / или Тхр остацима у мозгу и у ПЦКСНУМКС ћелијама и потврдио је да је ово добар систем ћелијске културе у коме се даље проучавају профили фосфорилације и деградације ΔФосБ.
ЦККСНУМКС, али не ПКЦ или ЦаМКИИ фосфорилира ΔФосБ ин витро
Као што је горе описано, анализа аминокиселинске секвенце ΔФосБ открила је високе оцене за ЦККСНУМКС, ПКЦ и ЦаМКИИ места фосфорилације. Да би се одредило која од ових киназа може фосфорилисати ΔФосБ, спровели смо серију ин витро реакције фосфорилације употребом пречишћених киназа и пречишћеног рекомбинантног ΔФосБ. Као што је приказано у Слика КСНУМКСAОд три кандидатне киназе, само ЦККСНУМКС је фосфорилисао ΔФосБ на значајан начин. Додатно, неколико других киназа је тестирано (нпр. ГСККСНУМКС и пКСНУМКССКСНУМКСК) али нису успеле да значајно фосфорилишу ΔФосБ (подаци нису приказани). Додатна карактеризација реакције ЦККСНУМКС према временском току показала је да ова киназа може катализовати инкорпорацију НКСНУМКС мол фосфата по молу ΔФосБ (Сл. КСНУМКСB). Чињеница да ЦККСНУМКС може фосфорилисати ΔФосБ ин витро до значајне стехиометрије (НКСНУМКС%) указује на физиолошки релевантну реакцију. Затим смо проучавали кинетику ове реакције инкубирањем ЦККСНУМКС у присуству повећаних количина пречишћеног ΔФосБ, и утврдили смо да ЦККСНУМКС фосфорилира ΔФосБ са VМак КСНУМКС пмол · мин-КСНУМКС · Μг-КСНУМКС ензима, а KM од КСНУМКС μм, и а kкако од КСНУМКС / с (Сл. КСНУМКСC). Добијене вредности за ове кинетичке параметре даље подржавају физиолошку релевантност ове реакције. На пример, KM ЦККСНУМКС за ДАРППКСНУМКС, један од његових најпознатијих супстрата, је КСНУМКС μм, а kкако је УМКСНУМКС / с (Гираулт ет ал., КСНУМКС); тхе KM за АТП распоне од НКСНУМКС – КСНУМКС μм (Цоцхет ет ал., КСНУМКС; Силва-Нето ет ал., КСНУМКС), и да се за казеин креће од НКСНУМКС – КСНУМКС μм (Меггио ет ал., КСНУМКС; Пиерин ет ал., КСНУМКС). Заједно, ови подаци указују да је ΔФосБ бона фиде супстрат за ЦККСНУМКС ин витро.
Прикажи већу верзију:
Слика КСНУМКС.
ЦККСНУМКС, али не ПКЦ или ЦаМКИИ фосфорилира ΔФосБ ин витро. Ауторадиограф (горњи панел) показује фосфориловани производ, а Цоомассие-обојени гел (доњи панел) показује укупни ΔФосБ присутан у реакцији. AПрочишћени рекомбинант ΔФосБ је подвргнут ин витро фосфорилација са различитим кандидатским киназама (од којих су три приказане). BВременски ток и стехиометријске анализе указују да ЦККСНУМКС може фосфорилисати ΔФосБ ин витро са стехиометријом од кКСНУМКС%. CКинетичка анализа реакције ЦККСНУМКС-а показала је да је ΔФосБ бона фиде ин витро супстрат. Линеаризација реакције је приказана у двоструко-реципрочном дијаграму (дно), али су кинетички параметри изведени из Мицхаелис-Ментен-ове криве (горе).
ЦККСНУМКС модулира фосфорилацију и стабилност ΔФосБ у интактним ћелијама
Да бисмо проценили физиолошку релевантност фосфорилације ΔФосБ посредоване са ЦККСНУМКС-ом, спровели смо упоредно мапирање фосфопептида користећи ин витро фосфорилован и ПЦКСНУМКС-ћелијски фосфорилисан ΔФосБ. После СДС-ПАГЕ и гел елуирања 32П-ΔФосБ (од ин витро или из имунопреципитата 32П-обележене ћелије), протеин је дигестиран са трипсином, а добијени фосфопептиди су подвргнути дводимензионалној сепарацији. Ова анализа је открила да је главни фосфопептид из реакције ЦККСНУМКС комбинован са једним од два главна фосфопептида из ΔФосБ фосфорилисаног у ПЦКСНУМКС ћелијама (Сл. КСНУМКСA), док фосфопептиди који су резултат ПКЦ или ЦаМКИИ (подаци нису приказани) реакција није. Постојао је други ΔФосБ фосфопептид присутан у мапи из ПЦКСНУМКС ћелија, али због немогућности било које од киназа које смо тестирали да би се генерисао сличан фосфопептид ин витротренутно не знамо да ли овај други фосфопептид садржи место фосфорилације које се разликује од другог фосфопептида или да ли представља посебан триптични пептид који садржи исто место фосфорилације.
Прикажи већу верзију:
Слика КСНУМКС.
ЦККСНУМКС модулира фосфорилацију и стабилност ΔФосБ у интактним ћелијама. AЧини се да ЦККСНУМКС, али не и ПКЦ, фосфорилише ΔФосБ у ћелијама. Дводимензионалне фосфопептидне мапе ΔФосБ фосфориловане са ЦККСНУМКС или ПКЦ ин витро или интактних ПЦКСНУМКС ћелија. Стрелице показују комиграцију ЦККСНУМКС-фосфорилованог пептида, али не и ПКЦ-фосфорилисане са једним од ΔФосБ фосфопептида добијених из ПЦКСНУМКС ћелија. BΔФосБ фосфорилација у ПЦКСНУМКС ћелијама се повећава третирањем ћелија са снажним активатором ЦККСНУМКС спермина (СП) и смањује се третманом са ЦККСНУМКС инхибитором ДРБ. Насупрот томе, ΔФосБ фосфорилација у ПЦКСНУМКС ћелијама није била под утицајем третмана са ПКЦ активатором (ПМА) или ПКЦ-специфичним инхибитором цалпхостин-Ц (Цалпх). Приказани су репрезентативни ауторадиограм (горњи панел) и имуноблот (доњи панел). Ц – Ф, Утицај активности ЦККСНУМКС на стабилност ΔФосБ. Слике показују временски ток (и репрезентативни ауторадиограм) деградације ΔФосБ. ПЦКСНУМКС ћелије које су пролазно експримирале ΔФосБ су биле подвргнуте експериментима пулсне потраге који су спроведени у одсуству или присуству инхибитора ЦККСНУМКС ДРБ (C), активатор ЦККСНУМКС спермин (D), или инхибитор киназе широког спектра Х-КСНУМКС (E), који је коришћен за контролу неспецифичних ефеката ДРБ. F, Утицај куцања каталитичке подјединице ЦККСНУМКС на стабилност ΔФосБ. ПЦКСНУМКС ћелије су трансфектоване било са нетаргетирајућом сиРНК (Цтр) или сиРНА циљањем пацова ЦККСНУМКСа и КСНУМКС х касније трансфициране са ΔФосБ плазмидом. Горњи панел приказује имуноблот целизирајућих лизата који показују ефекат ЦККСНУМКС сиРНА на ЦККСНУМКС и ΔФосБ нивое протеина. Одговарајући имуноблот за β-тубулин је приказан као контрола пуњења.
Да би се даље адресирала физиолошка важност ЦККСНУМКС као ΔФосБ киназе, третирали смо ΔФосБ-експримирајуће ПЦКСНУМКС ћелије са два лека који модулирају активност ЦККСНУМКС. Као што је приказано у Слика КСНУМКСB, ΔФосБ фосфорилација је смањена третманом ПЦКСНУМКС ћелија са ЦККСНУМКС инхибитором ДРБ који је пропустљив за ћелије (Меггио ет ал., КСНУМКС; Сзисзка и др., КСНУМКС), и повећан третманом са полиамин спермином, познатим као моћан ЦККСНУМКС активатор (Цоцхет и Цхамбаз, КСНУМКС; Меггио ет ал., КСНУМКС). Насупрот томе, третман ПЦКСНУМКС ћелија са ПКЦ инхибитором калфостином-Ц (Кобаиасхи ет ал., КСНУМКС; Тамаоки и др., КСНУМКС) или ПКЦ активатор ПМА (Сцхмидт и Хецкер, КСНУМКС; Бех ет ал., КСНУМКС) није резултирало значајним промјенама ΔФосБ фосфорилације. У случају ПМА, благо (а не значајно) повећање у 32П-ΔФосБ се може објаснити повећањем укупних ΔФосБ нивоа изазваних овим леком; у ствари, објављено је да естери форбола индукују експресију неколико протеина породице Фос, укључујући ФосБ (Иоза ет ал., КСНУМКС; Сух ет ал., КСНУМКС). Поред тога, третман ћелија са специфичним ЦаМКИИ инхибитором м-АИП који пропушта ћелије (Исхида и Фујисава, КСНУМКС; Стевенс ет ал., КСНУМКС) такође није резултирало смањењем фосфорилације ΔФосБ (подаци нису приказани). Заједно, ови резултати су у складу са нашим ин витро Налази и указују да је у интактним ћелијама ΔФосБ вероватно фосфорилисан са ЦККСНУМКС, али не и ПКЦ или ЦаМКИИ. Чињеница да ЦККСНУМКС инхибиција у потпуности не спречава ΔФосБ фосфорилацију указује на постојање додатних места фосфорилације у протеину.
Затим смо испитали да ли ЦККСНУМКС игра улогу у промету ΔФосБ и тиме у његовој стабилности. У ту сврху, спровели смо експерименте пулс-цхасе користећи ΔФосБ-експримирајуће ПЦКСНУМКС ћелије третиране било са ЦККСНУМКС инхибитором или са ЦККСНУМКС активатором који је коришћен у студији фосфорилације. Као што је приказано у Слика КСНУМКСC, третман ћелија са инхибитором ЦККСНУМКС ДРБ имао је значајан утицај на брзину флуктуације ΔФосБ, што се доказује променом облика његове криве деградације, од бифазне до криве која је ближа кривој експоненцијалног распада. Насупрот томе, присуство активатора ЦККСНУМКС спермина изазвало је значајно смањење брзине разградње ΔФосБ, што је довело до акумулације протеина током првих сати хајке (Сл. КСНУМКСD).
Као што је случај са многим активаторима и инхибиторима киназе, спермин и ДРБ могу имати метаболичке ефекте изван модулације активности ЦККСНУМКС. У ствари, показано је да ДРБ инхибира киназу транскрипционог фактора ИИХ (ТФИИХ) (Ианкулов и др., КСНУМКС), што резултира инхибицијом транскрипције посредоване РНА полимеразом ИИ. Пошто је овај ефекат могао да утиче на стабилност ΔФосБ, анализирали смо ефекат инхибитора киназе широког спектра Х-КСНУМКС (Хидака и Кобаиасхи, КСНУМКС) на промету ΔФосБ у концентрацији (КСНУМКС μм) за коју је познато да инхибира ТФИИХ-повезану киназу, али не и ЦККСНУМКС (Ианкулов и др., КСНУМКС). Као што је приказано у Слика КСНУМКСE, третман са Х-КСНУМКС није утицао на брзину обртања ΔФосБ. Слични резултати су добијени са Х-КСНУМКС, другим инхибитором киназе широког спектра, који се користи у концентрацији која инхибира ТФИИХ-повезану киназу, али не и ЦККСНУМКС (подаци нису приказани). Ови подаци даље подржавају тумачење да се смањење стабилности ΔФосБ узроковано ДРБ-ом највероватније може приписати инхибицији ЦККСНУМКС-а.
Да би се даље утврдила улога ЦККСНУМКС-а у ΔФосБ промету, истражили смо последице обарања ЦККСНУМКС-а преко сиРНА. Ми смо извршили ове експерименте користећи ПЦКСНУМКС ћелије које су прво трансфициране са контролном (нонтаргетском) сиРНК или сиРНК која циља на мРНА каталитичке подјединице пацова ЦККСНУМКС (ЦККСНУМКСα) и КСНУМКС х касније трансфициране са ΔФосБ. Као што је приказано у Слика КСНУМКСF, трансфекција са ЦККСНУМКСа сиРНА ефикасно и специфично срушила нивое ЦККСНУМКСα протеина без утицаја на ΔФосБ нивое (горњи панел). Пулсе-цхасе анализа је показала да је обарање ЦККСНУМКС-а резултирало значајним повећањем брзине флуктуације ΔФосБ, што је доказано бржом деградацијом протеина. Чињеница да инхибирање активности ЦККСНУМКС (било путем ДРБ третмана или сиРНА) повећава промет ΔФосБ и резултира нестанком спорије компоненте бифазне кривуље, док ЦККСНУМКС активација побољшава спору фазу кривуље, пружа снажну подршку за идеју да ЦККСНУМКС игра улогу у регулисању стабилности ΔФосБ.
ЦККСНУМКС фосфорилира ΔФосБ на СерКСНУМКС
Да бисмо почели да идентификујемо место (а) на ΔФосБ фосфорилирајућем ЦККСНУМКС, провели смо фосфо-аминокиселинску анализу рекомбинантног ΔФосБ фосфорилираног ЦККСНУМКС. ин витро и ΔФосБ фосфорилисан у ПЦКСНУМКС ћелијама. Ови експерименти су открили да је у оба случаја једина детектована фосфо-амино киселина била фосфо-сер (Сл. КСНУМКСA). Овај налаз, заједно са стехиометријом добијеном за ЦККСНУМКС ин витро реакција фосфорилације (НКСНУМКС%) (Сл. КСНУМКСB) и присуство само једног значајног места на ЦККСНУМКС мапи фосфопептида (Сл. КСНУМКСA), сугерише да је ЦККСНУМКС фосфорилација ΔФосБ вероватно ограничена на један серински остатак. Овај закључак је конзистентан са консензусном анализом фосфорилације (Сл. КСНУМКСB), који предвиђа само један кандидат за серин, тј. СерКСНУМКС, за ЦККСНУМКС. Таксономска анализа је показала да је СерКСНУМКС високо очуван кроз еволуцију међу члановима породице Фос (Сл. КСНУМКСB), сугеришући да може имати важну физиолошку функцију.
Прикажи већу верзију:
Слика КСНУМКС.
ЦККСНУМКС Фосфорилати ΔФосБ на СерКСНУМКС. A, Анализа фосфораминске киселине ЦККСНУМКС-фосфориловане (ин витрои ПЦКСНУМКС ћелијски фосфорилисани ΔФосБ који показује да је у оба случаја главни остатак фосфорилисан серин. B, Анализа различитих врста ФосБ / ΔФосБ секвенце аминокиселина открила је високу конзервацију СерКСНУМКС-а међу члановима породице Фос од човека до зебрице (тамна боја). Међутим, кисели остатак на позицији + КСНУМКС, који је потребан за ЦККСНУМКС консензус локацију, није сачуван (светлост). CХеЛа ћелије су пролазно трансфектоване са дивљим типом ΔФосБ (ВТ) или ΔФосБ које садрже тачкасту мутацију да замене СерКСНУМКС са Ала (СКСНУМКСА). Ћелије су метаболички обележене 32ПХ3PO4 и третирана са вехикулумом или са спермином (СП) да би се активирао ЦККСНУМКС. Приказани су репрезентативни ауторадиограм (горњи панел) и имуноблот (доњи панел) добијених ΔФосБ имунопреципита. Приказан је имунопреципитат лажно-трансфектованих ћелија (вектор).
Да бисмо утврдили да ли је СерКСНУМКС фосфорилисан у ΔФосБ, мутирали смо овај остатак у Ала и анализирали последице на статус фосфорилације протеина. У ту сврху, користили смо ХеЛа ћелије (које се могу трансфектовати са вишом ефикасношћу) да пролазно експримирају било ВТ или СКСНУМКСА мутант ΔФосБ. Приближно КСНУМКС х након трансфекције, ћелије су метаболички обележене 32Припремљени су П-ортофосфат и лизати целих ћелија. После имунопреципитације и СДС-ПАГЕ, 32П-ΔФосБ детектован је ауторадиографијом и укупним ΔФосБ имуноблотингом. Као што је приказано у Слика КСНУМКСC (доњи панел), ΔФосБ није детектован у ћелијама трансфектованим векторима, док су ћелије трансфектоване било са ВТ или СКСНУМКСА мутантом ΔФосБ успешно експримирале протеин. Открили смо да је мутација СКСНУМКСА узроковала значајно (∼КСНУМКС%) смањење у 32Нивои П-ΔФосБ (Сл. КСНУМКСC, горњи панел и граф), што указује да је ΔФосБ у живим ћелијама фосфорилисан на СерКСНУМКС. У настојању да се утврди да ли је у ћелијама СерКСНУМКС заиста фосфорилован са ЦККСНУМКС, ми смо упоредили способност спермина активатора ЦККСНУМКС да модулира фосфорилацију ВТ и СКСНУМКСА ΔФосБ. Као што смо раније приметили у ПЦКСНУМКС ћелијама (Сл. КСНУМКСB), третман ХеЛа ћелија са спермином значајно је повећао фосфорилацију ВТ протеина. Чињеница да је овај ефекат значајно смањен мутацијом СКСНУМКСА (Сл. КСНУМКСC) подржава тумачење да је СерКСНУМКС у ΔФосБ физиолошки супстрат за ЦККСНУМКС.
Фосфорилација СерКСНУМКС регулише стабилност ΔФосБ
Након што је установљено да је стабилност ΔФосБ смањена када је ЦККСНУМКС инхибиран и појачан када је ЦККСНУМКС активиран (Сл. КСНУМКС), и да ЦККСНУМКС фосфорилише ΔФосБ на СерКСНУМКС (Сл. КСНУМКС), предвидели смо да би спречавање фосфорилације овог места требало да дестабилизује протеин. Експерименти са пулсном потезом спроведени са ХеЛа ћелијама које су пролазно експримирале било ВТ или СКСНУМКСА мутант ΔФосБ показале су да, као што је предвиђено, мутација СКСНУМКСА резултирала је значајним повећањем брзине деградације ΔФосБ и пратећим смањењем полуживота протеина (Сл. КСНУМКСA). Затим смо истражили да ли се тај регулаторни механизам појављује иу више неуронској ПЦКСНУМКС станичној линији. Ови експерименти су открили да, као што смо приметили у ХеЛа ћелијама, СКСНУМКСА точкаста мутација узрокује драматично смањење полу-живота ΔФосБ у ПЦКСНУМКС ћелијама (од НКСНУМКС до НКСНУМКС х) (Сл. КСНУМКСB). Чињеница да је та дестабилизација слична оној која је узрокована инхибицијом ЦККСНУМКС-а или нокаутом (Сл. КСНУМКС) пружа даљу подршку идеји да фосфорилација СерКСНУМКС посредована са ЦККСНУМКС регулише стабилност ΔФосБ. Додатни докази за регулаторну улогу фосфорилације СерКСНУМКС на промету ΔФосБ протеина добијени су коришћењем фосфомиметичке СерКСНУМКС до Асп мутације (СКСНУМКСД). МКС мутација СКСНУМКСД се сматра фосфомиметичком, јер ставља велику негативно набијену (карбоксилну) групу на амино киселину КСНУМКС и тиме делимично опонаша фосфорилацију СерКСНУМКС. Као што је приказано у Слика КСНУМКСC, мутација СКСНУМКСД изазвала је супротан ефекат мутације СКСНУМКСА и резултирала је да је протеин значајно стабилнији од ВТ протеина. Слично ефекту који је постигнут након активације ЦККСНУМКС-а (Сл. КСНУМКСD), мутација СКСНУМКСД је резултирала акумулацијом и тако повећала ΔФосБ нивое у првим сатима хајке.
Прикажи већу верзију:
Слика КСНУМКС.
Фосфорилација СерКСНУМКС регулише стабилност ΔФосБ. A, C, Пулсе-цхасе анализа која показује ефекат фосфорилације СерКСНУМКС на брзину флуктуације ΔФосБ. Приказан је профил деградације и процењени полу-живот дивљег типа ΔФосБ (ВТ), мутанта СерКСНУМКС до Ала (СКСНУМКСА) и фосфомиметичког СерКСНУМКС до Асп мутанта (СКСНУМКСД). Исти резултати су добијени у ХеЛа ћелијама (A) и ПЦКСНУМКС ћелије (B, C).
СерКСНУМКС фосфорилација стабилизује ΔФосБ спречавајући његову протеасомалну деградацију
Да бисмо почели да објашњавамо механизам којим фосфорилација СерКСНУМКС-а стабилизује ΔФосБ, испитали смо способност протеазомских инхибитора МГКСНУМКС (Паломбелла ет ал., КСНУМКС; Тсубуки ет ал., КСНУМКС) и епокомицин (Ханада и сар., КСНУМКС; Ким ет ал., КСНУМКС) да се модулира брзина деградације ВТ и СКСНУМКСА мутанта ΔФосБ. Експерименти са пулс-цхасе-ом су спроведени коришћењем ПЦКСНУМКС ћелија инфицираних са рекомбинантним ХСВ који експримира или ВТ или СКСНУМКСА ΔФосБ и третиране са ДМСО или једним од два инхибитора протеасома. Ови експерименти су открили да, иако је брзина деградације ВТ протеина релативно неосетљива на присуство било којег од два инхибитора протеасома (Сл. КСНУМКСA), да је мутант СКСНУМКСА осетљив на ове лекове (Сл. КСНУМКСB). Ово указује да, за разлику од ВТ протеина, СКСНУМКСА мутант је мета протеасомалне деградације. Заиста, третман ћелија било са МГКСНУМКС или епоксомицином потпуно је променио ефекат СКСНУМКСА мутације на брзину деградације ΔФосБ, што се доказује повећањем полу-живота СКСНУМКСА мутанта од ∼КСНУМКС до КСНУМКС х за МГКСНУМКС и до КСНУМКС х за епоксомицин (Сл. КСНУМКСB). Заједно, ови налази указују да фосфорилација ΔФосБ на СерКСНУМКС штити протеин од протеасомалне деградације и стога је неопходна за његову неуобичајену стабилност.
Прикажи већу верзију:
Слика КСНУМКС.
Фосфорилација СерКСНУМКС-а стабилизује ΔФосБ спречавајући његову протеасомалну деградацију. A, B, Пулс-цхасе анализа са ХСВ-инфицираним ПЦКСНУМКС ћелијама које показују профил деградације и процењене полу-животе дивљег типа ΔФосБ (A) или СКСНУМКСА ΔФосБ (Bу одсуству или присуству било ког од два инхибитора протеазома [МГКСНУМКС и епоксомицин (Епоко)]. Обратите пажњу на чињеницу да ни један од лекова нема значајан ефекат на промену дивљег типа ΔФосБ, док је третман ћелија било протеазомским инхибитором резултирао стабилизацијом СКСНУМКСА ΔФосБ. C, Модел за улогу СерКСНУМКС фосфорилације у способности ΔФосБ да посредује у дуготрајној пластичности мозга. Једном када се индукује, део ΔФосБ се стабилизује у мозгу фосфорилацијом СКСНУМКС посредованом са ЦККСНУМКС. То резултира његовом акумулацијом, што резултира дуготрајним промјенама у експресији гена. Ове стабилне промене у експресији гена доприносе стабилним адаптивним понашањима. Насупрот томе, дефосфорилација СКСНУМКС-а са Сер / Тхр фосфатазама ППКСНУМКС и / или ППКСНУМКСА доводи до дестабилизације протеина и његове обраде протеасомалном машином.
Дискусија
У овој студији показали смо да ΔФосБ има полуживот НКСНУМКС х у ћелијској култури, што га чини стабилним у поређењу са ФосБ-ом пуне дужине и већином других индуцибилних фактора транскрипције, чији полу-живот у култури ћелија може бити кратак неколико минута и ретко прелази КСНУМКС х (Ханн и Еисенман, КСНУМКС; Добразански ет ал., КСНУМКС; Робертс и Вхителав, КСНУМКС; Феррара ет ал., КСНУМКС; Хирата ет ал., КСНУМКС). Поред тога, налазимо да је ΔФосБ фосфорилисан у мозгу и да је његова фосфорилација осетљива на инхибитор ППКСНУМКС / ППКСНУМКСА окадаичну киселину. Наше студије култура ћелија показују да је стабилност ΔФосБ модулирана помоћу ЦККСНУМКС, са вишом активношћу ЦККСНУМКС која стабилизује протеин. Коначно, наши налази сугеришу да ЦККСНУМКС фосфорилира ΔФосБ на високо конзервираном серину Н терминус (СКСНУМКС) и показују да фосфорилација СКСНУМКС штити ΔФосБ од протеасомалне деградације. Стога предлажемо модел којим фосфорилација ΔФосБ на СКСНУМКС-у од стране ЦККСНУМКС-а представља критични регулаторни механизам промета ΔФосБ (Сл. КСНУМКСC). Таква стабилизација ΔФосБ посредована фосфорилацијом је функционално важна, јер се показало да повећани ниво ΔФосБ у одређеним регионима мозга директно регулише бројне неуронске гене ин виво и да врше снажне ефекте понашања у животињским моделима неколико неуропсихијатријских поремећаја (види Увод).
Иако је фосфорилација брз и реверзибилан начин регулисања транскрипционе активности одређених транскрипционих фактора, као што је ЦРЕБ (везујући протеин цАМП одговора) (Бохманн, КСНУМКС), модулирање деградације транскрипционих фактора обезбеђује још моћнији (мање лако реверзибилни) облик регулације (Дестерро ет ал., КСНУМКС). Фактори транскрипције чија је функционална активност регулисана на нивоу њихове деградације укључују НФкБ (Дестерро ет ал., КСНУМКС(ц-Миц)Сеарс ет ал., КСНУМКС), и ц-Фос (Феррара ет ал., КСНУМКС), међу другима. У многим случајевима, фосфорилација је кључни регулатор стабилности транскрипционог фактора, као што је показано за ц-Фос (Оказаки и Сагата, КСНУМКС; Тсуруми ет ал., КСНУМКС), Фос-сродни антиген-КСНУМКС (Фра-КСНУМКС) (Виал и Марсхалл, КСНУМКСФра-КСНУМКСМанабе ет ал., КСНУМКС), ц-Јун (Фуцхс ет ал., КСНУМКС), ЈунБ (Фуцхс ет ал., КСНУМКС), АТФКСНУМКС (Фуцхс ет ал., КСНУМКС), и пКСНУМКС (Бусцхманн ет ал., КСНУМКС). Наше студије тако додају ΔФосБ овој листи транскрипционих фактора чија је функционална активност регулисана кроз њену стабилност зависну од фосфорилације.
ЦК2 је свеприсутна и конститутивно активна Сер / Тхр киназа која има> 300 наводних супстрата до сада идентификованих и умешана је у више биолошких процеса, укључујући ћелијску смрт и преживљавање (Литцхфиелд, КСНУМКС; Унгер ет ал., КСНУМКСодговора на ћелијски стрес (Ианагава ет ал., КСНУМКС; Като ет ал., КСНУМКС), и поправак ДНК и ремоделирање хроматина (Барз ет ал., КСНУМКС; Крохн ет ал., КСНУМКС). Више од једне трећине претпостављених супстрата ЦККСНУМКС су протеини укључени у регулацију експресије гена (Меггио и Пинна, КСНУМКС). У ствари, показало се да је ЦККСНУМКС истакнута нуклеарна киназа (Крек ет ал., КСНУМКС) (за преглед, види Иу ет ал., КСНУМКС) и интеракцију са бЗИП доменама неколико фактора транскрипције (Иамагуцхи ет ал., КСНУМКС). Фосфорилација посредована са ЦККСНУМКС такође је показала да модулира деградацију (било да је повећава или смањује) многих протеина, укључујући ИкБ (Сцхварз ет ал., КСНУМКС), ПТЕН (Торрес и Пулидо, КСНУМКС), лећа Цоннекин (Иин ет ал., КСНУМКС(ХМГКСНУМКС)Висниевски ет ал., КСНУМКС), и неколико фактора транскрипције као што је ХМГБ (Стеммер ет ал., КСНУМКС(Миф-КСНУМКС)Винтер ет ал., КСНУМКС), и ц-Миц (Цханнавајхала и Селдин, КСНУМКС). ЦККСНУМКС је најзаступљенији у мозгу (Алцазар ет ал., КСНУМКС; Гираулт ет ал., КСНУМКС), а његова активност је укључена у многе аспекте мождане функције, укључујући преживљавање неурона (Боехнинг ет ал., КСНУМКС), диференцијација (Нутхалл ет ал., КСНУМКС), функција јонског канала (Јонес и Иакел, КСНУМКС; Билдл ет ал., КСНУМКС), и дугорочно појачавање и неуронску пластичност (Диаз-Нидо ет ал., КСНУМКС; Лиеберман и Моди, КСНУМКС; Реикхардт ет ал., КСНУМКС).
Упркос овом растућем доказу за улогу ЦККСНУМКС у регулацији неуронске функције, мало се зна о томе шта контролише његову активност. Сматра се да је ЦККСНУМКС конститутивно активан, са регулацијом његове способности да фосфорилише специфичне супстрате ослањајући се углавном на промене у његовој интрацелуларној локализацији (нпр. Цитосол вс нуклеус) (Ахмед и Тавфиц, КСНУМКС; Иу ет ал., КСНУМКС). Ова информација поставља важно питање у вези са сигналима који су потребни за индуковање акумулације ΔФосБ у мозгу након хроничне стимулације (Сл. КСНУМКСC). Један од услова је поновна активација фосБ ген и индукција ΔФосБ мРНА (Цхен ет ал., КСНУМКС). Наши подаци указују да је ЦККСНУМКС фосфорилација ΔФосБ критична за његову стабилност, што сугерише да други сигнал може бити потребан за дугорочне ефекте ΔФосБ на експресију гена, наиме, сигнал који стимулише фосфорилацију протеина помоћу ЦККСНУМКС. Ово може укључивати активацију ЦККСНУМКС-а неким непознатим механизмом или његову транслокацију у нуклеус. Алтернативно, ЦККСНУМКС фосфорилација ΔФосБ може бити конститутивна, тако да се ΔФосБ протеин преводи као одговор на сваки стимулус, део се добија фосфорилисан и тиме стабилизован, тако да се уз поновљену стимулацију акумулира до високих нивоа у погођеним неуронима.
Наши резултати показују да ЦККСНУМКС и СКСНУМКС вероватно нису једина киназа и место одговорно за фосфорилацију ΔФосБ, јер ни инхибиција ЦККСНУМКС-а ни СКСНУМКСА мутације нису биле у стању да у потпуности спрече ΔФосБ фосфорилацију. Исто тако, чињеница да мутација СКСНУМКСА доводи до КСНУМКС% редукције у фосфо-ΔФосБ тврди да је СКСНУМКС главно место фосфорилације на протеину. Ми, ипак, истражујемо друге претпостављене киназе и места фосфорилације на ΔФосБ. На крају, важно је анализирати и фосфорилацију СКСНУМКС-а и свих других фосфорилационих места у ΔФосБ у мозгу ин виво после различитих типова хроничне стимулације, на пример, употребом масене спектрометрије или фосфоспецифичних антитела.
Као што је горе поменуто, СКСНУМКС у ΔФосБ је високо конзервиран током еволуције и међу другим протеинима породице Фос. Међутим, консензус сајт за ЦККСНУМКС није: као што је приказано у Слика КСНУМКСB, само ФосБ / ΔФосБ (и кенолог зебрафис), али не и ц-Фос или Фра-КСНУМКС, поседују кисели остатак на + КСНУМКС, кључну детерминанту фосфорилације ЦККСНУМКС (Марин ет ал., КСНУМКС; Меггио ет ал., КСНУМКС). Стога, недостатак ЦККСНУМКС фосфорилације на СКСНУМКС може објаснити зашто други протеини породице Фос нису тако стабилни као ΔФосБ. Међутим, ово не објашњава зашто ФосБ пуне дужине, који има исти ЦККСНУМКС консензус као ΔФосБ, није слично стабилизован. Не знамо да ли је ФосБ пуне дужине фосфорилисан са ЦККСНУМКС на овом конзервираном остатку. Једини извештаји ФосБ-а (Скиннер ет ал., КСНУМКС) и ц-Фос (Оказаки и Сагата, КСНУМКС; Цхен ет ал., КСНУМКС) фосфорилација описује места у Ц-терминалном региону ових протеина, која је одсутна у ΔФосБ. Потенцијална фосфорилација ФосБ пуне дужине и других протеина породице Фос од стране ЦККСНУМКС захтева директну истрагу. Међутим, чак и ако су фосфорилисани, познато је да други протеини из породице Фос садрже мотиве на њиховим Ц терминалима који циљају протеине за брзу деградацију (Папавассилиоу ет ал., КСНУМКС; Јариел-Енцонтре ет ал., КСНУМКС; Ацкуавива ет ал., КСНУМКС). На пример, показано је да се део ∼КСНУМКС остатака присутних у Ц терминалу свих протеина породице Фос, али одсутан у ΔФосБ, понаша као дестабилизујући домен за ц-Фос (Ацкуавива ет ал., КСНУМКС). Открили смо да иако ова секвенца слично дестабилизује ФосБ (Царле ет ал., КСНУМКС), одсуство овог домена у ΔФосБ није у потпуности одговорно за његову стабилизацију. Чини се да комбинација одсуства овог Ц терминуса и СерКСНУМКС фосфорилације у потпуности објашњава приближно петоструку разлику у стабилности између ΔФосБ и ФосБ.
Иако је деградација протеина Фос фамилије комплексна и није у потпуности разјашњена, протеасомска деградација је главни пут који је укључен (Салват и др., КСНУМКС; Ацкуавива ет ал., КСНУМКС; Феррара ет ал., КСНУМКС). Овде представљени подаци, у којима протеасомални инхибитори не мењају значајно стопу деградације ΔФосБ, тврде да, за разлику од других протеина Фос фамилије, ΔФосБ избегава КСНУМКСС протеасом, и то игра централну улогу у њеној стабилизацији. Стога предлажемо схему у којој се повећана стабилност ΔФосБ може приписати комбинацији два главна фактора: (КСНУМКС) одсуству Ц-терминалног дестабилизујућег домена и (КСНУМКС) фосфорилацији СКСНУМКС од ЦККСНУМКС.
Укратко, ова студија даје механистички увид у то зашто ΔФосБ, производ непосредног раног гена фосБ, је, за разлику од свих других чланова породице Фос, релативно дуговечни протеин. Иако се сматра да други протеини из породице Фос посредују у брзом али краткотрајном повезивању стимулуса и транскрипције (Морган и Цурран, КСНУМКС), релативна стабилност ΔФосБ му даје способност да посредује у дуготрајнијим транскрипционим променама изазваним хроничном стимулацијом. Ово подржава став да осФосБ функционише као продужени молекуларни прекидач у мозгу, постепено претварајући акутне одговоре у хроничне адаптације. Идентификација фосфорилације СерКСНУМКС као централног механизма за стабилност ΔФосБ отвара нове путеве за развој средстава за регулацију функције ΔФосБ и тиме модулира његове дугорочне ефекте на пластичност неурона и понашања.
Фусноте
- Примљено КСНУМКС, КСНУМКС.
- Ревизија је примљена фебруара КСНУМКС, КСНУМКС.
- Прихваћен Април КСНУМКС, КСНУМКС.
- Овај рад је подржан од стране Националне алијансе за истраживање о шизофренији и награду младог истраживача за депресију ПГУ-у, Националном институту за злоупотребу дрога (НИДА), Националној истраживачкој служби ПГУ-а, и грантовима Националног института за ментално здравље и НИДА за ЕЈН Захвалите се др Јамесу Биббу за његову помоћ са ин витро тестови фосфорилације, др Минг-Ху Хан за помоћ при припреми резова мозга који се користе за обиљежавање метаболизма, и др. Рацхаел Неве за помоћ у пакирању рекомбинантног ХСВ-а.
- Садашња адреса Г. Руденка: Институт за природне науке и Одељење за фармакологију, Универзитет у Мичигену, 210 Васхтенав Авенуе # 3163А, Анн Арбор, МИ 48109-2216.
- Кореспонденцију треба упутити Ерицу Ј. Нестлеру, КСНУМКС Харри Хинес Боулевард, Даллас, ТКС КСНУМКС-КСНУМКС. Е-пошта: [емаил заштићен]
Референце
Ацкуавива Ц, Броцкли Ф, Феррара П, Боссис Г, Салват Ц, Јариел-Енцонтре И, Пиецхацзик М (2001) Идентификација Ц-терминалног трипептидног мотива који је укључен у контролу брзе протеасомалне деградације ц-Фос прото-онкопротеина током Г (КСНУМКС) -то-С фазе транзиције. Онкоген 20:7563–КСНУМКС.
Ацкуавива Ц, Боссис Г, Феррара П, Броцкли Ф, Јариел-Енцонтре И, Пиецхацзик М (2002) Вишеструки путеви деградације протеина породице Фос. Анн НИ Ацад Сци 973:426–КСНУМКС.
Ахмед К, Тавфиц С (1994) Механизам интрацелуларне регулације протеинске киназе ЦККСНУМКС: улога субнуклеарних асоцијација посредованих стимулусима. Целл Мол Био Рес 40:539–КСНУМКС.
Алцазар А, Мартин Е, Лопез-Фандо Ј, Салинас М (1988) Побољшана процедура пречишћавања и својства казеин киназе ИИ из мозга. Неуроцхем Рес 13:829–КСНУМКС.
Андерссон М, Вестин ЈЕ, Ценци МА (2003) Време трајања стриаталне имунореактивности као и имунореактивности сличне ДелтаФосБ и мРНА продинорпхин након прекида хроничног допаминомиметичког третмана. Еур Ј Неуросци 17:661–КСНУМКС.
Барз Т, Ацкерманн К, Дубоис Г, Еилс Р, Пиерин В. (2003) Екрани експресије широм гена указују на глобалну улогу протеинске киназе ЦККСНУМКС у ремоделирању кроматина. Ј Целл Сци 116:1563–КСНУМКС.
Бех И, Сцхмидт Р, Хецкер Е (1989) Два изозима ПКЦ пронађена у ХЛ-КСНУМКС ћелијама показују разлику у активацији са форбол естером ТПА. ФЕБС Летт 249:264–КСНУМКС.
Билдл В, Страссмаиер Т, Тхурм Х, Андерсен Ј, Ебле С, Оливер Д, Книппер М, Манн М, Сцхулте У, Аделман ЈП, Факлер Б (2004) Протеинска киназа ЦККСНУМКС је збијена са малом проводљивошћу Ца (КСНУМКС +) - активираних К + канала и регулише пролаз канала. Неурон 43:847–КСНУМКС.
Бинг Г, Ванг В, Ки К, Фенг З, Худсон П, Јин Л, Зханг В, Бинг Р, Хонг ЈС (1997) Дуготрајна експресија Фос-сродног антигена и пролазна експресија делта ФосБ повезана је са нападајима у хипокампусу и стриатуму пацова. Ј Неуроцхем 68:272–КСНУМКС.
Блом Н, Сицхеритз-Понтен Т, Гупта Р, Гаммелтофт С, Брунак С (2004) Предвиђање пост-транслационе гликозилације и фосфорилације протеина из аминокиселинске секвенце. Протеомика 4:1633–КСНУМКС.
Боехнинг Д, Моон Ц, Схарма С, Хурт КЈ, Хестер ЛД, Роннетт ГВ, Схугар Д, Снидер СХ (2003) Неуротрансмисија угљен моноксида активирана ЦККСНУМКС фосфорилацијом хеме окигенасе-КСНУМКС. Неурон 40:129–КСНУМКС.
Бохманн Д (1990) Фосфорилација транскрипционог фактора: веза између трансдукције сигнала и регулације експресије гена. Цанцер Целлс 2:337–КСНУМКС.
Бусцхманн Т, Потапова О, Бар-Схира А, Иванов ВН, Фуцхс СИ, Хендерсон С, Фриед ВА, Минамото Т, Аларцон-Варгас Д, Пинцус МР, Гаарде ВА, Холброок Њ, Схилох И, Ронаи З (2001) Јунк фосфорилација пКСНУМКС-а на терминалној кинази на Тхр-КСНУМКС је важна за пКСНУМКС стабилизацију и транскрипционе активности као одговор на стрес. Мол Целл Биол 21:2743–КСНУМКС.
Царле ТЛ, Улери ПГ, Нестлер ЕЈ (2004) Одсуство конзервираног домена Ц-терминала породице Фос доприноси јединственој стабилности делтаФосБ-а. Соц Неуросци Абстр 30: КСНУМКС.
Цханнавајхала П, Селдин ДЦ (2002) Функционална интеракција протеин киназе ЦККСНУМКС и ц-Миц у лимфомагенези. Онкоген 21:5280–КСНУМКС.
Цхен Ј, Ние ХЕ, Келз МБ, Хирои Н, Накабеппу И, Хопе БТ, Нестлер ЕЈ (1995) Регулација делта ФосБ и ФосБ-сличних протеина електроконвулзивним нападом и третманом кокаином. Мол Пхармацол 48:880–КСНУМКС.
Цхен Ј, Келз МБ, Хопе БТ, Накабеппу И, Нестлер ЕЈ (1997) Хронични Фос-повезани антигени: стабилне варијанте ΔФосБ индуковане у мозгу хроничним третманима. Ј Неуросци 17:4933–КСНУМКС.
Цхен РХ, Јуо ПЦ, Цурран Т, Бленис Ј (1996) Фосфорилација ц-Фос на Ц-терминусу побољшава његову трансформациону активност. Онкоген 12:1493–КСНУМКС.
Цхое ЕС, Парелкар НК, Ким ЈИ, Цхо ХВ, Канг ХС, Мао Л, Ванг ЈК (2004) Протеин фосфатаза КСНУМКС / КСНУМКСА инхибитор окадаична киселина повећава ЦРЕБ и Елк-КСНУМКС фосфорилацију и ц-фос експресију у стриатуму штакора ин виво. Ј Неуроцхем 89:383–КСНУМКС.
Цоцхет Ц, Цхамбаз ЕМ (1983) Полиамином посредоване фосфорилације протеина: могућа мета за интрацелуларно деловање полиамина. Мол Целл Ендоцринол 30:247–КСНУМКС.
Цоцхет Ц, Феиге ЈЈ, Цхамбаз ЕМ (1983) Каталитичке и молекуларне особине високо пречишћене Г-врсте казеин-киназе из говеђег плућног ткива. Биоцхим Биопхис Ацта 743:1–КСНУМКС.
Цолби ЦР, Вхислер К, Стеффен Ц, Нестлер ЕЈ, Селф ДВ (2003) Стриатална тип-специфична прекомерна експресија ДелтаФосБ-а појачава стимулацију за кокаин. Ј Неуросци 23:2488–КСНУМКС.
Даунаис ЈБ, Робертс ДЦ, МцГинти ЈФ (1993) Самопримена кокаина повећава препродинорфин, али не и ц-фос, мРНК у стриатуму штакора. НеуроРепорт 4:543–КСНУМКС.
Дестерро ЈМ, Родригуез МС, Хаи РТ (2000) Регулација транскрипционих фактора деградацијом протеина. Целл Мол Лифе Сци 57:1207–КСНУМКС.
Диаз-Нидо Ј, Армас-Портела Р, Авила Ј (1992) Повећање активности цитоплазматског казеин киназе ИИ прати раст неурита након инхибиције синтезе ДНК у НИА-КСНУМКС ћелијама неуробластома. Ј Неуроцхем 58:1820–КСНУМКС.
Ди Маира Г, Салви М, Арригони Г, Марин О, Сарно С, Брустолон Ф, Пинна ЛА, Руззене М (2005) Протеинска киназа ЦККСНУМКС фосфорилише и појачава Акт / ПКБ. Целл Деатх Диффер 12:668–КСНУМКС.
Дображански П, Ногучи Т, Ковари К, Риззо ЦА, Лазо ПС, Браво Р (1991) Оба производа фосБ гена, ФосБ и његов кратки облик, ФосБ / СФ, су транскрипциони активатори у фибробластима. Мол Целл Биол 11:5470–КСНУМКС.
Феррара П, Андермарцхер Е, Боссис Г, Ацкуавива Ц, Броцкли Ф, Јариел-Енцонтре И, Пиецхацзик М (2003) Структурне детерминанте одговорне за протеасомалну деградацију ц-Фос протеина разликују се према условима експресије. Онкоген 22:1461–КСНУМКС.
Фуцхс СИ, Долан Л, Давис РЈ, Ронаи З (1996) Фосфорилација-зависно циљање ц-Јун убиквитинације Јун Н-киназом. Онкоген 13:1531–КСНУМКС.
Фуцхс СИ, Ксие Б, Адлер В, Фриед ВА, Давис РЈ, Ронаи З (1997) ц-Јун НХКСНУМКС-терминалне киназе циљају на убиквитинацију њихових повезаних транскрипционих фактора. Ј Биол Цхем 272:32163–КСНУМКС.
Фуцхс СИ, Таппин И, Ронаи З (2000) Стабилност АТФКСНУМКС транскрипционог фактора регулише се фосфорилацијом и дефосфорилацијом. Ј Биол Цхем 275:12560–КСНУМКС.
Гираулт ЈА, Хеммингс ХЦ Јр., Виллиамс КР, Наирн АЦ, Греенгард П (1989) Фосфорилација ДАРПП-КСНУМКС, фосфопротеина регулисаног допамином и цАМП-ом, казеин киназом ИИ. Ј Биол Цхем 264:21748–КСНУМКС.
Гираулт ЈА, Хеммингс ХЦ Јр., Зорн СХ, Густафсон ЕЛ, Греенгард П (1990) Карактеризација у мозгу сисара ДАРПП-КСНУМКС серин киназе идентична казеин кинази ИИ. Ј Неуроцхем 55:1772–КСНУМКС.
Ханада М, Сугавара К, Канета К, Тода С, Нисхииама И, Томита К, Иамамото Х, Конисхи М, Оки Т (1992) Епоксомицин, нови антитуморски агенс микробног порекла. Ј Антибиот (Токио) 45:1746–КСНУМКС.
Ханн СР, Еисенман РН (1984) Протеини кодирани хуманим ц-миц онкогеном: диференцијална експресија у неопластичним ћелијама. Мол Целл Биол 4:2486–КСНУМКС.
Хеммингс ХЦ Јр., Гираулт ЈА, Виллиамс КР, ЛоПрести МБ, Греенгард П (1989) АРПП-КСНУМКС, циклични АМП-регулисани фосфопротеин (Мр = КСНУМКС) обогаћен допамин-инервисаним регионима мозга. Аминокиселинска секвенца места фосфорилисана цикличним АМП у интактним ћелијама и кинетичке студије фосфорилације ин витро. Ј Биол Цхем 264:7726–КСНУМКС.
Хидака Х, Кобаиасхи Р (1992) Фармакологија инхибитора протеин киназе. Анну Рев Пхармацол Токицол 32:377–КСНУМКС.
Хирата Х, Бессхо И, Кокубу Х, Масамизу И, Иамада С, Левис Ј, Кагеиама Р (2004) Нестабилност ХесКСНУМКС протеина је кључна за сат са сегментом сомита. Нат Генет 36:750–КСНУМКС.
Хирои Н, Граибиел АМ (1996) Атипични и типични неуролептички третмани индукују различите програме експресије транскрипционог фактора у стриатуму. Ј Цомп Неурол 374:70–КСНУМКС.
Хопе Б, Кософски Б, Химан СЕ, Нестлер ЕЈ (1992) Регулација непосредне ране експресије гена и везивање АП-КСНУМКС-а у нуклеусу штакора акумбенс хроничним кокаином. Проц Натл Ацад Сци УСА 89:5764–КСНУМКС.
Хопе БТ, Келз МБ, Думан РС, Нестлер ЕЈ (КСНУМКСа) Третман хроничним електроконвулзивним нападима (ЕЦС) резултира експресијом дуготрајног АП-КСНУМКС комплекса у мозгу са измењеним саставом и карактеристикама. Ј Неуросци 14:4318–КСНУМКС.
Хопе БТ, Ние ХЕ, Келз МБ, Селф ДВ, Иадарола МЈ, Накабеппу И, Думан РС, Нестлер ЕЈ (КСНУМКСб) Индукција дуготрајног АП-КСНУМКС комплекса састављеног од измењених Фос-протеина у мозгу хроничним кокаином и другим хроничним третманима. Неурон 13:1235–КСНУМКС.
Исхида А, Фујисава Х (1995) Стабилизација протеин киназе ИИ зависне од калмодулина кроз аутоинхибиторни домен. Ј Биол Цхем 270:2163–КСНУМКС.
Јариел-Енцонтре И, Салват Ц, Стефф АМ, Париат М, Ацкуавива Ц, Фурстосс О, Пиецхацзик М (1997) Комплексни механизми за деградацију ц-фос и ц-јун. Мол Биол Реп 24:51–КСНУМКС.
Јонес С, Иакел ЈЛ (2003) Казеин киназа ии (протеин киназа цкКСНУМКС) регулише функцију канала серотонинског КСНУМКС-хт (КСНУМКС) рецептора у нгКСНУМКС-КСНУМКС ћелијама. Неуронауке 119:629–КСНУМКС.
Като Т Јр., Делхасе М, Хоффманн А, Карин М (2003) ЦККСНУМКС је Ц-терминална ИкаппаБ киназа одговорна за активацију НФ-каппаБ током УВ одговора. Мол Целл 12:829–КСНУМКС.
Келз МБ, Цхен Ј, Царлезон ВА Јр, Вхислер К, Гилден Л, Бецкманн АМ, Стеффен Ц, Зханг ИЈ, Маротти Л, Селф ДВ, Ткатцх Т, Баранаускас Г, Сурмеиер ДЈ, Неве Р, Думан РС, Пицциотто МР, Нестлер ЕЈ (1999) Експресија транскрипционог фактора делтаФосБ у мозгу контролише осетљивост на кокаин. Природа 401:272–КСНУМКС.
Ким КБ, Миунг Ј, Син Н, Цревс ЦМ (1999) Инхибиција протеазома природним производима епоксомицин и дихидроепонемицин: увид у специфичност и потенцију. Биоорг Мед Цхем Летт 9:3335–КСНУМКС.
Кобаиасхи Е, Накано Х, Моримото М, Тамаоки Т (1989) Калфостин Ц (УЦН-КСНУМКСЦ), ново микробно једињење, је веома моћан и специфичан инхибитор протеин киназе Ц. Биоцхем Биопхис Рес Цоммун 159:548–КСНУМКС.
Крек В, Маридор Г, Нигг ЕА (1992) Казеин киназа ИИ је претежно нуклеарни ензим. Ј Целл Биол 116:43–КСНУМКС.
Крохн НМ, Стеммер Ц, Фојан П, Грим Р, Грассер КД (2003) Протеинска киназа ЦККСНУМКС фосфорилише протеин ССРПКСНУМКС домена високе мобилности, индукујући препознавање ДНК оштећеног УВ зраком. Ј Биол Цхем 278:12710–КСНУМКС.
Кумар А, Цхои КХ, Рентхал В, Тсанкова НМ, Тхеобалд ДЕХ, Труонг ХТ, Руссо СЈ, ЛаПлант К, Вхистлер К, Неве РЛ, Селф ДВ, Нестлер ЕЈ (2005) Ремоделирање хроматина је кључни механизам који подупире пластичност кокаина у стриатуму. Неурон 48:303–КСНУМКС.
Лиеберман ДН, Моди И (1999) Казеин киназа-ИИ регулише функцију НМДА канала у неуронима хипокампуса. Нат Неуросци 2:125–КСНУМКС.
Литцхфиелд ДВ (2003) Протеинска киназа ЦККСНУМКС: структура, регулација и улога у станичним одлукама живота и смрти. Биоцхем Ј 369:1–КСНУМКС.
Манабе Т, Курамото Н, Накамицхи Н, Арамацхи К, Баба К, Хираи Т, Ионеиама М, Ионеда И (2001) Деградација ц-Фос протеина изражена Н-метил-d-аспартинска киселина у нуклеарним фракцијама мишјег хипокампуса. Браин Рес 905:34–КСНУМКС.
Манделзис А, Груда МА, Браво Р, Морган ЈИ (1997) Одсуство трајно повишене антигене и везивања ДНК сличне ДНККСД кос фосфатима у мозговима фосБ нул-мишева третираних каинском киселином. Ј Неуросци 17:5407–КСНУМКС.
Марин О, Меггио Ф, Марцхиори Ф, Борин Г, Пинна ЛА (1986) Специфичност локалитета казеин киназе-КСНУМКС (ТС) из цитосола јетре пацова. Студија са моделним пептидним супстратима. Еур Ј Биоцхем 160:239–КСНУМКС.
МцЦлунг ЦА, Нестлер ЕЈ (2003) Регулација експресије гена и награде за кокаин од стране ЦРЕБ и ДелтаФосБ. Нат Неуросци 6:1208–КСНУМКС.
МцЦлунг ЦА, Улери ПГ, Перротти ЛИ, Зацхариоу В, Бертон О, Нестлер ЕЈ (2004) ДелтаФосБ: молекуларни прекидач за дугорочну адаптацију у мозгу. Браин Рес Мол Браин Рес 132:146–КСНУМКС.
Меггио Ф, Пинна ЛА (2003) Један-хиљаду и један супстрат протеин киназе ЦККСНУМКС? ФАСЕБ Ј 17:349–КСНУМКС.
Меггио Ф, Донелла-Деана А, Пинна ЛА, Морет В (1977) Фосфорилација фракција казеина помоћу фосвитин киназе јетре пацова. ФЕБС Летт 75:192–КСНУМКС.
Меггио Ф, Брунати АМ, Пинна ЛА (1983) Аутофосфорилација типа КСНУМКС казеин киназе ТС и на њеним алфа- и бета-подјединицама. Утицај различитих ефектора. ФЕБС Летт 160:203–КСНУМКС.
Меггио Ф, Схугар Д, Пинна ЛА (1990) Деривати рибофуранозил-бензимидазола као инхибитори казеин-киназе-КСНУМКС и казеин-киназе-КСНУМКС. Еур Ј Биоцхем 187:89–КСНУМКС.
Меггио Ф, Марин О, Пинна ЛА (1994) Специфичност супстрата протеин киназе ЦККСНУМКС. Целл Мол Био Рес 40:401–КСНУМКС.
Миллер Ц, Зханг М, Хе И, Зхао Ј, Пеллетиер ЈП, Мартел-Пеллетиер Ј, Ди Баттиста ЈА (1998) Индукција транскрипције циклооксигеназе-КСНУМКС гена путем инхибиције фосфатазе у људским хондроцитима: ко-стимулација АП-КСНУМКС и ЦРЕ нуклеарних везних протеина. Ј Целл Биоцхем 69:392–КСНУМКС.
Мораталла Р, Елибол Б, Валлејо М, Граибиел АМ (1996) Промене на нивоу мреже у експресији индуцибилних Фос-Јун протеина у стриатуму током хроничног лечења и повлачења кокаина. Неурон 17:147–КСНУМКС.
Морган ЈИ, Цурран Т (1995) Непосредни-рани гени: десет година касније. Трендс Неуросци 18:66–КСНУМКС.
Накабеппу И, Натханс Д (1991) Природно присутан скраћени облик ФосБ који инхибира Фос / Јун транскрипциону активност. Ћелија 64:751–КСНУМКС.
Нестлер ЕЈ, Баррот М, Селф ДВ (2001) Делта ФосБ: продужени молекуларни прекидач за зависност. Проц Натл Ацад Сци УСА 98:11042–КСНУМКС.
Неве РЛ, Хове ЈР, Хонг С, Калб РГ (1997) Увођење подјединице рецептора глутамата КСНУМКС у моторне неуроне ин витро и ин виво употребом рекомбинантног вируса херпес симплек. Неуронауке 79:435–КСНУМКС.
Нутхалл ХН, Јоацхим К, Стифани С (2004) Фосфорилација серина КСНУМКС од Гроуцхо / ТЛЕКСНУМКС помоћу протеин киназе ЦККСНУМКС је важна за инхибицију неуронске диференцијације. Мол Целл Биол 24:8395–КСНУМКС.
Оказаки К, Сагата Н (1995) Пут Мос / МАП киназе стабилизује ц-Фос фосфорилацијом и повећава његову трансформациону активност у НИХ КСНУМКСТКСНУМКС ћелијама. ЕМБО Ј 14:5048–КСНУМКС.
Паломбелла ВЈ, Рандо ОЈ, Голдберг АЛ, Маниатис Т (1994) Пут убиквитин-протеасома је потребан за обраду НФ-капа БКСНУМКС прекурсорског протеина и активацију НФ-капа Б. Ћелија 78:773–КСНУМКС.
Папавассилиоу АГ, Треиер М, Цхавриер Ц, Бохманн Д (1992) Циљана деградација ц-Фос, али не в-Фос, сигналом зависним од фосфорилације на ц-Јун. Наука 258:1941–КСНУМКС.
Пеакман МЦ, Цолби Ц, Перротти ЛИ, Текумалла П, Царле Т, Улери П, Цхао Ј, Думан Ц, Стеффен Ц, Монтеггиа Л, Аллен МР, Стоцк ЈЛ, Думан РС, МцНеисх ЈД, Баррот М, Селф ДВ, Нестлер ЕЈ , Сцхаеффер Е (2003) Индуцибилна експресија доминантног негативног мутанта ц-Јун-а у можданом региону у трансгеним мишевима смањује осетљивост на кокаин. Браин Рес 970:73–КСНУМКС.
Перротти ЛИ, Хадеисхи И, Улери ПГ, Баррот М, Монтеггиа Л, Думан РС, Нестлер ЕЈ (2004) Индукција ДелтаФосБ-а у можданим структурама повезаним са наградом након хроничног стреса. Ј Неуросци 24:10594–КСНУМКС.
Персицо АМ, Сцхиндлер ЦВ, О'Хара БФ, Бранноцк МТ, Ухл ГР (1993) Експресија фактора транскрипције мозга: ефекти акутног и хроничног амфетамина и ињекциони стрес. Браин Рес Мол Браин Рес 20:91–КСНУМКС.
Плоегх ХЛ, Дунн БМ (2000) Пост-транслацијска модификација: фосфорилација и фосфатазе. У: Актуелни протоколи у науци о протеинима (Дунн БМ, ур.) Пп. 13.01–КСНУМКС. Нев Иорк: Вилеи и Сонс.
Пиерин В, Буров Е, Мицхаели К, Кублер Д, Кинзел В (1987) Каталитичке и молекуларне особине високо пречишћене фосвитин / казеин киназе типа ИИ из хуманих епителних ћелија у култури (ХеЛа) и односа према екто протеин кинази. Биол Цхем Хоппе Сеилер 368:215–КСНУМКС.
Реикхардт Б.А., Куликова О.Г., Борисова Г.рова., Александрова И.И., Сапронов Н.С. (2003) Статус система "протеин киназе ЦККСНУМКС-ХМГКСНУМКС" у амнезији повезаној са старењем код пацова. Неуросци Бехав Пхисиол 33:799–КСНУМКС.
Робертс БЈ, Вхителав МЛ (1999) Деградација базичног хелик-лооп-хелик / Пер-АРНТ-Сим хомологног домена диоксин рецептора преко убиквитин / протеасомског пута. Ј Биол Цхем 274:36351–КСНУМКС.
Рост Б, Иацхдав Г, Лиу Ј (2004) ПредицтПротеин сервер. Нуцлеиц Ацидс Рес 32:ВКСНУМКС–ВКСНУМКС.
Рилски М, Кацзмарек Л (2004) Ап-КСНУМКС мете у мозгу. Фронт Биосци 9:8–КСНУМКС.
Сахин Б, Канси ЈВ, Наирн АЦ, Спицхала Ј, Еалицк СЕ, Фиенберг АА, Греене РВ, Бибб ЈА (2004) Молекуларна карактеризација рекомбинантне мишје аденозин киназе и процена као циљ за фосфорилацију протеина. Еур Ј Биоцхем 271:3547–КСНУМКС.
Салват Ц, Акуавива Ц, Јариел-Енцонтре И, Феррара П, Париат М, Стефф АМ, Царилло С, Пиецхацзик М (1999) Да ли постоје вишеструки протеолитички путеви који доприносе деградацији протеина ц-Фос, ц-Јун и пКСНУМКС ин виво? Мол Биол Реп 26:45–КСНУМКС.
Сцхмидт Р, Хецкер Е (1975) Аутоксидација форбол естара под нормалним условима складиштења. Цанцер Рес 35:1375–КСНУМКС.
Сцхварз ЕМ, Ван Антверп Д, Верма ИМ (1996) Конститутивна фосфорилација ИкаппаБалфе казеин киназом ИИ појављује се преференцијално на серин КСНУМКС: захтев за деградацију слободног ИкаппаБалфе. Мол Целл Биол 16:3554–КСНУМКС.
Сеарс Р, Леоне Г, ДеГрегори Ј, Невинс ЈР (1999) Рас појачава стабилност Миц протеина. Мол Целл 3:169–КСНУМКС.
Силва-Нето МА, Фиалхо Е, Паес МЦ, Оливеира ПЛ, Масуда Х (2002) Циклична нуклеотид-независна фосфорилација вителина казеин киназом ИИ пречишћена из Рходниус проликус ооцита. Инсецт Биоцхем Мол Биол 32:847–КСНУМКС.
Скиннер М, Ку С, Мооре Ц, Висдом Р (1997) Транскрипциона активација и трансформација ФосБ протеином захтевају фосфорилацију карбоксил-терминалног активационог домена. Мол Целл Биол 17:2372–КСНУМКС.
Стеммер Ц, Сцхвандер А, Баув Г, Фојан П, Грассер КД (2002) Протеинска киназа ЦККСНУМКС диференцијално фосфорилише протеине кромосомске групе високе мобилности Б (ХМГБ) кукуруза, модулирајући њихову стабилност и интеракције ДНК. Ј Биол Цхем 277:1092–КСНУМКС.
Стевенс И, Деруа Р, Ронделез Е, Ваелкенс Е, Мерлеведе В, Горис Ј (1999) Идентификација цик, циклин БКСНУМКС киназе, као нове протеин киназе ИИ зависне од калциј / калмодулин и њена улога током сазревања ооцита Ксенопус лаевис. Екп Целл Рес 252:303–КСНУМКС.
Сух ХВ, Цхои СС, Лее ЈК, Лее ХК, Хан ЕЈ, Лее Ј (2004) Регулација експресије ц-фос и ц-јун гена липополисахаридима и цитокинима у примарно култивисаним астроцитима: ефекат ПКА и ПКЦ путева. Арцх Пхарм Рес 27:396–КСНУМКС.
Сзисзка Р, Богусзевска А, Гранковски Н, Баллеста ЈП (1995) Диференцијална фосфорилација рибозомалних киселих протеина из ћелија квасца помоћу две ендогене протеинске киназе: казеин киназа-КСНУМКС и КСНУМКСС киназа. Ацта Биоцхим Пол 42:357–КСНУМКС.
Тамаоки Т, Такахасхи И, Кобаиасхи Е, Накано Х, Акинага С, Сузуки К (1990) Цалпхостин (УЦНКСНУМКС) и једињења повезана са калфостином, нова класа специфичних и потентних инхибитора протеин киназе Ц. Адв Сецонд Мессенгер Пхоспхопротеин Рес 24:497–КСНУМКС.
Торрес Ј, Пулидо Р (2001) Тумор супресор ПТЕН је фосфорилисан протеин киназом ЦККСНУМКС на свом Ц терминалу. Импликације за ПТЕН стабилност на протеазом-посредовану деградацију. Ј Биол Цхем 276:993–КСНУМКС.
Тсубуки С, Саито И, Томиока М, Ито Х, Кавасхима С (1996) Диференцијална инхибиција активности калпаина и протеасома пептидил алдехидима ди-леуцина и три-леуцина. Ј Биоцхем (Токио) 119:572–КСНУМКС.
Тсуруми Ц, Исхида Н, Тамура Т, Какизука А, Нисхида Е, Окумура Е, Кисхимото Т, Инагаки М, Оказаки К, Сагата Н (1995) Деградација ц-Фос протеазомом КСНУМКСС се убрзава помоћу ц-Јун и више протеинских киназа. Мол Целл Биол 15:5682–КСНУМКС.
Унгер ГМ, Давис АТ, Слатон ЈВ, Ахмед К (2004) Протеинска киназа ЦККСНУМКС као регулатор станичног преживљавања: импликације за терапију рака. Цурр Цанцер Друг Таргет 4:77–КСНУМКС.
Виал Е, Марсхалл ЦЈ (2003) Повишена активност ЕРК-МАП киназе штити члана ФОС породице ФРА-КСНУМКС од протеасомалне деградације у ћелијама карцинома колона. Ј Целл Сци 116:4957–КСНУМКС.
Верме М, Мессер Ц, Олсон Л, Гилден Л, Тхорен П, Нестлер ЕЈ, Брене С (2002) ΔФосБ регулише рад котача. Ј Неуросци 22:8133–КСНУМКС.
Вхитмарсх АЈ, Давис РЈ (2000) Регулација функције фактора транскрипције фосфорилацијом. Целл Мол Лифе Сци 57:1172–КСНУМКС.
Винтер Б, Каутзнер И, Иссингер ОГ, Арнолд ХХ (1997) Два потенцијална места фосфорилације протеин киназе ЦККСНУМКС су важна за Миф-КСНУМКС активност. Биол Цхем 378:1445–КСНУМКС.
Висниевски ЈР, Сзевцзук З, Петри И, Сцхванбецк Р, Реннер У (1999) Конститутивна фосфорилација киселих репова протеина КСНУМКС групе високе покретљивости казеин киназом ИИ мења њихову конформацију, стабилност и специфичност везивања ДНК. Ј Биол Цхем 274:20116–КСНУМКС.
Иамагуцхи И, Вада Т, Сузуки Ф, Такаги Т, Хасегава Ј, Ханда Х (1998) Казеин киназа ИИ ступа у интеракцију са бЗИП доменама неколико транскрипционих фактора. Нуцлеиц Ацидс Рес 26:3854–КСНУМКС.
Ианагава Т, Иуки К, Иосхида Х, Баннаи С, Исхии Т (1997) Фосфорилација АКСНУМКС стресног протеина активностима сличним казеин кинази ИИ у макрофагима. Биоцхем Биопхис Рес Цоммун 241:157–КСНУМКС.
Ианкулов К, Иамасхита К, Рои Р, Егли ЈМ, Бентлеи ДЛ (1995) Инхибитор транскрипционе елонгације КСНУМКС-диклоро-КСНУМКС-бета-d-рибофураносилбензимидазол инхибира протеин киназу повезану са транскрипционим фактором ИИХ. Ј Биол Цхем 270:23922–КСНУМКС.
Иен Ј, Висдом РМ, Тратнер И, Верма ИМ (1991) Алтернативни спојени облик ФосБ је негативни регулатор транскрипционе активације и трансформације Фос протеина. Проц Натл Ацад Сци УСА 88:5077–КСНУМКС.
Иин Кс, Једрзејевски ПТ, Јианг ЈКС (2000) Казеин киназа ИИ фосфорилира леће конексин КСНУМКС и учествује у његовој деградацији. Ј Биол Цхем 275:6850–КСНУМКС.
Иоза БК, Броокс ЈВ, Мизел СБ (1992) Индукција компоненти транскрипционог фактора АП-КСНУМКС током активације Т-ћелија интерлеукином КСНУМКС и форбол естрима. Целл Гровтх Диффер 3:677–КСНУМКС.
Иу С, Ванг Х, Давис А, Ахмед К (2001) Последице ЦККСНУМКС сигнализације на нуклеарну матрицу. Мол Целл Биоцхем 227:67–КСНУМКС.
Иу С, Давис АТ, Гуо Ц, Греен ЈЕ, Ахмед К (1999) Диференцијално циљање протеин киназе ЦККСНУМКС на нуклеарну матрицу након пролазне прекомерне експресије његових подјединица. Ј Целл Биоцхем 74:127–КСНУМКС.
Зацхариоу В, Боланос ЦА, Селлеи ДЕ, Тхеобалд Д, Цассиди МП, Келз МБ, Схав-Лутцхманн Т, Бертон О, Сим-Селлеи Љ, ДиЛеоне РЈ, Кумар А, Нестлер ЕЈ (2006) ΔФосБ: есенцијална улога ΔФосБ у нуцлеус аццумбенс у дејству морфина. Нат Неуросци 9:205–КСНУМКС.
Чланци наводе овај чланак
- Бихевиорални и структурни одговори на хронични кокаин захтевају повратну петљу која укључује {Делта} ФосБ и протеин-киназу зависну од калцијума / калмодулина ИИ у љусци нуклеуса Часопис неуронаука, КСНУМКС Март КСНУМКС, 33(10):4295-4307
- Стриатална прекомерна експресија {Делта} ФосБ репродукује непродуктивне покрете изазване хроничном леводопом Часопис неуронаука, КСНУМКС мај КСНУМКС, 30(21):7335-7343
- Апстрактан
- Фулл Тект
- Пуни текст (ПДФ)
- Апстрактан
- Фулл Тект
- Пуни текст (ПДФ)
- Апстрактан
- Фулл Тект
- Пуни текст (ПДФ)
- Апстрактан
- Фулл Тект
- Пуни текст (ПДФ)
- Транскрипциони механизми зависности: улога {Делта} ФосБ Филозофске трансакције Краљевског друштва Б: Биолошке науке, КСНУМКС Оцтобер КСНУМКС, 363(1507):3245-3255
- Трајна рањивост на повратак метамфетамин-траживог понашања у мутантне мишеве мутантних глијалних ћелија \ т Тхе ФАСЕБ Јоурнал, КСНУМКС Јули КСНУМКС, 21(9):1994-2004
- Фактор транскрипције активатора протеина и КСНУМКС-а у карциногенези епитела респираторног система Молецулар Цанцер Ресеарцх, КСНУМКС фебруар КСНУМКС, 5(2):109-120
;