Декодирање неуронских кругова који контролишу компулзивно тражење сахарозе (КСНУМКС) (МЕХАНИЗАМ БИНГЕ)

Да бисмо идентификовали ЛХ неуроне који обезбеђују моносинаптички улаз у ВТА ин виво и посматрали њихову активност током слободног понашања, користили смо стратегију са двоструким вирусом да селективно експресујемо канал родопсин-2 (ЦхР2) у ЛХ неуронима који обезбеђују моносинаптички улаз у ВТА (Фигуре КСНУМКСА анд S1). Убризгали смо адено-повезани вирусни вектор (ААВ₅) који носи ЦхР2-еИФП у конструкцији двоструко инвертованог отвореног оквира за читање (ДИО) зависној од Цре-рекомбиназе у ЛХ да инфицира локалне сомате и убризгава ретроградно путујући херпес симплекс вирус (ХСВ) који носи Цре-рекомбиназу у ВТА. Накнадна рекомбинација је омогућила селективну експресију опсина и флуорофора у ЛХ неуронима обезбеђујући моносинаптички улаз у ВТА. Да бисмо потврдили наш приступ, извршили смо ек виво снимке целе ћелије у хоризонталним резовима мозга који садрже ЛХ и снимљени са неурона који експримирају ЦхР2-еИФП, као и суседних ЛХ неурона који су били ЦхР2-еИФП негативни (Слика 1Б). Латенције изазване светлошћу, мерене од почетка светлосног импулса до врха акционог потенцијала, кретале су се од 3-8 мс (Слика 1Ц). Такође смо открили да ниједна од забележених ћелија које не експримирају (ЦхР2-негативне) није показала ексцитаторне одговоре на фотостимулацију (н = 14; Слика 1Ц), упркос њиховој близини ћелијама које експримирају ЦхР2.

Да би се извршила оптогенетски посредована фотоидентификација ин виво, оптрода је имплантирана у ЛХ за снимање неуронске активности током задатка тражења сахарозе. У истој сесији снимања, пружили смо неколико образаца фотостимулације да идентификујемо ЛХ-ВТА неуроне који експримирају ЦхР2 (Фигуре КСНУМКСД анд S1). Испитали смо дистрибуцију латенција ексцитаторног фотоодговора на све ЛХ неуроне показујући временски закључану промену брзине паљења као одговор на осветљење и приметили бимодалну дистрибуцију (Слика 1Е). Приметили смо популацију неурона током ин виво снимања са латенцијама у распону од 3-8 мс. Ово је било идентично опсегу латенције који је пронађен у ЛХ-ВТА неуронима који експримирају ЦхР2 када смо снимили ек виво. Ове јединице смо назвали „јединицама типа 1“ (Фигуре КСНУМКСЦ, 1Е и 1Ф). Поред тога, постојала је посебна популација ћелија са латенцијама фотоодговора од ~100 мс (Фигуре КСНУМКСЕ и 1Г) и назвали смо ове јединице „Тип 2“. Такође смо приметили неуроне који су инхибирани као одговор на фотостимулацију ЛХ-ВТА неурона (Слика С2), и назвали смо ове јединице „Тип 3“. Упоредили смо трајање акционог потенцијала (мерено од врха до најниже) и средње стопе паљења јединица типа 1 и типа 2, као и оних које нису показале фотоодговор (Слика 1Х). Дистрибуција трајања акционог потенцијала типа 1 (Слика 1И) и Тип 2 (Слика 1Ј) јединица показује да већина јединица типа 1 има трајање акционог потенцијала мање од 500 μс (84%; н = 16/19, биномна расподела, п = 0.002).

Иако јединице типа 1 одговарају стандардним критеријумима да се класификују као ЦхР2 експресирајући (Цохен ет ал., 2012, Зханг ет ал., 2013), није било јасно да ли је фотоодговор са дужим кашњењем јединица типа 2 индикативан за неуроне који експримирају ЦхР2 који су реаговали спорије до фотостимулације, или да ли је овај ефекат био последица мрежне активности. Имајући у виду да се ЛХ неурони који експримирају ЦхР2 (Тип 1) пројектују директно на ВТА, једна од могућности је била да неурони типа 2 примају повратне информације од ВТА (Слика 1К). Друга могућност је била да су неурони типа 2 активирани колатералима аксона из неурона типа 1 (Слика 1Л). Да бисмо разликовали ова два могућа модела кола, инхибирали смо ВТА ​​у вези са фотоидентификацијом у ЛХ.

На основу наших модела кола, очекивали бисмо да дистална инхибиција нема ефекта на фотоодговоре ЛХ неурона који експримирају ЦхР2. Међутим, ако су фотореактивни, али не-експресивни, ЛХ неурони су се ослањали на повратне информације од ВТА да би изазвали временски закључан одговор на осветљење (Слика 1К), очекивали бисмо слабљење фотоодговора у овим неуронима након ВТА инхибиције. Експресирали смо ЦхР2 у ЛХ-ВТА ћелијама као што је горе наведено, али овог пута смо такође експримирали појачани халородопсин 3.0 (НпХР) у ВТА и имплантирали оптичко влакно у ВТА поред оптроде у ЛХ (Слика 2А). Испоручили смо исте обрасце осветљења плавим светлом у ЛХ за све три епохе, али смо такође фотоинхибирали ВТА жутим светлом у другој епохи (Слика 2А).

Фотореакције јединица типа 1 на осветљење плавим светлом у ЛХ нису биле под утицајем фотоинхибиције ВТА, што је у складу са експресијом ЦхР2 у неуронима типа 1 ЛХ-ВТА (Слика 2Б). Насупрот томе, већина јединица типа 2 (87%; н = 13/15, биномна дистрибуција, п = 0.004) показала је значајно слабљење фотоодговора на импулсе плавог светла који се испоручују у ЛХ након фотоинхибиције ВТА неурона. Одговори јединица типа 1 и типа 2 током фотоинхибиције ВТА били су значајно различити (хи-квадрат = 7.64, п = 0.0057; Фигуре КСНУМКСБ и 2Ц). Ове разлике се такође могу видети у максималним З скором током појединих епоха (Слика 2Д) и са епохом жутог укључивања нормализованом на епоху жутог искључења (Слика 2Е). Ови подаци сугеришу да неурони типа 2 ЛХ примају улаз (директно или индиректно) од ВТА (Слика 1К) уместо преко локалних колатерала аксона (Слика 1Л).

Након што смо идентификовали ова два различита типа ЛХ неурона у ЛХ-ВТА петљи, желели смо да испитамо природну неуронску активност током задатка само-администрирања сахарозе (Слика 3А). Мишеви су обучени да изводе реакције шкљоцањем носа за сигнал који предвиђа испоруку сахарозе у суседном порту (као у Тие ет ал., 2008). Да би нам се омогућило да разликујемо неуронске одговоре на шиљак за нос и знак, знак и сахароза су испоручени по распореду делимичног појачања, при чему је 50% носних шпица упарено са испоруком сигнала и сахарозе.

Јединице типа 1 показале су фазне одговоре на улазак у порт за сахарозу, као што се види у репрезентативној јединици типа 1 (Слика 3Б), као и податке о популацији за све јединице типа 1 (Слика 3Ц). Међутим, фазни одговори јединица типа 2 углавном су одражавали одговоре на знак који предвиђа награду (Фигуре КСНУМКСД и 3Е). Нормализовани обрасци активирања свих снимљених неурона (н = 198, подељени на Тип 1, 2, 3 и јединице које не реагују) су приказане за сваку компоненту задатка: шиљаци упарени са знаком, шиљаци носа у одсуству знака и унос порта за сахарозу (Слика 3Ф). Све јединице типа 1 које су показале фазне промене активности које су биле релевантне за задатак (74%; н = 14/19) биле су или фазно узбуђене или инхибиране уласком у порт за сахарозу, са малим бројем који је такође показао фазну инхибицију знака који предвиђа награду (Фигуре КСНУМКСБ, 3Ц и 3Г). Насупрот томе, јединице типа 2 биле су хетерогеније, са неуронима који реагују на задатак који су селективно кодирали знак (35%), селективно улазак у порт за сахарозу (26%) или и сигнал и улаз (12%); Фигуре КСНУМКСД, 3Е и 3Х). Да бисмо илустровали снагу одговора јединица типа 1 и типа 2 на догађаје везане за задатке, нацртали смо сваку ћелију на тродимензионалном графикону према З резултату (Слика 3И). Да бисмо на квалитативном нивоу приказали дистрибуцију фазних промена у окидању на више догађаја повезаних са задацима, нацртали смо број ћелија сваког типа фотоодговора које су спадале у дату категорију (Слика 3Ј).

С обзиром на добро дефинисану улогу ВТА у грешци предвиђања награде (нпр., фазно смањење активирања ДА неурона као одговор на неочекивано изостављање награде и фазно узбуђење као одговор на неочекивану испоруку награде) (Сцхултз ет ал., 1997), истражили смо да ли би ЛХ неурони кодирали неочекивани изостанак награде сахарозом. Да бисмо то урадили, снимили смо неуралну активност фотореактивних неурона током истог задатка награђивања код добро обучених животиња, али смо насумично изоставили 30% испорука сахарозе након сигнала (Слика 4А).

Већина јединица типа 1 (88%; н = 15/17, биномна дистрибуција, п = 0.001) била је неосетљива на изостављање награде (Фигуре КСНУМКСБ и 4Д), док је велика подскупина јединица типа 2 (67%; н = 12/18) показала значајно другачији одговор на испитивања која су представљена наградом и која су изостављена (Фигуре КСНУМКСЦ и 4Д). Закључили смо да неурони ЛХ-ВТА (Тип 1) кодирају акцију уласка у порт, пошто су ови одговори на улазак у порт били упорни чак и након изостављања награде (Слика 4Д), за разлику од јединица типа 2 (хи-квадрат = 10.9804, п = 0.0009).

Да бисмо утврдили да ли су одговори типа 1 на унос порта заиста кодирали условљени одговор (ЦР), за разлику од општег понашања у потрази за наградом или истраживачког понашања, снимили смо необучене мишеве који још нису добили задатак. Код мишева који нису били наивни, испоручили смо сахарозу порту у одсуству предиктивног знака (непредвиђена испорука награде) и открили да јединице типа 1 не показују фазне одговоре на улазак у порт (Фигуре КСНУМКСЕ, 4Ф и 4И), у складу са моделом да неурони типа 1 кодирају ЦР (Слика 4Ј).

Затим, да бисмо утврдили да ли је активност јединице типа 2 у складу са профилом одговора налик грешци предвиђања награде, такође смо снимили ове неуроне код добро обучених животиња током непредвиђене испоруке награде (Слика 4Г). Открили смо да је подскуп јединица типа 2 реаговао на непредвиђене испоруке сахарозе (50%; Фигуре КСНУМКСГ–4И). Узети заједно, подскупови јединица типа 2 осетљиви су на неочекивано изостављање награде (Фигуре КСНУМКСЦ и 4Д) и непредвиђену испоруку награда (Фигуре КСНУМКСГ–4И), у складу са профилом одговора налик грешци предвиђања награде.

Као што смо показали изнад, јединице типа 1 представљају неуронски корелат ЦР. Важно је да повећање брзине пуцања почиње пре ЦР, повећавајући се док се ЦР не заврши (Фигуре КСНУМКСБ, 3Ц и 4Б). Да бисмо утврдили да ли активација ЛХ-ВТА пута може да промовише ЦР, желели смо да тестирамо способност активације ЛХ-ВТА у покретању ЦР-а суочених са негативним последицама. Код мишева дивљег типа, експримирали смо ЦхР2-еИФП или еИФП само у телима ЛХ ћелија и имплантирали оптичко влакно преко ВТА ​​(Фигуре КСНУМКСА анд S4). Супротно томе, да бисмо тестирали улогу ЛХ-ВТА пута у посредовању ЦР-а или понашања везаних за храњење, билатерално смо експримирали НпХР-еИФП или еИФП само у ЛХ ћелијама и имплантирали оптичко влакно изнад ВТА (Фигуре КСНУМКСА анд S4).

Дизајнирали смо Павлововски задатак кондиционирања у којем су мишеви лишени хране морали да пређу шок мрежу да би добили награду за сахарозу (Слика 5Б). У првој „основној“ епохи (са искљученом мрежом шока), потврдили смо да је сваки миш добио задатак Павловљевог условљеног приступа. У другој („Шок“) епохи, решетка шокова је испоручила благе ударе стопала сваке секунде. Коначно, у трећој епохи („Схоцк+Лигхт“), наставили смо да испоручујемо шокове за стопала, али смо такође осветлили ЛХ терминале у ВТА плавим светлом (10 Хз) код мишева који изражавају ЦхР2 и усклађене еИФП контроле и жуто светло (константно) за мишеви који изражавају НпХР и њихове еИФП контроле (Слика 5Б).

Приметили смо значајно већи број уноса порта по сигналу током епохе Схоцк+Лигхт и значајно већи резултат разлике (Схоцк+Лигхт епоцх − Схоцк-онли епоцх) код ЦхР2 мишева у односу на еИФП мишеве (Слика 5Ц и Мовие СКСНУМКС). Насупрот томе, фотоинхибиција ЛХ-ВТА пута резултирала је значајним смањењем уноса порта по знаку и разлика у резултатима код НпХР мишева у односу на еИФП мишеве (Слика 5Д анд Мовие СКСНУМКС). Експерименти изумирања унутар сесије током којих презентације знакова нису праћене испоруком сахарозе показали су сличне трендове на снази (Слика С4).

Важно је да смо желели да утврдимо да ли су промене у тражењу сахарозе које смо добили узроковане променама у понашању у вези са храњењем или осетљивошћу на бол. Приметили смо да је фотоактивација ЛХ-ВТА пројекције значајно повећала време проведено на храњењу добро храњених мишева у групи ЦхР2 (Слика 5Е). Међутим, фотоинхибиција ЛХ-ВТА пута није значајно смањила храњење (Слика 5Ф), иако су ове животиње биле ускраћене за храну како бисмо побољшали нашу способност да откријемо смањење у односу на почетну епоху (у поређењу са засићеним животињама у Слика 5Е). Ни у ЦхР2 (Слика 5Г) ни НпХР група (Слика 5Х) да ли смо приметили разлику у кашњењу до повлачења репа из топле воде (Бен-Бассат ет ал., 1959, Гротто и Сулман, 1967), што указује да манипулисање пројекцијом ЛХ-ВТА није мењало аналгезију.

Да бисмо проучавали састав компоненти брзе трансмисије ЛХ улаза у ВТА које су изазивале ове ефекте, извршили смо снимање патцх-цламп-а у целој ћелији са ВТА неурона у акутној припреми пресека док смо оптички активирали ЛХ улазе који експримирају ЦхР2-еИФП (Фигуре КСНУМКСА анд S5). С обзиром на то да постоји добро утврђена хетерогеност унутар ВТА, укључујући ∼65% ДА неурона, ∼30% ГАБА неурона и ∼5% глутаматних неурона (Марголис ет ал., 2006, Наир-Робертс ет ал., 2008, Иамагуцхи ет ал. ал., 2007), напунили смо ћелије биоцитином док смо снимали да бисмо омогућили идентификацију типа ћелије коришћењем пост-хоц имунохистохемије за тирозин хидроксилазу (ТХ; Слика 6Б), поред снимања катионске струје активиране хиперполаризацијом (И_h) и мапирање локације ћелије (Фигуре КСНУМКСБ анд S5).

Прво, снимили смо струјну стезаљку током фотостимулације ЛХ улаза који експримирају ЦхР2 и приметили да је 23 од 27 неурона показало временски закључан одговор на фотостимулацију ЛХ улаза (Слика 6Ц). Већина ДА неурона узоркованих у ВТА примила је нето ексцитаторни улаз од ЛХ (56%), док је друга подскупина показала нето инхибицију (30%; Слика 6Ц). Просторна дистрибуција ових ДА неурона је мапирана на атлас за хоризонталне резове који садрже ВТА (Слика 6Д).

Да бисмо утврдили моносинаптички допринос ЛХ улаза у ВТА ДА неуроне, користили смо мапирање кола уз помоћ ЦхР2, где су снимања напонске стезаљке вршена у присуству тетродотоксина (ТТКС) и 4-аминопиридина (4АП; Петреану ет ал., 2007) . У складу са нашим запажањима из снимака са струјним стезаљкама, приметили смо да је већина снимљених ВТА ДА неурона искључиво примала ексцитаторни моносинаптички унос од ЛХ (67%), у поређењу са ВТА ДА неуронима који су искључиво примали инхибиторни моносинаптички улаз (11%), или обоје (22%; Фигуре КСНУМКСЕ анд S6).

Идентификовали смо ВТА ​​ГАБА неуроне убризгавањем Цре-зависног флуорофора (ААВ₅-ДИО-мЦхерри) у ВТА мишева ВГАТ::Цре и користио мЦхерри експресију за усмеравање снимања ВТА ГАБА неурона (н = 24; Слика 6Ф). Четрдесет шест процената ВТА ГАБА неурона је реаговало нето ексцитацијом, док је 54% реаговало нето инхибицијом, на фотостимулацију ЛХ улаза који експримирају ЦхР2 (Слика 6Г). Просторна дистрибуција ових ћелија је приказана у Слика 6Х. Након испитивања моносинаптичког улаза из ЛХ (као што је горе описано), открили смо да је 18% узоркованих ГАБА неурона примило искључиво ексцитаторни, а 9% искључиво инхибиторни (Слика 6И). Међутим, у односу на ВТА ДА неуроне, открили смо да је више ВТА ГАБА неурона примило и ексцитаторни АМПАР посредован и инхибиторни ГАБА_AР-посредовани моносинаптички унос из ЛХ (73%; хи-квадрат = 5.0505, п = 0.0246; Фигуре КСНУМКСја и S6).

С обзиром на то да су наши ек виво снимци пружили доказе који подржавају робустан унос из ГАБАергичних и глутаматергичних ЛХ пројекција у ВТА, затим смо испитали улогу сваке компоненте независно. Да бисмо то урадили, користили смо трансгене линије миша које експримирају Цре-рекомбиназу у неуронима који су експримирали или везикуларни глутаматни транспортер 2 (ВГЛУТ2) или везикуларни ГАБА транспортер (ВГАТ). Убризгали смо ААВ₅-ДИО-ЦхР2-еИФП или ААВ₅-ДИО-еИФП у ЛХ ВГЛУТ2::Цре и ВГАТ::Цре мишева и имплантирао оптичко влакно преко ВТА ​​(Слика С7). Ове животиње су затим тестиране на сваком од тестова понашања приказаних у Слика 5.

Нисмо приметили никакве уочљиве разлике у броју уноса портова по сигналу између мишева који изражавају ЦхР2 или еИФП у ЛХ^глут-ВТА пројекција (Слика 7А) или у ЛХ^ГАБА-ВТА пројекција (Слика 7Б). Међутим, након видео анализе, приметили смо аберантно понашање гризања у ЛХ^ГАБА-ВТА:ЦхР2 група при осветљењу плавим светлом (види Мовиес СКСНУМКС S4). У ЛХ^глут-ВТА мишеви, иако је постојао тренд ка смањењу храњења након фотостимулације у ЦхР2 групи у поређењу са еИФП групом, ово није било статистички значајно (Слика 7Ц). Насупрот томе, приметили смо снажно повећање времена проведеног у храњењу засићених мишева након осветљења у ЛХ^ГАБА-ВТА:ЦхР2 група у односу на контроле (Слика 7Д анд Мовие СКСНУМКС). Ни у једној групи животиња није било ефекта светлосне стимулације у тесту повлачења репа (Фигуре КСНУМКСЕ и 7Ф).

Током задатка храњења, као и током задатка тражења сахарозе, поново смо приметили аберантне моторичке секвенце везане за храњење које нису биле усмерене на храну. Снимили смо репрезентативног миша у ЛХ^ГАБА-ВТА:ЦхР2 група у празној провидној комори, а након фотостимулације од 20 Хз, приметили смо необичне апетитивне моторичке секвенце попут лизања и гризања пода или празног простора (Мовие СКСНУМКС). Квантификовали смо ова понашања „гризања“ током задатка храњења у дивљем типу ЛХ-ВТА (Слика 7Г), ЛХ^глут-ВТА (Слика 7Х), и ЛХ^ГАБА-ВТА (Слика 7И) групе и показао да је ЛХ^ГАБА-ВТА:ЦхР2 мишеви су гризли више него дивљи тип или ЛХ^глут-ВТА:ЦхР2 мишеви када су фотостимулисани, у поређењу са њиховим одговарајућим еИФП групама (Слика 7Ј). Размотрили смо да ли се аберантна понашања везана за храњење могу одвојити од адекватно усмереног храњења на нижим фреквенцијама. Међутим, када смо тестирали ЛХ^ГАБА-ВТА:ЦхР2 група са низовима плаве светлости од 5 Хз и 10 Хз, приметили смо пропорционалну везу између фреквенције стимулације и храњења и гризања (Слика 7К).

ЛХ пројекција на ВТА је истражена студијама колизије електричне стимулације (Биелајев и Схизгал, 1986) и дуго се претпостављало да игра улогу у процесу награђивања (Хоебел и Теителбаум, 1962, Маргулес и Олдс, 1962), а ипак је то тачно утврдило. улога је била изазов. Овде пружамо детаљну дисекцију како појединачне компоненте ЛХ-ВТА петље обрађују различите аспекте задатка који се односи на награду.

Коришћењем оптогенетски посредованог фототагирања (Слика 1), идентификовали смо две одвојене популације ЛХ неурона: ћелије које шаљу пројекције на ВТА (Тип 1) и ћелије које примају повратне информације од ВТА (Тип 2; Слика 2)—иако ове популације не морају да се међусобно искључују, јер је могуће да ЛХ неурони могу и да шаљу и примају улазе у и из ВТА. Занимљиво је да смо открили да релативно мало фотореактивних неурона пада изван бимодалне дистрибуције која обухвата ове две популације (Фигуре СКСНУМКСБ анд 1Е). С обзиром на ово, у комбинацији са дугим кашњењем у фотоодговорима типа 2 (∼100 мс), спекулишемо да може постојати један доминантни пут који доприноси активности неурона типа 2. Поред тога, пошто ДА везује рецепторе повезане са Г протеином, кинетика је спорија од већине глутаматергичних синапси (Гираулт и Греенгард, 2004) и може објаснити овај кластер фотореактивних јединица од 100 мс. Такође је могуће да ВТА може да обезбеди индиректну повратну информацију кроз друге дисталне регионе, преко ексцитаторних интермедијарних региона као што је амигдала, или са дезинхибицијом преко нуцлеус аццумбенс (НАц) или бед нуцлеус стриа терминалис (БНСТ).

Занимљиво је да, док фотостимулација јединица типа 1 изазива ексцитаторне одговоре у јединицама типа 2, јединице типа 1 и 2 показују различита својства кодирања у понашању. На пример, бројеви јединица типа 1 и типа 2 које селективно кодирају знак за предвиђање награде се значајно разликују (н = 0/19 Тип 1 наспрам н = 12/34 Тип 2, хи-квадрат = 8.67, п = 0.003) . Овај парадоксалан образац одговора могао би бити последица рачунских процеса у елементу средњег кола, као што је ВТА, који може играти активну улогу током задатка понашања, али неактиван током фото-означавања. Поред тога, понашање животиње може утицати на начин на који се ови подаци обрађују.

Наши експерименти изостављања награде омогућили су нам да направимо разлику између ЛХ неуронског кодирања ЦР-а и потрошње безусловног стимулуса (УС). У овим експериментима, подскуп јединица типа 2 је реаговао на знак предвиђања награда (ЦС) и САД и такође је показао смањење стопе пуцања када су очекиване награде изостављене. Штавише, подскуп јединица типа 2 такође показује фазно узбуђење након неочекиване испоруке награде (Фигуре КСНУМКСГ и 4Х). Ови подаци подсећају на начин на који ДА неурони у ВТА кодирају грешку предвиђања награде (Цохен ет ал., 2012, Сцхултз ет ал., 1997). Спекулишемо да ВТА неурони могу да преносе сигнале грешке предвиђања награде подскупу ЛХ неурона, који су добро позиционирани да интегришу ове сигнале за одређивање одговарајућег понашања. Конкретно, ЛХ је чврсто повезан са мноштвом других подручја мозга (Бертхоуд и Мунзберг, 2011) и узрочно је повезан са хомеостатским стањима као што су сан/узбуђење и глад/засићеност (Цартер ет ал., 2009, Јеннингс ет ал. , 2013).

Компулзивно понашање у потрази за наградом првенствено се расправљало у контексту зависности од дроге, где је класична парадигма за компулзивно тражење дроге била да се испита степен до којег понашање у потрази за дрогом опстаје суочено са негативним последицама, као што је шок стопала. (Белин ет ал., 2008, Пеллоук ет ал., 2007, Вандерсцхурен и Еверитт, 2004). Овај задатак смо прилагодили тражењу сахарозе како бисмо нам омогућили да истражимо да ли је активација ЛХ-ВТА пута била довољна да промовише компулзивно тражење сахарозе. С обзиром на то да је разлика између награде за дрогу и природне награде у томе што награде за дрогу нису неопходне за преживљавање, постоји контроверза о томе која понашања би представљала компулзивно понашање у потрази за сахарозом или храном. Алтернативно тумачење наших података је да активација ЛХ-ВТА пута једноставно повећава мотивациони нагон или нагон за тражењем појачавача апетита. Како је стопа гојазности порасла последњих деценија (Миетус-Снидер и Лустиг, 2008), компулзивно преједање и зависност од шећера су преовлађујућа стања која представљају велику претњу људском здрављу (Авена, 2007). Понашање храњења код засићених (потпуно ухрањених) мишева након активације пута ЛХ-ВТА подсећа на понашања у исхрани виђена код људи којима је дијагностикован компулзивни поремећај преједања (или поремећај преједања) (ДСМ-В).

Предложено је да поновљене радње доводе до формирања навика, које саме доводе до компулзивног тражења награде које карактерише зависност (Еверитт и Роббинс, 2005). Наш налаз да ЛХ-ВТА неурони кодирају само улаз у порт након кондиционирања сугерише да овај пут селективно кодира условљени одговор, а не само мотивисану акцију. Ово је у складу са нашим запажањима да оптичко активирање ове пројекције може подстаћи компулзивно тражење награде суочени са негативним последицама (Слика 5Ц), као иу одсуству потребе (као што се види код засићених мишева, Слика 5Е). Ово тумачење је додатно поткријепљено нашим открићем да фотоинхибиција ЛХ-ВТА пута селективно смањује компулзивно тражење сахарозе (Слика 5Д) али не смањује храњење код мишева ограничених на храну (Слика 5Ф). Један од највећих изазова у лечењу компулзивног преједања или поремећаја преједања је ризик од нарушавања понашања храњења уопште. Из перспективе транслације, можда смо идентификовали специфично неуронско коло као потенцијалну мету за развој терапијских интервенција за компулзивно преједање или зависност од шећера без жртвовања природног понашања храњења.

Показали смо да поред глутаматергичне ЛХ-ВТА компоненте (Кемпадоо ет ал., 2013), постоји и значајна ГАБАергична компонента у пројекцији (Леиннингер ет ал., 2009) и да ЛХ неурони синапсирају директно на ДА и ГАБА неурони у ВТА (Слика 6). Међутим, постоји разлика у равнотежи ексцитаторног/инхибиторног улаза на ВТА ДА и ГАБА неуроне.

Док смо користили имунохистохемијску обраду да потврдимо идентитет ВТА неурона, такође смо измерили И_h, неспецифична катјонска струја активирана хиперполаризацијом изнутра (Лацеи ет ал., 1989, Унглесс и Граце, 2012). Присуство ове струје је широко коришћено у електрофизиолошким студијама за идентификацију ДА неурона, али се показало да је присутно само у субпопулацијама ДА неурона, оцртаних пројекцијом циља (Ламмел ет ал., 2011). Иако је претходно у прегледу Фиелдса и колега предложено да „ЛХ неурони синапсе на ВТА пројекције на ПФЦ, али не и оне које пројектују на НАц“ (Фиелдс ет ал., 2007), наши подаци сугеришу да се ова контроверза поново отвори ради даље истраге. Иако смо приметили подскуп ДА неурона који су примили нето ексцитацију од ЛХ и поседовали веома мали И_h (у складу са ДА неуронима који пројекције мПФЦ- или НАц медијалне шкољке), такође смо приметили подскуп ДА неурона који су примили нето ексцитаторни улаз и показали велики И_h (у складу са карактеристикама ДА неурона који се пројектују на бочну љуску НАц; Слика С5; Ламел ет ал., 2011). Супротно томе, ВТА ДА неурони који су примили нето инхибиторни улаз показали су веома мали И_h или му је недостајала ова струја, што је у складу са идејом да ЛХ шаље претежно инхибиторни улаз на ВТА ДА неуроне који пројектују на мПФЦ или медијалну љуску НАц. Такође показујемо да се ЛХ улази могу посматрати и у медијалном и у бочном ВТА, што сугерише да ЛХ даје улазе на ВТА неуроне са различитим пројекцијским циљевима, пошто је познато да циљ пројекције ВТА донекле одговара просторној локацији дуж медијално-латералне осе ( Ламел ет ал., 2008).

Улога ЛХ-ВТА пута у промовисању награде је раније приписана глутаматергичној трансмисији у ВТА (Кемпадоо ет ал., 2013), пошто се често сматра да је промотор ЦаМКИИα селективан за неуроне ексцитаторне пројекције. Међутим, наши подаци јасно показују да експресија ЦхР2 под контролом промотора ЦаМКИИα такође циља на неуроне ГАБАергичне пројекције у ЛХ (Слика 6).

Понашање изазвано фотостимулацијом ЛХ^ГАБА-ВТА пут је био махнит, погрешно усмерен и неприлагођен (Мовие СКСНУМКС). Једно тумачење је та активација ЛХ^ГАБА-ВТА пут шаље сигнал мишу који изазива препознавање појачавача апетита. Алтернативно тумачење је да ЛХ^ГАБА-ВТА пут би могао да подстакне подстицање истакнутости или интензивну „жељу“, у складу са условљеним приступом који лежи у основи сигнала, али на нефизиолошком нивоу који производи ово аберантно понашање везано за храњење (Берридге и Робинсон, 2003). У складу са овим, могуће је да активација ЛХ^ГАБА-ВТА пројекција заправо производи интензивне сензације жудње или нагона за храњењем. Међутим, наши експерименти показују да је активација ЛХ^ГАБА-ВТА не доводи до повећања компулзивног тражења сахарозе, али је то вероватно због претераног гризања и аберантног понашања апетита фокусираног на непрехрамбене предмете у комори за тестирање. Иако је тешко одредити искуство миша током ове манипулације, јасно је да адекватно усмерена понашања везана за храњење захтевају координисану активацију и ГАБАергичне и глутаматергичне компоненте ЛХ-ВТА пута.

Оптогенетске и фармакогенетичке манипулације су моћни алати за успостављање узрочно-последичних веза, али не откривају ендогена, физиолошка својства елемената нервног кола. Наша студија обједињује информације о синаптичкој повезаности, природној ендогеној функцији и узрочној улози ЛХ-ВТА пута, пружајући нови ниво увида у то како су информације интегрисане у ово коло. Ови резултати наглашавају важност испитивања функционалне улоге неурона путем повезаности, поред генетских маркера. ЛХ-ВТА неурони су селективно кодирали акцију тражења награде, али нису кодирали стимулансе из околине, док су стимуланси за награђивање и предиктивни знаци били кодирани од стране дискретне популације ЛХ неурона низводно од ВТА. Штавише, идентификовали смо специфичну пројекцију која је узрочно повезана са компулзивним понашањем у потрази за сахарозом и храњењем. Хетерогеност у пројекцији ЛХ-ВТА је неопходна за обезбеђивање адаптивне равнотеже између мотивације за вожњу и регулисања адекватно усмереног понашања апетита. Ови налази пружају увиде релевантне за патолошка стања као што су компулзивни поремећај преједања, зависност од шећера и гојазност