DeltaFosB reglerar indirekt Cck-promotoraktivitet (2010)

Brain Res. 2010 maj 6; 1329: 10-20.

Publicerad online 2010 March 11. doi:  10.1016 / j.brainres.2010.02.081

PMCID: PMC2876727

John F. Enwright, III,1 Megan Wald,1 Madison Paddock,1 Elizabeth Hoffman,1 Rachel Arey,2 Scott Edwards,2 Sade Spencer,2 Eric J. Nestler,3 och Colleen A. McClung2, *

Författarinformation ► Upphovsrätt och licensinformation ►

Förlagets slutredigerade version av denna artikel finns tillgänglig på Brain Res

Se andra artiklar i PMC som citerar den publicerade artikeln.

Gå till:

Abstrakt

Några av de viktiga biokemiska, strukturella och beteendemässiga förändringarna som orsakas av kronisk exponering för missbruksmedel verkar förmedlas av den starkt stabila transkriptionsfaktorn ΔFosB. Tidigare arbete har visat att ΔFosB-överuttryck i möss under 2-veckor leder till en ökning av uttrycket av flera gener i striatum, varav de flesta senare regleras efter 8-veckor avFosB-uttryck. Intressant var också ett stort antal av dessa gener uppreglerade i möss som överuttryckte transkriptionsfaktorn CREB. Det var emellertid oklart av denna studie huruvida kortsiktiga ΔFosB reglerar dessa gener via CREB. Här finner vi att 2-veckor av ΔFosB-överuttryck ökar CREB-uttrycket i striatum, en effekt som försvinner genom 8-veckor. Den tidiga induktionen är associerad med ökad CREB-bindning till vissa målgenpromotorer i denna hjärnregion. Överraskande var en gen som var ett misstänkt CREB-mål baserat på tidigare rapporter, cholecystokinin (Cck), kontrollerades inte av CREB i striatum. För att ytterligare undersöka regleringen av CCK Efter ΔFosB-överuttryck bekräftade vi att kortvarig ΔFosB-överuttryck ökar båda CCK promotoraktivitet och genuttryck. Det ökar också bindningsaktiviteten vid ett förmodat CREB-bindningsställe (CRE) i CCK promotor. Men medan CRE-webbplatsen är nödvändig för normalt basalt uttryck av CCK, det är inte nödvändigt för ΔFosB induktion av CCK. Sammantaget föreslår dessa resultat att medan kortfristig ΔFosB-induktion ökar CREB-uttryck och aktivitet hos vissa genpromotorer, är detta inte den enda mekanismen genom vilken gener uppregleras under dessa betingelser.

Nyckelord: kärnan accumbens, transkription, missbruk

Gå till:

INLEDNING

Kronisk exponering för missbruksmedel orsakar biokemiska och strukturella förändringar i flera hjärnregioner. Dessa förändringar antas innebära förändringar i genuttrycksprofiler i mesolimbic-systemet. Detta system består av dopaminerga neuroner som kommer från det ventrala tegmentala området (VTA) i mitten av hjärnan till medelstora snygga neuroner i nukleär accumbens (NAc) (ventralstriatum) samt ett antal andra hjärnområden. Förändringar i aktiviteten av två transkriptionsfaktorer, cAMP-responselementbindande protein (CREB) och ΔFosB (ett Fos-familjeprotein) har föreslagits för att medla många av de biokemiska, strukturella och beteendeförändringar som ses vid kronisk exponering för missbruksmissbruk ( granskats av Nestler, 2005).

CREB är en ubiquitously uttryckt transkriptionsfaktor som är medlem i CREB / ATF-familjen. CREB-homodimerer binder till variationer av en CRE-sekvens (konsensus: TGACGTCA) som finns i promotorerna från många gener. Fosforylering av CREB (främst vid serin 133, fastän andra ställen har identifierats) kan stimuleras av flera signalkaskader inklusive de nedströms dopaminreceptorerna (Cole et al., 1995). Efter fosforylering vid serin 133 rekryterar CREB co-aktivatorn CREB-bindande protein (CBP) eller besläktade proteiner som leder till ökat genuttryck (granskas av Johannessen et al., 2004). Kronisk exponering för opiat eller psykostimulerande läkemedel av missbruk inducerar övergående ökningar av CREB-aktivitet i kärnan accumbens (Barrot et al., 2002; Shaw-Lutchman et al., 2002, 2003), en anpassning tänkt att minska dessa läkemedels givande egenskaper och att bidra till det negativa känslomässiga tillståndet för droganvändning (Nestler, 2005).

LOtillräckliga anpassningar till missbruksmissbruk antas delvis förmedlas av ΔFosB, en mycket stabil splitsningsvariant av FosB (Nestler et al., 1999; McClung et al., 2004; Nestler, 2008). Fos familjemedlemmar dimerisera med medlemmar av Jun-familjen för att bilda ett aktivatorprotein 1 (AP-1) komplex. AP-1 transkriptionskomplex binder till variationer av AP-1-responselementet (konsensus: TGACTCA) för att reglera transkription (granskad av Chinenov och Kerppola, 2001). Medan akut exponering för missbruksmedel leder till kortlivad induktion (timmar) hos Fos-familjemedlemmar (såväl som ökad CREB-aktivitet) leder upprepad läkemedelsexponering till ackumuleringen av den högstabila ΔFosB (Hopp et al., 1994; Perrotti et al., 2008), vars uttryck förblir i veckor.

Bi-transgena möss som inducerar överuttryckt antingen ΔFosB eller CREB i den vuxna striatumen visar många av de biokemiska och beteendemässiga fenotyperna som ses hos djur som exponeras upprepade gånger för psykostimulanter eller andra missbruksmissbruk. ennalys av genuttrycksförändringar hos dessa transgena djur identifierade flera gener uppreglerade av kortsiktiga (2 veckor) överuttryck av ΔFosB, förändringar förknippade med en samtidig minskning av läkemedelsbelöning. Förändringarna i genuttryck och beteenderespons med kortvarig ΔFosB var anmärkningsvärt liknande de som ses hos djur som överuttryckte CREB för 2 eller 8 veckor (McClung och Nestler, 2003). I slående kontrast minskade långsiktiga överuttryck (8 veckor) av ΔFosB uttryck av många av dessa samma gener och ledde till en ökning av läkemedelsbelöning (Kelz et al., 1999; McClung och Nestler, 2003).

En gen identifierad i dessa studier är kolecystokinin (CCK), en neuropeptid producerad i flera hjärnregioner, inklusive striatumet (Hokfelt et al., 1980). CCK kan modulera dopaminerg överföring (Vaccarino, 1992), är involverad i läkemedelsbelöning och förstärkning (Josselyn et al., 1996; Josselyn et al., 1997; Hamilton et al., 2000; Beinfeld et al., 2002; Rotzinger et al., 2002) och induceras i striatumet av kronisk kokain (Ding och Mocchetti, 1992). Dessutom CCK promotorn har visat sig vara mottaglig för både CREB- och AP-1-komplexen (Haun och Dixon, 1990; Deavall, et al., 2000; Hansen, 2001). Eftersom många av generna (inklusive CCK) som visade ökat uttryck efter både CREB och kortfristigt ΔFosB-uttryck var kända eller misstänkta CREB-målgener (McClung och Nestler, 2003), vi ville bestämma om kortsiktigt ΔFosB uttryck leder till reglering av dessa gener (med fokus på CCK) genom reglering av CREB eller genom mer komplexa mekanismer för genreglering.

Gå till:

RESULTAT

ΔFosB-överuttryck ökar transbikt CREB-nivåerna

Vi använde Western blotting för att undersöka om ΔFosB-överuttryck ökar CREB-proteinnivåerna i musens striatum. För denna studie använde vi bi-transgena möss (linje 11A) som bär både en NSE-tTA-transgen och en TetOp-FosB-transgen. I frånvaro av doxycyklin uppvisar dessa möss en robust ökning av ΔFosB-uttryck i de dynorfin-positiva neuronerna i striatum (Kelz et al., 1999). Denna metod att överuttrycka ΔFosB har dokumenterats i stor utsträckning och möjliggör regionspecifik överuttryckning, vilken parallellerar ΔFosB-induktionen sedd hos djur utsatta för kronisk kokain (Hopp et al., 1994; Kelz et al., 1999). Vi fann att i 11A-möss som överuttryckte ΔFosB, var CREB-proteinnivåerna signifikant uppreglerade efter 2-veckor av expression och dessa nivåer återvände till baslinjen efter 8-veckors uttryck (Figur 1A, n = 8). För att avgöra om förändringarna i CREB-nivåer med kortvarig ΔFosB-överuttryckning kunde replikeras i ett annat system överuttryckte vi transient ΔFosB i PC12-celler och fann att CREB-nivåerna ökade signifikant (p <0.05) jämfört med kontroller (Figur 1B, n = 4). Dessa resultat visar att kortsiktigt ΔFosB-uttryck ökar CREB-proteinhalterna.

Figur 1

Figur 1

CREB-nivåerna ökar med ΔFosB-överuttryck. Western blot analys av lysater från (A) musstriat från 11A-möss av dox för 2 eller 8 veckor eller (B) PC12-celler som överuttrycker ΔFosB. Data i A visas som procentuell förändring i jämfört dox jämfört .

Både ΔFosB och CREB binder till promotorer av specifika målgener i striatumet efter kortvarig ΔFosB-överuttryck

Vi använde ChIP (kromatinimmunutfällning) analyser av striatal vävnad för att bestämma om FFB eller CREB-bindning inträffade vid vissa målgenpromotorer och om denna bindning ökade efter kortvarig ΔFosB-överuttryck. Vi analyserade bindning vid BDNF och CCK promotorer, eftersom båda generna är högt uppreglerade efter kortvarig ΔFosB-överuttryck, CREB-överuttryck eller kronisk kokainbehandling (McClung och Nestler, 2003). Vi analyserade också bindning vid CDK5 promotorn, eftersom det är ett känt direkt mål för ΔFosB (Chen et al., 2000; Bibb et al., 2001; Kumar et al., 2005). Slutligen mätte vi bindning vid prodynorphin promotor, eftersom tidigare studier har visat att det kan vara bunden av både ΔFosB och CREB under olika förhållanden (Andersson et al., 2001; Zachariou et al., 2006).

ChIP-analys utfördes på striat från 11A-möss som överuttryckte ΔFosB för 2-veckor med användning av antikroppar som känner igen CREB eller ΔFosB. Under normala förhållanden fann vi att ΔFosB binder till CDK5 och prodynorphin promotorer, medan det inte finns någon detekterbar bindning vid BDNF or CCK promotorer (Tabell 1). Vidare ökade ΔFosB-överexpressionen bindningen av ΔFosB vid CDK5 promotor, men inte vid prodynorphin promotor. Vi mättes därefter CREB-bindning vid dessa promotorer och fann att CREB binder till CDK5, BDNF och prodynorphin promotorer, men inte till CCK promotorn, i normal striatum, och att ΔFosB-överuttryck för 2-veckor ökar CREB-bindningen vid BDNF och prodynorphin promotorer, men inte CDK5 promotor. Sammantaget visar dessa resultat att ΔFosB och CREB båda kan binda till vissa genpromotorer, såsom prodynorphin och CDK5emellertid är CREB-bindning specifik för andra promotorer, såsom BDNF. Vidare leder ΔFosB-överuttryck till ökning av FFosB-bindning vid vissa promotorer, vilket skulle förväntas, men också för CREB-bindning till specifika promotorer, som överensstämmer med den av FosB-medierade CREB-induktionen observerad vid denna tidpunkt.

Tabell 1

Tabell 1

Bindning av förmodade regulatoriska proteiner till olika promotorer hos möss som överuttrycker ΔFosB i två veckor.

Tidigare arbete har visat att förändringar i genuttryck inducerat genom långvarig FFBB-överuttryckning är associerade med kromatinmodifieringar, i synnerhet acetylering av histon H3 vid specifika genpromotorer (Kumar et al., 2005). För att bestämma om detta kunde svara för förändringar i genuttryck vid kortvarig ΔFosB-överuttryck uppmättes bindning av acetylerad histon H3 (en histon-modifikation associerad med transkriptionellt aktivt kromatin) eller en metylerad histon H3 (Lys9, en histonmodifikation associerad med transkriptionellt inaktivt kromatin). Vi fann att överuttryck av ΔFosB för 2-veckor resulterade i inga förändringar i bindning av acetylerad H3 vid någon av de genpromotorer som studerades (Tabell 1). Vi hittade en signifikant minskning av bindningen av metylerad histon H3 vid prodynorphin promotor men ingen bindning vid CCK promotor och ingen förändring i bindning vid CDK5 och BDNF promotorer, vilket tyder på att detta inte är en allmän mekanism med vilken ΔFosB på kort sikt reglerar genuttryck. Vi blev förvånade och intresserade av det faktum att vi inte hittade några skillnader i våra ChIP-analyser som kunde utgöra ökningen i CCK mRNA-uttryck i 11A-mössen efter 2-veckor avFosB-uttryck och bestämde sig för att undersöka denna mekanism ytterligare.

KortfristigAfosB ökar CCK uttryck i flera system

Microarray karakterisering av bi-transgena 11A-möss som överuttryckte ΔFosB i striatumen fann att CCK uttrycksnivåerna ökar efter 2-veckor av överuttryck och minskar sedan gradvis med längre perioder av FFosB-uttryck (Figur 2A, n = 3). Vi validerade denna effekt för CCK använder realtids-PCR i en separat grupp djur vid 2- och 8-veckor och fann resultat vid de två tidpunkterna som liknar mikroarrayanalysen (data ej visade).

Figur 2

Figur 2

Kortsiktig överuttryck av ΔFosB ökar CCK genexpression. (A) CCK mRNA-uttryck i striatum efter ΔFosB-överuttryck i 11A-möss för 1-, 2-, 4- eller 8-veckor. Microarrayanalys utfördes på striatala prover och CCK nivåer .

För att ytterligare undersöka förmågan hos FosB att reglera CCK uttryck, vi använde PC12-celler transiently transfekterade med a CCK-luciferasreporterplasmid och antingen en AFosB-expressionsplasmid eller en lika stor mängd pCDNA. Båda två (n = 5-9) och tre (n = 11-13) dagar av ΔFosB-överuttryck resulterade i en signifikant ökning i CCK-luciferasuttryck. Dessutom resulterade tre dagar av ΔFosB-överuttryck i betydligt mer CCK-luciferasinduktion när den jämfördes med två dagar av överuttryck (Figur 2B). Överuttryck av ΔFosB inducerade inte uttryck av en promotorfri luciferasekonstruktion (data ej visad). Under inga behandlingsförhållanden var en minskning i CCK-luciferasaktiviteten uppenbar. Dessa resultat visar att kortsiktigt ΔFosB-uttryck ökar aktiviteten hos CCK promotorn och lämnar obesvarad mekanism genom vilken långsiktig ΔFosB-överuttryckning undertrycker CCK uttryck.

ΔFosB-överuttryck ökar bindningen vid ett förmodat CREB-bindningsställe i CCK promotor

Våra analyser fann att CCK uttrycket ökar efter kortvarigt ΔFosB-uttryck, men våra ChIP-analyser visade att varken CREB eller ΔFosB binder till CCK promotor. För att bestämma om det finns några förändringar i proteinbindning vid CCK promotor som följer ΔFosB-överuttryck, använde vi elektroforetisk rörlighetskvämningsanalyser (EMSA) med en sond som innehöll den förmodade CRE-liknande siten närvarande inom CCK promotor. Genom att använda kärnekstrakter från striata av 11A-möss som överuttryckte ΔFosB för 2-veckor, fann vi en ökning av bindning till den förmodade CRE-platsen i CCK promotor (Figur 3 A, C, n = 4). Intressant är att 11A-möss överuttrycker ΔFosB för 8-veckor, vilket visar en minskning av CCK uttryck, visade också ökad bindning vid denna webbplats (Figur 3B, C, n = 4). Som en jämförelse undersökte vi bindning till en konsensus CRE-plats i möss som överuttryckte ΔFosB för 2-veckor och fann robust CRE-bindning i striatal-extrakt, men ingen ökning av bindning efter FFB-induktion (Figur 3F, n = 4). Således, trots en ΔFosB-inducerad ökning av totala CREB-nivåer som ses vid denna tidpunkt, är dessa resultat i linje med våra ChIP-analyser, vilket visar att ökad CREB-bindning vid promotorer som följer ΔFosB-överuttryck är specifik för endast vissa gener och är inte ett globalt fenomen . För att avgöra om CREB är bunden till CCK promotor i vår EMSA-analys utförde vi supershift-analyser med en CREB-specifik antikropp. I överensstämmelse med våra ChIP-analyser hittade vi ingen bindning av CREB till en CCK sond som innehöll det förmodade CRE-stället i EMSA-analyser, medan CREB bindade signifikant och supershift en konsensus CRE-webbplats (Figur 3D, E, n = 4). DNA-bindningsaktiviteten vid CCK promotorn påverkades inte heller av en antikropp mot AFosB (data ej visad) under betingelser som visades i flera tidigare studier för att blockera ΔFosB-bindning till bona-fide AP-1-ställen (Hope et al., 1994a, 1994b; Chen et al., 1995, Hiroi et al., 1998). Vi utförde också ChIP-analyser på striat av 11A-djur efter 8-veckor av ΔFosB-uttryck och finns fortfarande ingen bindning av CREB eller ΔFosB vid CCK promotor (data ej visad). Således leder ΔFosB-uttryck till en ökning av proteinbindning vid CCK promotor efter både 2 och 8 veckor av expression; Identiteten av dessa faktorer förblir emellertid okänd.

Figur 3

Figur 3

Proteinbindning vid CCK promotor. (A, B) Elektroforetisk mobilitetsskiftanalys med användning av CCK CRE-liknande webbplats med striatal vävnad från djur som överuttrycker ΔFosB för 2 veckor (A) eller 8 veckor (B). I (A), tävling med överskridande omärkt konkurrent .

Den förmodade CRE-webbplatsen i CCK promotorn är inte ansvarig för ökad promotoraktivitet

Eftersom vi hittade en ökning av proteinbindningen med hjälp av ett fragment av CCK promotor, som innehåller den förmodade CRE-webbplatsen, efter ΔFosB-överuttryck, ville vi bestämma om denna webbplats är nödvändig för ökad CCK uttryck efter ΔFosB-överuttryck. För att testa denna möjlighet transfekterade vi PC12-celler med a CCK-luciferasplasmiden innehållande dess intakta CRE-liknande ställe eller en innehållande en mutation på platsen som skulle avskaffa någon interaktion med CREB. Intressant är att mutation av CRE-liknande webbplats minskade basal CCK promotoraktivitet med 32% (Figur 4A, n = 9), men påverkar inte CCK promotors induktion genom ΔFosB-överuttryck (Figur 4B, n = 11-13). Detta tyder på att även om CCK promotorn kräver en intakt CRE-liknande plats för full basal aktivitet, kräver den ökade promotoraktiviteten inducerad av ABFBB-överuttryckning inte CRE-liknande sekvensen.

Figur 4

Figur 4

Smakämnen CCK-liknande CRE-webbplats är inte nödvändig för CCK induktion med ΔFosB. (A) CCK-luciferasaktivitet uppmättes 2 dagar efter transfektion med antingen normal CCK-luciferas eller ett i vilket det CRE-liknande stället muterades. * p <0.05 (B) CCK-luciferase .

cFos binds till CCK promotor

Tidigare studier har funnit det cFos mRNA ökar med kortfristigt ΔFosB-uttryck, men efter långvarigt FFB-uttryck minskar förmågan hos kokainbehandling att inducera cFos i striatum (McClung och Nestler, 2003; Renthal et al., 2008). Därför kan det vara möjligt att cFos bidrar till ökningen i CCK uttryck efter kortvarigt ΔFosB-uttryck. Vi utförde ChIP-analyser med en antikropp specifik för cFos och uppmätt cFos-bindning vid CCK promotor med och utan kortvarigt FFosB-uttryck. Medan vi fann att cFos binder till CCK promotorn ökade denna bindning inte signifikant efter ΔFosB-överuttryckning (Figur 5, n = 5). Detta föreslår att eftersom cFos binder CCK promotor kan det bidra till den allmänna regleringen av CCK uttryck, men det är sannolikt inte inblandat i reglering av CCK promotorn av ΔFosB.

Figur 5

Figur 5

cFos binds till CCK promotor. Kromatinimmunutfällningsanalyser utfördes med en specifik antikropp för cFos med användning av striatal vävnad från ΔFosB-expressuttryckande möss antingen på dox eller efter 2-veckor av doxavlägsnande. Realtid PCR-analys var .

Gå till:

DISKUSSION

Denna studie bekräftar och expanderar vid tidigare fynd som visar att ΔFosB reglerar genuttryck i striatumen och vi finner att det gör det genom flera mekanismer efter korttidsuttryck. Vi visar att efter 2-veckor av överuttryck binder ΔFosB direkt till promotorerna i vissa gener som leder till förändringar i uttryck (dvs. CDK5). Dessutom ökar det CREB-proteinhalter, en effekt som observeras i odlade celler såväl som i striatum, vilket leder till ökad CREB-bindning vid andra genpromotorer (dvs. dynorfin och BDNF). I en tidigare studie fann vi att kortsiktig överuttryck av ΔFosB i striatum leder till många av de samma genuttrycksförändringar som finns när CREB överuttrycks och leder till liknande beteendemässiga svar i åtgärder av kokainpreferens (McClung och Nestler, 2003). Således hjälper föreliggande uppfinning att ΔFosB leder till en induktion av CREB, såväl som bindning av CREB till vissa genpromotorer, att förklara varför så många av genuttrycksförändringarna delades av dessa två transkriptionsfaktorer.

Induktionen av CREB med ΔFosB är intressant, eftersom det har visat sig att missbruksmedel inducerar förändringar i serin 133-fosforylerade CREB-nivåer (Mattson et al., 2005) och öka CRE-medierad transkription (Barrot et al., 2002; Shaw-Lutchman et al., 2002, 2003) utan att ändra övergripande nivåer av CREB. Det är möjligt att förändringar i CREB-nivåer kan vara övergående och därför lätt missade i andra studier. I våra händer har vi sett kokaininducerade ökningar i CREB mRNA i speciella experiment, men denna effekt är mycket variabel (obublicerad observation). Eftersom både 11A-transgena möss och PC-12-celler uppvisar CREB-induktion efter kortvarig FFB-överuttryck, antyder detta att CREB faktiskt induceras av ΔFosB (eller ett mål för FosB), vilket ger ytterligare en mekanism för att förklara läkemedelsinducerade förändringar i gen uttryck.

Överraskande fann vi att varken CREB eller ΔFosB binder till CCK promotor trots att CCK uttryck är uppenbart uppreglerat efter kortvarigt ΔFosB-uttryck. Cck är en riklig neuropeptid uttryckt i både VTA och NAc (Hokfelt et al., 1980) och är sannolikt inblandad i beteendemässiga svar på missbruksmissbruk (Josselyn et al., 1996; Josselyn et al., 1997; Hamilton et al., 2000; Beinfeld et al., 2002; Rotzinger et al., 2002). I cellodlingsanalyser, CCK promotorn har karakteriserats i stor utsträckning och visat sig vara responsiv mot familjemedlemmarna CREB och AP-1 (granskad av Hansen, 2001). Haun och Dixon (1990) visade att AP-1-komplex kan binda till CCK CRE-liknande webbplats vitro, och det visades senare, med användning av SK-N-MC-neuroblastomceller, att mutation av CRE-liknande sätet reducerade promotorresponsen mot överuttryckt cFos / cJun (Rourke et al., 1999). Vi finner faktiskt också ökat CCK promotoraktivitet (Figur 2) och bindande vid eller runt CRE-liknande elementet (Figur 3) vid överuttryck av ΔFosB, en annan AP-1-familjemedlem men vi finner ingen direkt bindning av ΔFosB till CCK promotor in vivo- or vitro, även vid dess överuttryck.

Mycket arbete har visat en roll för CREB i reglering av CCK promotoraktivitet. De CCK CRE-liknande webbplats bevaras över ryggradsdjur (Hansen, 2001) och i vissa cellodlingsanalyser binder både CREB- och AP-1-komplexen till denna sida och är nödvändiga för CCK promotoraktivitet (Haun och Dixon, 1990; Deavall, et al., 2000; Hansen, 2001). Dessutom har flera kända aktivatorer av CCK uttryck (inklusive bFGF, PACAP, peptoner och depolarisering) har visat sig fungera via CREB (Hansen, et al., 1999; Deavall et al., 2000; Bernard et al., 2001; Gevrey et al., 2002; Hansen, et al., 2004). Vår CCK-luciferas reporter gendata stödjer en viktig roll för CRE-liknande webbplats i reglering av CCK promotoraktivitet, eftersom mutation av denna sida minskar basal CCK promotoraktivitet och CCK-luciferasuttryck inducerat av VP16-CREB, en konstitutivt aktiv form av CREB, försvinner när denna sida är muterad (obublicerad observation). Således blev vi förvånade över att finna att CREB inte tycks binda till CCK promotor i striatal-extrakt antingen vid baslinjen eller vid kortvarig FFB-överuttryck när CREB-nivåerna ökas. Detta hävdar att nivåerna av CREB per se är inte den enda faktorn för att bestämma bindningsgraden på denna sida, och detta stöds av andras arbete (Cha-Molstad, et al., 2004). Sedan promotorerna till andra, tidigare identifierade CREB-målgener, såsom BDNF och prodynorphin, binder CREB, vi är övertygade om vårt konstaterande att CREB inte är bindande för CCK promotor i striatala kärnkstrakter. Vidare är induktionen av CCK-luciferasaktivitet av ΔFosB var inte beroende av den intakta CRE-liknande siten, vilket tyder på att ΔFosB inte reglerar CCK uttryck genom att reglera den direkta bindningen av CREB till CCK promotor.

Vår oförmåga att upptäcka CREB interagerar med CCK promotorn stöds av Renthal et al. (2009), som använde ett ChIP-chip-tillvägagångssätt för att titta på globala förändringar i fosforylerad CREB (pCREB) och FosB-bindning i striatum efter kronisk kokainexponering. I dessa experiment immunprövas DNA-proteinkomplex med fosfB eller pCREB antikroppar och det utfällda DNA hybridiserades efter märkning till en promotor-mikroarray. Medan många tidigare karaktäriserade CREB-målgener identifierades med detta tillvägagångssätt (t.ex. BDNF, prodynorfin), CCK identifierades inte. Dessutom har det visats att bindningen av CREB till en konsensus CRE-plats varierar kraftigt mellan odlade cellinjer (Cha-Molstad, et al., 2004). Alla tidigare studier som hittade CREB-interaktioner med CCK promotorn utfördes i cellodling (inte hjärnan från vilken våra EMSA- och ChIP-prover härleddes) och använde gelskiftanalyser för att undersöka protein-DNA-interaktioner. Medan en EMSA kan bedöma potentialen för en faktor att binda till en DNA-sekvens, ger ChIP-analyser en ny titt på dessa interaktioner in vivo-. Dessutom visar mycket av data som visar antingen induktion av CCK promotoraktivitet eller CREB-bindning till CCK promotorn erhölls från celler som hade stimulerats av faktorer såsom peptoner (Bernard et al., 2001), avpolarisering (Hansen, et al., 2004) eller en mängd aktivatorer av intracellulära signalkaskader innefattande cAMP och ERK (Hansen et al., 1999). I våra experiment var den enda "stimulansen" som användes överexpression av ΔFosB, vilket är tillräckligt för att inducera CCK uttryck. Sammantaget föreslår detta att CREBs förmåga att binda till (och potentiellt reglera) CCK promotorn är starkt beroende av celltypen och aktiveringen av speciella signalvägar. Dessutom CCK CRE-liknande promotorelement (åtminstone i oducerade PC12-celler och i musstriatum) är inte ett direkt mål för CREB eller ΔFosB. Intressant är reglering av FosB uttryck av CREB är också specifikt för celltyp och typen av stimulering. En studie av Andersson et al,. fann att injektion av CREB antisensoligonukleotider i musstriatum delvis hämmade induktionen av FosB efter kokainadministrationen (Andersson et al., 2001). De fann emellertid också att L-Dopa förmåga att framkalla FosB uttryck i 6-OHDA-lesioned striatum påverkades inte av förekomsten av CREB-antisensoligonukleotider.

Eftersom CREB och ΔFosB verkar indirekt reglera CCK promotor och förändringar i kromatinstruktur har dokumenterats som svar på en mängd stimuli som inducerar ΔFosB (Tsankova et al., 2004; Kumar et al., 2005; Renthal et al., 2008), räknade vi att ΔFosB kan indirekt modulera promotoraktivitet genom att ändra kromatinstruktur. I möss som överuttryckte ΔFosB för 2 veckor var emellertid ingen förändring av histon H3-acetylering vid CCK promotor (Tabell 1). Detta stöds av ChIP-chip-data för Renthal et al. (2009), som rapporterade ingen förändring i acetylerad H3-bindning vid CCK promotor hos möss utsatta för kronisk kokain. Sedan CCK promotorn är aktiv i striatumen, förväntades eller observerades ingen repressiv metylerad histon H3-bindning. Intressant såg vi ingen förändring på grund av ΔFosB-överuttryck i acetylerad H3-bindning vid BDNF promotor (som visade ökad CREB-bindning) eller vid CDK5 och prodynorphin promotorer (som visade ökad FosB-bindning). Eftersom det finns en myriad av histon-modifikationer associerade med förändringar i promotoraktivitet (granskad av Rando och Chang, 2009) finns det sannolikt andra kromatinmodifieringar som associerar med induktion av dessa gener. Varje enskild kromatinmodifiering, även om den ofta är prediktiv för nivån av promotoraktivitet, kanske inte förändras under aktiveringen av en speciell gen. I framtida arbete skulle det vara intressant att titta på andra potentiella förändringar i kromatinstrukturen runt CCK promotor som följer ΔFosB-överuttryck. Intressant, kronisk kokain (sannolikt via ΔFosB induktion) har visat sig inducera uttryck av sirtuin 1 och 2, klass III-histon-deacetylaser som verkar förändra neuronal fysiologi, ERK-signalering och beteendehantering mot kokain (Renthal et al., 2009). Induktion av ett histondeacetylas skulle ha förmågan att samtidigt reglera uttrycket av ett stort antal gener via globala förändringar i kromatinstruktur.

En möjlig kandidat som är involverad i CCK reglering efter ΔFosB överuttryck var AP-1 familjemedlem cFos. Uttryck av cFos regleras av CREB (Sheng et al., 1990; Impey et al., 2004) och cFos överuttryck (överensstämmande med överuttryck av sin bindande partner cJun) ökar CCK promotoraktivitet (Rourke et al., 1999). Därför kan ökade CREB-nivåer på grund av kortvarig ΔFosB-överuttryck öka kFos-nivåerna och resultera i ökad bindning till CCK CRE-liknande webbplats. ekonomichefer mRNA induceras i möss efter två veckor avFosB-överuttryckning (McClung och Nestler, 2003) och minskade hos möss utsatta för kronisk kokain eller långvarig ΔFosB-överuttryckning (Renthal et al., 2008). Här finner vi att cFos binder direkt till CCK promotor i striatal vävnad ökar emellertid inte ÖFosB-överuttryckande bindning. Detta föreslår att medan cFos kan vara inblandade reglera CCK uttryck i allmänhet är en förändring av bindningen av cFos ensam inte sannolikt den mekanism med vilken ΔFosB reglerar CCK uttryck. Det är emellertid möjligt att ΔFosB kan inducera antingen posttranslationella förändringar i cFos (t.ex. förändrad fosforylering) eller inducera uttrycket av en bindande partner (såsom cJun) eller samaktivatorprotein. Eftersom den intakta CRE-liknande siten (som tidigare visat sig vara en bindningsplats för AP-1-komplex, se emellertid Haun och Dixon, 1990) krävs inte för den ökade CCK promotoraktivitet som ses med ΔFosB-överuttryck (som bedömts i våra reportergenexperiment), står det att andra transaktiva faktorer också regleras av ΔFosB.

Smakämnen CCK promotorfragmentet som används i våra luciferasreporter-genexperiment innehåller en konserverad Sp1-bindningsplats och en E-box (granskad av Hansen, 2002). I synnerhet har E-box-sekvenser visat sig binda många transkriptionsfaktorer (granskad av Forrest och McNamara, 2004). Med användning av PC12-celler har vi sett att mutationen av E-boxen minskar CCK promotoraktivitet, men ändrar inte promotorns respons till ΔFosB (data ej visad). Intressant, a CCK-luciferasreporter innehållande mutationer i både CRE-stället och E-boxen har ingen detekterbar basaktivitet och svarar inte på ΔFosB-överuttryck (ej offentliggjord observation). En annan potentiell medlare av ΔFosB-åtgärd på CCK promotorn är ATF, vissa former av vilka är kända att induceras i striatum genom kronisk psykostimulant exponering (Green et al., 2008). Vi har emellertid inte funnit några bevis för ΔFosB-induktion av dessa ATF (data ej visade) och ATF skulle inte förväntas binda till den muterade CRE-liknande siten på CCK promotor.

Ett tillvägagångssätt för denna studie är att vi använder ett bi-transgeniskt system för att överuttrycka ΔFosB och således måste man vara konservativ när man skriver paralleller mellan detta paradigm och administrering av kronisk kokain. De 11A-transgena mössen ger emellertid den unika möjligheten att titta på de specifika effekterna av ΔFosB i striatumet, eftersom överuttryck är begränsad till denna hjärnområde (Chen et al., 1998), medan administrering av kokain inducerar förändringar i en mängd andra hjärnregioner som då kan indirekt påverka striatumet. Vidare har flera studier dokumenterat liknande beteendemässiga och molekylära fenotyper i 11A-mössen jämfört med icke-transgena djur behandlade med kronisk kokain (Kelz et al., 1999; McClung och Nestler, 2003; Renthal et al., 2009). Dessutom, Bibb et al. (2001) rapporterade liknande nivåer av striatal Cdk5 mRNA och proteininduktion i samma 11A-stam i jämförelse med kokainbehandlade, icke-transgena kullkammare, liksom liknande förändringar i CDK5-målen, p35 och DARPP-32.

Sammanfattningsvis finner vi att kortsiktigt ΔFosB-uttryck leder till induktion av gener i striatum genom flera mekanismer. Dessa innefattar direkt promotorbindning, induktion av CREB-protein och aktivitet, kromatinmodifiering, förutom vägar som ännu inte bestäms.

Gå till:

EXPERIMENTELLA PROCEDURER

djur

Manliga bi-transgena 11A-djur (NSE-tTA x TetOP -FosB) användes i denna studie och kännetecknas av Kelz et al., 1999. För att överuttrycka ΔFosB avlägsnades möss från doxycyklin mellan 3 och 6 veckors ålder, medan kontrollmöss behölls på doxycyklin. Alla möss var grupphus och upprätthölls på en 12: 12 ljus / mörk cykel, lyser på 7 am och tänds vid 7 pm, med AD lib tillgång till mat och vatten. Alla musexperiment var i överensstämmelse med protokoll som godkändes av djurhälsan och användningsutskottet vid University of Texas Southwestern Medical Center i Dallas.

Reporter- och expressionsplasmider

Viltypen (WT) CCK promotor-luciferasreporter framställdes genom införande av ett approximativt 200 bp-PCR-fragment i pGL3-luc-vektorn (Promega). Detta fragment erhölls från mus genomiskt DNA (primrar: 5 'TATCCTCATTCACTGGGACGC 3' uppströms och 5 'TACCTTTGGATGGGGAAATCG 3' nedströms) och initialt infördes i pGEM-T Easy vektor (Promega, #A1360). Promotorfragmentet klonades sedan in i Kpn1 / Xho1-restriktionsenzymställena av pGL3-luc.

För att skapa CRE-punktmutationen i CCK promotor, en mutagen primer riktad mot ett tidigare rapporterat CRE-liknande säte (sense primer: 5'CGTGTCCTGCTGGACTGAGCTCGCACTGGGTAAACA 3 ', antisense primer: 5'CTGTTTACCCAGTGCGCGCTGAGTCCAGCAGGACACG 3') . Detta omvandlar den rapporterade CRE-liknande webbplatsen (ACTGCGTCAGC) till ACTGAGCTCC. Alla reporterplasmider bekräftades genom DNA-sekvensering. ΔFosB-expressionsplasmiden innehåller en ΔFosB-sekvens i full längd införd i det multipla kloningsstället i pCDNA 3.1 och har beskrivits tidigare (Ulery och Nestler, 2007).

Cellkultur och DNA-transfektioner

Råttofeokromocytomceller (PC12) bibehölls i Dulbeccos modifierade Eagles medium F-12, kompletterat med 10% hästserum, 5% fetalt bovint serum och 1% penicillin / streptomycin vid 37 ° C och 5% CO2. Celler transfekterades genom elektroporering med användning av en BTX 360-elektroporator (350V, 0 ohm och 850 μF) i 800 μL Dulbeccos fosfatbuffrad saltlösning i 4 mm gap-kyvetter med 10 μg av reportern och 5 μg av expressionskonstruktionen. Tom vektorplasmid (pCDNA) användes för att normalisera totala mängder DNA. Efter transfektion odlades cellerna på 35 mm kollagenbelagda skålar under den angivna mängden tid.

Luciferasanalyser

Två eller tre dagar efter transfektion tvättades cellerna tre gånger i Dulbeccos fosfatbuffrad saltlösning, lyserades (med användning av 3 mM glycylglycin, 25 mM MgS15).4, 4 mM EGTA, 1% Triton X-100, pH 7.8, 1 mM DTT), uppsamlades och rensades via centrifugering. 30 / il lysat kombinerades med 140 μL luciferasanalysbuffert (25 mM glycylglycin, 15 mM MgSO4, 4 mM EGTA, 1 mM DTT, 1 mM ATP, 1 mM kaliumfosfat, 1 mM ko-enzym A, pH 7.8). Luminescensaktivitet uppmättes med användning av en FLx-800 mikroplatta fluorescensläsare efter en automatiserad injektion av 40 μL 1 mM luciferin per brunn. Luciferasaktivitet normaliserades till total proteinhalt som bestämdes genom en BioRad-proteinanalys.

Elektroforetisk mobilitetsskiftanalys

Nukleära extrakt från bilaterala segment av striatum från bi-transgena 11A-möss (det där bibehålls på eller av doxycyklin för 2 eller 8 veckor) (McClung och Nestler, 2003) bereddes enligt Huang och Walters (1996). 32P-märkta dubbelsträngade oligonukleotidprober framställdes med användning av Promega Gel Shift Assay-systemprotokollet (#E3300) och prober renades med användning av Roche Quick Spin Columns. Konsensus CRE och AP-1 sond-sekvenser var från Promega (#E328A respektive E320B) och CCK CRE-sekvenser var (Cck-CRE-känsla: CTAGCGAGCTCTGGACTGCGTCAGCACTGGGTGCA; Cck-CRE antisens: CCCAGTGCTGACGCAGTCCAGAGCTCGCTAGCTTT).

Bindande reaktioner och elektrofores utfördes med användning av modifieringar av Promega Gel Shift Assay-systemförfarandet (#E3300). 50,000 CPM av märkt prob kombinerades med 10 μg striatal kärnkstrakt extrakt. Kallkonkurrent-DNA eller antikroppar tillsattes före införandet av de radioaktivt märkta proberna. För supershift-experiment användes 2 ^ ig CREB-antikropp (Upstate Biotechnology # 06-083). Reaktionerna elektroforesades på 4% polyakrylamidgeler, torkades och utsattes för film (med användning av intensifierande skärmar för 1-timme till 2-dagar).

immunoblotting

För PC12-celler tvättades 35 mm-plattor av transfekterade celler i iskall Dulbeccos fosfatbuffrad saltlösning och lysat framställdes i iskall RIPA-lysbuffert (50 mM Tris pH 7.4, 5 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% deoxikolat, 1 % Triton X-100, 0.1% natriumdodecylsulfat) innehållande proteashämmare. Efter ultraljudsbehandling, clearing och Bradford-proteinanalys denaturerades lysaten helt och 50 | ig av varje prov elektroforeserades på 10% SDS-polyakrylamidgeler. Proteiner överfördes till PVDF-membran, blockerades i 1 timme i 3% fettfri torrmjölk i Tris-buffrad saltlösning innehållande 0.1% Tween-20 (TBS-T mjölk) och sonderades över natten vid 4 ° C med primära antikroppar (CREB- Upstate Biotechnology # 06-083, används vid 1: 1,000; GAPDH- Sigma # G8795, används vid 1: 80,000) utspädd i TBS-T mjölk. Efter flera tvättar i TBS-T undersöktes blottar under en timme vid rumstemperatur med användning av alkaliska fosfataskonjugerade sekundära antikroppar (Sigma) utspädda 1: 5,000 i TBS-T-mjölk. Efter flera tvättar i Tris-buffrad saltlösning utfördes färgreaktionen enligt BioRad (# 170-6432) instruktioner. Membran torkades över natten, skannades på en flatbäddsskanner och densitometri utfördes med användning av ImageJ (se nedan).

För striatala extrakt utfördes Western blot-analyser såsom publicerats tidigare (Hopp et al., 1994). Vävnad avlägsnades från deckiterade mössen, placerades på is och snittades på en hjärnmatris med en tjocklek av 1 mm. Vävnadsstansar togs sedan och frystes vid -80 ° C tills de användes. Tissue sonicated på is i en modifierad detergentbaserad buffert innehållande både fosfatas och proteashämmare (Roche, Sigma). Efter sonication denaturerades proverna i kokande vatten och centrifugerades vid 15,000xg under 15 minuter; supernatanten samlades därefter och bearbetades; proteinkoncentrationsmängder kvantifierades därefter med användning av en Bradford-analys (Bio-Rad). Proverna kördes på en 10% akrylamid / bisakrylamidgel, överfördes till ett PVDF-membran, blockerades i 5% mjölk och inkuberades med primära antikroppar (Anti-CREB, Upstate, Lake Placid, NY). Blottvis visualiserades därefter med användning av ett kemiluminescenssystem (Pierce). Alla prover normaliserades till GAPDH (Fitzgerald, Concord, MA). Standardkurvor kördes för att säkerställa att vi befinner oss i det linjära intervallet för analysen.

Densitometrianalys

För PC12 immunoblott utfördes densitometrianalys med hjälp av ImageJ med rodbard-kalibrering. Genomsnittlig bakgrundssignal subtraherades från varje mätning och förhållandet CREB till GAPDH-signal beräknades för varje prov. För striatal immunoblott och EMSA-analys användes Scion Image 1.62c med bakgrundsintertraktion.

Kromatinimmunutfällning (ChIP)

ChIP-analyser utfördes enligt metoderna för Tsankova et al. (2004) och Kumar et al. (2005). Kortfattat tvärbinds bilaterala striatala prover från 11A-möss som hölls på eller av doxycyklin med 1% formaldehyd och tvärbindning släcktes med glycin (slutkoncentration 0.125 M). Dessa prover var från hela hjärnskivor som togs på nivån av kärnan med cortexen borttagen. Kromatin skjuvades till cirka 0.2 till 1 kb fragment via ultraljudsbehandling, rensades med Protein G-pärlor (Thermo Scientific # 22852) och ingående prover frystes vid -80 ° C. Mellan 60 och 100 μg kromatin användes för varje utfällning. 5-10 μg av varje primär antikropp användes (CREB: Upstate Biotechnology # 06-863, ΔFosB: Santa Cruz Biotechnology # SC-48x, acetylated H3: Upstate Biotechnology # 06-599, methylated H3 (LYS9): Cell Signaling Technology, cFos: Santa Cruz Biotechnology # SC-7202x). Antikropp-kromatinkomplex immunutfälldes med protein G plus pärlor enligt tillverkarens instruktioner (Thermo Scientific # 22852). Efter omvänd tvärbindning av inmatade och utfällda prover utsattes varje prov för kvantitativ PCR (qPCR). Användningen av alla dessa antikroppar för ChIP har validerats i stor utsträckning (Tsankova et al., 2004; Kumar et al., 2005; Renthal et al., 2009).

Nivåer av proteinbindning vid varje genpromotor av intresse bestämdes genom att mäta mängden associerat DNA med qPCR (Applied Biosystems (ABI) Prism 7700, Foster City, CA). Input eller total DNA (ickeimmunutfällt) och immunprecipiterat DNA amplifierades i triplikat i närvaro av SYBR Green (Applied Biosystems, CA). Ct-värden från varje prov erhölls med användning av sekvensdetektorn 1.1-mjukvaran. Relativ kvantifiering av mall-DNA utfördes med användning av AΔCt-metoden (Tsankova et al., 2004). Primers använda: BDNF-promotor 4: CTTCTGTGTGCGTGAATTTGCT; AGTCCACGAGAGGGCTCCA CDK5-promotor: GCTGAAGCTGTCAGGAGGTC; GTGCCCCGCTCTTGTTATTA Cck-promotor: CTTGGGCTAGCCTCATTCACTG; TTAAATAGCTCCTCCCGGTTCG-prodynorfinpromotor: GGCTTCCTTGTGCTTCAGAC; GCGCTGTTTGTCACTTTCAA.

Statistisk analys

Alla data presenteras som medelvärden ± standardfel av medelvärdet. Statistisk skillnad bestämdes av Students två-tailed t-test (p <0.05). När flera jämförelser gjordes justerades p-värden med Bonferroni-korrigering.

Gå till:

Tack

Vi vill tacka Will Renthal och Arvind Kumar för användbara diskussioner. Vi vill också tacka NIDA för att finansiera dessa experiment.

Gå till:

fotnoter

Ansvarsfriskrivning för förlag: Detta är en PDF-fil av ett oediterat manuskript som har godkänts för publicering. Som en tjänst till våra kunder tillhandahåller vi denna tidiga version av manuskriptet. Manuskriptet kommer att genomgå copyediting, uppsättning och granskning av det resulterande beviset innan det publiceras i sin slutliga formulär. Observera att under tillverkningsprocessen kan det upptäckas fel som kan påverka innehållet och alla juridiska ansvarsfrister som gäller för tidskriften avser.

Klassificeringsvillkor:

Sektion: #1 Cell- och molekylärbiologi av nervsystemet

Gå till:

Referensprojekt

  1. Andersson M, Konradi C, Cenci MA. cAMP-responselementbindande protein erfordras för dopaminberoende genuttryck i den intakta men inte dopamin-denerverade striatumen. J Neurosci. 2001; 21: 9930-43. [PubMed]
  2. Barrot M, Olivier JD, Perrotti LI, DiLone RJ, Berton O, Eisch AJ, Impey S, Storm DR, Neve RL, Yin JC, Zachariou V, Nestler EJ. CREB-aktivitet i kärnan accumbens skal kontrollerar gating av beteendemässiga svar på emotionella stimuli. Proc Natl Acad Sci USA A. 2002; 99: 11435-40. [PMC gratis artikel] [PubMed]
  3. Beinfeld MC, Connolly KJ, Pierce RC. Kokainbehandling ökar extracellulärt cholecystokinin (CCK) i nukleär accumbens skalet av vakna, fritt rörliga råttor, en effekt som förbättras hos råttor som är beteendemässigt sensibiliserade för kokain. J Neurochem. 2002; 81: 1021-7. [PubMed]
  4. Bernard C, Sutter A, Vinson C, Ratineau C, Chayvialle J, Cordier-Bussat M. Peptones stimulerar intestinal cholecystokinin-gentranskription via cykliska adenosinmonofosfatresponselementbindande faktorer. Endokrinologi. 2001; 142: 721-9. [PubMed]
  5. Bibb JA, Chen J, Taylor JR, Svenningsson P, Nishi A, Snyder GL, Yan Z, Sagawa ZK, Ouimet CC, Nairn AC, Nestler EJ, Greengard P. Effekter av kronisk exponering för kokain regleras av neuronproteinet Cdk5. Natur. 2001; 410: 376-80. [PubMed]
  6. Cha-Molstad H, Keller DM, Yochum GS, Impey S, Goodman RH. Celltypsspecifik bindning av transkriptionsfaktorn CREB till cAMP-responselementet. Proc Natl Acad Sci USA A. 2004; 101: 13572-7. [PMC gratis artikel] [PubMed]
  7. Chen J, Nye HE, Kelz MB, Hiroi N, Nakabeppu Y, Hopp BT, Nestler EJ. Reglering av delta FosB och FosB-liknande proteiner genom elektrokonvulsiv anfall och kokainbehandlingar. Mol Pharmacol. 1995; 48: 880-9. [PubMed]
  8. Chen J, Kelz MB, Zeng G, Sakai N, Steffen C, Shockett PE, Picciotto MR, Duman RS, Nestler EJ. Transgena djur med inducerande, riktade genuttryck i hjärnan. Mol Pharmacol. 1998; 54: 495-503. [PubMed]
  9. Chen J, Zhang Y, Kelz MB, Steffen C, Ang ES, Zeng L, Nestler EJ. Induktion av cyklinberoende kinas 5 i hippocampus genom kroniska elektrokonvulsiva anfall: ΔFosBs roll. J Neurosci. 2000; 20: 8965-71. [PubMed]
  10. Chinenov Y, Kerppola TK. Nära träffar av många slag: Fos-Jun-interaktioner som medger transkriptionsreglerande specificitet. Oncogene. 2001; 20: 2438-52. [PubMed]
  11. Cole RL, Konradi C, Douglass J, Hyman SE. Neuronal anpassning till amfetamin och dopamin: molekylära mekanismer för prodynorfingenreglering i råtta striatum. Nervcell. 1995; 14: 813-23. [PubMed]
  12. Deavall DG, Raychowdhury R, ​​Dockray GJ, Dimaline R. Kontroll av CCK-gentranskription av PACAP i STC-1-celler. Am J Physiol Gastrointest Leverfysiol. 2000; 279: G605-12. [PubMed]
  13. Ding XZ, Mocchetti I. Dopaminerg reglering av cholecystokinin-mRNA-halt i råttstriatum. Brain Res Mol Brain Res. 1992; 12: 77-83. [PubMed]
  14. Forrest S, McNamara C. Id familj av transkriptionsfaktorer och vaskulär lesionsbildning. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2004; 24: 2014-20. [PubMed]
  15. Gevrey JC, Cordier-Bussat M, Némoz-Gaillard E, Chayvialle JA, Abello J. Sammanfattning av cykliska AMP- och kalciumberoende proteinkinaser för transkriptionell aktivering av kolecystokiningenen genom proteinhydrolysat. J Biol Chem. 2002; 277: 22407-13. [PubMed]
  16. Grön TA, Alibhai IN, Unterberg S, Neve RL, Ghose S, Tamminga CA, Nestler EJ. Induktion av aktiverande transkriptionsfaktorer (ATF) ATF2, ATF3 och ATF4 i kärnan accumbens och deras reglering av känslomässigt beteende. J Neurosci. 2008; 28: 2025-32. [PubMed]
  17. Hamilton ME, Redondo JL, Freeman AS. Överflöde av dopamin och cholecystokinin i råttkärnan accumbens som svar på akut läkemedelsadministration. Synapse. 2000; 38: 238-42. [PubMed]
  18. Hansen TV, Rehfeld JF, Nielsen FC. Mitogenaktiverat proteinkinas och proteinkinas A-signalvägar stimulerar kolecystokinin-transkription via aktivering av cykliskt adenosin 3 ', 5'-monofosfatresponselementbindande protein. Mol Endocrinol. 1999; 13: 466–75. [PubMed]
  19. Hansen TV, Nielsen FC. Reglering av neuronal cholecystokinin-gentranskription. Scand J Clin Laboratory Invest Suppl. 2001; 234: 61-7. [PubMed]
  20. Hansen TV. Cholecystokinin-gentranskription: promotorelement, transkriptionsfaktorer och signalvägar. Peptider. 2001; 22: 1201-11. [PubMed]
  21. Hansen TV, Rehfeld JF, Nielsen FC. KCl och forskolin synergistiskt uppreglera cholecystokinin-genuttryck via koordinataktivering av CREB och co-aktivator CBP. J Neurochem. 2004; 89: 15-23. [PubMed]
  22. Haun RS, Dixon JE. En transkriptionsförstärkare som är väsentlig för uttrycket av råttkolecystokiningenen innehåller en sekvens som är identisk med -296-elementet i den humana c-fos-genen. J Biol Chem. 1990; 265: 15455-63. [PubMed]
  23. Hiroi N, Marek GJ, Brown JR, Ye H, Saudou F, Vaidya VA, Duman RS, Greenberg ME, Nestler EJ. Viktig roll för fosB-genen i molekylära, cellulära och beteendemässiga verkningar av kroniska elektrokonvulsiva anfall. J Neurosci 1998. 1998; 18: 6952-62. [PubMed]
  24. Hokfelt T, Rehfeld JF, Skirboll L, Ivemark B, Goldstein M, Markey K. Bevis för sameksistens av dopamin och CCK i meso-limbiska neuroner. Natur. 1980; 285: 476-8. [PubMed]
  25. Hoppas BT, Kelz MB, Duman RS, Nestler EJ. Kronisk elektrokonvulsiv anfall (ECS) -behandling resulterar i uttryck för ett långvarigt AP-1-komplex i hjärnan med förändrad sammansättning och egenskaper. J Neurosci. 1994; 14: 4318-28. [PubMed]
  26. Hoppas BT, Nye HE, Kelz MB, Self DW, Iadarola MJ, Nakabeppu Y, Duman RS, Nestler EJ. Induktion av ett långvarigt AP-1-komplex bestående av förändrade Fos-liknande proteiner i hjärnan av kronisk kokain och andra kroniska behandlingar. Nervcell. 1994; 13: 1235-44. [PubMed]
  27. Huang KX, Walters JR. Dopaminerg reglering av AP-1 transkriptionsfaktor-DNA-bindningsaktivitet i råtta striatum. Neuroscience. 1996; 75: 757-75. [PubMed]
  28. Impey S, McCorkle SR, Cha-Molstad H, Dwyer JM, Yochum GS, Boss JM, McWeeney S, Dunn JJ, Mandel G, Goodman RH. Definiera CREB-regulon: en genom-bred analys av regleringsregioner för transkriptionsfaktor. Cell. 2004; 119: 1041-54. [PubMed]
  29. Johannessen M, Delghandi MP, Moens U. Vad blir CREB på? Cellsignal. 2004; 16: 1211-27. [PubMed]
  30. Josselyn SA, Vaccarino FJ. Motsatta effekter av CCK (A) och CCK (B) antagonister på utvecklingen av konditionerad aktivitet hos råttor. Behav Pharmacol. 1996; 7: 505-512. [PubMed]
  31. Josselyn SA, De Cristofaro A, Vaccarino FJ. Bevis för CCK (A) receptorinsats i förvärv av konditionerad aktivitet som produceras av kokain hos råttor. Brain Res. 1997; 763: 93-102. [PubMed]
  32. Kelz MB, Chen J, Carlezon WA, Jr., Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, Själv DW, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Neve RL, Duman RS, Picciotto MR , Nestler EJ. Uttryck av transkriptionsfaktorn deltaFosB i hjärnan styr känsligheten för kokain. Natur. 1999; 401: 272-6. [PubMed]
  33. Kumar A, Choi KH, Renthal W, Tsankova NM, Theobald DE, Truong HT, Russo SJ, Laplant Q, Sasaki TS, Whistler KN, Neve RL, Self DW, Nestler EJ. Chromatin remodeling är en nyckelmekanism som ligger bakom kokaininducerad plasticitet i striatum. Nervcell. 2005; 48: 303-14. [PubMed]
  34. Mattson BJ, Bossert JM, Simmons DE, Nozaki N, Nagarkar D, Kreuter JD, Hope BT. Kokaininducerad CREB-fosforylering i kärnbärande celler av kokain-sensibiliserade råttor aktiveras genom förbättrad aktivering av extracellulär signalrelaterad kinas, men inte proteinkinas A. J Neurochem. 2005; 95: 1481-94. [PubMed]
  35. McClung CA, Nestler EJ. Reglering av genuttryck och kokainbelöning av CREB och DeltaFosB. Nat Neurosci. 2003; 6: 1208-15. [PubMed]
  36. McClung CA, Ulery PG, Perrotti LI, Zachariou V, Berton O, Nestler EJ. DeltaFosB: en molekylär växel för långsiktig anpassning i hjärnan. Brain Res Mol Brain Res. 2004; 132: 146-54. [PubMed]
  37. Nestler EJ, Kelz MB, Chen JS. ΔFosB: En molekylär mediator av långvarig neural och beteendets plasticitet. Brain Res. 1999; 835: 10-17. [PubMed]
  38. Nestler EJ. Finns det en vanlig molekylväg för missbruk? Nat Neurosci. 2005; 8: 1445-9. [PubMed]
  39. Nestler EJ. Transkriptionsmekanismer för missbruk: DeltaFosBs roll. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2008; 363: 3245-55. [PMC gratis artikel] [PubMed]
  40. Perrotti LI, Weaver RR, Robison B, Renthal W, Maze I, Yazdani S, Elmore RG, Knapp DJ, Selley DE, Martin BR, Sim-Selley L, Bachtell RK, Self DW, Nestler EJ. Distinkta mönster av DeltaFosB induktion i hjärnan av missbruk. Synapse. 2008; 62: 358-69. [PMC gratis artikel] [PubMed]
  41. Rando OJ, Chang HY. Genomövergripande syn på kromatinstrukturen. Annu Rev Biochem. 2009; 78: 245-71. [PMC gratis artikel] [PubMed]
  42. Renthal W, Carle TL, Maze I, Covington HE, 3rd., Truong HT, Alibhai I, Kumar A, Montgomery RL, Olson EN, Nestler EJ. Delta FosB medierar epigenetisk desensibilisering av c-fos-genen efter kronisk amphetaminexponering. J Neurosci. 2008; 28: 7344-9. [PMC gratis artikel] [PubMed]
  43. Renthal W, Kumar A, Xiao G, Wilkinson M, Covington HE, 3rd, Maze I, Sikder D, Robison AJ, LaPlant Q, Dietz DM, Russo SJ, Vialou V, Chakravarty S, Kodadek TJ, Stack A, Kabbaj M, Nestler EJ. Genomgående analys av kromatinreglering av kokain avslöjar en roll för sirtuiner. Nervcell. 2009; 62: 335-48. [PMC gratis artikel] [PubMed]
  44. Rotzinger S, Bush DE, Vaccarino FJ. Cholecystokinin-modulering av mesolimbisk dopaminfunktion: reglering av motiverat beteende. Pharmacol Toxicol. 2002; 91: 404-13. [PubMed]
  45. Rourke IJ, Hansen TV, Nerlov C, Rehfeld JF, Nielsen FC. Negativ kooperativitet mellan juxtapositerade E-box och cAMP / TPA-responsiva element i cholecystokinin-genpromotorn. FEBS Lett. 1999; 448: 15-8. [PubMed]
  46. Shaw-Lutchman TZ, Barrot M, Wallace T, Gilden L, Zachariou V, Impey S, Duman RS, Storm D, Nestler EJ. Regional och cellulär kartläggning av CRE-medierad transkription under naltrexon-utfälld morfinuttagning. J Neurosci. 2002; 22: 3663-3672. [PubMed]
  47. Shaw-Lutchman TZ, Impey S, Storm D, Nestler EJ. Reglering av CRE-medierad transkription i mushjärnan av amfetamin. Synapse. 2003; 48: 10-7. [PubMed]
  48. Sheng M, McFadden G, Greenberg ME. Membran depolarisering och kalcium inducerar c-fos transkription via fosforylering av transkriptionsfaktor CREB. Nervcell. 1990; 4: 571-82. [PubMed]
  49. Tsankova NM, Kumar A, Nestler EJ. Histon-modifikationer hos genpromotorregioner i råttahippocampus efter akuta och kroniska elektrokonvulsiva anfall. J Neurosci. 2004; 24: 5603-10. [PubMed]
  50. Ulery PG, Nestler EJ. Reglering av DeltaFosB transkriptionsaktivitet genom Ser27 fosforylering. Eur J Neurosci. 2007; 25: 224-30. [PubMed]
  51. Vaccarino FJ. Nucleus accumbens dopamin-CCK interaktioner i psykostimulant belöning och relaterade beteenden. Neurosci Biobehav Rev. 1992; 18: 207-14. [PubMed]
  52. Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchmann T, Berton O, Sim-Selley LJ, DiLeone RJ, Kumar A, Nestler EJ. ΔFosB: En väsentlig roll för ΔFosB i kärnan accumbens i morfinåtgärd. Natur Neurosci. 2006; 9: 205-11. [PubMed]