PMCID: PMC2820240
NIHMSID: NIHMS174679
Abstrakt
Kokaininducerade förändringar i genuttryck orsakar förändringar i neuronal morfologi och beteende som kan ligga till grund för kokainberoende. Vi identifierade en viktig roll för histon 3 lysin 9 (H3K9) dimetylering och lysindimetyltransferas G9a i kokaininducerad strukturell och beteendetsplasticitet. Upprepad kokainadministration minskade globala nivåer av H3K9-dimetylering i nukleinsymbolerna. Thans reduktion av histonmetylering medierades genom repression av G9a i denna hjärnregion, vilken reglerades av den kokaininducerade transkriptionsfaktorn FFosB. Med användning av villkorad mutagenes och viral-medierad genöverföring fann vi att G9a-downregulation ökade dendritisk ryggradsplasticitet hos nukleinsymboler och förbättrad preferens för kokain och därigenom etablera en avgörande roll för histon-metylering i de långsiktiga åtgärderna av kokain.
Beskrivning
Upprepad kokainexponering kännetecknas av bestående förändringar i genuttryck och förändrad neuronal morfologi inom nukleär accumbens (NAc), en nyckelkomponent i hjärnans belöningskretsar (1-2). Kromatinreformering är viktig vid avvikande transkriptionella förändringar i denna hjärnregion som kan ligga till grund för aspekter av kokainberoende (3-9). Kokainreglering av kromatinstrukturen i NAc resulterar delvis av direkta kokaininducerade modifieringar av den enzymatiska kromatinmekanismen, vilket leder till förändringar i histon-acetylering och fosforylering (4, 7-9); Emellertid har roller för enzymer som kontrollerar histonmetylering ännu inte undersökts.
En nyligen genomgående promotoranalys med användning av kromatinimmunutfällning kopplad till mikroarrays (ChIP-Chip) identifierade förändrade mönster av repressiv histon H3 lysin 9 (H3K9) och 27 (H3K27) metylering vid specifika genpromotorer i NAc efter upprepad kokainbehandling (6). Vi profilerade därför många lysinmetyltransferaser (KMT) och demetylaser (KDM) som är kända för att kontrollera H3K9 eller H3K27-metylering (Fig. 1A). Endast två enzymer, G9a och GLP, visade vidhäftande transkriptionsreglering 24 timmar efter upprepad kokainadministration, när uttrycket av båda generna var signifikant nedreglerat. Eftersom G9a och GLP specifikt katalyserar dimetyleringen av H3K9 (H3K9me2), är deras nedreglering av kokain förenlig med minskade globala nivåer av eukromatisk H3K9me2 observerad vid denna tidpunkt (Fig. 1B). Däremot förblev globala nivåer av heterochromatisk H3K27-metylering oförändrad genom upprepad kokainexponering (Fig. S1 i stödjande material på nätet). På grund av dess höga nivåer av katalytisk aktivitet både vitro och in vivo- (10) satte vi ut för att ytterligare undersöka den funktionella betydelsen av G9a-repression efter upprepad kokainexponering i NAc. Nivåer av G9a-protein, liksom nivåer av dess mRNA, reducerades signifikant 24 timmar efter upprepad kokainadministration (Fig. S2). Även om G9a-mRNA-uttrycket reducerades med 35% i NAc, avslöjade immunohistokemisk analys en mer blygsam 15% -minskning i G9a-proteinnivåer, vilket överensstämde med den observerade 21% minskningen i H3K9me2 efter upprepad kokainadministration (Fig. 1B). G9a-mRNA-uttrycket nedreglerades också i denna hjärnområde med 20% efter upprepad självadministrering av kokain (Fig. S3).
För att identifiera huruvida förändringar i eukromatisk H3K9me2 korrelerar med genomförändringar i genuttryck i NAc, använde vi mikroarrayanalyser för att undersöka genuttrycksprofiler inducerade av en utmaningsdos av kokain hos djur med eller utan tidigare koka-exponeringshistoria (se kompletterande genlistor i Tabeller S1-S3). Djur som hade fått upprepad kokain visade dramatiskt ökat genuttryck 1 timme efter en kokainutmaning i jämförelse med akut behandlade djur (Fig. 1C). Detta ökade genuttryck uppstod fortfarande som svar på en kokainutmaning som ges efter 1-veckan med återkallande från upprepad kokain. I överensstämmelse med tidigare rapporter visade en liten andel av gener (~ 10%) desensibiliserade transkriptionssvar efter upprepad kokainadministration (Fig. 1C; se Tabell S1) (5). För att direkt undersöka rollen av G9a-nedreglering i det förbättrade genuttrycket observerat efter upprepad kokain, fick möss intra-NAc-injektioner av herpes simplexvirus (HSV) -vektorer som uttryckte antingen GFP eller G9a och behandlades med saltlösning eller upprepad kokain för att bestämma huruvida G9a-överuttryck var tillräcklig för att blockera den upprepade kokaininducerade förbättringen av genuttryck. Från en uppsättning 12 slumpmässigt utvalda gener som uppvisade ökade expressionsnivåer efter upprepad kokain observerades att G9a reducerade signifikant det förbättrade uttrycket för 50% av dessa gener (Tabell S4).
För att identifiera uppströms transkriptionshändelser som medger den upprepade kokaininducerade repressionen av G9a-uttryck, undersökte vi en möjlig roll för ΔFosB, en höggradig spjälsprodukt av den omedelbara tidiga genen FosB. ΔFosB ackumuleras i NAc efter upprepad exponering för kokain, där den har kopplats till ökad kokainbelöning (11). ΔFosB kan verka som antingen en transkriptionsaktivator eller repressor beroende på målgenen som är involverad (3, 5, 6, 12). Användning av bitransgena NSE-tTA × tetOP-AFosB möss, vari ΔFosB-uttryck kan induceras selektivt i NAc och dorsalstriatum hos vuxna djur (13) undersökte vi effekten av ΔFosB uttryck på kokainreglering av H3K9me2 och KMTs i NAc. ΔFosB-överuttryck var tillräcklig för att minska nivåerna av både H3K9me2 (Fig. 1D) och G9a-uttryck (Fig. 1E), vilket efterliknar effekterna av upprepad kokain. Däremot reducerade ΔFosB inte GLP-uttrycket i denna hjärnområde och hade ingen effekt på SUV39H1 och EZH2, de primära trimetyleringsenzymerna för H3K9 respektive H3K27 (Fig. S4). För att bekräfta dessa data med användning av ett oberoende ΔFosB-överuttryckssystem, fick vilda typer av vuxna möss bilaterala intra-NAc-injektioner av Adeno-associerade virus (AAV) -vektorer som uttrycker antingen GFP eller ΔFosB. Viralmedierat överuttryck av ΔFosB minskade nivåerna av G9a-uttryck i detta hjärnregion (Fig. 1E).
En sådan uttalad och specifik reglering av G9a fick oss att undersöka om förändring av G9a-uttryck specifikt i NAc-neuroner reglerar beteendespons på kokain. Vildtypsmöss fick intra-NAc-injektioner av HSV-vektorer som uttrycker GFP eller G9a och analyserades sedan med användning av ett opartiskt kokainkonditionerat ställe-preferensparadigm, vilket ger ett indirekt mått på läkemedelsbelöning. Viralt överuttryck av G9a i NAc-neuroner bekräftades efter beteendestestning (Fig. 2A). G9a överuttryck minskade signifikant preferensen för kokain jämfört med djur som överuttryckte GFP (Fig. 2B) och ökade H3K9me2-nivåer i NAc (Fig. 2C). Överuttryck av en katalytiskt död mutant av G9a (G9aH1093K) (14) påverkade inte kokainpreferensen (Fig. 2B) och hade ingen påverkan på H3K9me2-nivåer i detta hjärnregion (Fig. 2C).
För att ytterligare studera G9as roll i beteendeeffekterna av kokain, och mer specifikt för att efterlikna det upprepade kokaininducerade repressionen av G9a-uttrycket i NAc, vuxen G9afl / fl möss (14) erhöll intra-NAc-injektioner av AAV-vektorer som uttrycker Cre-rekombinas eller GFP som en kontroll. AAV-Cre-knockdown av G9a i NAc, vilket bekräftades immunohistokemiskt (Fig. S5), ökade signifikant effekterna av kokain i platskonditioneringsexperiment och minskade H3K9me2-nivåerna i NAc (Fig. 2D, E). En kommersiellt tillgänglig farmakologisk hämmare av G9a och GLP, BIX01294 (15-16), användes för att fastställa om enzymhämning påverkar på beteendespons på kokain på liknande sätt. I själva verket ökade farmakologisk hämning av G9a och GLP signifikant preferensen för kokain och minskade H3K9me2 i NAc (Fig. 2F, G).
Upprepad administrering av kokain ökar densiteten för dendritiska ryggar på NAc-medelstora nervceller (17), en process associerad med funktionella förändringar vid exciterande glutamatergiska synapser på dessa neuroner (18-19) och sensibiliserade beteendespons på läkemedlet (17, 20). Vi antog alltså att nedreglering av G9a-aktivitet i NAc genom upprepad kokain kan förmedla kokainens förmåga att reglera den dendritiska ryggdensiteten hos NAc-neuroner. Med användning av kromatinimmunutfällning (ChIP) med en anti-G9a-antikropp identifierade vi flera förmodade G9a-genmål i NAc, som var och en har tidigare varit implicerad i kokaininducerad dendritisk plasticitet (Fig. 3A) (20-26). Vi fann att upprepad kokainadministration minskade signifikant G9a-bindning, såväl som nivåer av H3K9me2, vid dessa genpromotorer (Fig. 3B). Däremot rekryterade akut kokainadministration snabbt G9a till några av dessa samma genpromotorer, i överensstämmelse med ökat G9a-uttryck som observerades i NAc 1 timmen efter en akut dos kokain (Fig. S6). Även om G9a-bindning vid specifika genpromotorer korrelerar med förändringar i dess uttryck, förblir det oklart om sådana händelser förmedlas av förändrade globala nivåer av G9a i NAc och / eller av skillnader i G9a-rekrytering efter akut vs upprepad kokainadministration.
Baserat på G9as reglering av många plasticitetsrelaterade gener i NAc, undersökte vi direkt huruvida upprätthållande av G9a-uttryck i detta hjärnregion efter upprepad kokainbehandling var tillräckligt för att blockera kokaininducerad dendritisk ryggbildning. Att använda ett kokainbehandlingsprotokoll som tidigare visats främja induktion av dendritisk ryggrad i NAc (20) undersökte vi ryggdensitet hos djur injicerade med antingen HSV-GFP eller HSV-G9a. I överensstämmelse med tidigare fynd observerade vi en signifikant ökning av dendritisk ryggradens täthet i NAc efter kokainbehandling, en effekt som helt blockerades av G9a överuttryck (Fig. 3C). G9a överuttryck ensamt var inte tillräckligt för att minska NAc dendritisk ryggradens densitet i frånvaro av kokain. För att komplettera dessa data, G9afl / fl möss erhöll intra-NAc-injektioner av HSV-Cre och ryggdensitet kvantifierades och jämfördes med djur som fick HSV-GFP i frånvaro av kokain. Knockdown av G9a-uttryck ökade signifikant ryggtätheten på NAc-medelstora neuroner (Fig. 3C).
Med tanke på bevisen på att G9a nedreglering i NAc efter upprepad kokain medieras av ΔFosB undersökte vi därefter om denna transkriptionsfaktor också är involverad i regleringen av NAc dendritiska ryggar. Även om osFosB inte tidigare har kopplats kausalt till sådan dendritisk plasticitet, har flera av dess mål, inklusive Cdk5 och NFκB-subenheter, varit så implicerade (20-23), och osFB: s persistenta uttryck i NAc-neuroner korrelerar med ökad dendritisk ryggdensitet efter upprepad kokainbehandling (27). Först fann vi att induktion av osFosB i bitransgena möss i frånvaro av kokain, vilket nedreglerade G9a och H3K9me2 uttryck (Fig. 1D, E), minskade G9a-bindning till flera plastisitetsrelaterade gener, av vilka många också har visat sig vara direkta mål för "FosB själv" (Fig. 3D) (3, 6). Vi visade nästa att viralt överuttryck av ΔFosB i NAc signifikant ökade dendritisk ryggtäthet under basala förhållanden, liknande det som observerades efter upprepad kokainadministration (Fig. 3E). Omvänt blockerade överuttryck i NAc för ΔJunD, ett dominerande negativt mutantprotein som antagoniserar ΔFosB transkriptionell aktivitet, förmågan hos upprepad kokain att öka dendritisk ryggradsbildning i NAc (Fig. 3C).
Vår observation att osFosB reglerar G9a-uttryck i NAc, och att ΔFosB och G9a reglerar några av samma målgener, fick oss att undersöka andra interaktioner mellan ΔFosB och G9a. Efter akut kokain, när G9a-nivåerna ökades, binder G9a till FosB genen ökades, medan efter upprepad kokain, när G9a-uttrycket dämpades, binder G9a till FosB genen minskade (Fig. 3A). Sådan minskad G9a-bindning efter upprepad kokain observerades inte för c-fos, där G9a-bindning ökas med upprepad kokain (Fig. S7). Detta är förenligt med det faktum att till skillnad från FosB, c-fos förtrycks, inte induceras, av kronisk psykostimulant exponering (5). ΔFB-överuttryck i bitransgena möss var tillräckligt för att signifikant minska G9a-bindningen till FosB gen (Fig. 3D). Vidare var G9a överuttryck tillräckligt för att minska ökat ΔFosB-uttryck efter upprepad kokainadministrering (Tabell S4). Dessa data antyder en autoreguleringsslinga där G9a initialt begränsar induktion av FosB genom akut kokainadministration. När ΔFosB ackumuleras med upprepad läkemedelseksponering, undertrycker det emellertid G9a och förstärker därmed sin egen ytterligare induktion.
Sammanfattningsvis har vi visat att histonlysinmetylering i NAc är kritiskt involverat i att reglera neuronal genuttryck som svar på kokain. Förtryck av G9a och H3K9me2 efter upprepad kokainadministration främjar kokainpreferens, delvis genom transkriptionell aktivering av flera gener som är kända för att reglera avvikande former av dendritisk plastisitet. Att få en bättre förståelse för generna som regleras genom sådana mekanismer kommer att förbättra vår kunskap om den komplexa biologiska grunden för narkotikamissbruk och kan hjälpa till att utveckla mer effektiva behandlingar av beroendeframkallande störningar.
Material och metoder
Djur och behandlingar
Om inget annat anges hölls möss fyra till fem per bur i en koloni med en 12 timmars ljus / mörk cykel (ljus tänd från 7: 00 AM till 7: 00 PM) vid konstant temperatur (23 ° C) med AD libitum tillgång till vatten och mat. Alla djurprotokoll godkändes av IACUC vid både UT Southwestern Medical Center och Mount Sinai School of Medicine.
För kokainexperiment [immunohistokemitri, western blotting, kvantitativ PCR (qPCR), mikroarrayanalys och kromatinimmunutfällning (ChIP)] användes 8- till 10-veckor gamla C57BL / 6J-möss. Djur fick dagliga injektioner av antingen "saltlösning" (7-behandlingar saltlösning, ip), "akut" kokain (6-behandlingar saltlösning + en behandling 20 mg / kg kokain-HCl, ip) eller "upprepad" kokain (7-behandlingar 20 mg / kg kokain-HCl, ip). Möss avlivades antingen 1 timme eller 24 timmar efter den slutliga behandlingen. För mikroarraystudier behandlades djur dagligen med antingen "saltlösning" (15-behandlingar saltlösning, ip), "akut" kokain (14-behandlingar saltlösning + 1-behandling 20 mg / kg kokain-HCl, ip), "upprepad + akut" kokain ( 7-behandlingar saltlösning + 8-behandlingar 20 mg / kg kokain-HCl, ip) eller "upprepad tillbakadragning + akut" kokain (7-behandlingar 20 mg / kg kokain-HCl + 7-behandlingar saltlösning + 1 utmaningsbehandling 20 mg / kg kokain-HCl, ip) och avlivades 1 timme efter den slutliga behandlingen. I beteendeförsök hölls möss enskilt efter operationen och behandlades med 10 mg / kg kokain-HCl, ip såsom beskrivs nedan. För dendritisk rygganalys och validering av mikroarray efter HSV-GFP och HSV-G9a-GFP-infektion behandlades möss med 'saltlösning' (5-behandlingar saltlösning, ip) eller 'upprepad kokain' (5-behandlingar 20 mg / kg kokain-HCl, ip ) under loppet av 3 dagar, eftersom detta injektionsprotokoll tidigare har visats öka ryggdensiteten på nucleus accumbens (NAc) neuroner inom tidsramen för Herpes simplex virus (HSV) transgenuttryck (Kompletterande ref S1). Möss som använts för dendritisk rygganalys avlivades 4 timmar efter den sista behandlingen.
För att inducera lokal radering av G9a-transkriptet begränsat till NAc-neuroner, använde vi mutanta möss homozygota för en floxerad G9a-allel, som har beskrivits i detalj på annat håll (S2). Cre-inducerad rekombination producerar exon 22 till 25 skarvning utanför ram vilket leder till nonsensmedierat förfall av det muterade transkriptet. Vi använde G9a floxedmöss som var fullständigt backcrossed till C57BL / 6J möss. Möss injicerades sterotaxiskt i NAc med Adeno-associerade virusvektorer (AAV) -vektorer (serotyp 2) som uttrycker GFP eller Cre-GFP mellan åldern av 7 och 10 veckor. Immunohistokemisk analys användes för att verifiera effektiviteten av Cre-medierad rekombination (se Tilläggsfigur Fig. S5). Vi använde AAV-injicerade djur 21 dagar efter operationen eftersom rekombinationen i G9a floxade möss var stabil och maximal vid denna tidpunkt, i överensstämmelse med publicerade rapporter (S3-S4). G9a och ΔJunD-överuttrycksexperiment genomfördes på liknande sätt med användning av HSV-virusvektorer som uttryckte antingen GFP, vildtyp G9a-GFP, katalytiskt döda G9aH1093K-GFP eller ΔJunD-GFP (se S2 för detaljer om utvecklingen av G9a-konstruktioner). HSV-överuttryckande möss användes 3 dagar efter operationen eftersom överuttryck var maximalt vid denna tidpunkt, som observerats via immunohistokemi. På grund av den övergående naturen hos HSV-expression och den betydligt mer stabila naturen hos AAV-uttryck användes HSV-vektorer i experiment som krävde snabb, kortvarig transgenuttryck, medan AAV-vektorer användes i experiment som krävde längre perioder med transgenuttryck. Båda vektorerna har visats, i omfattande tidigare studier, infektera bara neuronala cellkroppar inom det injicerade hjärnområdet, utan någon infektion av afferenta eller efferenta neuroner.
För beteendeförsök med den farmakologiska G9a / GLP-hämmaren, BIX01294 (25 ng / mL), implanterades möss sterotaxiskt med två subkutana minipumpar, såväl som bilaterala ledkanyler, in i NAc. Mini-pumpar aktiverades 12 timmar före implantation som initierade den kontinuerliga leveransen (0.25 μl / timme) av antingen fordon (5 hydroxypropyl ß-cyclodextrin) eller läkemedel under 14 dagar, under vilken tids beteendevärderingar utfördes.
För ΔFosB-överuttrycksexperiment [western blotting, qPCR och ChIP], manlig bitransgen NSE-tTA × tetOP-ΔFosB möss användes (10 vecka gammal), varvid djur visade robust striatal begränsat konstitutivt uttryck av ΔFosB (i 8 veckor gammal), i frånvaro av tetracyklinderivat-doxycyklin (XNUMX veckor från doxycyklin)S5). OverFosB-överuttryck hos dessa möss bekräftades via qPCR. För att bekräfta fynd med NSE-tTA × tetOP-ΔFosB möss, vildtyp 8-veckor gamla C57BL / 6J-hanmöss injicerades intra-NAc med AAV-vektorer som uttryckte antingen GFP eller ΔFosB-GFP. AAV-vektorer användes i detta fall för att säkerställa maximalt ΔFosB-uttryck vid 8 veckor efter operationen, vilket möjliggjorde en direkt jämförelse mellan viralt infekterade och bitransgena ΔFosB-överuttryckande möss. Viralt överuttryck bekräftades med användning av qPCR vid 8 veckor efter operationen (15-gauge NAc-stansar dissekerades under injektionsstället). AAV-GFP och AAV-ΔFosB-GFP-överuttryckande möss som inte användes för qPCR behandlades med saltlösning (14-behandlingar saltlösning, ip) eller upprepade kokain (14-behandlingar 30 mg / kg kokain-HCl, ip) från 6 veckor efter- kirurgi. 4 dagar efter den slutliga behandlingen fixerades hjärnor med 4% paraformaldehyd, delades på en vibratom och användes för dendritisk ryggradsanalys.
Western blot-analys
14-gauge NAc-stansar togs från 1 mm koronalsektioner erhållna med användning av en rostfritt stål-hjärnmatris och sonikerades i 1 M HEPES-lysbuffert (1% SDS) innehållande proteas- och fosfatasinhibitorer. 10-30 μg prover av totalt protein elektroforeserades på 18% SDS-geler. Proteiner överfördes till PVDF-membran och inkuberades med antingen H3K9me2 (monoklonalt mus, 1: 500), anti-p-tubulin (monoklonalt mus, 1: 60,000), anti-total histon H3 (kanin polyklonal, 1, 5,000) anti-GFP (används för verifiering av lika viralt uttryck i stansad vävnad) (polyklonalt kanin, 1: 1000), anti-H3K27me3 (polyklonalt kanin, 1: 500) eller anti-aktinantikroppar (monoklonalt mus, 1) över natten: XUM 60,000 ° C (alla membran blockerades i 4% mjölk eller 5% bovint serumalbumin). Membraner inkuberades sedan med peroxidas-märkta sekundära antikroppar (5: 1-1: 60,000 beroende på den använda primära antikroppen) och band visualiserades med användning av SuperSignal West Dura-substrat. Banden kvantifierades med NIH Image J Software och H3K9me2-band normaliserades till antingen aktin eller P-tubulin och till total histon H3 för att kontrollera för lika belastning. Upprepad kokain hade ingen effekt på nivåerna av aktin (Fig. S8) eller total histon 3 (Fig. S1) i NAc. HSV-G9a-GFP och HSV-G9aH1093K-GFP-infektion hade dessutom ingen effekt på totala nivåer av p-tubulin i NAc (Fig. S8).
immunohistokemi
Möss sederades med en dödlig dos av klorhydrat och perfunderades med 4% paraformaldehyd innan de analyserades med enkel eller dubbel immunohistokemi som tidigare beskrivits (S6). I korthet inkuberades postfixerade hjärnor vid rumstemperatur över natten i 30% sackaros innan de sektionerades vid 35 um (hjärnor som användes för dendritisk ryggradsanalys delades på en vibratom vid 100 mikrometer i frånvaro av 30% sackaros). Fritt flytande NAc-sektioner tvättades med 1X PBS, blockerades (3% normalt åsnesserum, 0.1% tritonX, 1X PBS) och inkuberades senare med anti-GFP (kyckling polyklonalt, 1: 8000) och / eller anti-G9a (polyklonalt kanin) , 1: 500) antikroppar i blockerande lösning. Avsnitt som analyserades för dendritiska ryggrader inkuberades med en polyklonal kanin anti-GFP-antikropp vid 1: 200. Efter inkubation över natten sköljdes NAc-sektioner 3 gånger under 10 minuter med 1X PBS, följt av inkubation med Cy2 och / eller Cy3 fluorescerande kopplade sekundära antikroppar i 1X PBS-blockeringslösning under 2 timmar. Sektioner som användes för morfologistudier inkuberades i sekundär antikropp över natt vid rumstemperatur. Kärnfärgningsfärgning uppnåddes genom inkubering av sektioner i 1X PBS innehållande DAPI (1: 50,000) under 10 minuter. Sektionerna tvättades återigen, följt av etanol dehydratisering och montering med DPX. Alla sektioner avbildades med hjälp av konfokal mikroskopi.
RNA-isolering och qPCR
Bilaterala 14-gauge NAc-stansar homogeniserades i Trizol och bearbetades enligt tillverkarens instruktioner. RNA renades med RNAesy Micro-kolonner och spektroskopi bekräftade att RNA 260/280 och 260/230-rationerna var> 1.8. RNA transkriberades sedan med användning av ett Bio-Rad iScript-kit. cDNA kvantifierades med qPCR med SYBR Green. Varje reaktion kördes i duplikat eller triplikat och analyserades enligt ΔΔCt-metoden som tidigare beskrivits med användning av glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenas (GAPDH) som en normaliseringskontroll (S7). Se kompletterande tabell S5 för mRNA-primersekvenser.
DNA-mikroarray-analys
Fyra grupper (3 oberoende biologiska replikat per grupp) användes för mikroarray-studien, totalt 12-mikroarrayer. 1 timme efter den sista kokaininjektionen halshuggades djuren snabbt och hjärnorna avlägsnades och placerades på is. Dissektioner av NAc togs med användning av en nålstans av 15-mätaren och frystes snabbt på torris tills RNA extraherades. Bilaterala stansar slogs samman från fyra djur per replikat, totalt 12-möss per grupp. RNA-isolering, mikroarray-behandling och dataanalys utfördes som tidigare beskrivits (S8). Kortfattat isolerades och renades RNA såsom beskrivits ovan och kontrollerades med avseende på kvalitet med Agilent's Bioanalyzer. Omvänd transkription, förstärkning, märkning och hybridisering till Illumina MouseWG-6 v2.0-matriser utfördes med användning av standardprocedurer av UT Southwestern's microarray-kärna. Rå data subtraherades i bakgrunden och kvantiliserades med hjälp av Beadstudio-programvaran. Normaliserade data analyserades med hjälp av GeneSpring-programvara och genelister genererades med användning av signifikanskriterier för en 1.3-faldig förändringsgräns i kombination med en icke-strikt p-värdesgräns på p <0.05.
Vi har en hög grad av förtroende för dessa uppgifter av flera skäl. Först hanterades, behandlades och dödades alla djur samtidigt under samma förhållanden. Dessutom utfördes all RNA- och matrisbehandling samtidigt. För det andra utförde vi triplikatuppsättningar och samlade flera djur per arrayprov, vilket minimerade skillnaderna på grund av individuell variation och ökande statistisk effekt (S9). För det tredje rekommenderas kriterierna för dataanalys som använts för vår studie av projektet MicroArray Quality Control, eftersom dessa kriterier har validerats för att ge en hög grad av reproducerbarhet på intersiten och reproducerbarhet mellan och mellan plattformar (S10-S11).
Konstruktion av virala vektorer
På grund av begränsningar av virusinsättning av storlekar, kodades sekvenser för antingen vildtyp G9a (G9a) eller katalytiskt död G9a (G9aH1093K) subklonades in i den bicistroniska p1005 + HSV-plasmiden som uttrycker GFP under kontroll av det humana omedelbara tidiga cytomegal (cytomegal) införingsstorleken var ~ 9 kb, vilket överskrider den maximala införingsstorleken för AAV-3.96-vektorer). IE2 / 4-promotorn driver G5a-uttryck. Fragment subklonades in i den bicistroniska p9 + HSV-plasmiden via trubbiga ändligeringar med Klenow-behandlade PmeI och EcoRI digererade G1005a (från pcDNA9) och CIP-behandlade p3.1 + efter EcoRI-spjälkning. För produktion av HSV--JunD-GFP genererades den kodande sekvensen för ΔJunD flankerad av EcoRI-restriktionsställen genom PCR med användning av primeroligonukleotider innehållande EcoRI-stället. PCR-produkten ligerades sedan in i EcoRI-stället för vektorn p1005 +. Lokalt uttryck av Cre-rekombinas i NAc-neuroner uppnåddes genom viral-medierad genleverans med användning av en AAV-vektor som beskrivits (S12). GFP eller en N-terminal fusion av GFP till Cre subklonades i en rekombinant AAV-2-vektor innehållande en CMV-promotor med en skarvgivaracceptorsekvens och polyadenyleringssignal. Alla vektorinsättningar bekräftades genom dideoxysekvensering. Virala vektorer framställdes med hjälp av en trippeltransfektionshjälpfri metod, såsom tidigare beskrivits (S13). Renat virus lagrades vid −80 ° C. Viral kvalitet bedömdes med infektiös titer utvärderad i HEK293-celler. AAV-ΔFosB-GFP-virus bereddes på liknande sätt. För HSV-Cre drevs Cre-uttryck av en IRES-promotor, i motsats till IE4 / 5-promotorn, för att minimera Cre-uttryck och förhindra neuronal toxicitet (se S14 för viral konstruktion). I alla fall validerades viralt överuttryck, båda vitro och in vivo, via qPCR och virus bekräftades immunhistokemiskt för att uppvisa NAc-begränsat uttryck efter operation.
Stereotaxisk kirurgi
Under ketamin (100 mg / kg) / xylazin (10 mg / kg) anestesi placerades möss i ett stereotaxiskt instrument med små djur och kranialytan exponerades. Trettiotre spårningsnålar användes för att bilateralt infusera 0.5 ul virus i NAc med en 10 ° vinkel (AP + 1.6; ML + 1.5; DV - 4.4) med en hastighet av 0.1 μl / min. Djur som fick HSV-injektioner fick återhämta sig under 2 dagar efter operationen, medan möss som användes för beteendestestning som fick AAV-vektorer fick återhämta sig under 20 dagar innan de utsattes för platsbehandling. Dessa tider överensstämmer med perioderna med maximalt viralt medierat transgenuttryck för de två vektorerna. För BIX01294-infusioner placerades var och en av två minipumpar subkutant på musens rygg. Kanylplaceringar uppnåddes genom borrning av två små kranialhål över NAc och genom tillförsel av kanylen från bregma (AP + 1.5; ML + 1.0; DV - 5.4). Möss fick återhämta sig från kirurgi under 4 till 5 dagar innan påbörjandet av konditionen med kokain, som beskrivs nedan.
Villkorad platspreferens
Förfarande för städkonditionering utfördes som tidigare beskrivits med följande modifieringar (S7). Kort sagt, 3 dagar efter intra-NAc-infusioner av HSV-G9a-GFP, HSV-G9aH1093K-GFP eller HSV-GFP placerades möss i konditioneringskamrarna, som består av tre olika miljöer. Möss som visade signifikant preferens för någon av de två konditioneringskamrarna uteslöts från studien (<10% av alla djur). Konditioneringsgrupperna balanserades sedan för att justera för eventuell kammarförspänning. På efterföljande dagar injicerades djur med saltlösning och begränsades till en kammare på eftermiddagen i 30 minuter och injicerades sedan med kokain (10 mg / kg, ip) och begränsades under 30 minuter till den andra kammaren på kvällen i 2 dagar (två saltlösning och två kokainparningar). På dagen för testet placerades mössen tillbaka i apparaten utan behandling i 20 minuter och testades för att utvärdera vilken sida de föredrog. Lokomotoriska svar på kokain bedömdes via strålbrott i de kokainparade kamrarna för att säkerställa effektiviteten av läkemedelsbehandling. För AAV- och BIX01294 CPP-experiment användes ett något modifierat protokoll. Djuren injicerades åter med antingen saltlösning eller kokain (10 mg / kg, ip) och begränsades till specifika kamrar under 30 minuters sessioner, men konditionerades istället bara en gång om dagen i 4 dagar, följt av testet på dag 5 (djuren konditionerades på kvällen och behandlingsbehandlingar var alternerade). För alla grupper bedömdes rörelse vid baslinjen som svar på saltlösning för att säkerställa att rörelse inte påverkades av viral eller hämmande behandling.
Intravenös kokain självadministrering
Manliga adolescenta Long Evans råttor, som väger 230-250 g i början av försöket, erhölls. De hölls i en fukt- och temperaturstyrd miljö på en omvänd 12-timme ljus / mörk cykel (tänds vid 9: 00 am) med AD libitum tillgång till mat och vatten. Råttor fick acclimate i sin nya miljö och hanterades dagligen under 1 vecka före experimentets början. Alla förfaranden genomfördes i enlighet med National Institute of Health's Guide för vård och användning av laboratoriedjur och godkändes av Mount Sinai's Animal Care and Use Committee. Självutrustningsutrustningen var utrustad med infraröda strålar för mätning av lokomotoriskt beteende. Självadministration utfördes som tidigare beskrivits (S15-S16) med katetrar implanterade i den högra halsvenen under isofluran (2.4-2.7%) anestesi. Katetrar spolades med 0.1 ml saltlösning innehållande 10 U heparin och ampicillin (50 mg / kg). Efter en veckas återhämtning efter operationen började träning med självadministration under den mörka fasen av ljus / mörk cykel. Djur fick 3-timmars daglig tillgång till kokain (0.75 mg / kg / infusion) under ett förstärkt schema med ett fast förhållande-1 (FR1), där en aktiv spakpress resulterade i en enda infusion av läkemedel. Råttor stabiliserade sitt kokainintag efter 1 dagar (<6% variation i svarsfrekvensen under tre dagar i följd, med minst 15% som svarade på den förstärkta spaken). 3 timmar efter den sista självadministrationssessionen avhuggades råttor snabbt, hjärnorna avlägsnades snabbt och bearbetades för RNA-isolering och qPCR.
Kromatinimmunutfällning (ChIP)
Färska NAc-stanser var tvärbundna formaldehyd och framställdes för ChIP såsom tidigare beskrivits (S17-S18) med mindre ändringar. Kortfattat samlades 4 14-mätare NAc-slag per djur (5-djur sammanslagna per prov), tvärbundna med 1% formaldehyd och släcktes med 2 M glycin före frysning vid -80 ° C. 1-dagen före provkonsolering, får-anti-kanin / mus (beroende på utfällningsantikropp) framställdes IgG-magnetiska pärlor genom inkubering av lämpliga magnetiska pärlor med antingen anti-G9a (kaninpolyklonal ChIP-kvalitet) eller anti-H3K9me2 (musmonoklonal ChIP-kvalitet) antikroppar över natten vid 4 ° C under konstant rotation i blocklösning. Tissue-sonikering och kromatinskärning utfördes såsom tidigare beskrivits (S17). Efter sonikering överfördes lika stora koncentrationer av kromatin till nya rör och ~ 5% av slutprodukterna sparades för att fungera som inmatningskontroller. Efter noggrann tvättning och återuppslamning av de konjugerade pärl / antikroppblandningarna tillsattes lika volymer antikropp / pärlblandningar (~ 7.5 / ig antikropp / prov) till varje kromatinprov och inkuberades under ~ 16 timmar under konstant rotation vid 4 ° C. Prover tvättades vidare och omvänt tvärbundet vid 65 ° C över natten före DNA-rening med användning av ett PCR-reningskit. Efter DNA-rening utsattes prover för qPCR och normaliserades till deras lämpliga "ingångskontroller" som tidigare beskrivits (S17). Normala mus-IgG-immunutfällningar med användning av en polyklonal anti-IgG-antikropp av mus utfördes också för att kontrollera för lämplig anrikning av signalförstärkning. Adeninfosforibosyltransferas (APRT) användes som en negativ kontroll för kokain- och ΔFosB-överexpressionsexperiment. Se Supplerande tabell S5 för promotor-primer-sekvenser.
Dendritisk ryggradsanalys
För att studera rollen av G9a i regleringen av neuronal morfologi in vivo användes metoder som tidigare beskrivits med följande modifieringar (S1). Tre dagar efter injektion av HSV-GFP, HSV-G9a-GFP, HSV-AJunD-GFP (alla virus användes i vildtyp C57Bl / 6J möss) eller HSV-Cre-GFP (används i G9afl / fl möss), när virusuttryck var maximal, möss perfuserades, hjärnorna var kryoprotekterade och senare sektionerade vid 100 ^ im på ett vibratom. Sektioner immunostained sedan med användning av en antikropp mot GFP som beskrivits ovan (se Immunohistochemistry). För att bedöma effekterna av G9a-överuttryck och knockout på ryggradssiffror, liksom effekten av ΔJunD-överuttryck, mättes antalet spines på approximativt 1-2-neuriter per neuron som motsvarar minst 299 μm av sekundära dendriter från GFP-uttryckande NAc-medium spiny neurons (MSNs). Med tanke på att MSNs är morfologiskt skilda från andra neuronpopulationer i NAc, liksom tidigare rapporter som indikerar att HSV primärt infekterar DARPP-32-uttryckande neuroner i denna hjärnregion (S19) är vi övertygade om att MSN: s uteslutande bedömdes i dessa studier. För varje djur undersökte vi ~ 6-8-neuroner i 3-4-djur per grupp (7-grupper), varefter ett medelvärde erhölls för varje djur för statistisk analys. Experiment utformade för att undersöka effekterna av ΔFosB-överuttryck på NAc-ryggradens densitet bragdes på liknande sätt som det som beskrivits ovan, med det undantaget att AAV-vektorer användes för att uttrycka GFP eller AFosB-GFP under längre tidsperioder (8 veckor). Alla HSV-bilder fångades med hjälp av ett konfokalmikroskop med ett 100X-oljedämpningsmål (AAV-bilderna fångades med ett 63X-oljedämpningsmål). Bilder förvärvades med pinhole-uppsättningen vid 1-godtycklig enhet och en 1024 × 1024-ramstorlek. Dendritisk längd mättes med hjälp av NIH Image J-mjukvaran och ryggantalet räknades blinda av den primära experimentet, eftersom diabilder kodades före experimentell avsökning. Det genomsnittliga antalet spines per 10 μm av dendrit beräknades.
Statistisk analys
En- och tvåvägs ANOVAs utfördes för att bestämma betydelsen för konditionerad platspreferens och dendritisk ryggradsanalys med större än två grupper. Studentens t-tester användes för andra jämförelser, inklusive qPCR, western blotting, dendritisk ryggradsanalys som jämförde HSV-GFP med HSV-Cre i G9afl / fl möss, mikroarray-analyser (se ovan) och kromatinimmunutfällningsexperiment. Planerade studenters t-test användes efter tvåvägs ANOVA-analys av dendritisk ryggradstäthet efter ΔFosB-överuttryck med bekräftelse av signifikanta huvudeffekter av läkemedelsbehandling och virus. Alla värden som ingår i figurförklaringarna representerar medelvärde ± SEM (* p ≤ 0.05; ** p <0.001). Detaljerade statistiska analyser för Fig. 1-3 i huvudtexten ges i: Detaljerad figur legender inklusive statistik.
fotnoter
Jag intygar att inget av materialen ingår i manuskriptet med titeln Viktig roll hos histonmetyltransferas G9a i kokaininducerad plasticitet har tidigare publicerats eller behandlas på annat håll, inklusive på Internet.
Allt arbete som involverar användning av djur utfördes i enlighet med institutionella och IACUC riktlinjer vid både University of Texas Southwestern Medical Center och Mount Sinai School of Medicine.
Referenser och anteckningar
;