(MÄNNISK) Behavioral och strukturell respons på kronisk kokain Kräver en feedforward-loop som involverar ΔFosB och kalcium / kalmodulinberoende proteinkinase II i Nucleus Accumbens Shell (2013)

Transkriptionsfaktorn ΔFosB och det hjärnberikade kalcium / kalmodulinberoende proteinkinas II (CaMKIIa) induceras i nukleär accumbens (NAc) genom kronisk exponering för kokain eller andra psykostimulerande droger, där de två proteinerna medierar sensibiliserade läkemedelssvar . Fastän ΔFosB och CaMKIIa båda reglerar AMPA-glutamatreceptoruttryck och funktion i NAc, har dendritisk ryggradbildning på NAc-medium snygga neuroner (MSN) och lokomotorisk sensibilisering mot kokain inte hittills utforskats någon direkt länk mellan dessa molekyler. Här visar vi att ΔFosB fosforyleras av CaMKIIa vid det proteinstabiliserande Ser27 och att CaMKII är krävs för kokainmedierad ackumulering av ΔFosB i råtta NAc.

Omvänt visar vi att ΔFosB är både nödvändigt och tillräckligt för kokaininduktion av CaMKIIa-genuttryck in vivo, en effekt selektiv för D₁-typ MSN i NAc-skal-subregionen.

Vidare är induktion av dendritiska spines på NAc-MSN och ökad beteendehänsyn för kokain efter NAc-överuttryck avAFFB B båda CaMKII-beroende.

Viktigt är att vi för första gången demonstrerar induktion av ΔFosB och CaMKII i NAc av mänskliga kokainmissbrukare, vilket föreslår möjliga mål för framtida terapeutisk ingrepp. Dessa data visar att ΔFosB och CaMKII engagerar sig i en cell-typ- och hjärnregionsspecifik positiv frammatningsslinga som en nyckelmekanism för att reglera hjärnans belöningskretsar som svar på kronisk kokain.

Beskrivning

Ökande bevis stöder uppfattningen att förändringar i genuttryck bidrar till mekanismer för narkotikamissbruk (Robison och Nestler, 2011). En viktig medlare av dessa förändringar är ΔFosB, en Fos-familjetransskriptionsfaktor (Nestler, 2008). Kronisk administrering av praktiskt taget varje missbrukande läkemedel inducerar den långvariga ackumuleringen av ΔFosB i Nuclear Accumbens (NAc), en limbisk region som är väsentlig för belöningsbeteenden. Such induktion framträder specifikt för klassen av NAc medium spiny neuron (MSN) som uttrycker D1 dopaminreceptorer. Inducerbar överuttryckning av ΔFosB i dessa D1-typ NAc-MSN ökar lokomotoriska och givande svar på kokain och morfin (Kelz et al., 1999; Zachariou et al., 2006), inklusive ökad självständig administration av kokain (Colby et al., 2003). Vidare minskar genetisk eller viral blockad av ΔFosB transkriptionsaktivitet de givande effekterna av dessa läkemedel (Zachariou et al., 2006), vilket indikerar att denna fördröjda induktion av ΔFosB är en kritisk mediator av de varaktiga förändringar som induceras i NAc genom kronisk läkemedelsadministration.

Den ovanliga stabiliteten av ΔFosB (i förhållande till alla andra Fos-familjeproteiner) är både en inneboende egenskap hos molekylen på grund av trunkeringen av degrondomäner närvarande i full längd FosB (Carle et al., 2007) och en reglerad process. ΔFosB fosforyleras vitro och in vivo- vid Ser27, och denna reaktion stabiliserar vidare AFosB, ~ 10-vik, i cellodling och NAc in vivo- (Ulery-Reynolds et al., 2009). Fastän Ser27-ΔFosB har visat sig vara ett substrat för kasein-2-kasein vitro (Ulery et al., 2006), dess mekanism av in vivo- fosforylering förblir okänd.

Kalcium / kalmodulinberoende proteinkinas II (CaMKII) är ett starkt uttryckt serin / treoninkinas vars a- och p-isoformer bildar dodekameriska homo- och hetero-holoenzymer in vivo-, och är väsentliga för flera former av neuroplasticitet (Lisman et al., 2002; Colbran och Brown, 2004). CaMKIIa induceras selektivt i NAc-skal genom kronisk amphetamin (Loweth et al., 2010) och farmakologisk blockad av CaMKII-aktivitet i NAc-skal reducerar beteendets sensibilisering till amfetamin (Loweth et al., 2008) och kokain (Pierce et al., 1998), medan viral överuttryck av CaMKIIa i denna NAc-subregion ökar lokomotorisk sensibilisering till och självadministrering av amfetamin (Loweth et al., 2010). CaMKIIa kan påverka belöningsbeteenden via modulering av AMPA glutamatreceptorsubenheter (Pierce et al., 1998), eftersom CaMKIIa-aktivitet länge har associerats med AMPA-receptorfunktion och synaptisk inriktning i flera former av neuroplasticitet (Malinow och Malenka, 2002).

Denna litteratur visar flera paralleller mellan ΔFosB och CaMKII: båda är nödvändiga och tillräckliga för multipla beteendemässiga effekter av missbruksmedel, både uppreglerade dendritiska spines i olika neuronala celltyper in vivo- (Jourdain et al., 2003; Maze et al., 2010) och båda utövar åtminstone en del av deras beteendeeffekter genom modulering av AMPA-receptorer (Kelz et al., 1999; Malinow och Malenka, 2002; Vialou et al., 2010). Trots dessa paralleller är ingen funktionell länk mellan ΔFosB och CaMKII känd. Här upprättar vi ömsesidig reglering mellan ΔFosB och CaMKII och visar att de två proteinerna bildar en MSN-specifik feed-forward-loop i DTCNUMX-typ i NAc-skal som induceras av kokain och reglerar en rad kokainreaktioner in vivo-.

Gå till:

Material och metoder

Experiment 1: iTRAQ Proteomic Analysis of NAc Shell and Core After Cocaine Treatment (Fig 1A)

Råttor av vuxna (8 veckor) administrerades 20 mg / kg kokain eller saltlösnings-IP en gång per dag i sju dagar. 24 h efter den sista injektionen, NAc-skal och kärna mikrodissekterades (Fig 1A) och blixtfryst. iTRAQ-analyser utfördes som tidigare beskrivits (Ross et al., 2004; Davalos et al., 2010).

Figur 1

Shell-specifik induktion av CaMKII i NAc av kokain

Experiment 2: Kvantifierande proteinförändringar i råtta NAc-kärna och skal efter kokainbehandling (Fig 1B-D)

Råttor av vuxna (8 veckor) administrerades 10 mg / kg kokain eller saltlösnings-vehikel IP en gång per dag under sju dagar i lokomotoriska inspelningskamrar. Lokomotoriska svar på en enda injektion av kokain (5 mg / kg IP) registrerades hos de djur som tidigare behandlats med kokain (kallad "kronisk") och en del av de som behandlades med saltlösning (kallad "akut") och lokomotoriska svar på saltlösning ensam registrerades i de återstående kroniska saltlösningsbehandlade djuren (kallad "saltlösning"). Lokomotoriska aktivitetsanalyser utfördes såsom beskrivits (Hiroi et al., 1997). I korthet placerades vuxna manliga råttor i 18 "× 24" PAS öppen fält inspelningsboxar (San Diego Instruments) för 30 min till habituate, fick en enda IP-injektion av saltlösning och övervakades för ytterligare 30 min och fick en enda IP-injektion av 5 mg / kg kokain och övervakas för 30 min.

24 timmar efter denna sista injektion avtappades råttor utan anestesi för att undvika effekter av anestetika på neuronala proteinnivåer och fosfater. Hjärnor skivades seriellt i en 1.2 mm-matris (Braintree Scientific) och målvävnad avlägsnades i fosfatbuffrad saltlösning innehållande proteas (Roche) och fosfatas (Sigma Aldrich) hämmare med användning av en 14-mätstans för NAc-kärna och en 12-mätstans av de återstående vävnad för NAc-skal (se Fig 1A) och omedelbart fryst på torris. Prover homogeniserades genom lätt sonikering i modifierad RIPA-buffert: 10 mM Tris-bas, 150 mM natriumklorid, 1 mM EDTA, 0.1% natriumdodecylsulfat, 1% Triton X-100, 1% natriumdeoxikolat, pH 7.4, proteas- och fosfatashämmare som ovan. Efter tillsats av Laemmli-buffert separerades proteiner på 4-15% polyakrylamaidgradientgeler (Criterion System, BioRad) och Western blotting utfördes med användning av Odyssey-systemet (Li-Cor) enligt tillverkarprotokoll.

Experiment 3: Kvantifierande proteinförändringar i råtta NAc Core och Shell efter kokainuttagning (Fig 1E)

Råttor av vuxna (8 veckor) administrerades 10 mg / kg kokain eller saltlösnings-IP en gång per dag i sju dagar. 14 dagar efter den sista injektionen gavs djur som behandlades med saltlösning en annan saltlösningsinjektion (kallad "saltlösning") och djur behandlade med kokain gavs en annan saltlösningsinjektion (kallad 14-dagsavdrag eller "14d WD") eller en enda injektion av kokain ( kallad "14d WD Chal" för utmaning). En timme efter den slutliga injektionen avkapades djuren och Western blotting utfördes som i experiment 2.

Experiment 4: Kvantifierande proteinförändringar i råtta NAc-kärna och skal efter kokain-självförvaltning (Fig 2A-C)

Råttor utbildades för att själv administrera 0.5 mg / kg / infusion av kokain i en timmes sessioner under ett 1-schema med fast relation i nio dagar. Efter nio baslinjesessioner delades råttorna in i två grupper balanserade av kokainintag de senaste två sessionerna. En grupp råttor fick själv administrera kokain (0.5 mg / kg / infusion) i en timmes sessioner (kort åtkomst, ShA) medan den andra gruppen av råttor självadministrerad kokain i sex timmars sessioner (lång åtkomst, LgA ) i ytterligare tio dagar (eskalerings sessioner).

Hjärnsektioner behandlades för immunhistokemi såsom beskrivits (Perrotti et al., 2004). Hjärnor perfunderades 18-24 timmar efter den senaste exponeringen för läkemedel, vilket resulterade i nedbrytning av eventuellt kvarvarande FosB-protein i full längd så att all återstående immunreaktivitet reflekterar ΔFosB. Denna nedbrytning bekräftades genom Western blotting, vilket inte visade någon signifikant färgning med en antikropp riktad mot C-änden av FosB i full längd som inte igenkänner ΔFosB (data ej visad). Efter skivning i 35 μm sektioner kvantifierades antalet ΔFosB immunopositiva celler genom en blindad observatör i två sektioner genom NAc hos varje råtta och medelvärden per 40x-fält beräknades sedan per region för varje djur. Varje djur betraktades som en individuell observation för statistisk analys. Områden av intresse identifierades med hjälp av Paxinos och Watson (Paxinos och Watson, 2007).

Kvantifiering av CaMKIIa-immunreaktivitet utfördes med användning av ett Licor-system som beskrivits (Covington et al., 2009). Integrerade intensiteter av CaMKII och GAPDH bestämdes med Odyssey-mjukvaran. Resultaten presenteras som integrerade intensitetsvärden per mm² och presenteras som medel ± sem (n = 4-10 per grupp). Värden för GAPDH användes som referens för normalisering av CaMKII-intensitet för skivtjocklek och -betingelser.

Figur 2

Induktion av CaMKII i NAc-skal av självadministrerande råttor och mänskliga kokainmissbrukare

Experiment 5: Kvantifierande proteinnivåer hos kokainberoende människor (Fig 2D)

Tillvägagångssätt

Postmortem mänskliga hjärnvävnader erhölls från Quebec Suicide Brain Bank (Douglas Mental Health University Institute, Montreal, Quebec, Kanada). Behållandet av vävnad fortsatte väsentligen såsom beskrivits (Quirion et al., 1987). Kort när, en gång extraherad, placeras hjärnan på våt is i en Styrofoam-låda och rusade till Quebec Suicide Brain Bank-anläggningarna. Hemisfärer separeras omedelbart av en sagittalskärning i mitten av hjärnan, hjärnstammen och cerebellum. Blodkärl, pinealkörtel, choroid plexus, halv cerebellum och halv hjärnstammen dissekeras vanligtvis från vänstra halvklotet, som sedan skärs koronalt i 1 cm tjocka skivor före frysning. Det senare halva cerebellumet skärs sagittalt i 1cm-tjocka skivor före frysning. Vävnader flashfrysas i 2-metylbutan vid -40 ° C för ~ 60 sek. Alla frysta vävnader förvaras separat i plastpåse vid -80 ° C för långvarig förvaring. Specifika hjärnregioner dissekeras från frysta koronalskivor på en rostfri stålplatta med torris överallt för att styra temperaturen i miljön. Western blotting utfördes som beskrivet i experiment 2.

Kohort

Kohorten bestod av 37 manliga och 3 kvinnliga individer, som varierade i ålder mellan 15-66 år. Alla individer dog plötsligt utan ett långvarigt agonalt tillstånd eller långvarig medicinsk sjukdom. Dödsorsaken konstaterades i varje fall av Quebecs Coroner-kontor och en toxikologisk skärm utfördes med vävnadsprover för att få information om medicinering och olaglig substansanvändning vid tidpunkten för dödsfallet. Ämnesgruppen bestod av 20-individer som uppfyllde kriterierna för SCID-I för kokainberoende. Kontrollgruppen bestod av 20-personer utan historia av kokainberoende och inga större psykiatriska diagnoser. Alla ämnen dog plötsligt av orsaker som inte hade någon direkt påverkan på hjärnvävnaden. Grupper matchades för genomsnittlig ämnesålder, kylfördröjning och pH. För alla ämnen utfördes psykologiska autopsier som tidigare beskrivits (Dumais et al., 2005), så att vi kan få tillgång till detaljerad fallinformation om psykiatrisk och medicinsk historia, samt annan relevant klinisk och sociodemografisk data. Kortfattat genomförde en utbildad intervjuare Strukturerad klinisk intervju för DSM-IV Psykiska störningar (SCID-I) med en eller flera informanter av den avlidne. En panel av kliniker granskade SCID-I-bedömningar, fallrapporter, koronterns anteckningar och journaler för att få konsensuspsykiatriska diagnoser.

Experiment 6: Kromatinimmunutfällning för råtta NAc (Fig 3A-C)

Råttor av vuxna (8 veckor) administrerades 10 mg / kg kokain eller saltlösnings-IP en gång per dag i sju dagar. 24 tim efter den sista injektionen, NAc-skal och kärna mikrodissekterades. Kromatinimmunutfällning (ChIP) utfördes i kombination med bilaterala NAc-stanser av skal eller kärna från sju råttor per grupp i 14-totala grupper (98-djur totalt, 7-kokainpooler, 7-saltlösningspooler). Vävnader tvärbundna, tvättades och lagrades vid -80 ° C tills kromatisk skjuvning genom sonikering. Skjuvad kromatin inkuberades över natten med antikroppar som tidigare binds till magnetiska pärlor (Dynabeads M-280, Invitrogen). Non-immune IgG användes som en kontroll. Efter omvänd tvärbindning och DNA-rening användes qPCR för att mäta nivåer av CaMKIIa-promotor-DNA. Primers konstruerades för att amplifiera ett område som innehöll en AP-1-konsensussekvens som befanns ~ 450 bp före transkriptionsstartplatsen (Framåt: ACTGACTCAGGAAGAGGGATA; Reverse: TGTGCTCCTCAGAATCCACAA).

Figur 3

Celltyp- och regionspecifik ΔFosB-induktion av CaMKIIa in vivo-

Experiment 7: Mätning av CaMKII-transkript och proteinuttryck med celltypspecifik ΔFosB-överuttryckning (Fig 3D)

Manliga bitransgena möss härledda från NSE-tTA (rad A) × TetOP-ΔfosB (rad 11) och NSE-tTA (rad B) × TetOP-FLAG-ΔfosB (linje 11) möss (Chen et al., 1998; Kelz et al., 1999; Werme et al., 2002; Zachariou et al., 2006) upptäcks och upphöjdes på 100 / ig / ml doxycyklin för att undertrycka ΔFosB-uttryck under utveckling. Kullkompisar delades upp vid avvänjning: hälften förblev på doxycyklin och hälften byttes till vatten och djuren användes 8 till 11 veckor senare när transkriptionella effekter av ΔFosB är maximala (Kelz et al., 1999; McClung och Nestler, 2003). För transkriptionella analyser halsades möss snabbt och hjärnorna avlägsnades och placerades på is. Dissektioner av NAc togs med en 14-gauge nålstans och snabbt frystes på torris tills RNA extraherades. RNA-isolering, qPCR och dataanalys utfördes såsom tidigare beskrivits (LaPlant et al., 2009). I korthet isolerades RNA med TriZol-reagens (Invitrogen), renades ytterligare med RNAeasy-mikrosatsen från Qiagen och kontrollerades för kvalitet med Agilents Bioanalyzer. Omvänd transkription utfördes med användning av iScript (BioRad). qPCR utfördes med ett Applied Biosystems 7900HT RT PCR-system med följande cykelparametrar: 10 min vid 95 ° C; 40-cykler av 95 ° C för 1 min, 60 ° C för 30 sek, 72 ° C för 30 sek; graderad uppvärmning till 95 ° C för att generera dissociationskurvor för bekräftelse av enskilda PCR-produkter. Immunohistokemiska analyser av ΔFosB- och CaMKIIa-proteinuttryck utfördes som beskrivet i experiment 4.

Experiment 8: Effekter av Intra-NAc D1- och D2-dopaminreceptorantagonister på kokainmedierade proteinförändringar (Fig 3H)

Råttor av vuxna (8 veckor) administrerades 10 mg / kg kokain eller saltvattenfordon ("fordon" -grupp) IP en gång per dag i sju dagar. 30 min före varje kokaininjektion, administrerades råttor antingen D1-receptorantagonisten SCH 23390 (0.5 mg / kg, "D1 Ant" -gruppen) eller D2-receptorantagonisten etikloprid (0.5 mg / kg "D2 Ant" -grupp) , eller en saltinjektionsinjektion ("kokain" -grupp). 24 tim efter den slutliga injektionen, avkapades djuren och proteiner kvantifierades genom Western blotting enligt experiment 2.

Experiment 9: Effekter av AAV-medierad ΔFosB-överuttryck på proteinuttryck (Fig 4 A-C)

Stereotaxisk kirurgi utfördes på vuxna hanrotter (8 veckor) för att injicera AAV-GFP (grönt fluorescerande protein) eller AAV-GFP-FFB (Maze et al., 2010). 33 gauge nålar (Hamilton) användes för alla operationer, under vilka 0.5 / il renat högtitervirus infusionsblandades under en 5 min tidsperiod följt av en ytterligare 5 min efter infusions viloperiod. Alla avstånd mäts i förhållande till Bregma: 10 ° vinkel, AP = + 1.7 mm, Lat = 2.5 mm, DV = -6.7 mm. 14 dagar efter operationen gavs en enda IP-injektion av 10 mg / kg kokain i lokomotoriska övervakningskammare för att bedöma beteendeeffekterna av ΔFosB-överuttryck. 24 h efter denna sista injektion, råttor halshuggades per experiment 2, och vävnadsmikrodissektion utfördes under fluorescensmikroskopisk vägledning för att erhålla GFP-positiv NAc-vävnad. Western blotting utfördes sedan per Experiment 2.

Figur 4

ΔFosB är både nödvändigt och tillräckligt för kokainmedierad D1-receptorberoende CaMKIIa-induktion i NAc-skal

Experiment 10: Effekter av AAV-medierad ΔJunD-överuttryck på kokainberoende proteinuttryck (Fig 4 D-F)

Stereotaxisk injektion av AAV-GFP eller AAV-GFP-AJunD utfördes enligt Experiment 8. 14 dagar efter operationen administrerades djur 10 mg / kg kokain eller saltvatten vehikel IP en gång per dag under sju dagar i lokomotoriska inspelningskamrar. Lokomotoriska reaktioner på en enda injektion av kokain (5 mg / kg IP) eller saltlösning registrerades. 24 h efter denna sista injektion, råttor deapiterade, vävnadsskörd och västblott utfördes som i Experiment 9.

Experiment 11: vitro Proteinkinasanalyser (Fig 5A-D)

Rekombinant CaMKIIa och AFosB renades från insektsceller (Brickey et al., 1990; Jorissen et al., 2007) och proteinkinasanalyser utfördes (Colbran, 1993), såsom tidigare beskrivits. I korthet förinkuberades CaMKII på is med 2.5 ^ M (eller indikerad koncentration) avFosB, 1 mM Ca²⁺, 40 mM Mg²⁺, 15 ^ M calmodulin och 200 mM HEPES pH 7.5. Fosforylering initierades genom tillsats av 200 ^ M ATP med eller utan [y-³²P] ATP och fick fortsätta för 10 min vid rumstemperatur (Fig 5A & B) eller 2 min på is (Fig 5C & D). Produkterna löstes genom Western blotting (Fig 5A & B) eller genom autoradiogram och scintillationsräkning (Fig B-D).

Figur 5

ΔFosB är ett kraftigt substrat för CaMKIIa

Experiment 12: Identifiering av Ser27 ΔFosB-fosforylering (Fig 5E)

In vitro kinasanalyser utfördes enligt experiment 11proteiner separerades genom SDS-PAGE och band som motsvarade FFosB skars ut och utsattes för tandemmasspektrometri. M / z-uppdrag av motsvarande jonfragment i samtliga paneler är märkta ovanpå jontopparna. Inte alla fragmentjoner är märkta på grund av rymdbegränsningar. I allmänhet är texten för fragmentjonetiketterna färgad i svart, utom när de direkt bekräftar eller lägger till bevis för närvaron av fosforyleringsställena av intresse, i vilket fall de är märkta i rött. Bevis för ryggradsfragmenteringsprodukter presenteras i sekvensavläsningen av fosfopeptiden med det detekterade stället för fosforyleringsrest som indikeras i rött med en enkel aminosyrabrevbeteckning. Den numeriska beskrivningen av de observerade fragmentjonema markeras även på peptidsekvensen som b och y joner. Zoomfaktorerna för sektionerna av m / z-axeln för att visa nedre intensitetsfragmentjonema är märkta överst på varje fragmentmasspektra. De fragmentjoner som visas i panel H bekräftar närvaron av Ser27-fosforylerad isoform, emellertid inom en blandning av andra fosforylerade isoformer vid ställen Ser28, Ser31, Ser34 och Thr37. Förekomsten av pa5, pa5-P, pb5 och pb5-Pjoner bekräftar unikt fosforyleringen av Ser27-resten.

Experiment 13: Kvantifiering av Ser27-fosforylering (Fig 5F)

Standardpeptider utformades efterliknande fosfor- och icke-fosforformerna av Ser27AFosB. Efter syntes och rening löstes varje "tung" idiotypisk peptid i en 50 / 50-acetonitril / vattenbuffert och skickades för aminosyraanalys för att bestämma absolut koncentration på den syntetiska peptidförrådslösningen. Varje "tung" peptid infuerades sedan direkt in i 4000 QTRAP-masspektrometern (MS) för att bestämma den bästa kollisionsenergin för MS / MS-fragmentering och två till fyra MRM-övergångar. Därefter utsattes de snygga "tunga" peptiderna för LCMS på 4000 QTRAP för att säkerställa peptidseparation. Instrumentet kördes i triple quadrupole-läget, med Q1 inställt på det specifika prekursormärket (Q1 skannar inte) och Q3 satt till det specifika m / z-värdet som motsvarar ett specifikt fragment av den peptiden. I MRM-läget mättes en serie av enstaka reaktioner (prekursor / fragmentjon-övergångar där kollisionsenergin är inställd för att optimera intensiteten hos fragmentjonjonerna av intresse) i följd och cykeln (typiskt 1-2 sek) hela tiden för HPLC-separation. MRM-övergångar bestämdes från MS / MS-spektra av de existerande peptiderna. Två övergångar per peptid, som motsvarade högintensitetsfragmentjoner, valdes sedan och kollisionsenergin optimerades för att maximera signalstyrkan hos MRM-övergångar med användning av automatiseringsprogram. Toppar som härrör från standardpeptider och ΔFosB-prover exponerade för CaMKII eller kontroll jämfördes sedan för att bestämma den absoluta överflödet av varje peptidform i reaktionen. Dataanalys på LC-MRM-data utförs med hjälp av AB Multiquant 1.1-programvaran.

Experiment 14: Induktion av ΔFosB i CaMKII Overuttryckande Möss (Fig 5G & H)

Transgena möss som överuttrycker T286D CaMKII (Mayford et al., 1996; Kourrich et al., 2012) och vildtypskrämmar höjdes i frånvaro av doxycyklin för att möjliggöra transgenuttryck. Vuxna möss administrerades 20 mg / kg kokain eller saltlösning IP en gång dagligen under 14-dagar. 24h efter den slutliga injektionen avkapslades djuren och immunohistokemi och kvantifiering av ΔFosB-uttryck utfördes som i experiment 4.

Experiment 15: Effekter av HSV-medierad ΔFosB-överuttryckning och CaMKII-inhibering på NAc-dendritiska spines (Fig 6A-E)

Vuxna manliga möss (8 veckor) injicerades stereotaxiskt i NAc med HSV-GFP, HSV-GFP-FFosB (Olausson et al., 2006), HSV-GFPAC3I eller HSV-GFPAC3I-ΔFosB. I dessa konstruktioner fusioneras AC3I, en peptidbaserad inhibitor av CaMKII-aktivitet, till C-änden av GFP. GFPAC3I klonades genom PCR med användning av pMM400-vektorn innehållande GFPAC3I som en mall med följande primers: GFP-AC3I-F: 5 'CCGCTAGC GCCGCCACC ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGT 3' (clampNheIKozakmet); GFP-AC3I-R: 5 'CC TCCGGA TTACAGGCAGTCCACGGCCT 3' (clampBspEIstop). Den erhållna PCR-produkten infördes i p1005 + och p1005 + -A FosB-vektorerna med användning av NheI- och BspEI-ställen. Konstruktionen validerades genom sekvensering. Stereotaxiska koordinater var: 10 ° vinkel, AP = + 1.6 mm, Lat = + 1.5 mm, DV = -4.4 mm (Barrot et al., 2002). Perfusion och hjärnavsnitt utfördes enligt experiment 4.

Ryggradsanalys utfördes såsom beskrivits (Christoffel et al., 2011). I korthet valdes dendritiska segment 50-150 ^ i bort från summan slumpmässigt från HSV-infekterade celler som uttrycker GFP. Bilder förvärvades på en konfokal LSM 710 (Carl Zeiss) för morfologisk analys med NeuronStudio med rayburst-algoritmen. NeuronStudio klassificerar spines som tunna, svamp eller stubby baserat på följande värden: (1) bildförhållande, (2) huvud till halsförhållande och (3) huvuddiameter. Spines med nacke kan klassificeras som antingen tunna eller svamp, och de som inte har en betydande nacke klassificeras som stubby. Spines med nacke är märkta som tunna eller svampar baserade på huvuddiametern.

Figur 6

Blockad av CaMKII-aktivitet förhindrar de morfologiska och beteendemässiga effekterna av ΔFosB i NAc

Experiment 16: Effekter av HSV-medierad ΔFosB-överuttryckning och CaMKII-inhibering på kokainreaktioner (Fig 6F)

Vuxna manliga möss injicerades med virus enligt experiment 15, och lokomotoriska svar på en enda 5 mg / kg injektion av kokain mättes per Experiment 9. Lokomotoriska data uttrycks som totala strålbrytningar över 30 min efter kokaininjektion.

ytterligare information

Djurhus

Male Sprague Dawley-råttor (250-275 g; Charles River Laboratories) var parhus. Åtta veckor gamla C57BL / 6J manliga möss (The Jackson Laboratory) var grupphus med högst fem djur per bur. Alla djur habituerade till djuranläggningen för ≥1 vecka före experimentella manipulationer och inrymdes i klimatstyrda rum (23-25 ° C) på en 12 hr ljus / mörk cykel (lyser vid 7: 00 AM) med tillgång till mat och vatten AD libitum. Experiment utfördes i enlighet med riktlinjerna för Society for Neuroscience och den institutionella djurvårds- och användningsutskottet (IACUC) vid Mount Sinai.

Läkemedel

Läkemedel administrerades IP och löstes i steril saltlösning, inklusive kokain (5-20 mg / kg per 10 μl för möss, per 1 ml för råttor, NIDA) och SCH 23390 eller etiklopridhydroklorid (0.5 mg / kg per 1 ml, Tocris) . För stereotaxisk kirurgi bedövades möss med en "cocktail" av ketamin (100 mg / kg) och xylazin (10 mg / kg) (Henry Schein) i steril saltlösning.

antikroppar

CaMKIIa (totalt): Upstate 05-532, 1: 5,000

CaMKII-fosfor-Thr286: Promega V111A, 1: 1,000

ΔFosB (totalt): Cellsignalering 5G4, 1: 250

ΔFosB fosfor-Ser27: fosforlösningar, 1: 500

GluA1 (totalt): Abcam, Ab31232, 1: 1,000

GluA1-fosfor-Ser831: Millipore N453, 1: 1,000

GluA1-fosfor-Ser845: Chemicon Ab5849, 1: 2,000

GluA2: Millipore 07-598, 1: 2,000

NR2A: Sigma HPA004692, 1: 2,500

NR2B: Millipore Ab1557P, 1: 1,000

Statistiska analyser

Alla statistiska analyser utfördes med hjälp av Prism 6 mjukvarupaketet (GraphPad). Studentens t-tester användes för alla parvisa jämförelser (anges i Resultat där t-värdet ges), och envägs ANOVAs användes för alla multipla jämförelser (anges i resultatavsnitt där F-värde ges).

Gå till:

Resultat

Kronisk kokain inducerar CaMKII i NAc Shell

Många studier har visat att MSN i NAc-skalet och kärnan har olika biokemiska och fysiologiska reaktioner på kronisk exponering för missbruksmissbruk (Kourrich och Thomas, 2009; Loweth et al., 2010) och att de två delregionerna differentierar differentierade läkemedelssökande beteenden (Ito et al., 2004). Att bestämma skillnadseffekterna av kokain på proteinkomponenterna i NAc-skalet vs kärna använde vi multiplexerad isobarisk märkning (iTRAQ) och tandemmasspektroskopi (MS / MS). Vuxna manliga råttor injicerades IP med kokain (20 mg / kg) eller saltlösning dagligen under 7-dagar; 24 h efter den sista injektionen, NAc-skal och kärna mikrodissekterades (Fig 1A) och blixtfryst. Proteiner i dessa prover kvantifierades sedan med användning av iTRAQ. Alla fyra CaMKII-isoformerna uppvisade stora ökningar i uttryck efter kokainbehandling som var specifika för NAc-skal jämfört med kärnan. Flera proteinfosfataser, inklusive PP1 katalytiska och regulatoriska subenheter och PP2A, vilka tidigare har associerats med olika CaMKII-substrat i andra system (Colbran, 2004) följde ett liknande mönster. Dessa fynd gav nya, objektiva bevis för att CaMKII-signaleringsvägen är framträdande reglerad av kokain i NAc på ett skalspecifik sätt.

För att validera detta resultat mer kvantitativt behandlade vi råttor som ovan med kokain (vid varierande doser) eller saltlösning och mätta lokomotoriska reaktioner på en kokain (5 mg / kg) eller saltlösningsutmaningsdos. Upprepad exponering för 10 mg / kg kokain resulterade i det typiska mönstret av lokomotorisk sensibilisering (Fig 1B). Ytterligare studier med denna doseringsbehandling avslöjade, med användning av Western blotting, att upprepad kokain inducerar CaMKIIa selektivt i NAc-skalet 24-tim efter den slutliga injektionen av kokain (Fig 1C och D; p = 0.0019; F = 7.943; df = 29). Dessutom ökade fosforyleringen av det kanoniska CaMKII-substratet Ser831 av GluA1-subenheten från AMPA-receptorn avsevärt i NAc-skal och inte kärna (p = 0.0261; F = 4.208; df = 28), medan CaMKIIa Thr286-autofosforylering hade en stark men inte signifikant trend mot induktion i skal bara (Fig 1D). Flera andra glutamatreceptorer var opåverkade. I motsats till dessa mätningar av CaMKII visade samma vävnadsprover induktion av FosB i båda skalen (p = 0.0260; F = 4.189; df = 29) och kärnan (p = 0.0350; F = 3.807; df = 29) hos NAc (Fig 1C och D), i överensstämmelse med tidigare upptäckter (Perrotti et al., 2008).

Eftersom flera tidigare studier av kokainreglering av AMPA-receptorer analyserade djur efter ~ 14-dagar med tillbakadragande från kronisk kokain (se Diskussion) upprepade vi dessa biokemiska analyser vid denna tidpunkt. Vi fann att 14 dagar efter den slutliga injektionen av kokain förblir ΔFosB förhöjd i NAc (p = 0.0288; F = 4.258; df = 22), medan varken CaMKII eller fosforylering av GluA1 Ser831 förblir ökad (Fig 1E). 1-timmen efter en enda doseringsnivå av kokain av 10 mg / kg, nivåer av totalt CaMKII (p = 0.0330; F = 3.947; df = 26) och av GluA1 Ser831 (p = 0.0213; F = 4.509; df = 27) fosforylering är båda förhöjda i en grad som liknar den som finns efter initial kronisk kokainexponering (Fig 1E). Dessa data indikerar att NAc-skalneuroner primeras för CaMKII-induktion under förlängda perioder av abstinens, kanske via direkt priming av CaMKII-genpromotorn (se Diskussion). Dessutom är det faktum att ΔFosB-induktion är mer beständig än CaMKII-induktion antyder förekomsten av ytterligare mekanismer, oavsett om de är kromatinbaserade eller på annat sätt, som utövar en "broms" på CaMKII-reglering, som omfattas av diskussionen.

För att ytterligare stärka dessa observationer undersökte vi modeller för kokain självadministration, vilket medför volymerande läkemedelsintag. Vuxna manliga råttor gavs antingen kort eller lång tillgång till kokain; som förväntat (Ahmed och Koob, 1998), ledde endast långa tillträdesförhållanden till att eskalera självförvaltningen av läkemedlet (Fig 2A). ΔFosB inducerades i större utsträckning med lång tid vs kort tillgång till kokain i både NAc-skalet (p = 0.0011; F = 11.12; df = 17) och kärna (p = 0.0004; F = 13.86; df = 17). I motsats härtill inducerades CaMKIIa i NAc-skalet endast genom lång tillgång till kokain (Fig 2B och C; p = 0.0236; F = 4.957; df = 16). Det är intressant att jämföra det genomsnittliga dagliga kokainintaget mellan korta djur (~ 12 mg / kg IV), djur med lång tillgång (~ 70 mg / kg IV) och djur som administrerats av experiment (10 mg / kg) och fråga varför den senare framkallar robust induktion av ΔFosB och CaMKII medan kort åtkomst inte. Denna skillnad beror sannolikt på skillnader i högsta kokainnivåer (kokain som administreras av experimenter administreras som en enda bolus-IP, medan självadministrerat kokain levereras via multipla IV-doser) eller av skillnader i längd av läkemedelsexponering (7-dagar för försökspersonen administrering, 19 dagar för självadministrering).

Trots den stora litteraturen om ΔFosB och CaMKII i kokainaktivitet finns inga studier av dessa proteiner hos humana kokainanvändare. Här presenterar vi de första bevisen att nivåerna av både ΔFosB (p = 0.0316; t = 1.921; df = 34) och CaMKII (p = 0.0444; t = 1.755; df = 32) ökas i NAc av kokainberoende människorFig 2D, Tabell 1). Dessa data indikerar att vår undersökning av ΔFosB- och CaMKII-induktion med kokain i gnagare NAc är kliniskt relevant för mänsklig kokainberoende.

Tabell 1

Karakterisering av prover från humana kokainmissbrukare och matchad kontrollgrupp

ΔFosB reglerar CaMKII-transkription selektivt i D1-typ MSN från NAc Shell

Upptäckten att både CaMKII och ΔFosB uppreguleras av kokain i gnagaren NAc ledde oss att bestämma huruvida ΔFosB skulle kunna reglera transkription av CaMKII-genen. Vi hade tidigare rapporterat CaMKIIa som ett möjligt mål för ΔFosB i en opartisk mikroarrayanalys av NAc (McClung och Nestler, 2003), men denna bedömning validerades inte ytterligare i den studien. Vi använde först kvantitativ ChIP (qChIP-ChIP följt av kvantitativ PCR) för att bestämma huruvida ΔFosB binds till CaMKIIa-genpromotorn i NAc hos vuxna hanrotter och fann slående att denna bindning avsevärt ökade genom kronisk kokainadministration i skalet ( p = 0.0133; t = 2.901; df = 12), men inte kärnan, subregionen (Fig 3A). För att ytterligare förstå mekanismerna som hänför sig till denna subregionsspecifika skillnad i ΔFosB-bindning till CaMKIIa-promotorn, använde vi qChIP för att karakterisera tillståndet av histon-modfikationer vid denna genomiska region. Tidigare studier visade kokaininduktion av H3-acetylering vid CaMKIIa-promotorn i totalt mus NAc (Wang et al., 2010). Däremot fann vi att kokain minskar H3-acetylering vid CaMKIIa-promotorn selektivt i NAc-kärnan (Fig 3B; p = 0.0213; t = 2.726; df = 10), utan någon förändring som är uppenbar i skal, i överensstämmelse med subregionspecifika kromatinförändringar bortom ΔFosB-bindning. qChIP för det repressiva märket, dimetylerade H3 lysin 9 (H3K9me2), avslöjade trender för minskningar i både skal- och kärninterregionerna (Fig 3C).

För att bestämma om ΔFosB reglerar CaMKIIa transkription in vivo-, vi utnyttjade två bitransgena muslinjer som inducerar överuttryckt ΔFosB specifikt i D1 vs D2-typ MSN: er på ett sätt som regleras genom doxycyklinadministrering i dricksvatten (Chen et al., 1998; Kelz et al., 1999; Werme et al., 2002). Vuxna manliga möss som överuttryckte ΔFosB enbart i D1-typ MSN hade signifikant ökade nivåer av CaMKIIa-mRNA i NAc (p = 0.0337; t = 1.996; df = 13), en effekt som inte observerades hos möss som överuttryckte ΔFosB övervägande i D2-typ MSNFig 3D). Ökningen i CaMKIIa-mRNA, inducerad av ΔFosB-expression i MSN-D1-typ, åtföljdes av en samtidig ökning av CaMKIIa-protein i både NAc-skalet (p = 0.0030; t = 3.578; df = 14) och kärna (p = 0.0392; = 2.275; df = 14; Figurerna 3E och F). Dessa data visar att ΔFosB kan driva CaMKIIa-genuttryck i D1-typ MSN i båda delregioner, även om Figur 3B föreslår att kokainmedierad kromatin förändras vid CaMKIIa-promotorn (t.ex. minskad acetylering) förhindrar ΔFosB från uppreglerande CaMKII i kärnområdets subregion efter kokain.

Eftersom våra transgena musdata indikerade att ΔFosB-induktion av CaMKII-genuttryck är specifik för D1-typ MSN i NAc, försökte vi därefter bestämma om kokainberoende uppreglering av CaMKII kräver aktivering av D1-dopaminreceptorn. Vuxna hanråttor administrerades kronisk kokain eller saltlösning som tidigare, men 30 minuter före varje injektion fick råttor i kokaingruppen IP-injektion av saltlösning, D1-antagonisten SCH 23390 (0.5 mg / kg) eller D2-receptorantagonisten etikloprid (0.5 mg / kg). Djuren analyserades 24 timmar efter den sista injektionen av kokain. Western blotting avslöjade att D1, men inte D2, antagonisten helt blockerade den kokainmedierade ökningen av ΔFosB (p <0.0001; F = 18.96; df = 18), som tidigare rapporterats (Nye et al., 1995), liksom i CaMKII (p = 0.0005; F = 10.99; df = 18; Fig 3G och H). Dessa data stöder hypotesen att kokain engagerar en ΔFosB-medierad ökning av CaMKII-genuttryck specifikt i D1-typ MSNs av NAc-skal. Det skulle vara viktigt i framtida studier att direkt demonstrera denna celltyps specifika effekt av kokain på CaMKII-uttryck inom denna hjärnregion.

ΔFosB är både nödvändig och tillräcklig för kokaininduktion av CaMKII i NAc Shell

För att komplettera användningen av bitransgena möss studerade vi nästa roll rollen avFosB för att mediera kokaininduktion av CaMKIIa med användning av virusmedierad genöverföring hos råttor. Vi injicerade adeno-associerade virala (AAV) partiklar in i NAc-skalet hos vuxna hanrotter (där skalet kan selektivt riktas) för att överuttrycka ΔFosB plus GFP eller GFP ensam. Djurna gavs sedan en enda IP-injektion av 10 mg / kg kokain. Djuren som överuttryckte ΔFosB / GFP uppvisade ett ökat lokomotoriskt svar jämfört med djur som överuttryckte GFP ensamt (Fig 4A). 24 tim efter den enkla kokaininjektionen, skars GFP-positiv NAc-vävnad från dessa djur genom dissektion under en fluorescerande ljuskälla. Western blotting av denna vävnad (Fig 4B och C) avslöjade stark ΔFosB-överuttryck samt en signifikant ökning av totalt CaMKIIa-protein jämfört med GFP-djur (p = 0.0070; t = 2.894; df = 30), vilket liknar induktionen ses med kronisk kokainadministration. Dessutom ökades CaMKIIa-autofosforylering vid Thr286 (indikativ för enzymaktivering) med ΔFosB-överuttryck (p = 0.0330; t = 2.243; df = 28), liksom fosforylering av CaMKII-substratet, Ser831 av GluA1 (p = 0.0540; t = 2.012; df = 28), återigen efterlikna åtgärderna för kronisk kokain (Fig 1C och D). Taken tillsammans, ger dessa data ytterligare bevis på att ΔFosB-uttryck i NAc-skalet är tillräckligt för lokomotorisk sensibilisering mot kokain och för CaMKII-induktion och aktivering i detta subregion.

Vi använde ett liknande tillvägagångssätt för att bestämma om ΔFosB också är nödvändigt för kokainmedierad induktion av CaMKIIa i NAc-skalet. AAV användes för att överuttrycka ett trunkerat JunD-protein, benämnt ΔJunD, vilket är en negativ regulator för ΔFosB transkriptionell aktivering (Winstanley et al., 2007) plus GFP eller GFP ensam. Två veckor senare, när transgenuttryck är maximal, gavs djur cocaine (10 mg / kg) eller saltlösning dagligen under 7-dagar och testades för lokomotoriska reaktioner på en koksinutmaning (5 mg / kg) 24-tim efter den sista kroniska injektionen (Fig 4D). ΔJunD-överuttryck förebyggde lokomotorisk sensibilisering mot kokain och hindrade också CaMKIIa-induktion och aktivering i NAc-skalet (Fig 4E och F; p = 0.0437; F = 2.997; total df = 38), vilket indikerar att ΔFosB transkriptionell aktivitet är nödvändig för kokainmedierad induktion av CaMKIIa i detta subregion. Intressant visade vi att ΔJunD minskade ΔFosB-nivåer under både saltlösning och kokainbehandlade förhållanden (p = 0.0004; F = 8.110; df = 35), vilket höjde den nya möjligheten att ΔFosB beror på AP-1-aktivitet för sina egna expressionsnivåer.

CaMKII fosforylerar ΔFosB vid Ser27

Använda vitro proteinkinasanalyser bestämde vi att renat FFosB är ett robust substrat för CaMKIIa. Inkubation av hans₆-ΔFosB med CaMKIIa och ATP orsakade en uppåtgående förskjutning i elektroforetisk rörlighet för ΔFosB (Fig 5A); de flera resulterande banden föreslog flera ställen för fosforylering. Liknande vitro kinasanalyser med användning av [y-³²P] ATP visade inkorporering av radioaktivt märkt fosfat i de förskjutna ΔFosB-banden (Fig 5B), vilket demonstrerar direkt fosforylering av proteinet. Vi genererade en fosforspecifik antikropp mot den tidigare karakteriserade Ser27 av FFosB (Ulery et al., 2006). Medan denna antikropp inte producerar en signal mot hjärnekstrakter som innehåller Ser27-fosforylerade ΔFosB (data ej visade) kunde vi detektera Ser27-fosforylering i vitro kinasassay med användning av CaMKII (Fig 5B). Kinetiska analyser av CaMKII-fosforyleringen av FFosB indikerar att det är ett potent substrat för kinas (Fig 5C), med en uppenbar K_M av 5.7 ± 2.0μM och K_KATT av 2.3 ± 0.3min^-1. Dessa resultat är jämförbara med många välkarakteriserade in vivo- substrat av CaMKII (Colbran och Brown, 2004). Dessutom bestämde vi att CaMKII fosforylerar ΔFosB med en stökiometri av 2.27 ± 0.07 mol / mol (Fig 5D), vilket indikerar att det finns minst tre ställen för CaMKII-fosforylering inom His₆-ΔFosB-protein, i överensstämmelse med Fig 5A.

För att undersöka enskilda fosforyleringsställen använde vi MS-analyser av prover från vår vitro kinasanalyser. Fig 5E demonstrerar ΔFosB-fosforylering vid den tidigare karaktäriserade Ser27 och vid flera ytterligare ställen (data ej visad). Med tanke på den tidigare funktionella karakteriseringen av Ser27 fokuserade vi på denna sida genom att generera märkta syntetiska peptider som efterliknar fosfor- och nonfosforstaterna i Ser27, sedan använde kända kvantiteter av dessa peptider som standarder i MRM-analyser av FosB före och efter vitro fosforylering av CaMKII. Efterföljande kvantifiering (Fig 5F) bekräftar att Ser27 är ett kraftigt substrat för CaMKII. Dessa resultat indikerar att bland flera fosforylerade rester inom FFosB är Ser27 ett särskilt effektivt substrat för CaMKII.

CaMKII medverkar kokainackumulering av ΔFosB i NAc Shell

Eftersom CaMKII kan fosforylera ΔFosB vitro på en plats som dramatiskt förbättrar sin stabilitet vitro och in vivo- (Ulery et al., 2006; Ulery-Reynolds et al., 2009) bestämde vi om CaMKII-aktivitet kontrollerar ΔFosB-nivåer i NAc in vivo-. För att ta itu med denna fråga använde vi först en muslinje som överuttryckte en kalciumoberoende mutant av CaMKIIa (T286D) i flera hjärnregioner, inklusive NAc (Mayford et al., 1996; Kourrich et al., 2012). Vi injicerade åldersmatchade vuxna manliga mutant- och vildtypskrämmar med 20 mg / kg kokain eller saltlösning en gång dagligen under 14-dagar, analyserade sedan djuren en dag efter den slutliga injektionen. Vi fann att basala nivåer av ΔFosB ökades i de mutanta djuren i NAc-skalet (p = 0.0001; F = 9.207; df = 37), men inte kärna (Fig 5G och H). Överraskande blockerades kokainberoende induktion av ΔFosB i mutantdjuren i både skal och kärna, vilket tyder på att även om CaMKII direkt kan reglera ΔFosB-stabilitet i NAc-skalet, kan det ligga uppströms ΔFosB i kokainaktiverade vägar i båda NAc-subregionerna .

CaMKII-aktivitet är nödvändig för ΔFosB-medierad strukturell och beteendemässig plasticitet

Kokaininduktion av dendritiska spines på NAc MSN är en av de bäst etablerade läkemedelsinducerade anpassningarna i denna hjärnområde och sådan ryggradinduktion har korrelerats med sensibiliserat beteendehänsyn på läkemedlet (Robinson och Kolb, 2004; Russo et al., 2010) och rapporterades vara selektiva för MSX-typ av D1-typ (Lee et al., 2006). Vi har nyligen visat att kokaininduktion av dendritiska spines i NAc är beroende av ΔFosB och dess nedströms transkriptionella program (Maze et al., 2010). Även om det finns en omfattande litteratur om involvering av CaMKII i dendritisk ryggradsmorfologi och induktion i andra hjärnregioner och experimentella system (Jourdain et al., 2003; Penzes et al., 2008; Okamoto et al., 2009), har dess roll i NAc MSN ryggradsformation inte studerats. Därför bestämde vi om huruvida CaMKII-aktivitet krävs för AFosB-medierad induktion av MSN-dendritiska spines genom användning av HSV-medierad överuttryckning av CaMKII-inhibitorpeptiden AC3I fuserad till GFP, en konstruktion som tidigare visats hämma CaMKII-aktivitet in vivo- (Zhang et al., 2005; Klug et al., 2012). Viralt överuttryck av ΔFosB i NAc-skal hos vuxna möss inducerade en signifikant ökning av MSN-dendritisk ryggradstäthet (p <0.0001; F = 8.558; df = 59; Fig 6A och B) som tidigare rapporterats (Maze et al., 2010), och denna ökning drivs primärt av tunna (p = 0.0027; F = 5.319; df = 59) och stubby (p = 0.0378; F = 2.988; df = 59) ryggradstyper (båda trodde vara omognaFig 6C-E). Ingen effekt observerades på mer mogna, svampformade ryggraden. När GFP-AC3I coexpressades upphörde emellertid FFBB-induktion av ryggraden fullständigt (Fig 6A-E), vilket indikerar att CaMKII-aktivitet krävs för ΔFosB-induktion av dendritiska spines i NAc-skal.

Vi använde därefter samma virala verktyg för att bestämma om CaMKII-aktivitet krävs för ΔFosBs effekter på beteendets känslighet för kokain. 72 tim efter viral injektion i NAc-skal, gavs djur en enda injektion av 5 mg / kg kokain och deras lokomotoriska aktivitet registrerades. Som tidigare visat med mer förlängd AAV-överuttryck av FFosB (Fig 4A), Ökade HSV-medierad överuttryck av ΔFosB lokomotorisk känslighet mot kokain (p = 0.0002; F = 8.823; df = 37; Fig 6F). Liksom vid induktion av dendritiska spines blockerade inhibering av CaMKII-aktivitet genom samuttryck av GFP-AC3I fullständigt den FosB-medierade ökningen i kokain-känslighet, vilket indikerar att CaMKII-aktivitet är nödvändig för ΔFosB-inducerade förändringar i kokainens beteendeeffekter.

Gå till:

Diskussion

Den föreliggande studien avgränsar en ny frammatningsmekanism där kokain inducerar ΔFosB i NAc, vilket uppregulerar transkription av CaMKIIa-genen selektivt i NAc-skal. CaMKIIa fosforylerar därefter och stabiliserar ΔFosB vilket leder till ökad APFB-ackumulation och ytterligare CaMKIIa-induktion (Fig 6G). De samstegrande nivåerna av de två proteinerna vid kronisk exponering för kokain bidrar då på väsentliga sätt till sensibiliserat beteendehänsyn på läkemedlet. Detta är en särskilt tilltalande hypotes eftersom både ΔFosB och CaMKII har visat sig vara tidigare krävda för ökat beteendemässigt svar på kokain (Pierce et al., 1998; Peakman et al., 2003), och vi replikerar detta resultat för ΔFosB i NAc-skalet specifikt med hjälp av en viral metod (Figurer 4 och and66).

Även om transgen ÖFosB-överuttryck i D1-typ MSN kan driva CaMKII-induktion i både NAc-skal och kärna av kokainnaiva djur, i samband med kokain, ackumulering av endogen ΔFosB, som förekommer i båda delregionerna, driver induktion av CaMKII specifikt i NAc-skal . Denna skillnad kan relatera till de högre nivåerna av ΔFosB inducerad i vår bitransgena modell, men det kan också återspegla förmågan hos kokain att differentiellt ändra CaMKIIa-promotorn i skal vs core MSNs för att antingen främja FosB-bindning i den tidigare eller utesluta den i det senare subregionen. Faktum är att våra ChIP-data, som avslöjar en kokainmedierad deacetylering av histoner vid CaMKIIa-genpromotorn endast i NAc-kärnan, stöder eventuellt involvering av en kromatinmekanism. I överensstämmelse med denna hypotes kunde ΔFosB-överuttryck i D1-typ MSN-enheter driva CaMKIIa-induktion i NAc-kärna i frånvaro av kokain (Fig 3F), vilket tyder på att det finns aktiva modifieringar av CaMKIIa-promotorn som förhindrar denna induktion vid kronisk kokainexponering. Reglering av kromatinlandskapet vid CaMKII-promotorn kan också förklara varför CaMKII induceras av en utmaningsdos av kokain i NAc-skal av kroniska kokainuttagande råttor (Fig 1E) men inte av narkotika-naiva djur (Fig 1D). Detta kan representera en epigenetisk "gen-priming" -effekt av ΔFosB (Robison och Nestler, 2011) och kan därmed vara en molekylär mekanism för inkubation av kokainbehov (Pickens et al., 2011). För att denna kromatinförändring skulle vara orsakssamband med inkubation av begär, skulle det dock behöva öka över tiden. Det kommer att vara intressant att avgöra om detta är fallet och att undersöka huruvida andra gener visar ΔFosB-beroende subregionspecifik reglering av kokain. Det är också viktigt att notera att den matningsöverföringsslinga vi beskriver inte leder till en oändlig ackumulering av CaMKII eller ΔFosB (Fig 1E); avslöja den molekylära "bromsen" som är ansvarig för detta är ett viktigt mål för framtida studier.

De kända funktionerna av ΔFosB och CaMKII i flera experimentella system och hjärnområdena konvergerar på många nivåer (Fig 6F). Båda molekylerna är nära kopplade till tillväxt av dendritisk ryggrad: CaMKII interagerar med aktincytoskeletten (Okamoto et al., 2009), reglerar ryggradsstorlek (Matsuzaki et al., 2004) och är både nödvändig och tillräcklig för plastisk inducerad ökning av filopodi och synapsnummer i hippocampala organotypa skivkulturer (Jourdain et al., 2003), wHile ΔFosB är både nödvändig och tillräcklig för kokaininducerad dendritisk ryggradbildning i NAc MSNs (Maze et al., 2010). Dessutom har båda molekylerna associerats med reglering av AMPA glutamatreceptorer. CaMKII reglerar inte totala nivåer av AMPA-receptorsubenheter, men driver införandet av AMPA-receptorer i synapser och ökar AMPA-kanalkonduktans genom fosforylering av GluA1 vid Ser831 i hippocampala pyramidala neuroner i odling och in vivo- (granskad i (Malinow och Malenka, 2002; Colbran och Brown, 2004)). Sådan ökad handel med GluA1 till synaps har också medverkat i kronisk kokainaktivitet (Boudreau och Wolf, 2005). Vidare förbättras beteenderesponser mot AMPA-receptoraktivering i NAc genom CaMKIIa-överuttryck på ett D1-dopaminreceptorberoende sätt (Singer et al., 2010). Långsiktig D1-specifik överuttryck av FFosB har visat sig inducera GluA2-transkription i NAc (Kelz et al., 1999), vilket dämpar AMPA-svar medierade via GluA1, medan vi visar att kortare termen ΔFosB-överuttryck och kortare kokainexponering har ingen effekt på denna subenhet (Fig 1). Ändå har vi nyligen funnit att kortvarig ΔFosB-överuttryck minskar emellertid AMPA-svar i D1-typ MSN i NAc (Grueter et al., 2013). Dessa data tyder på temporärt separata mekanismer som kan utgöra en tidsberoende serie av neuroadaptationer till kokain som ligger till grund för olika aspekter av missionsprogression som ännu inte är väl förstådda. På beteendens nivå krävs både CaMKII och FosB för lokomotorisk sensibilisering mot kokain (se ovan) och båda krävs för upprepad kokain självadministration hos gnagare (Colby et al., 2003; Wang et al., 2010), vilket tyder på att de två proteinerna är viktiga för både kort- och långsiktiga beteendemässiga anpassningar till läkemedelsexponering, om än via delvis separata underliggande mekanismer. Förmodligen reglerar ΔFosB och CaMKII sådana komplexa beteendemässiga anpassningar genom förändringar i NAc-synaptisk funktion, även om mycket mer arbete behövs för att direkt koppla synaptiska fenomen till beteendeförändringar.

CaMKII-holoenzymet interagerar samtidigt med en mängd synaps-associerade proteiner (Robison et al., 2005) som antas reglera dess inriktning mot postsynaptisk densitet (PSD), ett fenomen som föreslogs vara viktigt för synaptisk plasticitet. I synnerhet visade sig interaktionen mellan CaMKII och GluN2B-subenheten av NMDA-typen glutamatreceptorn att reglera både synaptisk plasticitet och inlärning (Halt et al., 2012). Medan AC3I-peptiden efterliknar den autoinhibitoriska domänen för CaMKII och därmed hämmar enzymkatalytisk aktivitet blockerar den också flera protein-protein-interaktioner (Strack et al., 2000; Robison et al., 2005). Följaktligen kan de beteende- och morfologiska effekterna av HSV-GFP-AC3I rapporteras här genom minskad fosforylering av CaMKII-målproteiner, förändringar i CaMKII-målning eller en förändring av CaMKIIs föreslagna strukturella roll vid synapser (Lisman et al., 2002).

Begränsningen av den föreslagna ΔFosB-CaMKII-slingan till NAc-skalet är av särskild anmärkning, eftersom det nyligen visade arbetet har visat flera fysiologiska skillnader mellan NAc-skalet och kärnan som svar på kokainadministration, en uppfattning som bekräftas av våra objektiva iTRAQ-data (Tabell S1) . MSN i NAc-skal visar en depression i brännskapacitet efter kronisk kokain som hålls under flera veckor, medan kärnan MSN från samma djur visar en övergående (1-3-dag) ökning i brännskapacitet som återgår till basnivåer inom 2-veckor (Kourrich och Thomas, 2009). Dessutom regleras många synaptiska proteiner differentiellt i NAc-skalet vs kärna av djur utsatta för kronisk kokain, inklusive GluA2 (Knackstedt et al., 2010). Eftersom kroniskt amphetamin inducerar CaMKIIa specifikt i NAc-skalet (Loweth et al., 2010) är det inte förvånande att vi hittar en liknande effekt med kokain. Emellertid, som ΔFosB induceras i både NAc-skalet och kärnan av kronisk kokain (Perrotti et al., 2008), och eftersom vi visar att CaMKIIa-induktion i skal är ΔFosB-beroende, ger våra fynd nya bevis för tydliga transkriptionsmekanismer vid CaMKIIa-promotorn mellan dessa två delregioner, vilka är ansvariga för den selektiva induktionen av CaMKIIa i skal.

En stor del av det senaste arbetet har fokuserat på att avgränsa skillnaderna mellan D1- och D2-typ NAc MSN. Även om både D1- och D2-receptorer är inblandade i de givande effekterna av kokain (Själv, 2010), Det senaste arbetet visar att optogenetisk aktivering av MSN-D1-typ ökar beteendemässigt svar på kokain, medan D2-typ MSN-aktivering har motsatt effekt (Lobo et al., 2010). I linje med dessa fynd är D1-receptor-knockout-möss bristfälliga vid förvärv av kokain självadministrering (Caine et al., 2007), medan D2 knockouts inte är (Caine et al., 2002). D1-agonistadministration direkt i NAc utlöser kokainsökande beteende i återinställningsparadigmer (Själv, 2010). Intressant kräver denna effekt D1-receptorberoende ökningar av CaMKII-aktivitet i NAc-skalet, men inte kärna (Anderson et al., 2008), ett resultat som dovetails snyggt med den D1- och skalspecifika FosB-CaMKII-slingan som föreslås här.

Vi rapporterade tidigare att Ser27 i ΔFosB kan fosforyleras av kasein-kinas-2 (Ulery et al., 2006) vi fastställer emellertid här att CaMKII fosforylerar ΔFosB på denna och andra ställen med mycket större kinetik och stökiometri och kan replikera det högre uppenbara M_r observerad för ΔFosB (Fig 5A) med kokainexponering in vivo- (Nestler, 2008). Vi vet redan att Ser27-fosforylering ökar FosB-stabilitet och transkriptionell aktivitet (Ulery et al., 2006; Ulery och Nestler, 2007; Ulery-Reynolds et al., 2009). Framtida arbete kommer nu att fokusera på identifieringen och de funktionella konsekvenserna av nya platser av ΔFosB-fosforylering som indikeras av föreliggande studie.

Den här frammatade slingan beskriver en rimlig ny mekanism genom vilken upprepad administrering av kokain driver progressiva abnormiteter i NAc. Som sådan kan denna biokemiska väg ge ett viktigt mål för framtida terapeutisk ingrepp i beroendeframkallande störningar. Eftersom CaMKII är allestädes närvarande och krävs för många basala neuronala och beteendemässiga funktioner har direkt användning av CaMKII-hämmare undvikits som en missbruksbehandling. Våra data tyder på att mer subtil inriktning på mekanismen för CaMKII-induktion, som är specifik för en individuell celltyp och subregion av hjärnans belöningskretsar, skulle kunna ge ett terapeutiskt mål som skulle undvika komplikationerna för systemisk CaMKII-inhibering.

Gå till:

Tack

Detta arbete stöddes av bidrag från National Institute on Drug Abuse (EJN), NIDA-Yale Proteomics Center DA018343 (AJR och EJN) och Hartwell Foundation (AJR). Författarna vill tacka Gabby Rundenko för den generösa gåvan av renad ΔFosB och Roger Colbran för den generösa gåvan av renad CaMKIIa.

Gå till:

Referensprojekt

1. Ahmed SH, Koob GF. Övergång från måttligt till alltför stort läkemedelsintag: förändring i hedonisk börvärde. Vetenskap. 1998; 282: 298-300. [PubMed]
2. Anderson SM, Berömd KR, Sadri-Vakili G, Kumaresan V, Schmidt HD, Bas CE, Terwilliger EF, Cha JH, Pierce RC. CaMKII: en biokemisk bro som kopplar samman dopamin och glutamatsystem i kokainsökande. Nat Neurosci. 2008; 11: 344-353. [PubMed]
3. Boudreau AC, Wolf ME. Behavioral sensibilisering mot kokain är associerad med ökat AMPA-receptor ytauttryck i kärnan accumbens. J Neurosci. 2005; 25: 9144-9151. [PubMed]
4. Brickey DA, Colbran RJ, Fong YL, Soderling TR. Uttryck och karakterisering av alfa-subenheten för Ca2 + / kalmodulinberoende proteinkinas II med användning av baculovirusuttryckssystemet. Biochem Biophys Res Commun. 1990; 173: 578-584. [PubMed]
5. Caine SB, Negus SS, Mello NK, Patel S, Bristow L, Kulagowski J, Vallone D, Saiardi A, Borrelli E. Rollen av dopamin D2-liknande receptorer vid självkontroll av kokain: studier med D2-receptormutantmöss och ny D2-receptor antagonister. J Neurosci. 2002; 22: 2977-2988. [PubMed]
6. Caine SB, Thomsen M, Gabriel KI, Berkowitz JS, Guld LH, Koob GF, Tonegawa S, Zhang J, Xu M. Brist på självadministrering av kokain i dopamin D1-receptor-knock-out-möss. J Neurosci. 2007; 27: 13140-13150. [PMC gratis artikel] [PubMed]
7. Carle TL, Ohnishi YN, Ohnishi YH, Alibhai IN, Wilkinson MB, Kumar A, Nestler EJ. Proteasomberoende och oberoende mekanismer för FosB-destabilisering: identifiering av FosB degron-domäner och konsekvenser för DeltaFosB-stabilitet. Eur J Neurosci. 2007; 25: 3009-3019. [PubMed]
8. Chen J, Kelz MB, Zeng G, Sakai N, Steffen C, Shockett PE, Picciotto MR, Duman RS, Nestler EJ. Transgena djur med inducerande, riktade genuttryck i hjärnan. Mol Pharmacol. 1998; 54: 495-503. [PubMed]
9. Christoffel DJ, Golden SA, Dumitriu D, Robison AJ, Janssen WG, Ahn HF, Krishnan V, Reyes CM, Han MH, Ables JL, Eisch AJ, Dietz DM, Ferguson D, Neve RL, Greengard P, Kim Y, Morrison JH , Russo SJ. IkappaB-kinas reglerar socialt nedbrytande stressinducerad synaptisk och beteendetsplasticitet. J Neurosci. 2011; 31: 314-321. [PMC gratis artikel] [PubMed]
10. Colbran RJ. Inaktivering av Ca2 + / kalmodulinberoende proteinkinas II genom basal autofosforylering. J Biol Chem. 1993; 268: 7163-7170. [PubMed]
11. Colbran RJ. Proteinfosfataser och kalcium / kalmodulinberoende proteinkinas II-beroende synaptisk plasticitet. J Neurosci. 2004; 24: 8404-8409. [PubMed]
12. Colbran RJ, Brown AM. Kalcium / kalmodulinberoende proteinkinas II och synaptisk plasticitet. Curr Opin Neurobiol. 2004; 14: 318-327. [PubMed]
13. Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, Self DW. Striatal celltypsspecifik överuttryck av DeltaFosB ökar incitamentet för kokain. J Neurosci. 2003; 23: 2488-2493. [PubMed]
14. Covington HE, 3rd, Maze I, LaPlant QC, Vialou VF, Ohnishi YN, Berton O, Fass DM, Renthal W, Rush AJ, 3rd, Wu EY, Ghose S, Krishnan V, Russo SJ, Tamminga C, Haggarty SJ, Nestler EJ. Antidepressiva verkningar av histon-deacetylasinhibitorer. J Neurosci. 2009; 29: 11451-11460. [PMC gratis artikel] [PubMed]
15. Davalos A, Fernandez-Hernando C, Sowa G, Derakhshan B, Lin MI, Lee JY, Zhao H, Luo R, Colangelo C, Sessa WC. Kvantitativa proteomika av caveolin-1-reglerade proteiner: karakterisering av polymeras I och transkriptfrigivningsfaktor / CAVIN-1 IN endotelceller. Mol Cell Proteomics. 2010; 9: 2109-2124. [PMC gratis artikel] [PubMed]
16. Dumais A, Lesage AD, Alda M, Rouleau G, Dumont M, Chawky N, Roy M, Mann JJ, Benkelfat C, Turecki G. Riskfaktorer för självmordstäckning vid större depression: en fallkontrollstudie av impulsivt och aggressivt beteende hos män. Am J Psykiatri. 2005; 162: 2116-2124. [PubMed]
17. Grueter BA, Robison AJ, Neve RL, Nestler EJ, Malenka RC. ΔFosB modulerar differentiellt kärnan accumbens direkt och indirekt vägfunktion. Proc Natl Acad Sci USA. 2013 i press. [PMC gratis artikel] [PubMed]
18. Halt AR, Dallapiazza RF, Zhou Y, Stein IS, Qian H, Juntti S, Wojcik S, Brose N, Silva AJ, Hell JW. CaMKII-bindning till GluN2B är kritisk under minneskonsolidering. EMBO J. 2012; 31: 1203-1216. [PMC gratis artikel] [PubMed]
19. Hiroi N, Brown JR, Haile CN, Ye H, Greenberg ME, Nestler EJ. FosB-mutanta möss: förlust av kronisk kokaininduktion av Fos-relaterade proteiner och ökad känslighet för kokainens psykomotoriska och givande effekter. Proc Natl Acad Sci US A. 1997; 94: 10397–10402. [PMC gratis artikel] [PubMed]
20. Ito R, Robbins TW, Everitt BJ. Differentiell kontroll över kokain-sökande beteende av kärnan accumbens kärna och skal. Nat Neurosci. 2004; 7: 389-397. [PubMed]
21. Jorissen HJ, Ulery PG, Henry L, Gourneni S, Nestler EJ, Rudenko G. Dimerisering och DNA-bindande egenskaper hos transkriptionsfaktorn DeltaFosB. Biokemi. 2007; 46: 8360-8372. [PubMed]
22. Jourdain P, Fukunaga K, Muller D. Kalcium / kalmodulinberoende proteinkinas II bidrar till aktivitetsberoende filopodi tillväxt och ryggradbildning. J Neurosci. 2003; 23: 10645-10649. [PubMed]
23. Kelz MB, Chen J, Carlezon WA, Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, Själv DW, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Neve RL, Duman RS, Picciotto MR, Nestler EJ. Uttryck av transkriptionsfaktorn deltaFosB i hjärnan styr känsligheten för kokain. Natur. 1999; 401: 272-276. [PubMed]
24. Klug JR, Mathur BN, Kash TL, Wang HD, Matthews RT, Robison AJ, Anderson ME, Deutch AY, Lovinger DM, Colbran RJ, Winder DG. Genetisk hämning av CaMKII i dorsalt Striatal Medium Spiny Neurons reducerar funktionella excitatoriska synapser och förbättrar intrinsic excitability. PLOS One. 2012; 7: e45323. [PMC gratis artikel] [PubMed]
25. Knackstedt LA, Moussawi K, Lalumiere R, Schwendt M, Klugmann M, Kalivas PW. Extinktionstrening efter kokain självadministration inducerar glutamatergisk plasticitet för att hämma kokainsökande. J Neurosci. 2010; 30: 7984-7992. [PMC gratis artikel] [PubMed]
26. Kourrich S, Thomas MJ. Liknande neuroner, motsatta anpassningar: Psykostimulerande erfarenheter skiljer sig i olika grad från bränningsegenskaper i accumbens core versus shell. J Neurosci. 2009; 29: 12275-12283. [PMC gratis artikel] [PubMed]
27. Kourrich S, Klug JR, Mayford M, Thomas MJ. AMPAR-oberoende effekten av Striatal alfaCaMKII främjar känsligheten av kokainbelöning. J Neurosci. 2012; 32: 6578-6586. [PMC gratis artikel] [PubMed]
28. LaPlant Q, Chakravarty S, Vialou V, Mukherjee S, Koo JW, Kalahasti G, Bradbury KR, Taylor SV, Maze I, Kumar A, Graham A, Birnbaum SG, Krishnan V, Truong HT, Neve RL, Nestler EJ, Russo SJ . Rollen av kappaB-kärnfaktor i ovariehormonmedierad stressöverkänslighet hos honmöss. Biolpsykiatri. 2009; 65: 874-880. [PMC gratis artikel] [PubMed]
29. Lee KW, Kim Y, Kim AM, Helmin K, Nairn AC, Greengard P. Kokaininducerad dendritisk ryggradssbildning i D1- och D2-dopaminreceptorinnehållande mellanspinniga neuroner i nukleinsymboler. Proc Natl Acad Sci USA A. 2006; 103: 3399-3404. [PMC gratis artikel] [PubMed]
30. Lisman J, Schulman H, Cline H. Den molekylära grunden för CaMKII-funktionen i synaptisk och beteendeminnet. Nat Rev Neurosci. 2002; 3: 175-190. [PubMed]
31. Lobo MK, Covington HE, 3rd, Chaudhury D, Friedman AK, Sun H, Damez-Werno D, Dietz DM, Zaman S, Koo JW, Kennedy PJ, Mouzon E, Mogri M, Neve RL, Deisseroth K, Han MH, Nestler EJ. Celltypspecifik förlust av BDNF-signalering efterliknar optogenetisk kontroll av kokainbelöning. Vetenskap. 2010; 330: 385-390. [PMC gratis artikel] [PubMed]
32. Loweth JA, Baker LK, Guptaa T, Guillory AM, Vezina P. Inhibering av CaMKII i kärnan accumbens skal minskar förbättrat amfetaminintag i sensibiliserade råttor. Neurosci Lett. 2008; 444: 157-160. [PMC gratis artikel] [PubMed]
33. Loweth JA, Singer BF, Baker LK, Wilke G, Inamine H, Bubula N, Alexander JK, Carlezon WA, Jr, Neve RL, Vezina P. Övergående överuttryck av alfa-Ca2 + / kalmodulinberoende proteinkinas II i kärnan accumbens skal förbättrar beteende som svarar mot amfetamin. J Neurosci. 2010; 30: 939-949. [PMC gratis artikel] [PubMed]
34. Malinow R, Malenka RC. AMPA-receptorhandel och synaptisk plasticitet. Annu Rev Neurosci. 2002; 25: 103-126. [PubMed]
35. Matsuzaki M, Honkura N, Ellis-Davies GC, Kasai H. Strukturell grund för långsiktig potentiering i enstaka dendritiska ryggrad. Natur. 2004; 429: 761-766. [PubMed]
36. Mayford M, Bach ME, Huang YY, Wang L, Hawkins RD, Kandel ER. Kontroll av minnesbildning genom reglerad expression av en CaMKII-transgen. Vetenskap. 1996; 274: 1678-1683. [PubMed]
37. Maze I, Covington HE, 3rd, Dietz DM, LaPlant Q, Renthal W, Russo SJ, Mekaniker M, Mouzon E, Neve RL, Haggarty SJ, Ren Y, Sampath SC, Hurd YL, Greengard P, Tarakhovsky A, Schaefer A, Nestler EJ. Viktig roll för histon-metyltransferas G9a i kokaininducerad plasticitet. Vetenskap. 2010; 327: 213-216. [PMC gratis artikel] [PubMed]
38. McClung CA, Nestler EJ. Reglering av genuttryck och kokainbelöning av CREB och DeltaFosB. Nat Neurosci. 2003; 6: 1208-1215. [PubMed]
39. Nestler EJ. Recension. Transkriptionsmekanismer för missbruk: DeltaFosBs roll. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2008; 363: 3245-3255. [PMC gratis artikel] [PubMed]
40. Nye HE, Hopp BT, Kelz MB, Iadarola M, Nestler EJ. Farmakologiska studier av reglering av kronisk FOS-relaterad antigeninduktion av kokain i striatum och kärnan accumbens. J Pharmacol Exp Ther. 1995; 275: 1671-1680. [PubMed]
41. Okamoto K, Bosch M, Hayashi Y. Rollerna av CaMKII och F-aktin i den strukturella plasticiteten hos dendritiska spines: En potentiell molekylär identitet hos en synaptisk tagg? Fysiologi (Bethesda) 2009; 24: 357-366. [PubMed]
42. Olausson P, Jentsch JD, Tronson N, Neve RL, Nestler EJ, Taylor JR. DeltaFosB i kärnan accumbens reglerar matförstärkt instrumentalt beteende och motivation. J Neurosci. 2006; 26: 9196-9204. [PubMed]
43. Paxinos G, Watson C. Råttahjärnan i stereotaxiska koordinater. 6th Edition. Amsterdam; Boston: Academic Press / Elsevier; 2007.
44. Peakman MC, Colby C, Perrotti LI, Tekumalla P, Carle T, Ulery P, Chao J, Duman C, Steffen C, Monteggia L, Allen MR, lager JL, Duman RS, McNeish JD, Barrot M, Self DW, Nestler EJ , Schaeffer E. Inducerbart hjärnregionsspecifik expression av en dominant negativ mutant av c-Jun i transgena möss minskar känsligheten för kokain. Brain Res. 2003; 970: 73-86. [PubMed]
45. Penzes P, Cahill ME, Jones KA, Srivastava DP. Konvergent CaMK och RacGEF signalerar kontrolldendritisk struktur och funktion. Trends Cell Biol. 2008; 18: 405-413. [PubMed]
46. Perrotti LI, Hadeishi Y, Ulery PG, Barrot M, Monteggia L, Duman RS, Nestler EJ. Induktion av deltaFosB i belöningsrelaterade hjärnstrukturer efter kronisk stress. J Neurosci. 2004; 24: 10594-10602. [PubMed]
47. Perrotti LI, Weaver RR, Robison B, Renthal W, Maze I, Yazdani S, Elmore RG, Knapp DJ, Selley DE, Martin BR, Sim-Selley L, Bachtell RK, Self DW, Nestler EJ. Distinkta mönster av DeltaFosB induktion i hjärnan av missbruk. Synapse. 2008; 62: 358-369. [PMC gratis artikel] [PubMed]
48. Pickens CL, Airavaara M, Theberge F, Fanous S, Hopp BT, Shaham Y. Neurobiologi av inkubation av läkemedelsbehov. Trender Neurosci. 2011; 34: 411-420. [PMC gratis artikel] [PubMed]
49. Pierce RC, Quick EA, Reeder DC, Morgan ZR, Kalivas PW. Kalciummedierade andra budbärare modulerar uttrycket av beteendessensibilisering mot kokain. J Pharmacol Exp Ther. 1998; 286: 1171-1176. [PubMed]
50. Quirion R, Robitaille Y, Martial J, Chabot JG, Lemoine P, Pilapil C, Dalpe M. Mänsklig hjärnreceptorautoradiografi med hela halvklotet: en allmän metod som minimerar vävnadsartefakter. Synapse. 1987; 1: 446-454. [PubMed]
51. Robinson TE, Kolb B. Strukturell plasticitet i samband med exponering för missbruk. Neuro. 2004; 47 (Suppl 1): 33-46. [PubMed]
52. Robison AJ, Nestler EJ. Transkriptionella och epigenetiska mekanismer för missbruk. Nat Rev Neurosci. 2011; 12: 623-637. [PMC gratis artikel] [PubMed]
53. Robison AJ, Bass MA, Jiao Y, MacMillan LB, Carmody LC, Bartlett RK, Colbran RJ. Multivalenta interaktioner av kalcium / kalmodulinberoende proteinkinas II med postsynaptiska densitetsproteinerna NR2B, densin-180 och alfa-actinin-2. J Biol Chem. 2005; 280: 35329-35336. [PubMed]
54. Ross P, Huang YN, Marchese JN, Williamson B, Parker K, Hattan S, Khainovski N, Pillai S, Dey S, Daniels S, Purkayastha S, Juhasz P, Martin S, Bartlet-Jones M, He F, Jacobson A, Pappin DJ. Multiplexerad proteinkvantitation i Saccharomyces cerevisiae med användning av aminreaktiva isobariska märkning reagenser. Mol Cell Proteomics. 2004; 3: 1154-1169. [PubMed]
55. Russo SJ, Dietz DM, Dumitriu D, Morrison JH, Malenka RC, Nestler EJ. Den beroende av synaps: mekanismer av synaptisk och strukturell plasticitet i kärnan accumbens. Trender Neurosci. 2010; 33: 267-276. [PMC gratis artikel] [PubMed]
56. Själv DW. I: Dopaminreceptorerna. Neve KA, redaktör. New York: Humana Press; 2010. pp. 479-524.
57. Sångare BF, Loweth JA, Neve RL, Vezina P. Transient viral-medierad överuttryckning av alfa-kalcium / kalmodulinberoende proteinkinas II i nukleins accumbens skal leder till långvarig funktionell uppreglering av alfa-amino-3-hydroxyl-5 -metyl-4-isoxazol-propionatreceptorer: dopamin-typ-1-receptor och proteinkinas A-beroende. Eur J Neurosci. 2010; 31: 1243-1251. [PMC gratis artikel] [PubMed]
58. Strack S, McNeill RB, Colbran RJ. Mekanism och reglering av kalcium / kalmodulinberoende proteinkinas II riktade mot NR2B-subenheten hos N-metyl-D-aspartatreceptorn. J Biol Chem. 2000; 275: 23798-23806. [PubMed]
59. Ulery-Reynolds PG, Castillo MA, Vialou V, Russo SJ, Nestler EJ. Fosforylering av DeltaFosB medierar dess stabilitet in vivo. Neuroscience. 2009; 158: 369-372. [PMC gratis artikel] [PubMed]
60. Ulery PG, Nestler EJ. Reglering av DeltaFosB transkriptionsaktivitet genom Ser27 fosforylering. Eur J Neurosci. 2007; 25: 224-230. [PubMed]
61. Ulery PG, Rudenko G, Nestler EJ. Reglering av DeltaFosB-stabilitet genom fosforylering. J Neurosci. 2006; 26: 5131-5142. [PubMed]
62. Vialou V, et al. DeltaFosB i hjärnbelöningskretsar medierar motståndskraft mot stress och antidepressiva reaktioner. Nat Neurosci. 2010; 13: 745-752. [PMC gratis artikel] [PubMed]
63. Wang L, Lv Z, Hu Z, Sheng J, Hui B, Sun J, Ma L. Kronisk kokaininducerad H3-acetylering och transkriptionell aktivering av CaMKIIalpha i kärnans accumbens är kritisk för motivation för läkemedelsförstärkning. Neuropsychopharmacology. 2010; 35: 913-928. [PMC gratis artikel] [PubMed]
64. Werme M, Messer C, Olson L, Gilden L, Thoren P, Nestler EJ, Brene S. Delta FosB reglerar hjullöpning. J Neurosci. 2002; 22: 8133-8138. [PubMed]
65. Winstanley CA, LaPlant Q, Theobald DE, Green TA, Bachtell RK, Perrotti LI, DiLeone RJ, Russo SJ, Garth WJ, Self DW, Nestler EJ. DeltaFosB-induktion i orbitofrontal cortex medger tolerans mot kokaininducerad kognitiv dysfunktion. J Neurosci. 2007; 27: 10497-10507. [PubMed]
66. Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchman T, Berton O, Sim-Selley LJ, Dileone RJ, Kumar A, Nestler EJ. En viktig roll för DeltaFosB i kärnan accumbens i morfin åtgärder. Nat Neurosci. 2006; 9: 205-211. [PubMed]
67. Zhang R, Khoo MS, Wu Y, Yang Y, Grueter CE, Ni G, Pris EE, Jr, Thiel W, Guatimosim S, Song LS, Madu EC, Shah AN, Vishnivetskaya TA, Atkinson JB, Gurevich VV, Salama G, Lederer WJ, Colbran RJ, Anderson ME. Calmodulin kinas II-hämning skyddar mot strukturell hjärtsjukdom. Nat Med. 2005; 11: 409-417. [PubMed]