Ökad aktivitet av cyklinberoende kinas 5 leder till dämpning av kokainmedierad dopamin-signalering (2005)

Proc Natl Acad Sci US A. 2005 februari 1; 102(5): 1737-1742.

Publicerad online 2005 januari 21. doi:  10.1073 / pnas.0409456102
PMCID: PMC547862
Neuroscience
Denna artikel har varit citerad av Andra artiklar i PMC.

Abstrakt

Kokain, ett missbrukemedel, ökar synaptiska dopaminnivåer i striatumen genom att blockera dopaminupptagning vid axonterminaler. Cyklinberoende kinas 5 (Cdk5) och dess aktivator p35, proteiner som är involverade i fosforylering av substrat i postmitotiska neuroner, har befunnits uppreglerade efter kronisk exponering för kokain. För att ytterligare undersöka effekterna av Cdk5- och p35-induktion på striataldopamin-signalering genererade vi två oberoende transgena muslinjer där Cdk5 eller p35 överuttrycktes specifikt i neuroner. Vi rapporterar här att ökad Cdk5-aktivitet, som en följd av p35 men inte av överexpression av Cdk5, leder till dämpning av kokainmedierad dopamin-signalering. Ökad Cdk5-medierad fosforylering av dopamin och cAMP-reglerat fosfoprotein, molekylvikt 32 kDa (DARPP-32) vid Thr-75, åtföljdes av minskad fosforylering av DARPP-32 vid Thr-34. Ökad Cdk5-medierad fosforylering av extracellulärt signalreglerat kinaskinas 1 vid Thr-286 åtföljdes av minskad aktivering av extracellulärt signalreglerat kinas 1 / 2. Dessa effekter bidrog till dämpning av kokaininducerad fosforylering av cAMP-responselementbindande protein såväl som en mindre induktion av c-fos i striatumet. Dessa resultat stöder tanken att Cdk5-aktivitet är involverad i förändrat genuttryck efter kronisk exponering för kokain och följaktligen påverkar de långvariga förändringarna i neuronfunktionen som ligger till grund för kokainberoende.

Nyckelord: kokainberoende, fosforylering, striatum

Kokain ökar synaptiska dopaminnivåer i striatumet och ändrar genuttrycket i dopaminoceptiva neuronerna genom aktivering av intracellulära vägar som sprider initialsignalen från dopamin D1-receptorn till kärnan (1). Kronisk exponering för kokain uppreglerar flera transkriptionsfaktorer, vilket resulterar i de långvariga förändringar i genuttryck som tros ligga till grund för neuronala anpassningar vid kokainmissbruk (2). ΔFosB, identifierad som en sådan transkriptionsfaktor (3) har visat sig öka djurens beteendehänsyn till kokain (4, 5). Därför förväntas identifiering av målgenerna som regleras av ΔFosB-induktion bidra till en större förståelse av den molekylära mekanismen som ligger till grund för kokainberoende. Nyligen har kronisk behandling av djur med kokain visat sig reglera uttrycket av cyklinberoende kinas 5 (Cdk5) och dess aktivator p35 i striatum genom induktion av ΔFosB (6, 7).

Cdk5 är medlem i Cdk-familjen av serin / treoninkinaser. Till skillnad från andra Cdks som är viktiga regulatorer av cellcykelprogression, är Cdk5 huvudsakligen inblandad i fosforylering av substrat i postmitotiska neuroner (8). Den neuronala specificiteten hos Cdk5-aktivitet uppnås genom föreningen med dess aktivatorer, antingen p35 eller p39, vilka huvudsakligen uttrycks i postmitotiska neuroner (8). Förutom den viktiga rollen som Cdk5 i hjärnans utveckling (9, 10), jagt har också blivit involverad i dopaminerg överföring i postnatal hjärna (11, 12). Inhibering av Cdk5-aktivitet resulterar i ökad dopaminfrisättning i striatum, vilket indikerar en presynaptisk funktion av Cdk5 som en negativ regulator för dopaminfrisättning (11). Vidare modulerar Cdk5 effekten av postsynaptisk dopamin-signalering genom fosforylering av dopamin- och cAMP-reglerat fosfoprotein, molekylvikt 32 kDa (DARPP-32) vid Thr-75, som omvandlar DARPP-32 till en inhibitor av cAMP-beroende kinas (PKA) (12).

Dessa observationer tyder på att Cdk5 och p35 är nedströmsregulatorer av den långvariga aktiveringen av dopamin-signalering efter kronisk exponering för kokain och därmed i kokainmissbruk. För att ytterligare adressera rollen av Cdk5 på striatal dopamin-signalering genererade vi två transgena muslinjer där antingen Cdk5 eller p35 överuttrycktes specifikt i neuroner under kontroll av p35-promotorn. Våra resultat indikerade att Cdk5-aktiviteten var uppreglerad med ökade nivåer av p35-protein men inte Cdk5-protein, vilket tyder på att nivån av p35-proteinet är hastighetsbegränsande för Cdk5-aktivitet. Vi tillhandahåller här in vivo- bevis för ökad Cdk5-aktivitet, som ett resultat av p35-överuttryck, leder till dämpning av kokainmedierad dopamin-signalering till kärnan genom en inhibering av PKA och extracellulär signalreglerade kinas (ERK) -kaskader.

Material och metoder

Antikroppar. Polyklonala antikroppar mot Cdk5 (C-8) och p35 (C-19) köptes från Santa Cruz Biotechnology. De fosforyleringsberoende och oberoende antikropparna mot ERK-kinas (MEK) 1 / 2, ERK1 / 2 och cAMP-responselementbindande protein (CREB) erhölls från Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Antikropparna mot fosfor-Thr-34 DARPP 32 (13), fosfon-Thr-75 DARPP-32 (12), totalt DARPP-32 (12) och c-fos (14) användes såsom beskrivits. En antikropp mot aktin köptes från Sigma.

Experimentella djur. Vi klonade tidigare musen p35-genen Cdk5r1, som kodar för p35-protein, och karakteriserade sin genomiska struktur (15). För att generera den transgena musen med neuronal överuttryck av p35 (Tgp35), 6-kb EcoRI-EcoRI-fragment innehållande 1.2-kb-promotorregionen subklonades i en pGEM9Z (-) plasmid och en 45-bp-tagg härledd från SV40 infördes i KPNI platsen nedströms poly (A+) signal (Fig 1A). Taggen innehöll a SpeJag plats för genotypning av djuren. 6-kb-fragmentet skars ut från plasmiden och renades, följt av pronukleär injektion av transgen för att alstra de transgena mössen. Att undersöka expressionsprofilen för transgenen under den reglerande kontrollen av 1.2-kb p35-promotorn in vivo-, en dubbel transgen mus (Tgp35; p35 - / -) genererades vidare med användning av en tvåstegs avelsstrategi genom vilken Tgp35-musen regenererades i en endogen p35-null-bakgrund. De andra musmodellerna som användes i denna studie omfattade p35 +/-, p35 - / -, Cdk5 +/- och en transgen mus med neuronal överuttryck av Cdk5 (TgCdk5) (9, 16, 17). Genotyper av dessa möss bestämdes genom att utföra antingen Southern blot-analys eller PCR på genomiskt DNA isolerat från svansbiopsierna. Mössen hölls under en 12-h ljus / 12-h mörkcykel. All vård gavs i enlighet med National Institutes of Health riktlinjer för vård och användning av laboratorie- och experimentdjur.

Fig. 1.  

Generering av transgen mus med neuronal överuttryck av p35 styrd av p35-promotorn (Tgp35). (A) Transgenkonstruktionen visas med schematiska strukturer av vildtyp och riktade p35-alleler. Röda staplar indikerar sonden som används för genotypning. .

Southern Blot Analysis. Genomiskt DNA extraherat från svansbiopsier spjälkades med EcoRI och SpeI, elektroforeserades på en 0.9% agarosgel och överfördes till ett nylonmembran. Membranet hybridiserades med en slumpmässig priming 32P-märkt sond vid 42 ° C över natten. 485-bp-sonden för genotypning av p35 knockout (p35 - / -) och Tgp35-möss genererades genom PCR genom att använda följande primrar: 5'-ACATCCTGCTGCCACGGTGAC-3 'och 5'-CCACTGTAAAAGCAACAAGA-3'. Det hybridiserade membranet tvättades två gånger i 2 × SSC / 0.1% SDS vid 42 ° C för 10 min och två gånger i 0.1 × SSC / 0.1% SDS vid 65 ° C för 20 min och exponerades för röntgenfilm.

Drogbehandling. Kokain (Sigma) löstes i steril saltlösning. Djur injicerades med kokain (15 mg / kg) eller en lika stor mängd saltlösning vid 3-månadens ålder och dödades genom avkapning vid olika tidpunkter (15, 30, 60 och 120 min) efter injektionen. Hjärnorna avlägsnades snabbt och kyldes i iskall PBS. Striberna dissekerades därefter och utsattes för nordlig eller västlig blötanalys. För immunohistokemisk analys erhölls striatala sektioner från möss 2 h efter injektionen.

Northern Blot Analysis. Total RNA extraherades från striaten med TRIzolreagens (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) och utsattes för Northern blot-analys enligt beskrivning (18). För detektion av c-fos mRNA användes ett 189-bp-fragment av mus c-fos cDNA som en sond som beskrivits (19). Nivåerna av c-fos mRNA kvantifierades genom mätning av den optiska densiteten hos det specifika bandet med användning av ett bildanalyssystem med nih bildprogramvara, Version 1.62.

Western Blot Analysis. Striatala vävnader sonikerades i 1% SDS och kokades för 10 min. Proteinkoncentrationen i varje prov bestämdes genom BCA-proteinanalys (Pierce). Lika mängder protein separerades med SDS / PAGE innan de överfördes på ett nitrocellulosamembran. Membranen blockerades i 1 × PBS innehållande 5% skummjölk och 0.05% Tween 20 och inkuberades med primära antikroppar över natten vid 4 ° C. Inkubation med peroxidas-konjugerad anti-mus eller kanin-IgG (Sigma) utfördes vid rumstemperatur under 60 min. En signal detekterades genom förbättrad kemiluminescens (Pierce) och de optiska densiteterna hos banden kvantifierades såsom beskrivits ovan.

Cdk5-kinasassay. Striatallysat framställdes med en lysbuffert bestående av 50 mM Tris · HCl, pH 7.4 / 50 mM NaCl / 5 mM EDTA / 1% Triton X-100 / 1mMDTT / 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid / 1 μg / ml aprotinin / 1 μg / ml leupeptin / fosfatasinhibitorer (fosfatasinhibitorblandning I och II, Sigma). Lysaten immunoprecipiterade med antingen antikroppar mot Cdk5 (C-8) eller anti-p35 (C-19). Cdk5-immunprecipitaten framställdes genom inkubation av 300 / il av lysatet (motsvarande 300 ^ g protein) med anti-Cdk5-antikropp (3 ^ ig) över natten vid 4 ° C följt av ytterligare inkubering med 25 / il protein A-agarospärlor (50 % uppslamning i lysbufferten, Santa Cruz Biotechnology) för 3 h vid 4 ° C. För framställning av p35-immunprecipitater inkuberades 500 / il av lysatet (motsvarande 1 mg protein) med anti-p35-antikropp (3 ^ ig) som beskrivits ovan. Immunprecipitaten tvättades två gånger med lysbufferten och två gånger med en kinasbuffert bestående av 50 mM Tris · HCl, pH 7.4 / 5 mM MgCl22/ 1 mM EDTA / 1 mM EGTA / 1 mM DTT, resuspenderad i 60 μl av kinasbufferten. Kinasaktivitet uppmättes med användning av histon H1 som substrat (18).

Immunohistokemi. Möss bedövades med hjälp av ip-injektioner av avertin (250 mg / kg, Fluka) och perfusionerades transkartärt med 0.1 M natriumfosfatbuffert, pH 7.4, följt av Streck Tissue Fixative (Streck Laboratories, La Vista, NE), ett icke-tvärbindande fixativ. Dissected hjärnor fixerades vidare i samma fixativ över natten vid 37 ° C. Därefter inbäddes hjärnor i paraffin, skars i 5-pm-tjocka koronavsnitt och utsattes för immunhistokemi genom användning av avidin-biotin-peroxidas-komplexteknik (Vector Laboratories) med diaminobenzidin som ett substrat. Sektionerna inkuberades med en affinitetsrenad polyklonal antikropp mot c-fos över natten vid 4 ° C. Färgspecificiteten bedömdes genom utelämnande av den primära antikroppen.

Resultat

Generering av transgena möss med neuronal överuttryck av p35. Transgenen som användes för att uppnå ökat neuronalt uttryck av p35 innefattade 6-kb-fragmentet av den klonade mus-p35-genen innehållande 1.2-kb-promotorn och hela kodningssekvensen av p35 (Fig 1 A). Genotyperna hos möss bestämdes genom Southern blot-analys med användning av en sond som utformades för att särskilja p35- / - och Tgp35-möss från vildtypsmus (Fig 1 A och B). För att undersöka transgenuttrycket under kontrollen av 1.2-kb p35-promotorn genererade vi dubbla transgena möss (Tgp35; p35 - / -), i vilket p35-uttryck endast drivits från transgenen. P35-uttrycket i Tgp35; p35- / - möss observerades endast i hjärnan (Fig 1C), där rumsuttrycksmönstret liknade det hos vildtypsmus (Fig 1D). Brist på p35 har visat sig resultera i onormal skiktstruktur i hjärnbarken och hippocampus hos möss (10). Tgp35; p35 - / - mössa visade emellertid en fullständig räddning av p35 - / - hjärnfenotypen (Fig 1E). Dessa data indikerade att 1.2-kb p35-promotorn kontrollerade expressionen av transgenen med en liknande expressionsprofil som den för p35 från den endogena p35-genen.

P35 Protein Level är taktsänkning för uppreglering av Cdk5-aktivitet. Vi undersökte gendosseffekterna av generna som kodar för p35 och Cdk5 på proteinuttryck i striatala extrakt från p35- /, p35 +/-, vildtyp, Tgp35, Cdk5 +/- och TgCdk5-möss vid en ålder av 3 månader. Nivåerna av p35 och Cdk5 protein korrelerade väl med gendoseringema (Fig 2 A och B). Tgp35-möss uppvisade en ≈1.6-faldig ökning av p35-proteinhalten jämfört med vildtypsmus, medan Cdk5-proteinnivåer var opåverkade av de olika nivåerna av p35-protein. TgCdk5-möss uppvisade en ≈1.9-faldig ökning av Cdk5-proteinhalten jämfört med vildtyps-möss, medan p35-proteinnivåerna var opåverkade av de olika nivåerna av Cdk5-protein. För att undersöka effekterna av olika mängder p35-protein på Cdk5-aktivitet, Cdk5 immunprecipiterades från striatal-extrakt med anti-Cdk5-antikropp och kinasaktivitet uppmättes. På liknande sätt för att undersöka effekterna av olika mängder av Cdk5-protein på kinasaktivitet immunprecipiterades p35 från striatalaxtrakt med anti-p35-antikropp och kinasaktivitet mättes. Cdk5-aktivitet korrelerade väl med nivån av p35-protein men inte med nivån av Cdk5-protein (Fig 2 C och D). Dessa resultat indikerade att mängden p35-protein är en hastighetsbegränsande faktor för Cdk5-aktivitet. Vi använde därför Tgp35-möss för att undersöka effekterna av ökad Cdk5-aktivitet vid striatal dopamin-signalering.

Fig. 2.  

Uppreglering av Cdk5-aktivitet är avgiftsbegränsad av p35-proteinnivån. (A) Western blottar som visar att proteinkoncentrationerna av p35 och Cdk5 korrelerar med gendoserna av respektive p35- och Cdk5-generna. (B) Relativa nivåer av p35 eller Cdk5 protein .

Kokaininducerad fosforylering av DARPP-32 vid Thr-34 dämpas i Tgp35-möss. Funktionen för DARPP-32 beror på dess fosforyleringstillstånd vid flera ställen (20). PKA fosforylerar DARPP-32 vid Thr-34, medan Cdk5 fosforylerar DARPP-32 vid Thr-75. Således undersökte vi fosforyleringstillståndet för DARPP-32 i striatal-extrakt från vildtyps- och Tgp35-möss. Nivån av fosfat-Thr-75 DARPP-32 var högre i Tgp35-möss (Fig 3A; 1.6 ± 0.2-vik över värdet av vildtypande möss). Vi bedömde därefter effekterna av ökad Cdk5 aktivitet vid striatal dopamin signalering. Vi undersökte den kokaininducerade PKA-aktiveringen i Tgp35-möss genom att analysera fosforyleringstillståndet för DARPP-32 vid Thr-34. Nivån av fosfat-Thr-34 DARPP-32 ökades i vildtyps möss 15 min efter kokaininjektionen (Fig 3B; 1.8 ± 0.2-vik över basal nivå). Emellertid dämpades effekten av kokain på Thr-34-fosforylering av DARPP-32 i Tgp35-möss (1.2 ± 0.3-vik över basalnivån). Dessa resultat indikerade att en ökning av Cdk5-aktivitet dämpade den kokaininducerade PKA-aktiveringen troligen genom DARPP-32-fosforyleringen vid Thr-75 (6, 12). Det är också möjligt att en ökning av presynaptisk Cdk5-aktivitet leder till minskad dopaminfrigöring och att detta bidrar till minskad effekt av kokain. Speciellt påverkade en enda injektion av kokain inte nivåerna av p35 och Cdk5 protein såväl som kinasaktiviteten (Fig 3 C och D). Detta står i kontrast till en tidigare studie där kronisk exponering för kokain har visats uppreglera uttrycket p35 och Cdk5 (6).

Fig. 3.  

Uppreglering av Cdk5-aktivitet ökar nivån av fosfor-Thr-75 DARPP-32 och dämpar kokaininducerad PKA-aktivering. (A) Immunoblot som visar ökad fosforylering av DARPP-32 vid Thr-75 (P-D32 Thr-75) i striatalaxtrakt från Tgp35-möss. I .

Uppreglering av Cdk5-aktivitet dämpar kokaininducerad aktivering av ERK1 / 2. Nya bevis tyder på att dopaminreceptoraktivering i striatumet också aktiverar andra signalkaskader, inklusive ERK-vägen (21, 22), som har en viktig roll i beteendemässigt svar på kokain (23). Vi undersökte därför huruvida Cdk5-aktivitet kan påverka den kokaininducerade aktiveringen av ERK-vägen. Aktivering av ERK-vägen observerades efter kokaininjektion i striatala extrakt från mus av vildtyp, vilket framgår av ökad fosforylering av MEK1 / 2 vid Ser-217 och Ser-221 (1.5 ± 0.2-vik över basal nivå) och av ERK1 / 2 vid Thr-202 och Tyr-204 (ERK2-fosforylering: 1.5 ± 0.2-vik över basnivå) (Fig 4 A och B). Den kokaininducerade aktiveringen av MEK1 / 2 (1.2 ± 0.2-vik över basalnivån) och av ERK1 / 2 (ERK2-fosforylering: 1.2 ± 0.2-vik över basalnivån) dämpades emellertid i Tgp35-möss (Fig 4 A och B). Dessutom var de basala nivåerna av fosfor-ERK1 / 2 lägre i Tgp35-möss (0.8 ± 0.2-vik under värdet av vildtypsmus), medan denna trend inte var statistiskt signifikant. Detta senare resultat kan tillskrivas Cdk5-beroende fosforylering av MEK1 vid Thr-286, vilket resulterar i en minskning av den katalytiska aktiviteten (24). För att bedöma denna möjlighet undersökte vi fosforyleringstillståndet för MEK1 vid Thr-286 och fann att högre nivåer av fosfon-Thr-286 MEK1 var närvarande i striatala extrakt från Tgp35-möss (Fig 4C; 1.3 ± 0.1-vik över värdet av vildtypande möss). Vidare förändrades fosforyleringstillståndet för MEK1 vid Thr-286 inte genom en enda injektion av kokain, i överensstämmelse med konstaterandet att Cdk5-aktivitet inte påverkades av behandlingen (Fig 3D).

Fig. 4.  

Cdk5-medierad hämning av MEK1 / 2 leder till dämpning av kokaininducerad aktivering av ERK1 / 2. Striatala extrakt framställdes från vildtyp (WT) och Tgp35-möss 15 min efter injektion av antingen kokain eller saltlösning och utsattes för immunoblottning .

Förökning av dopamin-signalering till nukleären dämpas genom ökad Cdk5-aktivitet. Kokaininducerad aktivering av multipla signalkaskader som involverar PKA och ERK leder till efterföljande aktivering av transkriptionsfaktorn CREB i kärnan genom dess fosforylering vid Ser-133 (22, 25). För att undersöka huruvida de Cdk5-medierade hämmande effekterna på PKA och ERK-aktiveringskaskader kan konvergera på CREB-fosforylering i kärnan, undersökte vi fosforyleringstillståndet för CREB vid Ser-133 i striatal-extrakt från vildtyps- och Tgp35-möss. Den basala nivån av fosfor-CREB var lägre i Tgp35-möss (0.7 ± 0.1-vikning av värdet av vildtypsmus) (Fig 5). Som svar på injektion av kokain ökades nivån av fosfor-CREB i striatum av vildtypsmus (1.5 ± 0.1-vik över basalnivån), men detta svar på kokain dämpades i Tgp35-möss (1.2 ± 0.1- vik över basalnivån) (Fig 5).

Fig. 5.  

Uppreglering av Cdk5-aktivitet resulterar i minskad fosforylering av CREB vid Ser-133 hos möss med injektion av antingen saltlösning eller kokain. Striatala extrakt framställdes från vildtyp (WT) och Tgp35-möss 30 min efter injektion och utsattes för immunoblottning .

Fosforylering av CREB vid Ser-133 ökar sin transkriptionsaktivitet via ett cAMP-responselement i promotorregionen hos vissa gener, inklusive c-fos-genen (26). Vi undersökte därför induktionen av c-fos i striatum av vildtyp och Tgp35-möss efter kokaininjektion. I vildtypsmus ökade nivån av c-fos mRNA till ett toppvärde (1.8 ± 0.2-vik över basal nivå) 30 min efter injektion av kokain och återvände därefter till basnivå med 120 min efter injektionen (Fig 6 A och B). Nivåerna av c-fos mRNA var dock ≈30% lägre i Tgp35-möss än i vildtypss möss tills 30 min efter injektionen (Fig 6 A och B). Den mindre induceringen av c-fos i Tgp35-möss bekräftades ytterligare genom immunhistokemi (Fig 6 C-F). Kokainadministration ökade c-fosimmunoreaktiviteten, starkt i striatumens dorsomedial-dorsocentrala delar och svagt i sidodelarna, både i vildtyp och Tgp35-möss. Den kokaininducerade ökningen i antal c-fosimmunopositiva celler dämpades emellertid märkbart i striatumet av Tgp35-möss (Fig 6G). Tillsammans indikerade dessa resultat att kokainmedierad förstärkning av striataldopamin-signalering till kärnan hämmades i Tgp35-möss, ett sannolikt resultat av ökad Cdk5-aktivitet.

Fig. 6.  

Uppreglering av Cdk5-aktivitet resulterar i en minskning av striatal c-fos-expression och dess mindre induktion efter kokainadministration. (A) Northern blot som visar tiden för c-fos-induktion i vildtyp (WT) och Tgp35 (Tg) möss efter kokaininjektion. .

Diskussion

Cdk5 och dess aktivator p35 har identifierats som målgener som uppregleras av kronisk exponering för kokain (6). Vi rapporterar här bevis på att ökad Cdk5-aktivitet, som en följd av p35 uppreglering snarare än Cdk5 uppreglering, leder till dämpning av kokainmedierad dopamin-signalering i striatala neuroner. För att undersöka konsekvenserna av det uppreglerade uttrycket av antingen Cdk5 eller p35 på striatal dopamin-signalering analyserades två transgena muslinjer, TgCdk5 och Tgp35-möss. Vi fann att Cdk5-aktiviteten var uppreglerad i proportion till en ökad nivå av p35-protein men påverkades inte av en ökad nivå av Cdk5-protein. Vår tidigare rapport har också visat att Cdk5-aktivitet i TgCdk5-hjärnan var lägre än i vildtypsmushjärnan när aktiviteten uppmättes med användning av Cdk5-immunprecipitater (17), vilket tyder på att Cdk5-överuttryck resulterar i en ökad nivå av monomer Cdk5 om p35-nivån ej ökas. Dessa resultat indikerade att nivån av p35-protein är en hastighetsbegränsande faktor för Cdk5-aktivitet.

Tgp35-möss uppvisade en mindre induktion av både CREB-fosforylering och c-fos i striatum efter akut injektion av kokain, vilket tyder på att striatal responsen på kokain hämmades av ökad Cdk5-aktivitet. Dämpningen av kokainmedierad dopamin-signalering i Tgp35-möss uppnåddes sannolikt genom Cdk5-medierad inhibering av multipla signalkaskader som involverar DARPP-32, PKA och ERK. Kokainadministration ökade PKA-fosforylering av DARPP-32 vid Thr-34 hos vildtypss möss, medan detta svar dämpades i Tgp35-möss. PKA-fosforylering av DARPP-32 vid Thr-34 har visats hämma aktiviteten av proteinfosfatas 1 (PP1), enzymet som är ansvarigt för defosforyleringen av Ser-133 av CREB (27). Således skulle PP1-aktivitet inte antagoniseras via DARPP-32 / PP1-vägen i Tgp35-möss.

Kokaininducerad aktivering av ERK1 / 2 dämpades också i Tgp35-möss. Det finns flera distinkta mekanismer genom vilka Cdk5 kan hämma den kokaininducerade aktiveringen av ERK1 / 2. För det första kan Cdk5-beroende fosforylering av DARPP-32 vid Thr-75 hämma PKA, vilket leder till efterföljande inhibition av vilken PKA-medierad MEK1 / 2-aktivering som krävs för ERK1 / 2-aktivering. En nyligen genomförd studie har också funnit att fosforylering av DARPP-32 vid Thr-34 är nödvändig för kokainmedierad aktivering av ERK1 / 2 genom multipla vägar som involverar indirekt reglering av MEK-aktivering samt involvering av reglering av striatalberikat fosfatas, en tyrosin fosfatas som verkar direkt på ERK1 / 2 (28). Stöd för denna möjlighet föreslås av upptäckten att kokaininducerad fosforylering av MEK1 / 2 vid Ser-217 och Ser-221 avskaffades i Tgp35-möss. En annan sannolik väg är via Cdk5-beroende fosforylering av MEK1 vid Thr-286, vilket skulle resultera i en minskning av dess katalytiska aktivitet och leda till inhibering av ERK1 / 2-aktivitet (24).

Inhibering av Cdk5-aktivitet i striatum har visat sig förstärka beteendeeffekter av kronisk kokainbehandling hos djur (6). I överensstämmelse med hypotesen att uppreglering av Cdk5-aktivitet kan bidra till neuronal anpassning för att motverka effekterna av upprepad kokainadministration (6) fann vi att Cdk5-medierad fosforylering av DARPP-32 och MEK1 bidrog till dämpningen av kokaininducerad aktivering av ERK1 / 2, vilket resulterade i mindre induktion av CREB-fosforylering och c-fos i striatumet. Våra funn stöder tanken att ökad Cdk5 aktivitet, som en följd av p35 uppreglering, kan förändra genuttryck i striatum efter kronisk exponering för kokain. Detta kan inträffa genom förändringar i aktiviteterna för transkriptionsfaktorer som CREB och c-fos. Således kan Cdk5-aktivatorn p35, på grund av dess hastighetsbegränsande effekter på Cdk5-aktivitet, bidra till långvariga förändringar i neuronfunktionen som ligger bakom kokainberoende.

Erkännanden

Vi tackar Drs. Mary Jo Danton, Philip Grant och Sashi Kesavapany för kritisk läsning av manuskriptet. Detta arbete stöddes av National Institute of Health Grant Z01DE00664-05 (till ABK), US Public Health Service Grant DA10044, och bidrag från Simons Foundation, Peter J. Sharp Foundation och Picower Foundation (till PG).

Anmärkningar

Förkortningar: Cdk5, cyklinberoende kinas 5; ERK, extracellulärt signalreglerat kinas; DARPP-32, dopamin och cAMP-reglerat fosfoprotein, molekylvikt 32 kDa; PKA, cAMP-beroende kinas; MEK, ERK-kinas; CREB, cAMP-responselementbindande protein.

referenser

1. Hope, B., Kosofsky, B., Hyman, SE & Nestler, EJ (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5764-5768. [PMC gratis artikel] [PubMed]
2. Nestler, EJ, Hope, BT & Widnell, KL (1993) Neuron 11, 995-1006. [PubMed]
3. Hope, BT, Nye, HE, Kelz, MB, Self, DW, Iadarola, MJ, Nakabeppu, Y., Duman, RS & Nestler, EJ (1994) Neuron 13, 1235-1244. [PubMed]
4. Kelz, MB, Chen, J., Carlezon, WA, Jr., Whisler, K., Gilden, L., Beckmann, AM, Steffen, C., Zhang, YJ, Marotti, L., Self, DW, et al. (1999) Nature 401, 272-276. [PubMed]
5. McClung, CA & Nestler, EJ (2003) Nat. Neurosci. 6, 1208-1215. [PubMed]
6. Bibb, JA, Chen, J., Taylor, JR, Svenningsson, P., Nishi, A., Snyder, GL, Yan, Z., Sagawa, ZK, Ouimet, CC, Nairn, AC, et al. (2001) Nature 410, 376-380. [PubMed]
7. Chen, J., Zhang, Y., Kelz, MB, Steffen, C., Ang, ES, Zeng, L. & Nestler, EJ (2000) J. Neurosci. 20, 8965-8971. [PubMed]
8. Dhavan, R. & Tsai, LH (2001) Nat. Pastor Mol. Cell. Biol. 2, 749-759. [PubMed]
9. Ohshima, T., Ward, JM, Huh, CG, Longenecker, G., Veeranna, Pant, HC, Brady, RO, Martin, LJ & Kulkarni, AB (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 11173-11178. [PMC gratis artikel] [PubMed]
10. Chae, T., Kwon, YT, Bronson, R., Dikkes, P., Li, E. & Tsai, LH (1997) Neuron 18, 29-42. [PubMed]
11. Chergui, K., Svenningsson, P. & Greengard, P. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 2191-2196. [PMC gratis artikel] [PubMed]
12. Bibb, JA, Snyder, GL, Nishi, A., Yan, Z., Meijer, L., Fienberg, AA, Tsai, LH, Kwon, YT, Girault, JA, Czernik, AJ, et al. (1999) Nature 402, 669-671. [PubMed]
13. Snyder, GL, Girault, JA, Chen, JY, Czernik, AJ, Kebabian, JW, Nathanson, JA & Greengard, P. (1992) J. Neurosci. 12, 3071-3083. [PubMed]
14. Young, ST, Porrino, LJ & Iadarola, MJ (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 1291-1295. [PMC gratis artikel] [PubMed]
15. Ohshima, T., Kozak, CA, Nagle, JW, Pant, HC, Brady, RO & Kulkarni, AB (1996) Genomics 35, 372-375. [PubMed]
16. Ohshima, T., Ogawa, M., Veeranna, Hirasawa, M., Longenecker, G., Ishiguro, K., Pant, HC, Brady, RO, Kulkarni, AB & Mikoshiba, K. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 2764-2769. [PMC gratis artikel] [PubMed]
17. Tanaka, T., Veeranna, Ohshima, T., Rajan, P., Amin, ND, Cho, A., Sreenath, T., Pant, HC, Brady, RO & Kulkarni, AB (2001) J. Neurosci . 21, 550-558. [PubMed]
18. Takahashi, S., Saito, T., Hisanaga, S., Pant, HC & Kulkarni, AB (2003) J. Biol. Chem. 278, 10506-10515. [PubMed]
19. Grimm, C., Wenzel, A., Hafezi, F. & Reme, CE (2000) Mol. Vis. 6, 252-260. [PubMed]
20. Nairn, AC, Svenningsson, P., Nishi, A., Fisone, G., Girault, JA & Greengard, P. (2004) Neuropharmacology 47, 14-23. [PubMed]
21. Nestler, EJ (2001) Nat. Rev. Neurosci. 2, 119-128. [PubMed]
22. Zanassi, P., Paolillo, M., Feliciello, A., Avvedimento, EV, Gallo, V. & Schinelli, S. (2001) J. Biol. Chem. 276, 11487-11495. [PubMed]
23. Valjent, E., Corvol, JC, Pages, C., Besson, MJ, Maldonado, R. & Caboche, J. (2000) J. Neurosci. 20, 8701-8709. [PubMed]
24. Sharma, P., Veeranna, Sharma, M., Amin, ND, Sihag, RK, Grant, P., Ahn, N., Kulkarni, AB & Pant, HC (2002) J. Biol. Chem. 277, 528-534. [PubMed]
25. Hyman, SE, Cole, RL, Konradi, C. & Kosofsky, BE (1995) Chem. Känslor 20, 257-260. [PubMed]
26. Dash, PK, Karl, KA, Colicos, MA, Prywes, R. & Kandel, ER (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 5061-5065. [PMC gratis artikel] [PubMed]
27. Greengard, P., Allen, PB & Nairn, AC (1999) Neuron 23, 435-447. [PubMed]
28. Valjent, E., Pascoli, V., Svenningsson, P., Paul, S., Enslen, H., Corvol, JC, Stipanovich, A., Caboche, J., Lombroso, P., Nairn, AC, et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103, 491-496.