Periadolescenta möss visar förbättrad ΔFosB Upregulation som svar på kokain och amfetamin (2002)

J Neurosci. 2002 Nov 1;22(21):9155-9.
 

källa

Nathan Kline Institute, Orangeburg, New York, 10962, USA. [e-postskyddad]

Abstrakt

Barn och ungdomar utsätts alltmer för psykostimulanter, antingen olagligt eller för behandling av vanliga neuropsykiatriska tillstånd, såsom uppmärksamhetsbriststörning med och utan hyperaktivitet. Trots den omfattande användningen av psykomotoriska stimulanser i yngre åldersgrupper är lite känt angående de kroniska molekylära neuroadaptiva svaren på dessa medel i den omogna hjärnan. Här visar vi att efter kronisk administrering av psykostimulantia kokain och amfetamin, transkriptionsfaktorn DeltaFosB är uppreglerade i kärnan accumbens av periadolescent möss men inte i efterväxling eller vuxen möss. Induktion av DeltaFosB förekommer också uteslutande i caudate putamen av periadolescent möss efter amfetamin administrering. Dessa resultat visar den unika plasticiteten i den ungdomliga hjärnan hos en kritisk molekyl som reglerar psykostimulerande verkan och föreslår att dessa neuroadaptiva förändringar kan vara involverade i förmedling av förbättrad beroendeframkallande tendenser hos ungdomar i förhållande till vuxen.

Beskrivning

Psykostimulerande medel används vid behandling av vanliga barndomsstörningar, såsom uppmärksamhetsbrist hyperaktivitetsstörning. Dessutom är missbruk av stimulantia, inklusive amfetamin och kokain, vanligt bland ungdomar, en ålder där det finns bevis för ökad beroendeframkallande relationer till vuxna (Estroff et al., 1989; Myers och Anderson, 1991). Trots data som indikerar utvecklingsreglerat beteendeeffekter är lite känt angående de molekylära neuroadaptiva svaren i den omogna hjärnan som uppträder under administreringstiden av dessa medel. Kokain och amfetamin kan påverka långvariga beteendeförändringar delvis via stimulering av dopamin D1receptorer och ökning av nivåer av transkriptionsfaktorer, inklusive ΔFosB, i dorsalstriatumet (dvs caudat putamen) och ventralstriatumet (dvsChen et al., 1997). Ökningar i nivåer av ΔFosB, kanske via stabilisering av proteinprodukter, upprätthålls i flera veckor efter kronisk exponering för kokain eller amfetamin och regleras åtminstone delvis av dopamin-signaltransduktionsvägen (Chen et al., 1997; Nestler et al., 2001).

Det centrala dopaminergsystemet hos unga djur är mycket i flöde som ett resultat av de förändrade nivåerna av kritiska molekyler under normal utveckling, inklusive dopamin D1receptor DARPP-32 (dopamin och cAMP-reglerat fosfoprotein; Mr av 32 kDa) och cAMP (Ehrlich et al., 1990;Teicher et al., 1993; Perrone-Capano et al., 1996; Tarazi et al., 1999;Andersen, 2002). Exponering under denna period för psykostimulanter, som förbättrar dopaminerg neurotransmission, kan därför resultera i kvantitativt och / eller kvalitativt olika molekylära svar, inkluderande förändringar i ΔFosB-uttryck. För att testa hypotesen att det finns åldersberoende neuroadaptiva responser vid kronisk exponering för psykostimulanter, analyserades tre grupper av möss i seriella experiment: vuxna (60 d gammal vid injektionsstart), periadolös (33 d gammal vid inledande av injektioner), och post-weanling (24 d gammal vid injektionsstart). Detta är den första direkta jämförelsen mellan molekylära neuroadaptiva svar på kronisk psykostimulant exponering i dessa tre åldersgrupper. Vi fann att efter identiska behandlingsparadigmer visar periadolescenta möss förbättrad FosB-uppreglering som svar på både kokain och amfetamin.

MATERIAL OCH METODER

Djur och läkemedelsadministration. Manliga CD-1-möss (Charles River Laboratories, Kingston, NY) hölls på en 12 hr ljus / mörk cykel (6: 00 AM till 6: 00 PM) med AD libitumtillgång till mat och vatten. Djur fick ta emot djurrummet för minst 10 d före initiering av injektioner. Djur hanterades av två utredare som utförde alla injektioner i samma rum där djuren hölls. Alla djur avvänjdes vid 21 d i åldern. Injektioner började vid 24 (post-weanling), 33 (periadolescent) eller 60 (vuxen) d av ålder. Djur fick 20 mg / kg kokain (Sigma, St. Louis, MO), 5 mg / kg amfetamin (Sigma) eller en lika stor mängd saltlösning intraperitonealt mellan 4: 00 och 5: 00 PM dagligen för 7 d. Djur dödades genom avkapning efter kort exponering för CO2 vid 10: 00 AM dagen efter den slutliga injektionen. Hjärnor avlägsnades omedelbart från skallen, och de caudata putamen och nucleus accumbens dissocierades snabbt på is. Alla dissektioner utfördes från koronala hjärnskivor av en enda undersökare, och proteinekstrakter framställdes från färsk vävnad utan frysning. Alla djurprocesser godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee och var i överensstämmelse med National Institute of Health Guide till vård och användning av laboratoriedjur.

Western blot-analys. För Western blot-analyser laddades lika stora mängder protein (40 μg för caudat putamen och 20 μg för kärnaccumulatorer) från varje prov i varje bana av en 10% SDS-polyakrylamidgel efter mätning av proteinkoncentrationer med BCA-analysen (Pierce, Rockford, IL). Lika proteinladdning verifierades också genom visualisering av totalt protein med Ponceau Red efter överföring till nitrocellulosa och / eller blotting med anti-aktin antikropp (1: 500; Sigma). Fos-relaterat antigen (FRA) antiserum, som känner igen AFosB-isoformema, tillhandahölls generöst av Dr. M. Iadarola (National Institutes of Health, Bethesda, MD) och användes i en koncentration av 1: 4000. Tidigare studier (Chen et al., 1997; Hiroi et al., 1997), inklusive preadsorption av FRA-antiserumet med M-peptidimmunogenet, påvisade specificiteten hos detta antiserum. Den monoklonala antikroppen DARPP-32 5a, som användes vid 1: 10,000, tillhandahölls generöst av Drs. Hugh Hemmings och Paul Greengard (The Rockefeller University, New York, NY). Dopamintransportörens (DAT) antikropp var från Chemicon (Temecula, CA). Blottar reagerades med NEN-DuPont (Boston, MA) kemiluminescenssystem och utsattes för film. Densitometriska värden för ΔFosB immunreaktivitet erhölls med användning av ScanAnalysis för Apple (Biosoft, Ferguson, MO). Statistisk signifikans bestämdes med en envägs ANOVA följt av post hoc Tukeys multipeljämförelsetest eller en oparad, tvåsidig student t test som anges i figurerna. För läkemedelsbehandlingsexperimenten utfördes analys av varje åldersgrupp på en separat blöt, varför varje saltlösningsgrupp godtyckligt tilldelades ett 100% -värde för jämförelse mellan åldersgrupper. För de ontogena studierna analyserades prover från alla åldersgrupper tillsammans på en enda blot.

RESULTAT

Induktion av ΔFosB efter kokain och amfetamin inträffar i kärnan accumbens av endast periadolescent möss

Expressionen av ΔFosB uppmättes i kärnans accumbens och caudate putamen av post-weanling, periadolescent och vuxna möss efter 7 d för amfetamin eller kokainadministration. Kärnan accumbens är hjärnregionen trodde vara mest kritisk för att förmedla de givande effekterna av psykostimulanter. ΔFosB immunreaktivitet (35 kDa) inducerades selektivt i nukleär accumbens hos periadoljande djur efter kronisk administrering av amfetamin (Fig. 1 A) eller kokain (Fig. 1 B). I motsats härtill förändrades nivåerna av ΔFosB (35 kDa) inte signifikant i kärnan accumbens av post-weanling eller vuxna djur (Fig.1 A,B). I de caudata putamena var ΔFosB-nivåerna (35 kDa) också signifikant uppreglerad efter kronisk amphetaminadministration endast hos periadoljande djur (Fig.2 A). Samtliga tre åldersgrupper visade signifikanta ökningar i ΔFosB (35 kDa) -uttryck i de caudata putamen efter kronisk administrering av kokain (Fig.2 B). Storleken på induktion var dock störst hos periadolescerande djur, särskilt jämfört med post-weanlings (Fig. 2 B). Andra FRA- och Fos-isoformer var oförändrade i alla åldersgrupper (data ej visade).

Fig. 1.

ΔFosB immunreaktivitet i kärnan accumbens efter kronisk psykostimulant administrering. CD-1-möss injicerades en gång dagligen med saltlösning, amfetamin eller kokain för 7 d som började på dag 24 (P24; post-weanling), dag 33 (P33; periadolescent) eller dag 60 (Vuxen). Nivåer av ΔFosB (35 kDa) immunreaktivitet i nukleinsymbolerna visas efter kronisk amphetamin (A) eller kokain (B) administrering. Representativa immunoblottar från saltlösning- (S), amfetamin- (A) och kokain- (C) injicerad post-weanling (P24), periadolescent (P33) och vuxna möss visas i topppaneler. Bottenpaneler visa medelvärdet ± SEM procentandel av basalt ΔFosB-uttryck. n värden för varje grupp visas i barer. Signifikanta ökningar av ΔFosB hittades i nukleär accumbens av endast periadoljansmössen. *p <0.05; **p <0.01 (studentens t testa; saltlösning mot läkemedel).

Fig. 2.

ΔFosB immunreaktivitet i caudat putamen efter kronisk psykostimulant administrering. CD-1-möss injicerades en gång dagligen med saltlösning, amfetamin eller kokain för 7 d som började på dag 24 (P24; post-weanling), dag 33 (P33; periadolescent) eller dag 60 (Vuxen). Nivåer av ΔFosB (35 kDa) immunreaktivitet i caudat putamen visas efter kronisk amphetamin (A) eller kokain (B) administrering. Representativa immunoblottar från saltlösning- (S), amfetamin- (A) och kokain- (C) injicerade periadolescenta möss (P33) visas itopppaneler. Bottenpaneler visa medelvärdet ± SEM procentandel av basalt ΔFosB-uttryck. n värden för varje grupp visas i barer. Signifikanta amfetamininducerade ökningar i FFB-immunoreaktivitet hittades i caudat-putamen av endast periadolescenta möss (A). Kronisk kokainadministration gav ökningar i ΔFosB i alla tre åldersgrupper (B). *p <0.05; **p <0.01 (studentens t testa; saltlösning mot läkemedel).

DAT- och DARPP-32-nivåerna förändras inte efter kronisk kokain eller amfetamin

Flera nyckelmolekyler uttryckta av dopaminerga och / eller dopaminceptiva neuroner, inklusive DARPP-32, D1 dopaminreceptor och DAT, bidrar till akuta och kroniska reaktioner på psykostimulanter (Moratalla et al., 1996; Fienberg et al., 1998; Sora et al., 1998; Gainetdinov et al., 2001). Data från DARPP-32, D1 receptor och DAT-null och DAT-knock-down-möss indikerar ett komplicerat förhållande mellan deras nivåer, regleringen av dopaminergaktivitet och svar på psykostimulerande medel. Faktum är att ΔFosB induktion inte uppträder i DARPP-32 null-möss som tar emot kronisk kokain (Fienberg et al., 1998). Hos vuxna möss förändrar dock 7 d-exponeringen för 20 mg / kg kokain inte totala nivåer av DARPP-32 (Fienberg et al., 1998). DAT-proteinreglering har inte tidigare rapporterats hos möss som exponeras kroniskt för psykostimulanter, även om förändringar i radioligandbindning till dopamintransportören efter exponering för psykostimulanter har rapporterats hos vissa arter (Letchworth et al., 2001). Här mättes nivåerna av DARPP-32 och DAT-protein för att bestämma huruvida uttrycket av dessa proteiner förändras efter kronisk psykostimulant administrering i någon av de tre åldren av möss. Våra resultat visar att det inte fanns några signifikanta förändringar i nivåerna av totalt DARPP-32 eller DAT i hela caudat putamen eller kärnan accumbens efter kronisk administrering av antingen kokain eller amfetamin i någon av de tre åldersgrupperna (tabell 1).

Tabell 1.

Relativa densitometriska värden för DARPP-32 och DAT i amfetamin- och kokainbehandlade P24-, P33- och vuxna möss i förhållande till kontroll, salinvärden, godtyckligt inställda till 100%

Baslinjenivåerna av ΔFosB är utvecklingsreglerade

Vi undersökte ontogenen av ΔFosB eftersom vuxna möss med genetiskt konstruerat ökat uttryck av ΔFosB i striatumet har ett ökat beteenderespons mot psykostimulanter (Kelz et al., 1999). Vi fann att basnivåerna av ΔFosB var signifikant lägre hos yngre djur jämfört med vuxna i både caudat putamen och nucleus accumbens (Fig.3 A). Nivåer av funktionella markörer för dopaminsystemet, inklusive DARPP-32 (Ehrlich et al., 1990), DAT (Perrone-Capano et al., 1996) och dopaminreceptorer (Teicher et al., 1993; Tarazi et al., 1999) är också utvecklingsreglerat. Tidigare rapporter i CD-1-möss indikerar en topp i striatal DARPP-32 vid postnatal dag 28 (P28) (Ehrlich et al., 1990). I råtta caudate putamen och nucleus accumbens, D1receptornivåer topp från P28 till P40 (Teicher et al., 1993; Tarazi et al., 1999), men liknande studier har inte utförts i musen. Däremot fann vi att DAT-proteinnivåerna i caudat putamen och kärnan accumbens var konstanta mellan postnatal dag 24 och vuxenlivet (Fig. 3 B). Sålunda är de relativa förhållandena mellan D1 receptorer, DAT, DARPP-32 och ΔFosB skiljer sig mellan åldersgrupper, vilket potentiellt leder till skillnader i D1 receptoraktivitet som kan påverka graden av ΔFosB induktion.

Fig. 3.

Utvecklingsuttryck av ΔFosB och DAT. A, ΔFosB (35-37 kDa) immunreaktivitet i caudat putamen och kärnan accumbens av naiva CD-1 möss som en funktion av ålder. Representativa immunoblott visas i topppaneler.Bottenpaneler visa medel ± SEM av tre möss per grupp. *p <0.05, vuxen kontra P24; #p <0.05, vuxen mot P36 (Tukeys multipeltjämförelsetest efter ANOVA). B, Densitometriska värden för DAT-immunreaktivitet i caudat putamen och kärnan accumbens för naiva CD-1-möss som en funktion av ålder. DAT-nivåer skilde sig inte mellan de tre åldersgrupperna.

DISKUSSION

Beteendeeffekter av psykomotoriska stimulanser är åldersberoende. Vanedannande tendenser är störst i ungdomar när användningen av olagliga ämnen eskalerar (Estroff et al., 1989; Myers och Anderson, 1991). Faktum är att yngre barn ofta blir dysforiska när de utsätts för psykostimulanta medel, medan tonåringar och vuxna upplever eufori (Rapoport et al., 1980). I gnagaremodeller föreslår vissa studier att periadoljande djur har högre basnivåer av aktivitet (Spjut och broms, 1983) och förändrade svar på psykostimulanter i förhållande till yngre och äldre djur. De visar sålunda mindre lokomotorisk stimulans och nyhet som söker som svar på akut administrering av låga doser av psykostimulantia i förhållande till weanling och vuxna djur men ökad hyperaktivitet efter högdosbehandling. Med kronisk administrering är sensibilisering mot kokaininducerad rörelse större hos periadolescenta råttor jämfört med vuxna, medan sensibilisering för stereotypi är lägre. Mikrodialysdata har också avslöjat skillnader mellan periadolescenta och vuxna råttor med avseende på sensibilisering mot amfetamininducerad dopaminfrisättning (Laviola et al., 1995; Adriani et al., 1998; Adriani och Laviola, 2000;Laviola et al., 2001). Det finns emellertid motstridiga studier om långsiktig reaktivitet mot kokain efter administrering av metylfenidat hos ungdomarBrandon et al., 2001; Andersen et al., 2002). Dessa senare två rapporter lyfter fram svårigheten att jämföra studier när olika experimentella paradigmer används. Försök att jämföra beteendestudier hos yngre djur är ytterligare förknippade med användning av olika arter och stammar.

Musen blir en allt viktigare djurmodell i studien av användning och missbruk av psykostimulanter, och detta är den första systematiska analysen av molekylära neuroadaptiva svar i tre olika utvecklingsålder hos mus eller någon annan enskild art. Tidigare studier från vilka vi härledde våra behandlingsparadigmer har visat en ökning av ΔFosB i den isolerade dorsala och ventralstriatumen av vuxna råttor av vild typ efter kronisk kokain- och amfetaminadministration (Hopp et al., 1994; Nye et al., 1995; Turgeon et al., 1997) men endast i den kombinerade dorsala och ventralstriatumen eller isolerad dorsalstriatum av vuxna möss av vildtyp efter kronisk kokain (Fienberg et al., 1998; Zachariou et al., 2001).

Vi visar nu en rumslig och kvantitativ skillnad i psykostimuleringsinducerad ΔFosB i post-weanling, periadolescent och adult möss. Observationen av ett ökat respons hos de periadoljande djuren jämfört med vuxna och post-weanlings förstärks av det faktum att svaret är liknande hos kokain- och amfetaminbehandlade möss. Psykostimulanterna kokain och amfetamin ökar både synaptisk dopamin, liksom serotonin och noradrenalin, men genom olika mekanismer. Kokain binds till plasmalemtransportörerna för dopamin, serotonin och norepinefrin och hämmar deras återupptagning i presynaptiska terminaler. I motsats till detta främjar amfetamin frigörandet av dessa sändare. Den selektiva induceringen av ΔFosB i kärnan accumbens av endast periadolescent åldersgruppen efter 7 d för stimulant administrering och den relativt ökade induktionen avAFF i B i caudat putamen kan vara en neurobiologisk representation eller orsak till den tidigare noterade ökade tendensen att missbruka psykostimulanter i detta åldersgrupp (Estroff et al., 1989; Myers och Anderson, 1991) och andra långsiktiga förändringar i genuttryck som skiljer sig mellan åldersgrupper (Andersen et al., 2002). Dessutom kan dessa skillnader regleras i grunden av utvecklingsändringar i nivåer av nyckelmolekyler, inklusive själva FFB. De potentiella konsekvenserna av skillnader i basnivåerna av ΔFosB mellan åldersgrupper är analog med den som föreslagits avseende skillnader mellan råttstammar (Haile et al., 2001). Faktum är att vi förväntar oss att liknande stamskillnader kommer att hittas bland inavlade möss. Det är också möjligt att möss av olika åldrar kommer att visa olika molekylära anpassningar i andra delar av hjärnan än kärnan accumbens. Ytterligare analys med användning av periadolescenta möss med genetiskt manipulerade förändringar i nivåer av nyckelmolekyler och samtidiga beteendeobservationer kommer ytterligare att testa dessa hypoteser.

fotnoter

    • Mottagna April 8, 2002.
    • Revision mottagen Augusti 6, 2002.
    • Godkända Augusti 8, 2002.
  • Detta arbete stöddes av National Institute of Health / National Institute of Neurological Disorders och Stroke Grant NS41871 (MEE och EMU) och National Institute on Drug Abuse Grant P30-DA13429 (EMU).

  • Korrespondens bör adresseras till Dr Michelle E. Eichlich, Thomas Jefferson University, Curtis 310, 1025 Walnut Street, Philadelphia, PA 19107. E-post: [e-postskyddad].

REFERENSER

Artiklar som citerar denna artikel