PSMC5, ett 19S proteasomalt ATPas, reglerar kokainaktivitet i Nucleus Accumbens (2015)

PLoS One. 2015 May 11; 10 (5): e0126710. doi: 10.1371 / journal.pone.0126710. eCollection 2015.

Ohnishi YH1, Ohnishi YN2, Nakamura T3, Ohno M4, Kennedy PJ5, Yasuyuki O6, Nishi A7, Neve R8, Tsuzuki T.4, Nestler EJ5.

Abstrakt

ΔFosB är en stabil transkriptionsfaktor som ackumuleras i nucleus accumbens (NAc), en viktig del av hjärnans belöningskretsar, som svar på kronisk exponering för kokain eller andra missbrukande droger. Medan ΔFosB är känd för att heterodimerisera med en Jun-familjemedlem för att bilda ett aktivt transkriptionsfaktorkomplex har det hittills inte varit en öppen undersökning av andra möjliga bindningspartners för ΔFosB i hjärnan. Här, med användning av jäst två-hybrid analyser, identifierar vi PSMC5-även känd som SUG1, en ATPase-innehållande underenhet av 19S proteasomal komplex-som ett nytt interagerande protein med ΔFosB. Vi verifierar sådana interaktioner mellan endogent ΔFosB och PSMC5 i NAc och visar att båda proteinerna också bildar komplex med andra kromatinreglerande proteiner associerade med genaktivering. Vi fortsätter med att visa att kronisk kokain ökar kärnkraftsnivåerna men inte cytoplasmatiska i PSMC5 i NAc och att överuttryck av PSMC5 i denna hjärnregion främjar de rörliga reaktionerna på kokain. Tillsammans beskriver dessa fynd en ny mekanism som bidrar till ΔFosB: s handlingar och för första gången implicerar PSMC5 i kokaininducerad molekylär och beteendemässig plasticitet.

Citation: Ohnishi YH, Ohnishi YN, Nakamura T, Ohno M, Kennedy PJ, Yasuyuki O, et al. (2015) PSMC5, ett 19S proteasomalt ATPas, reglerar kokainaktivitet i Nucleus Accumbens. PLOS ONE 10 (5): e0126710. doi: 10.1371 / journal.pone.0126710

Akademisk redaktör: James Edgar McCutcheon, University of Leicester, FÖRENADE KUNGARIKET

Mottagen: December 10, 2014; Accepterad: April 7, 2015; Publicerad: Maj 11, 2015

Upphovsrätt: © 2015 Ohnishi et al. Detta är en öppen åtkomstartikel som distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i vilket medium som helst, förutsatt att den ursprungliga författaren och källan krediteras

Data Tillgänglighet: Alla relevanta uppgifter finns i papperet.

finansiering: Detta arbete stöddes av bidrag från National Institute of Health, National Institute of Drug Abuse, och av Ishibashi Foundation och Japan Society for Promoting Science (KAKENHI-nummer: 24591735, 26290064, 25116010). Fundrarna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera eller förbereda manuskriptet.

Konkurrerande intressen: Författarna har förklarat att inga konkurrerande intressen existerar.

Beskrivning

ΔFosB, en stympad produkt av FosB genen tillhör Fos-familjen av transkriptionsfaktorer, som även innefattar c-Fos, full längd FosB, Fra-1 och Fra-2. ΔFosB, som andra Fos-proteiner, heterodimeriserar med en Jun-familjeprotein-c-Jun, JunB eller JunD-för att bilda ett aktivt AP-1 (aktivator protein-1) transkriptionsfaktorkomplex som inducerar eller undertrycker uttrycket av specifika målgener [1,2].

ΔFosB har visat sig spela en nyckelroll i narkotikamissbruk [2]. Unikt bland Fos-familjeproteiner, ackumuleras det i nukleinsaccumbens (NAc) och andra belöningsrelaterade hjärnområden efter upprepad administrering av läkemedel på grund av sin höga stabilitetsnivå [3,4], som medieras av bristen på C-terminala degrondomäner och genom fosforylering av flera proteinkinaser [5-7]. Sådan induktion av ΔFosB i NAc medierar ökade beteendemässiga svar på missbruksmissbruk. Sålunda ökar överuttryck av ΔFosB i denna hjärnområde av vuxna djur, antingen genom användning av virala vektorer eller inducerbara bitransgena möss, ett djurs känslighet för de lokomotoriska aktiverande och givande effekterna av kokain och opiater, såväl som ett djurs motivation att själv administrera kokain [7-11]. Omvänt orsakar överuttryck av dominanta negativa antagonister av ΔFosB de motsatta beteendefenotyperna [10-12].

Vi och andra har tidigare bekräftat, med hjälp av gelskiftanalyser, att JunD och kanske andra Jun-familjeproteiner är de viktigaste bindande partnerna för ΔFosB i hjärnan in vivo [13-15]. Hittills har det emellertid inte funnits någon öppen utvärdering av ΔFosBs bindande partners i hjärnan. Här försökte vi identifiera nya bindande partners för FFosB med användning av en jäst-två-hybrid-analys [16,17]. Våra data avslöjade att PSMC5, även känd som SUG1, är en robust partner av ΔFosB både in vitro och i NAc in vivo, där den förenar ΔFosB som en del av ett kokaininducerat transkriptionsaktiveringskomplex, som även innehåller CBP (CREB-bindande protein ) och p300-båda histon-acetyltransferaser (HAT) -som såväl som BRG1 (ett kromatinomvandlingsprotein). Vi fortsätter att visa att kronisk exponering för kokain förändrar kärnnivåerna i PSMC5, en ATPaseinnehållande subenhet i 19S proteasomala komplexet, i NAc och att PSMC5 i sin tur styr uppförandesvar mot kokain.

Material och metoder

Jäst två-hybrid screening

MaV203-jästceller (Invitrogen Life Technologies) samtransfekterades med pDBLeu som driver olika fragment av ΔFosB-proteinet och ett hjärnbibliotek i musen subklonades i pPC86 (Invitrogen Life Technologies). Transformerade celler odlades på SC-medium som saknade leucin, tryptofan och histidin och innehållande 10 mM 3-aminotriazol. Bindning mellan FosB-fragment och en kandidatpartner inducerar tre reportergener (His3, Ura3och LacZ), och induktionen gör att transformanter kan överleva under de odlade betingelserna som användes. Positiva kloner testades med färskt pDBLeu-AFosB-fragment genom retransformationsanalyser i MaV203-celler.

Cellinjer

Mus Neuro 2A neuroblastomceller (ATCC) hölls i Eagles minimala essentiella medium (EMEM) (ATCC), kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) vid 37 ° C och 5% CO2. Rat 1A-celler var en present från Yusaku Nakabeppu (Fukuoka, Japan) [18] och upprätthålls i Dulbeccos MEM (DMEM) (Life Technologies), kompletterat med 10% FBS vid 37 ° C och 5% CO2. Transfektion av celler med plasmid-DNA utfördes med användning av Effectene (Qiagen) enligt tillverkarens instruktioner.

PSMC5 och ΔFosB konstruktioner

Flera mutanta former av PSMC5, vardera FLAG-märkta vid deras N-terminus, alstras för användning vid immunprecipitation eller virusmedierade genöverföringsexperiment. Dessa inkluderade: PSMC5-K196M, PSMC5-Eco-coil-domänen (PSMC5-AC, saknar aminosyror 27-68), PSMC5-NT (bestående av det N-terminala fragmentet av proteinet, aminosyrorna 1-151) och PSMC5 -CT (bestående av det C-terminala fragmentet av proteinet, 172-aminosyror) (se Fig 1). Vi utnyttjade också N-terminala MYC-märkta former av vildtyp ΔFosB samt ΔFosB med en mutation i dess leucin-dragkedjedomän (mutation av aminosyrorna 182 till 205 som är känt att utplåna heterodimerisering med Jun-familjeproteiner [6].

miniatyr
Fig 1. ΔFosB binder till PSMC5 in vitro.

 

A. Schematisk av ΔFosB, FFosB-LZM, i vilken leucin-dragkedjedomen är muterad för att utplåna ΔFosB-heterodimerisering med Jun-proteiner och A2AFosB, som saknar de första 78-aminosyrorna i AFosB N-terminalen. B. Schematisk av PSMC5, PSMC5-NT, som innefattar de första 151-aminosyrorna i PSMC5, PSMC5-CT, som saknar de första 235-aminosyrorna i PSMC5 och PSMC5-AC som saknar spolningsdomänen (aminosyror 28-68) . AAA-domänen motsvarar ett motiv, ATPaser associerade med olika cellulära aktiviteter, närvarande i många ATPaser. C. 2.4 μg av pcDNA3.1-ΔFosB (banor 1-4) eller FFB-LZM (lane 5) samtransfekterades med 2.4 μg FLAG-märkt PSMC5 eller olika deletionsmutanter i Neuro2a-celler. Två dagar efter transfektion lyserades celler och utsattes för immunutfällning med en anti-FLAG-antikropp och sedan Western blottades med anti-AFosB eller anti-FLAG-antikropp. Observera att ΔFosB, men inte ΔFosB-LZM, bindar robust till PSMC5 eller PSMC5-NT, men inte PSMC5-CT eller PSMC5 -ΔCC. Data som visas i figuren replikerades i tre exemplar i var och en av tre separata experiment.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g001

djur

Nio till 11-veckobarn C57BL / 6J manliga möss (The Jackson Laboratory) användes för alla experiment. Djur hölls på en 12-h ljusmonk cykel med tillgång till mat och vatten AD libitum och habituated 1 vecka före experiment. Två kokainbehandlingsregimer användes. För att studera de biokemiska effekterna av kokain, gavs djur 7 dagliga doser kokain (20 mg / kg) eller saltlösning och dödades genom avkapning 24 tim efter den sista injektionen. Detta är ett standardprotokoll som har visat sig producera många molekylära och cellulära svar på läkemedlet [7]. För att studera inflytande av PSMC5 i nukleinsymboler på beteendemässiga svar på kokain, använde vi en subtreteldos av läkemedlet (7.5 mg / kg, se Lokomotorisk sensibilisering nedan) baserat på hypotesen att PSMC5 skulle, som ΔFosB, öka ett djurs känslighet för kokain [8]. Alla djurförsök godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee på Mount Sinai.

Immunfällning och Western blotting

Neuro 2A-celler transfekterades med vildtyps- eller mutantformer av PSMC5. Två dagar efter transfektion tvättades cellerna i PBS, lyserades i RIPA-buffert (50 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 0.25% natriumdeoxikolat, 10 mM natriumbutyrat, proteasinhibitorcocktail) . Lysater delades och inkuberades med antingen icke-immun IgG (Sigma) eller anti-FLAG antikroppar (Sigma) för 3 hr vid 4 ° C. Immunfällning utfördes med Protein G-pärlor (Invitrogen) enligt beskrivningen [19]. I korthet utsattes immunprecipiterade proteiner för SDS-PAGE och analyserades genom Western blotting med användning av anti-FosB / AFosB-antikropp (Cell Signaling Technology) baserat på publicerade protokoll [7]. För in vivo proteinbindningsanalyser använde vi renade nukleära fraktioner från stansdissekterade NAc hos möss efter kronisk kokainbehandling (20 mg / kg IP dagligen under 7-dagar, med möss som använde 24-tim efter den senaste injektionen). Co-immunutfällning från nukleära fraktioner utfördes med användning av det kärnkomplexa sam-IP-kit (Active Motif) enligt tillverkarens instruktioner. Följande antikroppar användes: MYC eller ß-actin, Cell Signal Technology (Danvers, MA), PSMC5 och histon H3, Abcam (Cambridge, MA), CBP, p300 och BRG1, Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) och FLAG M2, Sigma.

immunohistokemi

Immunohistokemi utfördes enligt offentliggjorda förfaranden [20]. Mössen bedövades och perfusionerades intrakardiellt med 4% paraformaldehyd i PBS. Hjärnan kryoprotekterades med 30% sackaros och frystes därefter och lagrades vid -80 ° C tills användning. Koronala sektioner (40 μm) skars på en kryostat och behandlades för immunhistokemi. Frittflytande sektioner förinkuberades i en blockeringsbuffert innehållande 0.3% Triton och 3% normalt åsnor-serum. ΔFosB detekterades med användning av en getpolyklonal antikropp höjd mot den N-terminala delen av proteinet (1 / 1000 Santa Cruz Biotechnology). PSMC5 detekterades med användning av en kaninkolyklonal antikropp (1 / 100 Abcam, Cambridge, MA). Bilder togs med ett konfokalt mikroskop (60x förstoring, Zeiss).

Lokomotorisk sensibilisering

Alla möss fick dagliga IP-injiceringar av saltlösning under 3-dagar för att ge dem till spänningen i injektionerna. Nästa dag injicerades möss med saltlösning eller en subthresholddos av kokain (7.5 mg / kg, se under Djur ovan) och placerades omedelbart i nya lokomotoriska lådor. Lokomotoriska aktiviteten hos mössen registrerades med användning av ett fotobjemsystem som ambulatorisk strålbrytare för 30 min. Dessa behandlingar upprepades dagligen under 3-dagar.

Viral-medierad genöverföring

Vi använde i stor utsträckning publicerade metoder för viral-medierad genöverföring [7,8,11,19]. I korthet subklonades expressionsplasmider för PSMC5 eller för flera av dess mutanter (se PSMC5 och ΔFosB-konstruktioner ovan) i den bicistroniska p1005 (+) HSV-plasmiduttryckande GFP under kontroll av CMV-promotorn och PSMC5 eller dess mutanter under den för IE4 / 5-promotorn. Under ketamin (100 mg / kg) / xylazin (10 mg / kg) anestesi, möss placerades i ett stereotaxiskt instrument med liten djur och kranytan exponeras. Trettiotre gauge-sprutnålar användes för att bilateralt infiltrera 0.5 / il av en HSV-vektor i NAc vid en 10 ^ l / min vid en 1.6 ° -vinkel (AP + 1.5; ML + 4.4; DV-0.1). Djur som fick HSV-injektioner fick återhämta sig under 2 dagar efter operation före experiment.

Statistik

ANOVA och studentens t-test användes, korrigerade för flera jämförelser, med betydelse inställd på p <0.05.

Resultat

PSMC5: ny bindande partner av ΔFosB

Vi utförde preliminära experiment för att identifiera ett lämpligt fragment av ΔFosB som fungerade som bete i en jäst-tvåhybridanalys utan att automatiskt aktivera systemet. Holo-ΔFosB-inducerad reportergenaktivitet i sig, liksom det N-terminala 1-78-aminosyrafragmentet av proteinet. En N-terminal trunkerad ΔFosB (Fig 1A), betecknad Δ2ΔFosB, som saknar de första 78-aminosyrorna i proteinet, hade inte denna effekt. Därför använde vi Δ2ΔFosB som betetprotein.

För att söka efter potentiella bindande partners använde vi ett hjärnbibliotek med subklon i pPC86. Vi identifierade 11-kandidater för bindande partners. Fastän dessa proteiner inkluderade ΔFosB: s kända heterodimeriseringspartner, c-Jun och JunD (Tabell 1) var den mest framträdande kandidaten överlägset PSMC5. Det var överraskande att det här var ett intressant upptäckt, eftersom PSMC5 visades i en enda rapport för år sedan att binda till c-Fos in vitro [21]. Det finns dock inga tidigare rapporter om PSMC5-deltagande i kokainåtgärder. På grund av styrkan hos PSMC5-signalen i jäst-tvåhybridanalysen, bestämde vi oss emellertid för att ytterligare studera möjliga ΔFosB-PSMC5-interaktioner.

miniatyr
Tabell 1. Resultat av jäst två-hybrid screening med Δ2AFosB.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.t001

Först för att bekräfta den fysiska interaktionen mellan ΔFosB och PSMC5 utförde vi in-vitro-samprecipitationsprov. Vi fann att FLAG-märkta PSMC5 (Fig 1B), transfekterad i Neuro 2A-celler, drog effektivt ned ΔFosB (Fig 1C). För det andra, för att identifiera regionen i PSMC5 som är ansvarig för dess bindning till ΔFosB genererade vi flera FLAG-märkta PSMC5-mutanter (Fig 1B) och upprepade samimmunutfällningsexperimentet. ΔFosB drogs effektivt ner med de N-terminala 151-aminosyrorna i PSMC5 (PSMC5-NT), men inte med det C-terminala 172-aminosyrafragmentet av proteinet (PSMC5-CT) (Fig 1C). PSMC5 saknade dess coiled-spolen domän (PSMC5 -ΔCC) var också ineffektiv vid utfällning avFosB. Dessa resultat tyder på att PSMC5 binder ΔFosB via sin coiled-coil-domän (aminosyrorna 27-68). Vidare fällde FLAG-märkt PSMC5 inte en mutant form avFosB med en muterad leucin-dragkedjedomän (AFosB-LZM) (Fig 1C), vilket indikerar att ΔFosB binder antingen PSMC5 genom denna domän eller, mer sannolikt, att ΔFosB heterodimerisering krävs för PSMC5-bindning.

PSMC5-AFosB-bindning i NAc efter kronisk kokainadministration

Baserat på dessa fynd in vitro studerade vi huruvida PSMC5-nivåerna i NAc förändras som svar på kronisk kokainadministration. Vi hittade genom subcellulär fraktionering och Western blotting att kronisk kokain ökar kärnnivåerna av PSMC5 i denna hjärnregion utan förändring i cytoplasmiska nivåer (Fig 2A). Denna effekt observerades inte efter enstaka doser kokain (data ej visad). Vi undersökte därefter lokaliseringen av PSMC5 och ΔFosB i NAc genom konfokal immunofluorescensmikroskopi. Vi analyserade möss 24 tim efter den senaste upprepade dosen kokain, en tidpunkt då ΔFosB är den enda detekterbara FosB genprodukt (se Nestler 2008). Vi fann stark PSMC5 immunreaktivitet i NAc, inklusive en stark kärnsignal. ~ 85% av ΔFosB + -kärnor samfärgade för PSMC5 (Fig 2B). Dessutom utförde vi co-immunprecipitationsexperiment på NAc-extrakt och fann att, efter kronisk kokainbehandling, ΔFosB drogs effektivt ned av en anti-PSMC5-antikropp (Fig 2C). Däremot uppvisade analys av njur-naiv NAc (efter upprepade saltlösningsinjektioner) ingen detekterbar ΔFosB-dragning (data ej visad). Dessa data överensstämmer med våra fynd i cellodling och bekräftar att ΔFosB och PSMC5 interagerar i NAc in vivo.

miniatyr
Fig 2. PSMC5-reglering i mus NAc.

 

A. Western blotting av nukleära och cytosoliska fraktioner av NAc hos möss behandlade dagligen med saltlösning eller kokain (20 mg / kg) i 7 dagar, med djur analyserade 24 timmar efter den sista injektionen. Kokain ökar kärnkraftsnivåerna men inte cytosoliska nivåer av PSMC5. Histon H3 och ß-aktin, som inte påverkades av kokain, användes som laddningskontroller. Data är medelvärde ± SEM (n = 8-10 / grupp, * p <0.05). B. Samlokalisering av endogent PSMC5 (grönt) och ΔFosB (blått) i NAc hos möss behandlade kroniskt med kokain som i AC Nukleära lysat av mus NAc efter kronisk kokainbehandling utsattes för immunutfällning med anti-PSMC5-antikropp eller mus-IgG som kontroll och sedan Western blottades med anti-FosB / ΔFosB-antikropp. Figuren visar PSMC5-ΔFosB-interaktioner i NAc in vivo. Data i B och C replikerades i tre exemplar i vart och ett av tre separata experiment.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g002

PSMC5 ökar ΔFosB-uttryck in vitro

Eftersom PSMC5 är en känd medlem i proteasomkomplexet, testade vi om det reglerar ΔFosB-nivåer med hjälp av Rat 1A-celler. PSMC5-överuttryck hade ingen effekt på basala nivåer av ΔFosB men orsakade en liten men signifikant ökning av FFB-induktion på serumstimulering av cellerna (Fig 3A). En liknande trend upplevdes för FosB i full längd men effekten uppnådde inte statistisk signifikans. Omvänt påverkar undertryckandet av endogent PSMC5-uttryck i Rat 1A-celler, som uppnås genom användning av siRNA som riktar sig mot PSMC5, inte basala FosB-nivåer men inhiberade starkt AFosB-induktion genom serumstimulering (Fig 3B). Liknande effekter observerades för full längd FosB. Dessa data tyder på att PSMC5 inte främjar proteasomal nedbrytning av ΔFosB, vilket kan förväntas som en kärnunderenhet av proteasomen, men är i stället nödvändig för maximal ackumulering av FosB genprodukter in vitro, kanske genom att stabilisera proteinerna.

miniatyr
Fig 3. PSMC5-reglering av FosB / AFosB-uttryck i Rat 1A-celler.

 

A. Råtta 1A-celler transfekterades med 4 | ig PSMC5 eller kontroll-DNA. PSMC5-överuttryck hade ingen effekt på basala uttrycksnivåer av FosB eller ΔFosB-protein, bestämt genom Western blotting, men gav en liten men signifikant ökning av induktionen av ΔFosB genom serumstimulering (F (2,21) = 9.75, p = 0.001). B. Råtta 1A-celler transfekterades med 5 pmol av endera av två siRNA eller krypterad RNA (kontroll). Båda siRNAs minskade effektivt PSMC5-proteinnivåerna jämfört med kontrollförhållanden (siRNA # 1, 23 ± 5% av kontrollen; siRNA # 2, 18 ± 6%; p <0.05; n = 4). PSMC5-knockdown hade ingen effekt på basala nivåer av FosB eller ΔFosB men dämpade induktionen av både FosB och ΔFosB genom serumstimulering (FosB: F (2,6) = 20.99, p = 0.002; ΔFosB: F (2,6) = 22.83 , p = 0.002).

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g003

ΔFosB och PSMC5 bilda komplex med CBP, p300 och BRG1 i NAc

För att bättre förstå de transkriptionsmekanismer genom vilka PSMC5 kan påverka ΔFosB-funktionen undersökte vi eventuella ytterligare bindande partners för de två proteinerna i NAc under kroniska kokainbehandlade tillstånd. Det finns en rapport som PSMC5 binder till CBP-a HAT-och ökar histon H3-acetylering vid den proximala MHC-II-promotorn i HeLa-celler [22]. Dessutom visar mus som är bristfälliga i CBP minskad beteendekänslighet för kokain samt minskad histonacetylering vid FosB promotor [23]. Vi testade sålunda huruvida PSMC5 kan binda med ΔFosB som en del av komplex som också innehåller CBP och kanske andra transkriptionsaktivatorer.

Vi demonstrerade först att ΔFosB effektivt drog ner både CBP och p300, en relaterad HAT, i Neuro2A-celler (Fig 4A). I motsats härtill uppvisade den leucin-zipper-mutanta formen av APF, som förväntat, inte denna aktivitet. På samma sätt drog PSMC5 effektivt CBP och p300 (Fig 4B). Intressant sett sågs också denna effekt för PSMC5 -ΔCC, som inte drog ner ΔFosB, vilket indikerar att PSMC5 interagerar med CBP och p300 via andra domäner i proteinet och oberoende av dess bindning till FFosB.

miniatyr
Fig 4. ΔFosB och PSMC5 interagerar med CBP, p300 och BRG1 in vitro och in vivo.

 

A. Neuro2A-celler transfekterades med 2.4 ^ ig av MYC-märkt ΔFosB eller MYC-märkt ΔFosB-LZM. Cellextrakten immunoprecipiterades med anti-CBP- eller anti-p300-antikropp, och fällningar västes blottades med samma antikropp eller med anti-MYC-antikropp. Både CBP och p300 interagerar med ΔFosB och sådana interaktioner kräver en intakt leucin-dragkedja. B. Neuro2A-celler transfekterades med 2.4 / ig FLAG-märkt PSMC5 eller FLAG-märkt PSMC5-AC. Cellextrakten immunoprecipiterade med anti-CBP eller anti-p300-antikropp, och fällningar västes blottades med samma antikropp eller med anti-FLAG-antikropp. Både CBP och p300 interagerar med PSMC5 och sådana interaktioner kräver inte CC-domänen. C. Nukleära lysat av mus NAc efter kronisk kokainbehandling utsattes för immunutfällning med anti-CBP eller anti-p300-antikropp. Efterföljande Western blotting av resulterande fällningar med anti-FosB / AFosB antikropp visade endogena interaktioner mellan ΔFosB och CBP / p300. D. Alikvoter av samma nukleära lysater utsattes för immunutfällning med anti-BRG1 eller anti-PSMC5-antikropp, följt av Western blotting av fällningar med anti-FosB / AFosB eller anti-BRG1-antikropp. Resultaten visar endogena interaktioner mellan ΔFosB och BRG1, och BRG1 och PSMC5. E. Schematisk illustration av transkriptionellt aktiveringskomplex sammansatt av ΔFosB: JunD-heterodimerer som interagerar med CBP / p300, BRG1 och PSMC5.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g004

För att bekräfta att dessa interaktioner också inträffar in vivo administrerade vi kokain kroniskt för att inducera ΔFosB och nukleära PSMC5-nivåer, sedan immunutfällda NAc-extrakt med anti-CBP eller anti-p300-antikroppar. I överensstämmelse med våra cellodlingsdata drog immunpresipitation av CBP eller p300 effektivt ΔFosB (Fig 4C). Vi testade huruvida BRG1, en kärnunderenhet i SWI-SNF-kromatin-remodelingskomplexet, också skulle binda till ΔFosB och PSMC5 baserat på vårt tidigare konstaterande att BRG1 rekryteras till vissa ΔFosB-målgener i samverkan med deras aktivering i NAc efter kronisk kokain [24]. Vi fann att immunutfällning av BRG1 drog ner ΔFosB i NAc-extrakt, och att immunutfällning av PSMC5 på samma sätt samfällt endogent BRG1 (Fig 4D). Tillsammans föreslår dessa resultat att ΔFosB-PSMC5 bildar komplex i NAc som även innefattar CBP / p300 och BRG1 (Fig 4E).

PSMC5 överuttryck ökar lokomotoriska svar på kokain

Den framträdande bindningen av PSMC5 med ΔFosB i NAc uppmanade oss att undersöka om ökande PSMC5-nivåer i denna hjärnregion reglera beteendemässiga reaktioner mot kokain. Vi genererade en herpes Simplex Virus (HSV) vektor som överuttrycker antingen vildtyp PSMC5 eller en av dess mutanter och validerade vektorerna i NAc in vivo (Fig 5A). Viralt medierat uttryck av PSMC5 dominerar i cellkärnan (Fig 5B). Möss som överuttryckte vildtyp PSMC5 visade inte förändrade svar på initialdoser av kokain, men visade ökad rörelseaktivitet som svar på upprepade kokaindoser jämfört med GFP-uttryckande kontrollmöss. I motsats härtill uppvisade inte möss som överuttryckte en mutant form av PSMC5 som saknar sin coiled-coil-domän (PSMC5 -ΔCC) denna effekt (Fig 5B). Intressant är att överuttryck av PSMC5-K196M, som saknar ATPas-aktiviteten hos vildtypproteinet, även potentierade kokainens lokomotoriska svar.

miniatyr
Fig 5. PSMC5 överuttryck i NAc ökar lokomotoriska svar på kokain.

 

A. Representativ HSV-medierad transgenuttryck i medial NAc. AC, främre kommission. NAc kärna och skal delregioner noteras på figuren. B. Representativa högre förstoringar (60x) av immunhistokemisk färgning av PSMC5 i NAc-nervceller efter HSV-PSMC5-injektion som visar att proteinet huvudsakligen är kärnämne, vilket markeras med DAPI-färgning. C. Möss fick bilaterala HSV-injektioner i NAc följt av dagliga IP-injektioner av subtröskeldoser av kokain (7.5 mg / kg). Lokomotoriska svar visas som svar på den första och sista av 3 dagliga doser av läkemedlet. Överuttryck av PSMC5 eller PSMC5-K196M ökar rörelsens svar på upprepad kokain, en effekt som inte ses med PSMC5-ACC. Det fanns ingen signifikant effekt av transgenerna på rörelsens svar på initiala kokaindoser. ANOVA F (3,125) = 4.163, * p <0.05 av Dunnetts posthoc-test.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g005

Diskussion

Resultaten av den föreliggande studien avslöjar en ny mekanism genom vilken ΔFosB medierar dess effekter på hjärnan och en ny mekanism som är inblandad i kokainaktivitet. Genom användning av ett opartiskt tillvägagångssätt, en jäst-två-hybridanalys identifierade vi PSMC5 som en ny bindande partner för ΔFosB. Vi validerade detta resultat både i odlade celler in vitro och i NAc in vivo genom att demonstrera robust PSMC5-FosB-bindning. Viktigt är att nukleära nivåer av PSMC5 induceras i NAc genom kronisk kokainadministration. Vi visade vidare att PSMC5-FosB-bindning sker i samverkan med flera andra transkriptionella aktivatorproteiner, nämligen CBP och p300 (två HAT) och BRG1 (en nyckelbeståndsdel i SWI-SNF-kromatin-remodelingskomplex). Tillsammans stöder våra resultat hypotesen att PSMC5 är en del av det transkriptionella aktiveringskomplexet som rekryteras till åtminstone vissa FFB-inducerade gener under en tid av kronisk kokainadministration (Fig 4E). I överensstämmelse med denna hypotes är det ytterligare konstaterandet att överuttryck av PSMC5 i NAc, liksom överuttrycket av FosB i sig, främjar beteendemässiga svar på kokain. Det skulle vara intressant i framtida studier att följa upp dessa in vivo observationer med karakterisering av PSMC5-FFB-HAT-BRG1-interaktioner med hjälp av in vitro-reporteranalyser.

Inblandning av PSMC5 i kokainaktivitet är helt ny. Identifierades initialt som medlem av en stor familj av ATPaser, som innefattar proteasomen, har PSMC5 visats under åren för att interagera med flera transkriptionsfaktorer, inklusive c-Fos, p53, kärnhormonreceptorer och beståndsdelar i det basala transkriptionskomplexet [25] har dock få funktionsstudier utförts under åren [26]. Dess bäst etablerade åtgärd är att främja aktiviteten av MYC transkriptionsfaktorer i odlade celler [27]. Implikationen av PSMC5 i transkriptionsmekanismer har föreslagit en potentiell roll för ubiquitinations-proteasomal aktivitet vid reglering av gentranskription, men involveringen av PSMC5 i sådan reglering förblir nästan otestad hittills [28,29].

Mycket lite är känt om PSMC5-funktionen i hjärnan. En tidigare studie visade utbrett uttryck av PSMC5 mRNA genom hjärnan [30], men dess funktionella aktivitet har förblev ostudierad. Våra fynd uppmanar nu ytterligare undersökningar av detta intressanta protein för att bättre förstå dess roll vid reglering av gentranskription och dess relation till ubiquitinations-proteasomal funktion i hjärnan. Bindningen av PSMC5 till ΔFosB medieras av PSMC5s coiled-coil-domän. Dessutom kräver förmågan hos PSMC5 att främja lokomotoriska svar på kokain, medan det krävs en spoladomän, inte ATPas-aktiviteten som är inriktad mot proteinet. Dessa resultat ökar möjligheten att, åtminstone i vårt system, huvudaktiviteten hos PSMC5 kan förmedlas genom dess bindning till ΔFosB och andra transkriptionella regulatoriska proteiner och inte genom dess proteasomalrelaterade aktivitet i sig. Ytterligare arbete behövs för att direkt testa dessa och alternativa möjligheter. Hypotesen att virusmedierad överuttryck av PSMC5 ökade lokomotoriska responser mot kokain via interaktioner med ΔFosB är trovärdigt trots användning av en 3-dag kokainbehandling, eftersom det är känt att märkbara nivåer av ΔFosB ackumuleras i hjärnan inom denna tidsram [3].

De föreliggande resultaten understryker vidare användbarheten av att använda objektiva, öppna experimentella tillvägagångssätt vid studier av molekylär grund för hjärnreglering. Vår första uppmärksamhet på PSMC5 baserades enbart på dess framträdande bindning till ΔFosB i en jäst-tvåhybridanalys, men det verkar vara en viktig komponent i transkriptionsförändringar som rekryteras i NAc genom upprepad kokainadministration. En bättre förståelse av de detaljerade mekanismerna vid vilka kärnnivåer av PSMC5 induceras av kokain och i sin tur genom vilken PSMC5 bidrar sedan till kokaininducerade transkriptionella aktiveringskomplex är fokus för aktuella undersökningar. Under tiden avslöjade vår jäst-två-hybridanalys flera ytterligare förmodade bindande partners av FFosB (Tabell 1) som också nu motiverar direkt undersökning i kokainmodeller. Tillsammans bidrar detta arbete till en ökad förståelse för de komplexa molekylära mekanismerna genom vilka kokain förändrar NAc-funktionen.

Erkännanden

Detta arbete stöddes av bidrag från National Institute on Drug Abuse, och av Ishibashi Foundation och Japan Society for Promoting Science (KAKENHI nummer: 24591735, 26290064, 25116010).

Författarbidrag

Upptäckt och utformat experimenten: YHO YNO EJN. Utförde experimenten: YHO YNO PJK RN. Analyserade data: YHO YNO EJN. Bidragande reagens / material / analysverktyg: TN MO OY AN RN TT. Skrev papperet: YHO EJN.

Referensprojekt

  1. 1. Morgan JI, Curran T (1995) Omedelbara tidiga gener: tio år på. Trender Neurosci 18: 66-67. pmid: 7537412 doi: 10.1016 / 0166-2236 (95) 80022-t
  2. 2. Nestler EJ (2008) Transkriptionsmekanismer för missbruk: deltaFosB: s roll. Philos Trans R Soc London B Biol Sci 363: 3245-3255. doi: 10.1098 / rstb.2008.0067. PMID: 18640924
  3. Visa artikel
  4. PubMed / NCBI
  5. Google Scholar
  6. Visa artikel
  7. PubMed / NCBI
  8. Google Scholar
  9. Visa artikel
  10. PubMed / NCBI
  11. Google Scholar
  12. Visa artikel
  13. PubMed / NCBI
  14. Google Scholar
  15. Visa artikel
  16. PubMed / NCBI
  17. Google Scholar
  18. Visa artikel
  19. PubMed / NCBI
  20. Google Scholar
  21. Visa artikel
  22. PubMed / NCBI
  23. Google Scholar
  24. Visa artikel
  25. PubMed / NCBI
  26. Google Scholar
  27. Visa artikel
  28. PubMed / NCBI
  29. Google Scholar
  30. Visa artikel
  31. PubMed / NCBI
  32. Google Scholar
  33. Visa artikel
  34. PubMed / NCBI
  35. Google Scholar
  36. Visa artikel
  37. PubMed / NCBI
  38. Google Scholar
  39. Visa artikel
  40. PubMed / NCBI
  41. Google Scholar
  42. Visa artikel
  43. PubMed / NCBI
  44. Google Scholar
  45. Visa artikel
  46. PubMed / NCBI
  47. Google Scholar
  48. Visa artikel
  49. PubMed / NCBI
  50. Google Scholar
  51. Visa artikel
  52. PubMed / NCBI
  53. Google Scholar
  54. Visa artikel
  55. PubMed / NCBI
  56. Google Scholar
  57. Visa artikel
  58. PubMed / NCBI
  59. Google Scholar
  60. Visa artikel
  61. PubMed / NCBI
  62. Google Scholar
  63. Visa artikel
  64. PubMed / NCBI
  65. Google Scholar
  66. Visa artikel
  67. PubMed / NCBI
  68. Google Scholar
  69. Visa artikel
  70. PubMed / NCBI
  71. Google Scholar
  72. Visa artikel
  73. PubMed / NCBI
  74. Google Scholar
  75. Visa artikel
  76. PubMed / NCBI
  77. Google Scholar
  78. Visa artikel
  79. PubMed / NCBI
  80. Google Scholar
  81. Visa artikel
  82. PubMed / NCBI
  83. Google Scholar
  84. Visa artikel
  85. PubMed / NCBI
  86. Google Scholar
  87. Visa artikel
  88. PubMed / NCBI
  89. Google Scholar
  90. 3. Hoppas BT, Nye HE, Kelz MB, Self DW, Iadarola MJ, Nakabeppu Y, et al. (1994) Induktion av ett långvarigt AP-1-komplex bestående av förändrade Fos-liknande proteiner i hjärnan genom kronisk kokain och andra kroniska behandlingar. Neuron 13: 1235-1244. pmid: 7946359 doi: 10.1016 / 0896-6273 (94) 90061-2
  91. 4. Hiroi N, Brown J, Haile C, Ye H, Greenberg ME, Nestler EJ (1997) FosB-mutanta möss: Förlust av kronisk kokaininduktion av Fos-relaterade proteiner och ökad känslighet för kokainens psykomotoriska och givande effekter. Proc Natl Acad Sci USA 94: 10397–10402. pmid: 9294222 doi: 10.1073 / pnas.94.19.10397
  92. 5. Ulery PG, Rudenko G, Nestler EJ (2006) Reglering av ΔFosB-stabilitet genom fosforylering. J Neurosci 26: 5131-5142. pmid: 16687504 doi: 10.1523 / jneurosci.4970-05.2006
  93. 6. Carle TL, Ohnishi YN, Ohnishi YH, Alibhai IN, Wilkinson MB, Kumar A, et al. (2007) Frånvaro av konserverad C-terminal degrondomän bidrar till ΔFosBs unika stabilitet. Eur J Neurosci 25: 3009-3019. PMID: 17561814
  94. 7. Robison AJ, Vialou V, Mazei-Robison M, Feng J, Kourrich S, Collins M, et al. (2013) Behavioral och strukturella svar på kronisk kokain kräver en matningsförloppsslunga som involverar ΔFosB och CaMKII i kärnans accumbens skal. J Neurosci 33: 4295-4307 doi: 10.1523 / JNEUROSCI.5192-12.2013. PMID: 23467346
  95. 8. Kelz MB, Chen J, Carlezon WA Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, et al. (1999) Uttryck av transkriptionsfaktorn FosB i hjärnan styr känsligheten för kokain. Natur 401: 272-276. PMID: 10499584
  96. 9. Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, Self DW (2003) ΔFosB ökar incitamentet för kokain. J Neurosci 23: 2488-2493. PMID: 12657709
  97. 10. McClung CA, Nestler EJ (2003) Reglering av genuttryck och kokainbelöning av CREB och DFosB. Nat Neurosci 11: 1208-1215. pmid: 14566342 doi: 10.1038 / nn1143
  98. 11. Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, et al. (2006) ΔFosB: En viktig roll för ΔFosB i nucleus accumbens i morfinåtgärd. Natur Neurosci 9: 205-211. pmid: 16415864 doi: 10.1038 / nn1636
  99. 12. Peakman MC, Colby C, Perrotti LI, Tekumalla P, Carle T, Ulery P et al. (2003) Inducerbart hjärnregionsspecifikt uttryck av en dominant negativ mutant av c-Jun i transgena möss minskar känsligheten för kokain. Brain Res 970: 73-86. pmid: 12706249 doi: 10.1016 / s0006-8993 (03) 02230-3
  100. 13. Chen J, Nye HE, Kelz MB, Hiroi N, Nakabeppu Y, et al. (1995) Reglering av delta FosB och FosB-liknande proteiner genom elektrokonvulsiv anfall och kokainbehandlingar. Mol Pharmacol 48: 880-889. PMID: 7476919
  101. 14. Hiroi N, Marek GJ, Brown J, Ye H, Saudou F, Vaidya VA, et al. (1998) Viktig roll för fosB-genen i molekylära, cellulära och beteendeaktioner av elektrokonvulsiva anfall. J Neurosci 18: 6952-6962. PMID: 9712664
  102. 15. Perez-Otano I, Mandelzys A, Morgan JI (1998) MPTP Parkinsonism åtföljs av vidhäftande uttryck av ett D-FosB-liknande protein i dopaminerga vägar. Mol Brain Res 53: 41-52. pmid: 9473580 doi: 10.1016 / s0169-328x (97) 00269-6
  103. 16. Ma J, Ptashne M (1988) Konvertera en eukaryotisk transkriptionshämmare till en aktivator. Cell 55: 443-446. pmid: 3180218 doi: 10.1016 / 0092-8674 (88) 90030-x
  104. 17. Chien CT, Bartel PL, Sternglanz R, Fields S (1991) Tvåhybridsystemet: en metod för att identifiera och klona gener för proteiner som interagerar med ett protein av intresse. Proc Natl Acad Sci USA 88: 9578-9582. pmid: 1946372 doi: 10.1073 / pnas.88.21.9578
  105. 18. Nakabeppu Y 1, Oda S, Sekiguchi M (1993) Proliferativ aktivering av vilande Rat-1A-celler genom delta FosB. Molcell Biol 13: 4157-4166. PMID: 8321220
  106. 19. Scobie KN, Damez-Werno D, Sun H, Shao N, Gancarz A, Panganiban CH, et al. (2014) Väsentlig roll för poly (ADP-ribosyl) ation vid kokainverkan. Proc Natl Acad Sci USA 111: 2005-2010. doi: 10.1073 / pnas.1319703111. PMID: 24449909
  107. 20. Perrotti LI, Weaver RR, Robison B, Renthal W, Maze I, Yazdani S, et al. (2008) Distinkta mönster av ΔFosB induktion i hjärnan av missbruksmedel. Synapse 62: 358-369. doi: 10.1002 / syn.20500. PMID: 18293355
  108. 21. Wang WL, Chevray PM, Nathans D (1996) Mammalian Sug1 och c-Fos i det kärnämne 26S proteasomen. Proc Natl Acad Sci USA 93: 8236-8240. pmid: 8710853 doi: 10.1073 / pnas.93.16.8236
  109. 22. Koues OI 1, Dudley RK, Truax AD, Gerhardt D, Bhat KP, McNeal S et al. (2008) Regulering av acetylering vid den huvudsakliga histokompatibilitetskomplexet klass II proximal promotor av 19S proteasomal ATPas Sug1. Molcell Biol 28: 5837-5850. doi: 10.1128 / MCB.00535-08. PMID: 18662994
  110. 23. Levine AA, Guan Z, Barco A, Xu S, Kandel ER, Schwartz JH (2005) CREB-bindande protein reglerar respons på kokain genom acetylering av histoner vid fosB-promotorn i musstriatumet. Proc Natl Acad Sci USA 102: 19186-19191. pmid: 16380431 doi: 10.1073 / pnas.0509735102
  111. 24. Kumar A, Choi KH, Renthal W, Tsankova NM, Theobald DEH, Truong HT, et al. (2005) Kromatinomvandling är en nyckelmekanism som ligger bakom kokaininducerad plasticitet i striatum. Neuron 48: 303-314. pmid: 16242410 doi: 10.1016 / j.neuron.2005.09.023
  112. 25. St-Arnaud R (1999) Dubbla funktioner för transkriptionsregulatorer: myt eller verklighet. J Cell Biochem Suppl 32/33: 32–40. doi: 10.1002 / (sici) 1097-4644 (1999) 75: 32+ <32 :: aid-jcb5> 3.0.co; 2-x
  113. 26. Ferrell K, Wilkinson CRM, Dubiel W, Gordon C (2000) Regulatoriska subenhetsinteraktioner av 26S proteasomen, ett komplext problem. Trends Biochem Sci 25: 83-88. pmid: 10664589 doi: 10.1016 / s0968-0004 (99) 01529-7
  114. 27. von der lehr N, Johansson S, Larson LG (2003) Implikation av ubiquitin / proteasomsystemet i myc-reglerad transkription. Cykel 2-5: 403-407. doi: 10.4161 / cc.2.5.484
  115. 28. Geng FQ, Wenzel S, Tansey WP (2012) Ubiquitin och proteasomer vid transkription. Annu Rev Biochem 81: 177-201. doi: 10.1146 / annurev-biochem-052110-120012. PMID: 22404630
  116. 29. Collins GA, Tansey WP (2006) Proteasom: ett verktyg för transkription? Curr Op Genet Dev 16: 197-202. PMID: 16503126
  117. 30. Sun DH, Swaffield JC, Johnston SA, Milligan CE, Zoeller RT, Schwartz LM (1997) Identifiering av en fylogenetiskt konserverad Sug1 CAD-familjemedlem som uttrycks differentiellt i musens nervsystem. Dev Neurobiol 33: 877–890. doi: 10.1002 / (sici) 1097-4695 (199712) 33: 7 <877 :: aid-neu2> 3.0.co; 2-5