Tillräcklighet för Mesolimbic Dopamin Neuron Stimulering för Progression To Addiction (2015)

 

Vincent Pascoli3,Jean Terrier3,Agnès Hiver

,Christian Lüscher'Korrespondensinformation om författaren Christian Lüscherhttp://www.cell.com/templates/jsp/_style2/_marlin/images/icon_email.pngMaila författaren Christian Lüscher

DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.neuron.2015.10.017

slingor

• Självstimulering av dopaminneuropa framkallar synaptisk plasticitet i NAc, körningsfall

• Dopamin är tillräcklig för att trigga tvångsmedel

• Neuroner i orbitofrontal cortex är hyperexcitable i möss som är resistenta mot bestraffning

• Kemogenetisk inhibering av OFC reducerar tvångsmässig självstimulering

Sammanfattning

Faktorerna som orsakar övergången från narkotikakonsumtion till missbruk är i stort sett okända. Det har inte testats om dopamin (DA) är tillräckligt för att utlösa denna process. Här använder vi optogenetisk självstimulering av DA-nervceller i det ventrala tegmentala området (VTA) för att selektivt härma den definierande gemensamheten för beroendeframkallande läkemedel. Alla möss fick lätt självstimulering. Efter veckors avhållsamhet observerades köinducerat återfall parallellt med en förstärkning av excitatoriska afferenter på D1-receptoruttryckande neuroner i nucleus accumbens (NAc). När mössen var tvungna att uthärda en mild elektrisk fotchock för att få en stimulering, stannade vissa medan andra fortsatte. Motståndet mot bestraffning var associerat med förbättrad neural aktivitet i den orbitofrontala cortexen (OFC) medan kemogenetisk hämning av OFC minskade kompulsiviteten. Tillsammans visar dessa resultat att stimulering av VTA DA-nervceller inducerar beteendemässiga och cellulära kännetecken för missbruk, vilket indikerar tillräcklighet för induktion och progression av sjukdomen.

Beskrivning

Addiction är en sjukdom som utvecklas i flera steg (Everitt et al., 2008, George et al., 2014). Diagnosen ställs när fritidsanvändningen blir tvångsmässig och kvarstår trots negativa konsekvenser. Medan en ledande missbrukshypotes antyder att missbrukande droger orsakar sjukdomen på grund av att de ökar koncentrationen av dopamin (DA) i hjärnan överdrivet, är det oklart om det är tillräckligt att utlösa detta system för att driva övergångarna från fritidsbruk till missbruk (Di Chiara och Bassareo, 2007, Volkow och Morales, 2015). De stödjande bevisen för DA-hypotesen för läkemedelsförstärkning har ackumulerats under flera decennier och bygger på den ursprungliga effekten av droger. Exempelvis minskar beroendeframkallande läkemedel tröskeln för intrakraniell självstimulering (ICSS) av det mediala framhjärnspaketet, en fiberkanal innehållande bland annat stigande DA-projektion från mellanhjärnan (Stein, 1964, Crow, 1970, Kornetsky et al., 1979). Farmakologi och lesionsstudier identifierade sedan det mesokortikolimbiska DA-systemet som ursprung för denna krets (Wise och Bozarth, 1982). I slutet av 1980-talet bekräftade ett direkt mått på den extracellulära DA-koncentrationen med mikrodialys att beroendeframkallande läkemedel delade egenskapen att framkalla en DA-stigning i NAc (Di Chiara och Imperato, 1988). Detta ledde till förslaget om en mekanistisk klassificering av beroendeframkallande läkemedel (Lüscher och Ungless, 2006).

Mycket mindre är känt om hur dessa initiala effekter av droganvändning underlättar övergången till missbruk. DA-oberoende mekanismer har övervägs eftersom beroendeframkallande läkemedel har andra farmakologiska mål. Till exempel binder kokain, förutom att hämma DA-transportören (DAT), också till SERT (serotonintransportör) och NET (noradrenalintransportör) för att minska serotonin- och norepinefrinåterupptagning, vilket ökar koncentrationen av alla större monoaminer (Han och Gu, 2006, Tassin, 2008). Liknande problem kan gälla andra psykostimulerande medel. Dessutom finns det ett påstående att opiater är åtminstone i den inledande fasen, DA-oberoende (Badiani et al., 2011, Ting-A-Kee och van der Kooy, 2012). DA-hypotesen har också ifrågasatts baserat på genetiska musmodeller, där, efter störningar i DA-systemet, vissa former av läkemedelsadaptivt beteende fortfarande var uppenbara. Till exempel, DAT-knockout-möss självadministrerar kokain (Rocha et al., 1998) och avskaffande av DA-syntes antingen farmakologiskt (Pettit et al., 1984) eller genetiskt (Hnasko et al., 2007) misslyckades med att förhindra läkemedelsadministrering eller villkorad platsinställning. Medan bättre karakterisering av dessa transgena möss och generering av dubbla monoamintransportörer knockouts har löst några av dessa problem (Rocha, 2003, Thomsen et al., 2009), är tillräckligheten för DA för att utlösa kardinalfunktioner av missbruk okänd. För att kringgå frågor som inte är specifika har vi därför beslutat att låta möss självstimulera VTA DA-nervceller med en optogenetisk metod.

Nya studier har visat att aktivering av DA-nervceller i mellanhjärnan kan inducera platsförmåga (Tsai et al., 2009) eller förstärka instrumentalt beteende (Adamantidis et al., 2011, Witten et al., 2011, Kim et al., 2012, Rossi et al., 2013, McDevitt et al., 2014, Ilango et al., 2014). Medan denna selektiva aktivering av DA-vägar bekräftar intrakraniell självstimulering (ICSS) -studier som utfördes för mer än 30 år sedan för att avgränsa belöningssystemet (Fouriezos et al., 1978), blir de korta och visar induktion av adaptivt beteende i sena steg som definierar missbruk och identifierade inte heller de underliggande neuronanpassningarna. Här använde vi optogenetisk manipulation inte bara för att möjliggöra direkt testning av tillräcklighetskriteriet för fas DA-signalering vid initiering av förstärkning utan också för att testa för övergången till missbruk.

En slående observation av de senare stadierna av sjukdomen är att även med de mest beroendeframkallande drogerna blir bara en bråkdel av användarna beroende (Warner et al., 1995, O'Brien, 1997). Mänskliga missbrukare kommer att fortsätta drogkonsumtion trots negativa konsekvenser (se American Society for Addiction Medicine's “Definition of Addiction,” DSM5, American Psychiatric Association, 2013), vanligtvis relaterad till sociala och psykologiska nederlag som ofta är försenade i tid. På liknande sätt klassificeras ungefär ett av fem djur som förvärvar självadministrering av kokain så småningom som beroende (Deroche-Gamonet et al., 2004, Kasanetz et al., 2010; men se George et al., 2014). Uthållighet av läkemedelsintag trots negativa konsekvenser kan också modelleras hos gnagare genom att införa en enkel aversiv stimulans till konsumtionsplanen. Även om den mänskliga sjukdomen är mer komplex, är associering av straff med konsumtion en rak modell av en kärnkomponent i missbruk.

Här använde vi en mild fotchock för att utvärdera dess konsekvens av självadministration av kokain, sackaros och optogenetisk självstimulering. Vi undersöker vidare huruvida DA neuron-självstimulering kan inducera två beroendeframkallande beteenden-cue-associerade belöningssökande och kompulsivitet associerad med konsumtion trots negativa konsekvenser och karakteriserar neural plasticitet i samband med dessa beteenden.

Resultat

Förvärv av VTA DA Neuron självstimulering

 

För att styra DA neuronaktivitet injicerade vi ett Cre-inducerbart adenoassocierat virus (AAV) med en dubbel-floxed inverterad öppen läsram (DIO) innehållande ChR2 smält till förbättrat gult fluorescerande protein (eYFP) (Atasoy et al., 2008, Brown et al., 2010) i VTA för DAT-Cre-möss. Dessutom placerades en optisk fiber för att rikta sig mot VTA (ChR2, Se Experimentella procedurer). Specificitet av ChR2 uttryck bekräftades genom samlokalisering av eYFP med tyrosinhydroxylas (TH), ett enzym som erfordras för DA-syntes (Figur 1EN). 

Först för att upprätta laserstimuleringsprotokollet placerades möss i en operantlåda där de kunde trycka på en aktiv spak, vilket utlöste ett antal laserstimuleringar som varierades (1, 2, 8, 32, 60 eller 120 skurar) varje två sessioner. För att efterlikna fasiskt skjutmönster (Hyland et al., 2002, Mameli-Engvall et al., 2006, Zhang et al., 2009) induceras vanligtvis av naturlig belöning (Schultz, 1998) använde vi burststimulering. En skur bestod av fem laserpulser på 4 ms vid 20 Hz och upprepades två gånger per sekund. Vi fann att möss anpassade sitt spakpressande beteende som en funktion av skurar per laserstimulering, vilket kontrollerade det totala antalet mottagna skurar (Figur 1B). Detta beteende påminde om självadministrering av beroendeframkallande läkemedel när dosen per infusion varierades (Piazza et al., 2000). För de efterföljande experimenten valde vi att administrera 30 skurar per spakpress, vilket gav ett halva maximalt antal skurar (Figur 1B). För att efterlikna förseningen av DA-ökning som vanligtvis observeras när läkemedel administreras intravenöst (Aragona et al., 2008) försenade vi laserstimuleringen med 5 s och lade till ett blinkande signalljus i 10 s (Figur 1C).

Under 12 dagar i följd fick möss självstimulera maximalt 80 gånger på 2 timmar. Möss ökade snabbt hastigheten för laserstimulering och nådde 80 laserstimuleringar (LS) före slutet av den första timmen av en session (Figurer 1D och 1E). Skillnaden mellan den aktiva och inaktiva armen blev snabbt förvärvad och antalet aktiva häftpressar ökade följaktligen med ökande fasta förhållanden (FR1, 2, 3) scheman (Figurer 1F och 1G). I kontrollexperiment med användning av DAT-Cream eller möss som uttryckte ChR2 i y-aminobutyrsyra (GABA) -neuroner (GAD-Cre + möss, för att rikta sig mot VTA-hämmande neuroner) var självstimuleringshastigheten låg och kontinuerligt minskad över sessioner. Detta gäller även för två Cre + djur där post-hoc-validering visade att VTA inte infekterades med ChR2-eYFP (ej visad). Dessutom upptäcktes ingen diskriminering mellan den aktiva och inaktiva armen (Siffror S1A och S1B).

Vi observerade att DAT-Cre + -mus pressades oftare på den aktiva hävarmen än vad som krävdes för laserstimuleringen. I själva verket utgjorde sådana "felfria" aktiva spakpressar mer än 30% av alla aktiva spakpressar (Figur S2A) och inträffade-som sessioner fortskred-mestadels mellan cue och laser stimulering start (Siffror S2B och S2C). Detta singulära beteende utvecklades under förvärvet och kan spegla impulsiva svar.

Tillsammans förstärker burstaktiviteten i VTA DA-neuroner starkt spakresponsen.

 

Ocklusion av VTA DA Neuron självstimulering av kokain

För att testa om VTA DA-neuron självstimulering hänger på samma hjärnkretsar som är riktade av beroendeframkallande läkemedel för att förstärka beteendet, injicerade vi kokain intraperitonealt (ip) omedelbart före självstimuleringssessioner (fri tillgång till laser i 45 minuter, Figur 2A). Vid baslinjen pressade vältränade djur cirka 400 gånger för att få 85 LS på 45 minuter enligt FR3-schemat. Efter kokaininjektion minskade prestandan betydligt på ett dosberoende sätt till cirka 30 LS för 100 spakpressar med den högsta dosen (Figur 2B). Denna ocklusion var mest uttalad under sessionens första 30 minuter, vilket återspeglar läkemedlets farmakokinetik (Figur 2C). Detta experiment indikerar att förstärkning genom optogenetisk självstimulering och förstärkning av kokain delar underliggande neurala kretsar.

Synaptisk plasticitet associerad med att söka efter uttag

För att ytterligare jämföra optogenetisk självstimulering med beroendeframkallande läkemedel frågade vi nästa om möss skulle återfalla till självstimulering av VTA DA-nervceller efter flera veckors uttag. Eftersom cue-associerad läkemedelssökning är en etablerad modell för återfall (Epstein et al., 2006, Soria et al., 2008, Bossert et al., 2013) placerade vi möss tillbaka i operatörskammaren 30 dagar efter det sista själv- stimuleringssession, där aktiv spaktryckning nu utlöste signalljuset utan laserstimulering (Figur 3EN). Robustt cue-associerat sökande beteende, som demonstrerades av en hög hastighet aktiva tryckpressar, var endast uppenbart hos möss med uttryck av eYFP-ChR2 i VTA DA-nervceller (DAT-Cre + men inte DAT-Cre-möss, Figur 3B).

Tidigare studier har visat orsakssambandet mellan köassocierat återfall och synaptisk plasticitet framkallat av kokain i en undertyp av NAc-neuroner som uttrycker DA D1R (Pascoli, Terrier et al., 2014). För att utvärdera denna synaptiska plasticitet genererade vi därför DAT-Cre-möss korsade med Drd1a-tdTomato möss för att identifiera den medelstora spiny neuronen (MSNs) -typen i NAc. I stället för det sökande testet framställdes skivor av NAc där D1R-MSN var röda, kontrasterande med gröna fibrer från VTA DA-neuroner infekterade med flox-ChR2-eYFP (Figur 3C). Helcells-patch-clamp-inspelningar ex vivo avslöjade ett korrigerande strömspänningsförhållande för AMPAR-framkallade postsynaptiska strömmar (AMPAR-EPSC) och ett ökat AMPAR / NMDAR-förhållande (Figurer 3D och 3E), i D1R-MSN men inte i D2R-MSN. Liknande resultat som tidigare erhölls efter uttag från kokain-självadministrering visade sig indikera den kombinerade insättningen av GluA2-brist och GluA2-innehållande AMPAR, vid separata ingångar på D1R-MSN (Pascoli, Terrier et al., 2014).

 

 

 

Självstimulering trots straff

Substansanvändning trots negativa konsekvenser är ett viktigt avgörande inslag i missbruk (se DSM5-definition, American Psychiatric Association, 2013). Råttmodeller har etablerats (Deroche-Gamonet et al., 2004, Pelloux et al., 2007, Pelloux et al., 2015, Chen et al., 2013) där en elektrisk chock som infördes i kokainens självadministrationsschema undertrycker kokain konsumtion hos vissa djur. Efter 12 dagars första exponering (förvärv) fick möss ha ytterligare tre sessioner vid FR3 men med en minskad session cut-off (60 min eller maximalt 40 belöningar). Dessa tre sessioner fungerade som en baslinje för de efterföljande fyra sessionerna, där var tredje laserstimulering parades ihop med en fotchock (500 ms; 0.2 mA) förutsagt av en ny kö (Figur 4EN). Intensiteten och varaktigheten av fotstöten justerades för att helt undertrycka hävstången för sackarosbelöning (se även data nedan). Straffschemat ledde till två motsatta beteendesvar (Figur 4B). Några möss slutade snabbt reagera när straffet infördes (kallat "känsligt"), medan andra fortsatte att svara på att få maximalt antal laserstimuleringar och kan betraktas som "resistenta" för bestraffning. De två grupperna av djur uppstod helt i slutet av de fyra strafsessionerna (Figur 4C). "Motståndskraftiga möss" behöll antalet laserstimuleringar (mindre än 20% reduktion) medan "känsliga möss" minskade självstimulering med mer än 80%. Med dessa kriterier kunde endast ett djur (grå prickar) inte tilldelas. Denna observation visar att tvångsbristningsaktivitet framkallad av självstimulering av VTA DA-neuroner är tillräcklig för att inducera uthållighet av konsumtion trots negativa konsekvenser i en fraktion av möss. Som en kontroll utvärderades nociception i en oberoende grupp av möss som hade etablerad resistens eller känslighet för straffet associerat med självstimulering med användning av svansflickanalysen. Ingen skillnad i latensen att dra tillbaka svansen nedsänkt i varmt vatten mellan känsligt och resistent detekterades (Figur S3).

Vi frågade oss, efter hoc, huruvida någon särskild egenskap under förvärvsfasen av självstimulering kunde ha förutsagt beständighet mot straff. Känsliga och resistenta möss gjorde ett identiskt antal aktiva och inaktiva tryckpressar under baslinjens sessioner och alla möss nådde maximalt 80 LS (Siffror S4A och S4B), på samma tid (Siffror S4A och S4C). Medan fraktionen av felfil aktiv spakpress var igen inte annorlunda i de två delpopulationerna (Figurer 4D och S4D) blev antalet felfiliga tryckpressar före laserstimuleringens start signifikant högre hos resistenta möss vid slutet av förvärvssessionerna (Figurer 4E och S4E). Eftersom detta beteende utvecklades under förvärvet, kan det tillsammans med medfödd impulsivitet (Economidou et al., 2009, Broos et al., 2012, Jentsch et al., 2014) bidra till att etablera motståndet mot bestraffning. Dessutom utfördes ett progressivt förhållandeförsök vid dag 11 för att kvantifiera motivationen för optogenetisk stimulering (Richardson och Roberts, 1996). Resistenta möss uppvisade en brytpunkt som inte statistiskt skiljer sig från känsliga möss (Figur S4F).

Beständighet mot bestraffning för kokain men inte för sackaros

För att testa om konsumtionsparadigmet trots skadliga konsekvenser tillsammans med pressning av impulshävarm också kunde förutsäga tvångsmässigt intag av ett beroendeframkallande läkemedel, genomgick en ny kohort av möss 12 dagars kokain-självadministrering. Experimentella parametrar för kokain-självadministreringsförvärv sattes till maximalt 80 infusioner av kokain inom 4 timmar under förvärv och till 40 infusioner inom 2 timmar under de tre baslinjesessionerna före de fyra straffsessionerna (Figurer 5A och S5EN). Återigen kom två grupper fram efter att ha kopplat kokainbelöning med elektriska stötar. Faktum är att 5 från 22-möss klassificerades som resistenta (mindre än 20% minskning från baslinjen), medan 17 kvalificerades som känslig (mer än 80% minskning) och ett djur föll mellan (13-infusioner på dag 19) (Figur 5B). Vi letade efter beteendeprediktorer mot beständighet mot straff. Mellan de två grupperna var antalet infusioner, infusionshastigheten och antalet aktiva eller inaktiva tryckpressar inte olika (Siffror S5B-S5D), och brytpunkterna var likartade (Figur S5E). Vad som skilde sig var fördelningen av fördelningen i tid för de felfria pressarna på den aktiva spaken. Under de första fyra sessionerna minskade felfria häftpressar regelbundet under tidsperioderna i både resistenta och känsliga möss, medan i slutet av förvärvet behöll endast känsliga möss detta beteende (Figurer 5C och 5D och S5F). Däremot tenderade resistenta möss att öka sitt totala antal felfiliga tryckpressar (Figurer 5C och S5D), särskilt i sista kvartalet av time-out-perioden (Figur 5D). Medan kvalitativt liknar den observation som tidigare gjordes med den optogenetiska stimuleringen av DA-neuroner (se ovan) sågs inte klustringen av de frivilliga pressarna under den tidiga time-out-perioden med kokain, troligen på grund av den långsammare kinetiken som läkemedlet ökade DA nivåer. Likväl kan liknande slutsatser dras utifrån denna singulära utveckling av felfunktion av hävstångsfördelningen under den korta tidsperioden som föregår "den interna detektionen av DA-överskottet". Våra observationer antyder således att fördelningen av de frivilliga aktiva hävarpressarna förutsäger droganvändning trots negativa konsekvenser.

Slutligen upprepade vi experimentet med ad libitum-matade möss som kunde häva press för en sackarosbelöning. När straffet infördes stoppade alla möss självadministrering av sackarosen (Figur 5E), vilket visar att detta schema undertryckte intaget av en icke-väsentlig naturlig belöning, men möjliggjorde detektering av tvångsmedel av ett beroendeframkallande läkemedel eller stark DA neuron stimulering.

Sammantaget visar dessa resultat att VTA DA-självstimulering är tillräcklig för att inducera kompulsivitet, vilket framgår av beständigheten mot straff i en delmängd av möss (68%). På samma sätt blev vissa möss efter kokain SA resistenta mot bestraffning (23%), vilket aldrig var fallet efter sackaros SA (Figur 5F).

 

 

 

Ett cellulärt korrelat mot beständighet mot straff  

För att kartlägga hjärnområdet som kan styra beslutet att fortsätta med självadministration trots negativa konsekvenser, övervakade vi först generisk ”neuronal aktivitet” genom att räkna antalet neuroner i vilka straffsessionen utlöste uttrycket av den omedelbara tidiga genen cFos 15 olika regioner. Möss perfunderades intrakardiellt med PFA 90 minuter efter slutet av den sista straffsessionen. Kontrollgrupperna inkluderade naiva djur, såväl som möss som åkades till känsliga eller resistenta möss för att kontrollera den eventuellt förvirrande effekten av antalet mottagna chocker.

Medan i de flesta av de valda regionerna var antalet cFos-positiva neuroner högst i skivor från resistenta möss jämfört med naiva mössskivor, uppstod två typer av svar, varav den prelimbiska cortexen (PL) och den laterala OFC är exempel. I PL fann vi en liknande ökning av cFos-positiva celler i resistenta möss och deras yoked kontroller, medan i OFC var denna ökning endast uppenbar i resistenta och inte motsvarande yoked möss (Figurer 6A och 6B). För att kvantifiera denna skillnad normaliserades all data först till expressionsnivåer i naiva djur. Därefter beräknades förhållandet mellan den resistenta överkänsliga delad av yoked till resistent över yoked till känslig (Ratioekonomichefer = (R / S) / (YR / YS), Figur 6B). Denna procedur identifierade cingulatbarken, OFC och VTA som de regioner som aktiveras i resistenta men inte hos känsliga möss och där det var liten skillnad i båda grupperna av ok-kontroller (liknande låga cFos-positiva neuroner i ok, faktiskt) . Att hitta VTA är inte förvånande, eftersom det är regionen med laserstimulerade nervceller. Detta är i linje med en tidigare rapport som visar att ChR2-stimulering utlöser cFos-aktivering (Lobo et al., 2010, Van den Oever et al., 2013). Ett lågt förhållandeekonomichefer hittades i regioner där aktiveringen liknade känsliga och resistenta (såsom CeA och PAG). Förhållandetekonomichefer var också låg när aktiveringen parallelliserades med en stor skillnad i de yoked kontrollerna (såsom PL, Figur 6C för sammanfattat förhållandeekonomichefer data). Ett liknande cFos-uttryck i resistenta och yoked resistenta möss drivs därför troligtvis av antalet fotstötar och hade lite att göra med beständighet mot straff. Tillsammans, det höga förhållandetekonomichefer i OFC antyder att neural aktivitet i denna region är förenad med beständighet mot straff och kan därmed gynna övergången till missbruk.

 

 

 

Plastitet för beständighet mot straff  

För att identifiera substratet för den ökade neuronala aktiviteten i OFC hos mössen som motstår bestraffning, förberedde vi skivor av PL och L-OFC 24 timmar efter den sista bestraffningssessionen för att testa för inneboende upphetsning. De två regionerna valdes på grund av deras mycket distinkta mönster av c-Fos-uttryck i de tidigare experimenten. Den neuronala excitabiliteten kvantifierades genom att räkna antalet åtgärdspotentialer (AP) som framkallades genom injicering av ökande mängder ström (från 0 till 600 pA) i helcellsinspelningar. Dessa inspelningar avslöjade en ihållande hypo-excitabilitet i pyramidala nervceller hos PL hos resistenta möss (och deras okontroll) jämfört med känsliga eller naiva möss (Figur 7EN). Den vilande membranpotentialen (RMP) hos inspelade neuroner var inte annorlunda mellan försöksgrupperna (Figur 7B). Dessa resultat tyder starkt på att excitabiliteten hos neuroner i PL direkt korrelerar med antalet mottagna stötar och kanske inte med beslutet att motstå straff. Detta återspeglar sannolikt en negativ feedback anpassning utlösen av neuronal excitation framkallad av fotstötar dagen innan. Däremot var neuroner från L-OFC mer exciterbara endast i resistenta möss. Excitability av neuroner från yoked möss var inte annorlunda än excitability av neuroner från naiva möss, utesluter en effekt av fotstödet själv (Figurer 7C och 7D). Denna ökade aktivitet av OFC-neuroner ligger sannolikt under cFos-uttrycket och kan driva resistansen mot straff.

 

Reduktion av kompulsivitet med kemogenetisk inhibering av OFC 

För att testa orsakssamband mellan förbättrad OFC-neuronupplevelse och beständighet mot bestraffning uttryckte vi den hämmande DREADD (designerreceptorer som uteslutande aktiverats av designer-läkemedel: CamKIIα-hM4D) i pyramidala nervceller hos OFC hos DAT-Cre + -möss (Figur 8EN). I akuta skivor från OFC framkallade badapplikationen av CNO (clozapin-N-oxid) en långsam utström, troligen förmedlad av GIRK-kanaler, som reverserades av barium (Ba2+), en icke-specifik blockerare av kaliumkanaler (Figur 8B). CNO skiftade även in / ut-kurvan till höger (Figur 8C). DAT-Cre + möss infekterade med AAV1 / CamKIIa-hM4D-mCherry i OFC (Figur 8D) förvärvade DA neuron självstimuleringsparadigm följt av två på varandra följande block med straffschemat, det första i närvaro av CNO och det andra utan CNO. De två blocken avbröts med 6 dagar utan straff (Figur 8E). Vid slutet av det första straffblocket, i närvaro av CNO var endast 5 av 16-möss resistenta (Figur 8F, vänster panel). Däremot klassificerades 14 utan 16 utan "OFC-inhibering" under den andra straffperioden som "resistent" (Figurer 8F, höger panel och 8G). Med andra ord var fraktionen av resistenta möss signifikant lägre i närvaro av CNO jämfört med den första kohorten av 34-möss som tidigare testades under samma betingelser (mellangrupps jämförelse, Figur 8H) och blev lik den första kohorten utan CNO (inom-grupp jämförelse). Slutligen, för de nio mössen som förändrats från känsliga mot resistenta, modifierade CNO inte svansflakens latens vid nedsänkning i varmt vatten (Figur 8I).

Sammantaget demonstrerar detta experiment att aktiviteten hos OFC-pyramidala neuroner beslutar att fortsätta självstimulering trots negativa konsekvenser som representerar ett centralt inslag i övergången till missbruk hos gnagare.

Diskussion 

En nyligen föreslagen missbruksmodell skiljer tre steg i sjukdomsutvecklingen: sporadisk rekreationsdroganvändning, följt av intensifierad, ihållande, eskalerad droganvändning och så småningom tvångsmässig användning i samband med förlust av kontroll (Piazza och Deroche-Gamonet, 2013; men se George et al., 2014). Vår studie visar att stimulering av VTA DA-nervceller är tillräcklig för att driva denna utveckling med en relativt snabb tidsförlopp.

Genom att härma ett naturligt förekommande burst-firing-mönster framkallas en effektiv frisättning av DA i målregioner i VTA, såsom NAc (Bass et al., 2010). DA-nivåer i NAc styr därför troligen självstimuleringen, precis som gnagare själv administrerar nästa infusion av kokain eller heroin när DA-koncentrationen sjunker under tröskeln (Wise et al., 1995). Detta stöds också av vår observation att kokain, injicerad ip, kan hindra självstimulering. Således liknar DA-neurons självstimulering mycket läkemedelssjälvadministration, även om dess kinetik verkligen är snabbare än någon farmakologisk substans, inklusive kokain, vilket föreslås av den olika frekvensen av svar som observerats i föreliggande studie.

Medan vi selektivt riktade in DA-nervceller i VTA kan deras optogenetiska självstimulering ha aktiverade grupper av celler med olika fysiologiska funktioner. Till exempel har det nyligen föreslagits att vissa DA-neuroner kodar för aversiva stimuli (Lammel et al., 2012, Gunaydin et al., 2014). Dessa celler projicerar för mPFC, medan VTA DA-neuroner som projicerar till lateralt NAc-skal förmedlar positiv förstärkning (Lammel et al., 2012). Det skulle vara intressant att bedöma självstimulering och progression med selektiv inriktning (Gunaydin et al., 2014). Eftersom vår manipulation aktiverade alla VTA DA-neuroner, precis som kokain verkar på alla DAT-uttryckande neuroner, är det tänkbart att vissa DA-neuroner skulle driva förstärkningsinlärning medan andra DA-neuroner skulle driva motvilja. Nettoeffekten skulle fortfarande vara en förstärkning av beteendet; emellertid kan "aversionneuronerna" bidra till induktion av en motståndarprocess (Koob, 2013, Wise och Koob, 2014).

Efter tvingad avhållsamhet, återuttalande till det sammanhang som inducerades sökandet efter självstimulering, en etablerad gnagarmodell för läkemedelsåterfall. Anmärkningsvärt kan den underliggande neurala plasticiteten inte särskiljas från den som observerats efter tillbakadragande från kokain-självadministrering (Pascoli, Terrier et al., 2014). Detta lägger till en studie som tidigare rapporterade identisk synaptisk plasticitet i VTA DA-neuroner framkallade av en enda session med optisk stimulering eller en första injektion av ett beroendeframkallande läkemedel (Brown et al., 2010). Ett mönster av synaptiska anpassningar dyker upp som c adaptivt beteende som är vanligt för alla beroendeframkallande läkemedel.

Ett slående inslag i vår studie är dikotomin i svaret på en aversiv stimulans som är tillräckligt stark för att störa konsumtionen av icke-nödvändig naturlig belöning hos alla djur. I vår miljö visade resistenta möss inte en signifikant högre motivation för belöningen av självleverans, vilket står i kontrast till en studie med kokain hos råttor (Pelloux et al., 2007). Beteendeförutsägaren för motstånd mot bestraffning hos möss var dock meningslös spaktryckning under 5-talet före DA-neuronstimuleringens början. Oförmågan att vänta tills belöningsleverans kan därför ses som en markör för impulsivitet (Dalley et al., 2011, Olmstead, 2006, Everitt et al., 2008, Winstanley, 2011, Leyton and Vezina, 2014). Vi blev fascinerade av iakttagelsen att impulsivt intag först utvecklades efter flera sessioner av självstimulering. Detta höjer möjligheten att motstånd mot bestraffning (och i sårbarhet för missbruk) kanske inte är helt medfödd, utan utvecklas under de inledande faserna mot missbruk. Om så är fallet kan den dikotomi som observerats av oss och andra (Deroche-Gamonet et al., 2004) kanske inte enbart bestämmas av genetiska faktorer. Detta skulle också förklara att en liknande fraktion av individer blir beroende av genetiskt relativt homogena musstammar och genetiskt nog mer varierade mänskliga populationer.

Om beständighet mot bestraffning avslöjar den individuella sårbarheten för missbruk, uppskattad till högst 20% hos människor även med kokain (Warner et al., 1995, O'Brien, 1997, George et al., 2014), är den mycket högre andelen som finns här kan återspegla kraften i den direkta och selektiva DA-neuronstimuleringen. Med andra ord kan selektiv DA-neuronstimulering vara mycket mer beroendeframkallande än något läkemedel. Detta kan förklaras med den icke-selektiva effekten av farmakologiska ämnen. När det gäller kokain kan till exempel andra monoaminer än DA faktiskt fördröja induktion av missbruk. Serotonin kan faktiskt motsätta sig DA-beroende adaptivt beteende som att svara för konditionerad belöning, självstimulering och konditionerad platspreferens (Wang et al., 1995, Fletcher och Korth, 1999, Fletcher et al., 2002) genom att underlätta föreningen av ledtrådar till aversiva stimuli (Bauer, 2015, Hindi Attar et al., 2012). Alternativt kan skillnaden ligga i skillnaden i kinetik mellan optogenetisk självstimulering och farmakologisk induktion av extracellulär DA-ökning. Sådan beroendeframkallande potensvariation kan också existera bland olika missbruksdroger (George et al., 2014).

Även om vi inte formellt kan utesluta skillnader i DA-frisättning och / eller relativ signalering för att bidra till upprättandet av beständighet mot beständighet, är detta scenario osannolikt eftersom den histologiska validering av infektionen hos djur som ingår i studien visade EYFP-ChR2 uttryck i hela VTA. Dessutom ledde det optogenetiska stimuleringsprotokollet för att mätta DA-frisättning till självstimulering som kulminerade i unimodalt fördelade värden för brytpunkten, vilket återspeglade incitamentmotivationen.

Ett annat överraskande resultat är att antalet elektriska fotchocker korrelerade med nervcellernas excitabilitet i PL. Minskad excitabilitet hos pyramidala nervceller och ökat AMPAR / NMDAR-förhållande i pyramidala nervceller i samma celler har observerats i ”beroende råttor”, men dessa studier kontrollerade inte effekten av elektriska stötar i sig (Kasanetz et al., 2010, Kasanetz et al., 2013, Chen et al., 2013). Icke-dissociationen kan därför förklaras av mPFC: s dubbla roll i både beslutsprocesser och rädsla för integration (Peters et al., 2009). För det motsatta sambandet förändras excitabiliteten hos pyramidala nervceller i den infralimbiska cortexen med fotchocker (Santini et al., 2008). Detta bevis utesluter inte möjligheten att mPFC spelar en framträdande roll för beslutet om intagsutövning. Vår cFos-analys och observationer av inneboende excitabilitet pekar dock på OFC och cingulate cortex. Vidare förhindrade hämning av neuronal excitabilitet i OFC med DREADD motstånd mot bestraffning. Denna orsakssamband är ett viktigt steg för att förstå de cellulära mekanismerna som är ansvariga för övergången till missbruk. Framtida studier kommer att behövas för att testa om detta också gäller hela spektrumet av beroendeframkallande läkemedel.

Våra resultat är i linje med iakttagelser att en dysfunktion av OFC kan försämra beslutet om kostnadsnytta (Seo och Lee, 2010, Walton et al., 2010, Fellows, 2011) och kan driva tvångsmässigt beteende (Burguière et al., 2013 ). Hos människor har drogmissbruk kopplats till nedsatt beslutsfattande och förändrad OFC-funktion (Lucantonio et al., 2012, Gowin et al., 2013). Sammantaget framträder aktiviteten hos OFC-neuroner som en nyckeldeterminant för övergången till tvångsmedicin (Everitt et al., 2007). Detta utesluter inte en roll för läkemedelsframkallad plasticitet vid excitatoriska afferenter på MSN som observerats här och i andra studier (Kasanetz et al., 2010). Det kommer att vara intressant att utvärdera om manipulationer som syftar till att kontrollera OFC: s upphetsning påverkar motivationen hos missbrukare.

Här föreslår vi DA-neurons självstimulering som en kraftfull modell för att studera stadierna som leder till missbruk. Vi reproducerar kärnkomponenter av narkotikamissbruk, såsom återfall, synaptisk plasticitet och uthållighet av konsumtion trots negativa konsekvenser. Medan modellen verkligen inte är lämplig för att studera effekter specifika för ett visst läkemedel (t.ex. jämföra opioid med psykostimulerande medel), har den flera fördelar. Det möjliggör en exakt tidsmässig kontroll av belöningstillförseln, den aktiverar mycket specifikt bara VTA DA-nervcellerna, och sist men inte minst ger det möjligheten att studera möss under mycket längre tid än med läkemedelsadministrering. Genom att fokusera på den definierande gemensamheten för beroendeframkallande läkemedel är förhoppningen att riva upp de neurala mekanismer som ligger till grund för icke-substansberoende former av missbruk (Alavi et al., 2012, Robbins och Clark, 2015) och därmed bidra till en allmän teori om sjukdomen. Optogenetiska sjukdomsmodeller möjliggör således ett avgörande steg för en grundlig förståelse av neuronal dysfunktion som är involverad i sent skede av missbruk och kommer att vägleda nya, rationella behandlingar för en sjukdom som för närvarande är utan bot.

Författarbidrag  

VP, JT och AH utförde beteendexperimenten medan VP gjorde de elektrofysiologiska inspelningarna och samordnade analysen. Studien var utformad och skriven av alla författare.

Erkännanden  

Arbetet stöddes av bidrag från den schweiziska nationella stiftelsen och ERC: s avancerade bidrag (MeSSI), Carigest SA, Genèves akademiska samhälle och Fondation Privée des Hopitaux Universitaires de Genève. JT är en MD-doktorand som betalas av Schweiziska edsförbundet.

 

Kompletterande information 

Dokument S1. Supplerande experimentella procedurer och figurer S1-S6

Tabell S1. Statistiska analyser