Appetitiv vs Aversiv konditionering hos människor (2015)

Front Behav Neurosci. 2015 maj 19;9:128. doi: 10.3389/fnbeh.2015.00128. eCollection 2015.

Andreatta M1, Pauli P1.

Abstrakt

I klassisk konditionering blir en initialt neutral stimulans (betingad stimulus, CS) associerad med en biologiskt framträdande händelse (okonditionerad stimulus, US), som kan vara smärta (aversiv konditionering) eller mat (aptitlig konditionering). Efter några associationer kan CS initiera antingen defensiva respektive fullbordande svar. I motsats till aversiv konditionering undersöks aptitlig konditionering sällan hos människor, även om dess betydelse för normala och patologiska beteenden (t.ex. fetma, beroende) är obestridlig. Den aktuella studien syftar till att översätta djurfynd om aptitlig konditionering till människor som använder mat som ett USA. Trettiotre deltagare undersöktes mellan 8 och 10 utan frukost för att försäkra sig om att de kände sig hungriga. Under två förvärvsfaser förutspådde en geometrisk form (avCS+) en aversiv UL (smärtsam elektrisk stöt), en annan form (appCS+) förutspådde en aptitretande US (choklad eller salt kringla enligt deltagarnas preferens) och en tredje form (CS– ) förutspådde varken USA. I en utrotningsfas presenterades dessa tre former plus en ny form (NY) igen utan amerikansk leverans. Valens- och upphetsningsvärden såväl som skrämsel- och hudkonduktanssvar (SCR) samlades in som inlärningsindex. Vi hittade framgångsrik aversiv och aptitlig konditionering. Å ena sidan bedömdes avCS+ som mer negativt och mer upphetsande än CS– och inducerade skrämselpotentiering och förstärkt SCR. Å andra sidan bedömdes appCS+ som mer positivt än CS– och inducerade skräckdämpning och större SCR. Sammanfattningsvis bekräftade vi framgångsrikt djurfynd hos (hungriga) människor genom att demonstrera aptitlig inlärning och normal aversiv inlärning.

Beskrivning

Att förutsäga hot och mat är av avgörande betydelse för alla organismers överlevnad. I klassisk konditionering (Pavlov, 1927), föregår en cue en motbjudande händelse, såsom en mild smärtsam elektrisk stöt (aversiv obetingad stimulans, UL), eller en aptitlig händelse, såsom en matpellet (aptitlig UL), flera gånger. Efteråt kan denna stimulus ensam (nu märkt CS, CS+) framkalla antingen defensiva respektive fullbordande svar. Den förra typen av associativ inlärning kallas aversiv konditionering, medan den senare kallas appetitiv konditionering.

Även om förutsägelsen av aptitliga händelser är lika viktig för överlevnad som förutsägelsen av aversiva händelser, är aptitlig konditionering anmärkningsvärt mindre undersökt hos djur (Bouton och Peck, 1989; Koch et al., 1996; McDannald et al., 2011, för en recension se Martin-Soelch et al., 2007) såväl som hos människor (Klucken et al., 2009, 2013; Austin och Duka, 2010; Delgado et al., 2011; Levy och Glimcher, 2011). Denna brist på forskning kan möjligen bero på komplexiteten i det aptitliga paradigmet jämfört med det aversiva. Till exempel måste mat som primär förstärkare levereras när organismen är hungrig för att vara givande (för en ny recension se Dickinson och Balleine, 1994; Clark et al., 2012). I mänsklig forskning har denna svårighet övervunnits genom att använda pengar (Austin och Duka, 2010; Delgado et al., 2011; Levy och Glimcher, 2011) eller erotiska bilder (Klucken et al., 2009, 2013). Emellertid har neuro-avbildningsstudier påpekat att primära (dvs snacks eller drycker) och sekundära (dvs pengar) förstärkare aktiverar vissa vanliga hjärnregioner (t.ex. striatum) men också medför distinkta mönster av aktivering (Delgado et al., 2011; Levy och Glimcher, 2011).

Såvitt vi vet har endast ett fåtal mänskliga konditioneringsstudier undersökt effekterna av primära aptitförstärkare som lukt (Gottfried et al., 2002), vatten (Kumar et al., 2008), eller mat (Prévost et al., 2012). I den första studien, Gottfried et al. (2002) associerade neutrala ansikten (CS) med antingen en obehaglig, behaglig eller neutral lukt. Intressant nog fann de större aktivering i orbitofrontal cortex (OFC) och i ventral striatum som svar på aptitretande CS+ jämfört med aversiva CS+. De drog slutsatsen att OFC bearbetar värdet av lukten och är involverad i att överföra det affektiva värdet från luktsystemet (USA) till det visuella (CS) systemet. Den (ventro) striatala aktiveringen har tolkats som att återspegla den aptitliga CR som framkallas av den aptitliga CS+. I den andra studien, Kumar et al. (2008) bjöd in sina deltagare (friska kontroller och patienter med allvarlig depression) till laboratoriet tidigt på morgonen och bad dem att avstå från att dricka under natten för att försäkra sig om att de var törstiga innan undersökningen. Fraktalbilder var CSs och 0.1 ml vatten i USA. Intressant nog, bland andra aktiveringar, visade friska deltagare (men inte depressionspatienter) större aktivering i ventral striatum till aptitretande CS+, vilket tyder på att denna stimulans bearbetades som givande. I den tredje studien, Prévost et al. (2012) presenterade också fraktala bilder som CS och antingen söta eller salta snacks som US enligt deltagarnas preferenser. CS presenterades i 6 s och under sista sekunden presenterades dessutom en matbild. Varje gång matbilden dök upp lade försöksledaren en bit mat i deltagarnas händer, som fick äta mellanmålet direkt. Tyvärr rapporterade författarna inte hjärnaktiveringen till den aptitliga CS+ under den klassiska konditioneringsfasen; dock observerade de mindre hjärtinbromsning till den belönade CS+ jämfört med den icke-belönade CS–, vilket indikerar differentiella konditioneringseffekter.

Bristen på studier som använder skrämselsvaret som ett index för aptitlig konditionering är förvånande, särskilt med tanke på dess breda användning i aversiv konditionering. Skrämselrespons är ett förfäders och automatiskt defensivt svar mot plötsliga, oväntade och starka aversiva händelser (Koch, 1999). Denna defensiva respons förmedlas av en relativt enkel neuronal väg som involverar cochlearotneuronerna, den kaudala pontinkärnan i den retikulära formationen (PnC) och spinala motoneuroner (Fendt och Fanselow, 1999; Koch, 1999). Djurstudier har avslöjat att skräckpotentiering beror på projektionerna från amygdala till PnC (Fendt och Fanselow, 1999; Koch, 1999), medan skräckdämpning beror på en intakt nucleus accumbens (NAcc, Koch, 1999). Sådan modulering av skrämselsvaret är ett användbart implicit mått för valensen av de presenterade förgrundsstimulierna. Potentiering indikerar således negativ valens, medan dämpning indikerar positiv valens, båda utan att påverkas i stor utsträckning av kognitiva processer (Hamm och Weike, 2005; Andreatta et al., 2010). Såvitt vi vet har endast en djurstudie undersökt aptitlig konditionering genom att mäta skrämselsvar som ett beroende mått. Intressant nog visade de undersökta råttorna skrämmande dämpning av en CS+ (dvs ljus) associerad med tillförseln av en sackaroslösning. Noterbart var att sådan dämpning försämrades hos de djur med NAcc-lesioner, men inte hos de med amygdala-lesioner, vilket tyder på att NAcc spelar en specifik roll för att framkalla aptitretande CRs och för att dämpa skrämselsvar (Koch et al., 1996).

Den aktuella studien är såvitt vi vet den första att översätta detta aptitliga konditioneringsparadigm till människor genom att använda primära förstärkare som US, dvs söta (choklad Smarties®) eller salt mat (liten salt pretzel) och skrämselmodulering som ett mått på CR. Vi förväntade oss att appCS+ skulle utlösa starka aptitretande CR, vilket återspeglas i skrämseldämpning, förbättrad SCR och positiv valensvärdering jämfört med andra stimuli, dvs avCS+ och CS–.

Material och metoder

Deltagare

Fyrtiotvå frivilliga accepterade att delta i studien och fick kurspoäng. Nio deltagare exkluderades från analysen, två på grund av tekniska problem, tre på grund av att de kodades som icke-svarare (medelvärde för skräckamplitud < 5 μV), och fyra för att de inte uppvisade tillräckligt med skrämselsvar per tillstånd (minst = 2; för detaljer, se Material och metod). Till slut övervägdes 33 deltagare i analysen (16 män; medelålder: 22.09 år, SD: 2.84; intervall: 18–29 år). Fyra deltagare var inte infödda tyskar och sex var vänsterhänta. En deltagare förblev omedveten om CSs-USs associationer under hela experimentet (se Procedur), men vi beslutade att inte utesluta denna deltagare eftersom hans svar var normala och inte påverkade resultaten.

material

Okonditionerad stimuli (USA)

Två typer av US användes. Som motbjudande USA applicerade vi en lätt smärtsam elektrisk stöt på deltagarnas icke-dominanta underarm. Den elektriska stöten gavs med hjälp av två elektroder med 9 mm diameter och avstånd 30 cm. Den elektriska stimulansen bestod av en pulsstimulus med en frekvens på 50 Hz och en varaktighet på 200 ms, genererad av en strömstimulator (Digitimer DS7A, Digitimer Ltd, Welwyn Garden City, Storbritannien, 400 V, maximalt 9.99 mA). Intensiteten av den elektriska stöten bestämdes individuellt genom en tröskelprocedur som beskrivits tidigare (Andreatta et al., 2010). Kortfattat genomgick deltagarna två serier av stigande och fallande intensiteter i intervaller på 0.5 mA. De var tvungna att betygsätta varje stimulus på en visuell skala från 0 (känner ingenting alls) till 10 (verkligt intensiv smärta) med 4 som ett ankare för tröskeln (bara märkbar smärta). Medelintensiteten för den elektriska stimulansen var 2.12 mA (SD = 0.56) och det bedömdes som smärtsamt (M = 6.45, SD = 1.73). Det aptitliga USA bestod av antingen en choklad (Smarties®) eller liten salt kringla. Valet av aptitretande US berodde på deltagarens individuella preferenser som rapporterades under den preliminära intervjun. Deltagarna fick nämligen rapportera om de normalt äter salt eller söt mat under frukosten. De kunde också fritt välja om de föredrog chokladen eller den salta kringlan under själva experimentet. Till sist valde 22 deltagare chokladen och 11 den lilla salta kringlan.

Conditioned Stimuli (CS)

Geometriska former (blå kvadrat, gul cirkel, grön triangel, röd hexagon) med en diagonal på 8 cm presenterades som CS. Formerna presenterades mitt på en svart datorskärm i 8 s. En form (avCS+) var alltid associerad med den motbjudande UL (smärtsam elektrisk chock), en form (appCS+) associerades alltid med den aptitliga UL (choklad eller salt kringla), en form (CS–) var aldrig associerad med någon av de aversiva eller de aptitliga USs, och den fjärde formen (NEW) presenterades i utrotningsfasen men inte under förvärvsfasen för att säkerställa dess neutralitet.

Skrämma sond

Vitt brus på 103 dB med en varaktighet på 50 ms användes som en skräcksond. De akustiska stimuli presenterades binauralt över hörlurar och inträffade slumpmässigt 4–6 sekunder efter att formen började.

frågeformulär

Före och efter experimentet var deltagarna tvungna att fylla i de tyska versionerna av State-Trait Anxiety Inventory (STAI, Laux et al., 1981) och schemat för positiva negativa effekter (PANAS, Krohne et al., 1996). STAI är en inventering för att bedöma deltagarnas egenskaper och/eller tillståndsångest och består av 20 objekt för både egenskaps- och tillståndsversionen. Deltagarnas ångestnivå innan (M = 37.06, SD = 7.80) och efter (M = 39.33, SD = 9.16) experimentet förändrades inte signifikant [t(32) = 1.61, p = 0.117]. Karaktärsångestpoäng i det aktuella urvalet varierade mellan 20 och 58 (M = 36.6, SD = 8.98), vilket är jämförbart med det publicerade normalintervallet för vuxna (Laux et al., 1981). PANAS (Krohne et al., 1996) är ett index för positiv och negativ stämning. Individer med höga poäng på skalan för positiva effekter (PAS) är benägna att få känslor som entusiasm, medan individer med höga poäng på negativa effekter-skalan (NAS) är benägna att få känslor som nöd. Varje objekt består av ett adjektiv och deltagarna anger på en skala som sträcker sig från 1 (väldigt lite) till 5 (extremt) i vilken utsträckning adjektivet reflekterar deras känslor i just det ögonblicket. Inga signifikanta skillnader hittades i deltagarnas negativa påverkan som ett resultat av experimentet [börja: M = 11.67, SD = 2.29; slutet: M = 12.88, SD = 4.69; t(32) = 1.55, p = 0.130]. På något sätt ändrade deltagarna avsevärt sitt positiva humör från början (M = 26.72, SD = 4.70) till slutet (M = 23.66, SD = 7.02) av experimentet [t(31) = 3.11, p = 0.004]. Denna minskning av deltagarnas positiva humör kan ha varit relaterad till det obehagliga i paradigmet (smärtsamma elektriska stötar såväl som aversivt vitt brus presenterades).

Tillvägagångssätt

Vid ankomsten till laboratoriet läste och undertecknade deltagarna ett informerat samtyckesformulär som godkänts av den etiska kommittén vid institutionen för psykologi vid universitetet i Würzburg. De informerades inte om händelsen mellan CSs och USs. Efter att ha fyllt i frågeformulären fästes elektroderna och smärttröskelproceduren utfördes enligt ovan.

Under tillvänjningsfasen, presenterades de fyra geometriska formerna två gånger med ett mellanförsöksintervall (ITI) som varierade mellan 18 och 25 s (medelvärde: 21.5 s). Inga US- eller skrämselsonder levererades under denna fas.

Före förvärvsfasen levererades sju anfall av vitt brus var 7–15:e s för att minska den initiala skrämselreaktiviteten.

Följande två förvärvsfaserna var identiska (bild 1). Varje förvärvsfas bestod av 24 försök: 8 CS– försök, 8 avCS+ försök och 8 appCS+ försök. CS-sekvensen var pseudoslumpmässig med den enda begränsningen att samma stimulus inte kunde presenteras mer än två gånger i rad. Noterbart presenterades avCS+ tillsammans med en blixt som en symbol för elchocken och det smärtsamma US levererades vid offset. AppCS+ presenterades i sammansättning med en bild av Smarties eller en salt kringla och deltagaren kunde välja en Smarties eller en kringla från en burk. CS– presenterades tillsammans med en förbudssymbol och inget USA levererades. Under tre av de 8 CS-presentationerna av varje typ levererades en skräcksond mellan 4 och 6 sekunder efter stimulansstart. Tre ytterligare skrämselsonder presenterades under ITIs för att säkerställa deras oförutsägbarhet och för att minska tillvänjning av skräck. ITI, som består av en svart skärm, varierade mellan 18 och 25 s med ett medelvärde på 21.5 s.

BILD 1

www.frontiersin.org

Figur 1. Försök under de två förvärvsfaserna (A) och utrotningsfasen (B). Deltagarna lärde sig att en form (avCS+) förutspådde en mild smärtsam elektrisk stöt, en form (appCS+) förutspådde antingen en bit choklad eller en liten salt kringla (enligt deras preferenser), och en tredje form (CS–) förutsade inte någon biologiskt framträdande händelse. Varje form presenterades i samband med en bild som föreställer en elektrisk stöt, smarties/salt kringla eller ingenting beroende på kopplingen till USA. Under utrotningsfasen presenterades de tre geometriska formerna ännu en gång, men inga US levererades. Dessutom presenterades en fjärde geometrisk form (NY) som en neutral kontroll.

Under utrotningsfas, såg deltagarna de tre geometriska formerna (dvs. avCS+, appCS+ och CS–) igen plus en ny neutral form (NY). Inget USA levererades och formerna presenterades inte i samband med bilder av blixtar, choklad/salt kringla eller banor. Varje stimulus presenterades åtta gånger i en pseudoslumpmässig ordning (dvs. samma stimulus presenterades inte mer än två gånger i rad), vilket skapade 32 försök. Skräcksondstimuli presenterades under 4 av 8 stimuluspresentationer av varje CS-typ. Liksom i förvärvs- och tillvänjningsfasen varierade ITI:erna mellan 18 och 25 sekunder, och 4 ytterligare skrämselsonder levererades oförutsägbart under ITI:erna.

Efter varje fas bedömde deltagarna valensen (behagligheten) och upphetsningen (excitatorisk) hos CSs med visuella analoga skalor (VAS) som sträckte sig från 1 till 9. Valansskalan sträckte sig från "1" vilket indikerar "mycket obehagligt" till "9" indikerar "mycket trevlig;" upphetsningsskalan varierade från "1" som indikerar "lugn" till "9" som indikerar "spännande". Dessutom utvärderades riskklassificeringar efter de två förvärvsfaserna och utrotningsfasen. Deltagarna såg en geometrisk form i 1 s och sedan fick de ange om denna form var associerad med elchocken, med choklad/salt kringla, med ingenting, eller om de inte kunde göra någon association. Noterbart var att alla deltagare (utom en) var medvetna om oförutsedda händelser efter förvärv 2.

Datareduktion

Fysiologiska svar registrerades med en V-Amp 16-förstärkare och Vision Recorder V-Amp Edition-programvara (version 1.03.0004, BrainProducts Inc., München, Tyskland). En samplingshastighet på 1000 Hz och ett 50 Hz notchfilter användes. Offlineanalyserna utfördes med Brain Vision Analyzer (version 2.0; BrainProducts Inc., München, Tyskland).

Skrämma svar

Skrämselsvaret mättes med hjälp av elektromyografi (EMG) till vänster orbicularis oculi muskel med två 5 mm Ag/AgCl-elektroder. I enlighet med riktlinjer (Blumenthal et al., 2005) placerades en elektrod under pupillen och den andra 1 cm i sidled. Jord- och referenselektroderna placerades på höger respektive vänster mastoid. Innan elektroderna fästes, nöts huden lätt och rengjordes med alkohol för att hålla impedansen under 10 kΩ. Den elektromyografiska signalen filtrerades offline med ett 28 Hz low cutoff-filter och ett 500 Hz high cutoff-filter. Sedan korrigerades EMG-signalen och ett glidande medelvärde på 50 ms applicerades. Vi använde 50 ms innan startle-proben började som baslinje (Grillon et al., 2006). Svar på skrämselprober poängsattes manuellt och försök med överdrivna baslinjeförskjutningar (±5 μV) eller rörelseartefakter uteslöts från ytterligare analys. Skräcksvar lägre än 5 μV kodades som noll och beaktades för beräkningen av skrämselstorlek (Blumenthal et al., 2005). Sammanlagt avvisades 10.4 % av försöken, och minst 2 av 3 skrämselsvar i förvärvsfaserna och 4 av 8 skrämselsvar i utrotningsfasen för varje tillstånd krävdes för att behålla deltagaren i analyspoolen. Av denna anledning exkluderades fyra deltagare. Toppamplituden definierades som den maximala toppen i förhållande till baslinjen under tidsfönstret på 20–120 ms efter startle-probens start. Rådata normaliserades sedan inom försökspersoner med användning av z-poäng och sedan T-poäng för att minska påverkan av individuell variabilitet och för att bättre upptäcka psykologiska processer. T-poängen togs i medeltal för varje tillstånd (avCS+, appCS+, CS–, NEW och ITI). För att undersöka skrämselpotentiering eller skräckdämpning subtraherades poängen för ITI skrämselsvaren från skrämselsvaren för varje tillstånd.

Skin Conductance Response (SCR)

Hudkonduktanssvar (SCR) registrerades med användning av två 5 mm Ag/AgCl-elektroder placerade på handflatan av den icke-dominanta handen. Det galvaniska svaret filtrerades offline med ett 1 Hz high cutoff-filter. SCR definierades som skillnaden (i μS) mellan responsstart (1–3 sekunder efter stimulansstart) och responstoppen (Tranel och Damasio, 1994; Delgado et al., 2011). Försök som innehöll skrämselsonder beaktades inte i analysen av SCR. Svar under 0.02 μS kodades som noll. Ytterligare fem deltagare uteslöts från SCR-analysen eftersom de hade en genomsnittlig SCR lägre än 0.02 μS. De råa hudkonduktansdatana kvadratrottransformerades för att normalisera fördelningen och medelvärdena beräknades för varje tillstånd separat för de två förvärvsfaserna (avCS+, appCS+, CS–) och extinktionsfasen (avCS+, appCS+, CS– och NEW ).

Statistisk analys

All data analyserades med SPSS för Windows (Version 20.0, SPSS Inc.). För de fysiologiska svaren beräknades separerade multivariata variansanalyser (ANOVA) för de två förvärvsfaserna och extinktionsfasen. ANOVA för förvärvsfaserna hade stimulans (avCS+, appCS+, CS–) och fas (Acquisition 1, Acquisition 2) som faktorer inom subjekten. ANOVA för utsläckningsfasen hade bara stimulans (avCS+, appCS+, CS–, NEW) som en inom-subjektsfaktor. Valens, upphetsning och oförutsedda betyg analyserades med separata ANOVAs innehållande inom-subjektsfaktorerna stimulus (avCS+, appCS+, CS– och NEW) och fas. Denna faktor hade fyra nivåer för valens- och upphetsningsbetyg (T1: efter tillvänjningsfas, T2: efter första förvärvsfasen, T3: efter andra förvärvsfas, T4: efter utrotningsfas), men tre nivåer för beredskapsklassificeringarna (T1: efter första förvärvsfasen, T2: efter andra förvärvsfasen, T3: efter utrotningsfasen).

Alfa(α)-nivån sattes till 0.05 för alla analyser. Effektstorleken rapporteras som partiell η2.

Resultat

Valens- och upphetsningsvärdena för varje fas visas i figuren 2; skrämselsvaren och SCRs avbildas i figur 3.

BILD 2

www.frontiersin.org

Figur 2. Betyg för valens (A) och upphetsning (B). Linjer (med standardfel) visar betygen efter tillvänjningsfasen (T1), Acquisition 1 (T2), Acquisition 2 (T3) och extinktionsfasen (T4). Den aversiva CS+ (svart heldragen linje) fick negativ valens och hög upphetsning efter de två förvärvsfaserna jämfört med CS- (svart streckad linje) och NEW (svart prickad linje). Viktigt är att den aptitliga CS+ (grå heldragen linje) fick positiv valens jämfört med CS– och NEW. *p <0.05, **p > 0.01,***p <0.001.

BILD 3

www.frontiersin.org

Figur 3. Skräcksvar (A) och hudkonduktans (B) (med standardfel) under den första förvärvsfasen (Acq1), den andra förvärvsfasen (Acq2) och extinktionsfasen (Ext). Skrämselreaktioner potentierades signifikant till aversiva CS+ (svart heldragen linje) och försvagades signifikant till aptitretande CS+ (grå heldragen linje) jämfört med CS- (svart streckad linje) under förvärvsfaserna. SCR var betydligt högre för avCS+ och appCS+ jämfört med CS–. Inga skillnader avslöjades under utrotningsfasen. *p <0.05, **p > 0.01,***p <0.001.

Betyg

ANOVA för valensbetyg under förvärvet avslöjade betydande huvudeffekter av stimulans [F(3, 93) = 17.26, GG-e = 0.801, p < 0.001, partiell η2 = 0.358] och fas [F(3, 93) = 3.30, GG-e = 0.731, p = 0.039, partiell η2 = 0.096] samt en signifikant interaktion mellan stimulus och fas [F(9, 279) = 9.54, GG-e = 0.463, p < 0.001, partiell η2 = 0.235]. Uppföljning t-test tyder på att valenserna för de fyra geometriska formerna i början av experimentet var identiska (ps > 0.19), medan efter både förvärv 1 och förvärv 2 bedömdes avCS+ som särskilt negativt och appCS+ som särskilt positivt. Specifikt bedömdes avCS+ som mer negativt valens jämfört med CS– [Acq1: t(31) = 2.34, p = 0.026; Acq2: t(31) = 3.07, p = 0.004], den NYA [Acq1: t(31) = 2.70, p = 0.011; Acq2: t(31) = 3.89, p < 0.001] och appCS+ [Acq1: t(31) = 5.41, p < 0.001; Acq2: t(31) = 6.11, p < 0.001]. appCS+ bedömdes som betydligt mer positiv än CS– [Acq1: t(31) = 4.99, p < 0.001; Acq2: t(31) = 5.31, p < 0.001] och den NYA [Acq1: t(31) = 4.92, p < 0.001; Acq2: t(31) = 4.14, p < 0.001]. Skillnaderna mellan CS– och NEW var aldrig signifikanta (ps > 0.18).

Viktigt är att inga signifikanta skillnader hittades när man jämförde valensvärdena för appCS+ förknippad med choklad kontra salt kringla [Acq1: t(30) = 0.03, p = 0.477; Acq2: t(30) = 0.29, p = 0.775].

Efter utrotningsfasen bedömdes avCS+ fortfarande som mer negativt jämfört med CS– [t(31) = 2.40, p = 0.023], den NYA [t(31) = 3.40, p = 0.002], och appCS+ [t(31) = 3.35, p = 0.002]. Tvärtom, valensen för appCS+ skiljde sig inte längre från CS– [t(31) = 1.77, p = 0.086] eller den NYA [t(31) = 1.07, p = 0.293].

ANOVA för upphetsningsbetyg under förvärvet avslöjade en betydande huvudeffekt av stimulans [F(3, 96) = 7.07, GG-e = 0.737, p = 0.001, partiell η2 = 0.181], men inte av fas [F(3, 96) = 1.27, GG-e = 0.805, p = 0.289, partiell η2 = 0.038], och en signifikant interaktion mellan stimulus och fas [F(9, 288) = 4.53, GG-e = 0.582, p = 0.001, partiell η2 = 0.124]. Uppföljning t-tester visade inga signifikanta skillnader mellan stimuli när det gäller deras initiala upphetsning (ps > 0.74). Men efter de två förvärvsfaserna bedömdes avCS+ som mer upphetsande än NYA [Acq1: t(32) = 2.99, p = 0.005; Acq2: t(32) = 5.97, p < 0.001] och appCS+ [Acq1: t(32) = 2.62, p = 0.013; Acq2: t(32) = 4.42, p < 0.001], och marginellt mer upphetsande än CS – efter den första förvärvsfasen [t(32) = 1.96, p = 0.058], men betydligt mer upphetsande efter den andra förvärvsfasen [t(32) = 3.65, p = 0.001]. I motsats till valensvärdena skilde sig upphetsningen av appCS+ inte från upphetsningen av CS– och den NYA (ps > 0.13) efter förvärvsfaserna.

På samma sätt som med valensvärdena skilde sig inte CS– och NEW i sin upphetsning (ps > 0.07).

Liksom fallet var för valens avslöjades inga skillnader för appCS+ förknippad med chokladen och appCS+ förknippad med den salta kringlan [Acq1: t(31) = 0.26, p = 0.797; Acq2: t(31) = 0.33, p = 0.724].

Efter utrotningsfasen avslöjades inga signifikanta skillnader i upphetsningsvärdena (ps > 0.08).

För ytterligare post-hoc t-tester som jämför betygen efter tillvänjningsfasen, den första och andra förvärvsfasen och utrotningsfasen, se Kompletterande material.

Skrämma svar

ANOVA för förvärvsfaserna gav en huvudeffekt av stimulans [F(2, 64) = 49.92, GG-e = 0.964, p < 0.001, partiell η2 = 0.609], men inte fas [F(1, 32) = 3.16, p = 0.085, partiell η2 = 0.090], och en signifikant interaktion Stimulus × Fas [F(2, 64) = 3.37, GG-e = 0.875, p = 0.048, partiell η2 = 0.095]. Uppföljning t-tester avslöjade signifikant skräckpotentiering för avCS+ jämfört med CS– under både de första [t(32) = 3.27, p = 0.003] och den andra [t(32) = 4.00, p < 0.001] förvärvsfaser. Skrämselsvar på avCS+ var också signifikant potentierade jämfört med dem på appCS+, återigen efter både förvärv 1 [t(32) = 8.20, p < 0.001] och förvärv 2 [t(32) = 5.74, p < 0.001]. Viktigt är att skrämselstorleken för appCS+ var avsevärt försvagad jämfört med CS– under både förvärv 1 [t(32) = 6.34, p < 0.001] och förvärv 2 [t(32) = 2.91, p = 0.007]. Återigen och i linje med betygen avslöjades inga olika skrämselsvar för appCS+ när den associerades med chokladen eller med den salta kringlan [Acq1: t(31) = 1.04, p = 0.309; Acq2: t(31) = 0.07, p = 0.947]. Under utrotningsfasen hittades ingen signifikant effekt [F(3, 96) = 0.26, GG-e = 0.906, p = 0.833, partiell η2 = 0.008].

Skin Conductance Response (SCR)

Från ANOVA för SCR under de två förvärvsfaserna, stimulansen för de viktigaste effekterna [F(2, 54) = 18.04, GG-e = 0.908, p < 0.001, partiell η2 = 0.401] och fas [F(1, 27) = 20.91, p < 0.001, partiell η2 = 0.436] visade sig vara signifikant, men inte deras interaktion [F(2, 54) = 0.68, GG-e = 0.637, p = 0.451, partiell η2 = 0.024]. Post-hoc t-tester visade signifikant högre SCR för avCS+ [t(27) = 6.46, p < 0.001] och till appCS+ [t(27) = 4.84, p < 0.001] jämfört med CS–, medan deltagarna visade jämförbar SCR med avCS+ och appCS+ [t(27) = 0.64, p = 0.527]. Noterbart, inga skillnader i SCRs till choklad appCS+ och till salta kringla appCS+ hittades [Acq1: t(26) = 2.55, p = 0.120; Acq2: t(26) = 1.29, p = 0.210]. Som var sant för betygen och skrämselsvaret, hittades inga signifikanta effekter för utrotningsfasen [F(3, 81) = 0.28, GG-e = 0.634, p = 0.743, partiell η2 = 0.010].

Diskussion

Målet med denna studie var att översätta djurfynd till människor genom att använda ett klassiskt aptitkonditioneringsparadigm med en primär förstärkare som obetingad stimulans (US). För att göra det kom deltagarna till labbet tidigt på morgonen utan frukost för att försäkra sig om att de var hungriga, och enligt deras preferenser användes bitar av choklad eller salta kringlor som aptitretande USs. Under förvärvsfasen blev en geometrisk form (avCS+) associerad med en lätt smärtsam elektrisk stöt (aversiv US), en annan form (appCS+) med den aptitliga US och en tredje form (CS–) med varken den aptitliga US eller med aversiva USA. Resultaten indikerar framgångsrik aversiv och aptitlig konditionering på den explicita verbala nivån (dvs. betyg), på den implicita beteendenivån (dvs. skrämselsvar) och på den fysiologiska nivån (dvs. SCR). Specifikt framkallade avCS+ jämfört med CS– fler negativa valensvärden, högre upphetsningsvärden, skrämselpotentiering och högre SCR. Det viktigaste är att appCS+ jämfört med CS– utlöste fler positiva valensvärden, skrämseldämpning och högre SCR. Våra resultat om aversiv konditionering var i linje med förväntningarna, eftersom tidigare studier har funnit att ett stimulusförutsägande hot (avCS+) bedöms som aversivt, framkallar större rädsla och ökar fysiologisk upphetsning (Fendt och Fanselow, 1999; Hamm och Weike, 2005; Andreatta et al., 2010, 2013). Våra resultat om aptitlig konditionering var också i linje med tidigare studier på människor och djur som visade att en stimulansförutsägande belöning (appCS+) bedöms som positiv, hämmar rädslareaktioner och ökar fysiologisk upphetsning (Koch et al., 1996; Gottfried et al., 2002; Kumar et al., 2008; Klucken et al., 2009, 2013; Austin och Duka, 2010; Prévost et al., 2012). Såvitt vi vet är detta den första studien som visar betingad skräckdämpning hos människor till en stimulans som förutsäger en primär belöning. Viktigt är att vi kunde överföra och bekräfta resultaten av en djurstudie (Koch et al., 1996). Denna djurstudie visade att skrämseldämpning hos råttor beror på projektioner från NAcc (en del av ventral striatum) till PnC. Därför kan skräckdämpningen i vår studie innebära NAcc-aktivitet, vilket också är i linje med fMRI-fynd (Gottfried et al., 2002; Kumar et al., 2008; Klucken et al., 2009, 2013; Delgado et al., 2011; Levy och Glimcher, 2011). Därför drar vi slutsatsen att vårt paradigm för aptitkonditionering var framgångsrikt, vilket både den explicita (betygen) och den implicita (överskräckningsdämpningen) positiva valensen indikerade.

Utöver detta nya men ganska förutsägbara fynd förtjänar ytterligare två intressanta resultat att nämnas. Först dissocierade verbala och fysiologiska upphetsningssvar på appCS+. För det andra hittade vi snabbare utrotning av de aptitliga CRs jämfört med de aversiva CRs.

SCR indikerar sympatisk aktivering, som ökas till både den belöningsassocierade stimulansen (appCS+) och den hotassocierade stimulansen (avCS+). Detta resultat är i linje med en tidigare konditioneringsstudie, där erotiska bilder användes som aptitretande US (Klucken et al., 2013), och en studie som avslöjar jämförbar SCR med en cue som förutsäger pengar och en cue som förutsäger ett aversivt brus (Austin och Duka, 2010). Noterbart är SCR ett orienterande svar relaterat till aktiveringen av det sympatiska systemet. Detta svar har föreslagits för att återspegla förberedelsen av en beteendereaktion på motiverande framträdande händelser (Bradley, 2009). Utifrån detta tror vi att både de hotrelaterade och belöningsrelaterade stimulierna framkallade ett förberedande svar för successiva beteendesvar. Mat och smärtsignaler initierade med andra ord förberedelse för närmande respektive undvikandebeteende. I motsats till den höga fysiologiska upphetsningen indikerade verbala svar låg upphetsning av den belöningsassocierade stimulansen. Det är möjligt att verbal upphetsning kan vara mer påverkad av USA:s upphetsande natur snarare än den fysiologiska aktiveringen per se. Faktum är att vi tror att appCS+ kontra avCS+ bedömdes som låga kontra mycket upphetsande eftersom de var kopplade till låga respektive mycket upphetsande USs. Tyvärr har vi inte samlat in upphetsningsbetyg för USA, och därför kommer det att vara upp till framtida studier att testa denna hypotes explicit.

Under utrotningsfasen levererades inget USA. Detta kan ha inducerat en ny hämmande inlärning som kallas utrotning (för en recension se Milad och Quirk, 2012), med både aversiva och aptitliga CRs som minskar som en konsekvens. Uppenbarligen, på de beteendemässiga (dvs. skrämselsvar) och på de fysiologiska (dvs. SCR) nivåerna, var inga differentiella reaktioner på avCS+, appCS+ och CS– längre detekterbara. På liknande sätt utjämnades den explicita upphetsningen av de betingade stimuli som bedömdes efter utrotningsfasen på en låg nivå, vilket tyder på framgångsrik utrotningsinlärning. AvCS+ bedömdes dock fortfarande vara betydligt mer negativt än CS–, medan appCS+-valensen inte längre skilde sig från CS–-valensen. Den långsammare utplåningen av det aversiva uttryckliga svaret kan bero på en evolutionär konservatism, vilket innebär att hotsignaler är särskilt svåra att glömma eftersom ett uteblivet svar på en hotsignal kan vara livshotande.

En fråga kvarstår fortfarande: varför slocknade då skrämselsvaret (dvs den implicita valensen) helt under utrotningsfasen? Först beräknades dessa svar under hela fasens gång. Därför är det tänkbart att diskriminerande CR fortfarande skulle kunna detekteras under de första försöken av utrotningsfasen. På ett utforskande sätt följde vi denna hypotes och tittade på både skrämselsvaren och SCR under utrotningsfasen (se tilläggsmaterial). Även om vi inte hittade signifikanta skillnader, observerade vi något högre skräckmagnitud för avCS+ jämfört med CS– och den nya kontrollstimulusen. Vi observerade också något mer skrämmande dämpning av appCS+ jämfört med CS– och den nya kontrollstimulansen i början av utrotningsfasen, som dock försvann inom några få försök. SCR till appCS+ sjönk redan efter andra extinktionsförsöket, medan SCR till avCS+ förblev högre för nästan all utrotning jämfört med SCR till NEW. Även om vi bör tolka dessa resultat med stor försiktighet, verkade skrämselsvaren vara parallella med valensvärdena. Dessutom stödjer både skrämselsvar och SCR ytterligare idén om en evolutionär konservatism mot hotstimuli.

Slutligen måste vi erkänna några begränsningar i denna studie. För det första, på grund av ett tekniskt problem kunde vi inte rapportera betyg om behaglighet (och upphetsning) för chokladen och den salta kringlan. De aptitliga CRs tyder dock på att deltagarna verkligen upplevde de två USA som aptitliga. För det andra, varaktigheten av det motbjudande och det aptitliga USA skilde sig mycket åt. Således gavs den smärtsamma elektriska stöten vid förskjutningen av avCS+ och varade exakt 200 ms, medan chokladen och den salta kringlan presenterades för deltagarna cirka 2 sekunder efter appCS+-starten, och varaktigheten var odefinierbar eftersom den berodde på hur snabbt individen åt dem. Valet att leverera de aptitliga USs på detta sätt baserades på en tidigare studie på människor (Prévost et al., 2012). Det skulle dock vara metodologiskt mer elegant att leverera ett aptitligt USA som är mer jämförbart med det aversiva USA, till exempel en klunk juice eller ginger ale med appCS+ offset. För att kompensera för denna stora perceptuella skillnad presenterade vi geometriska former i samband med en visuell stimulans som symboliserar USA. För det tredje kan vi inte definitivt utesluta möjligheten att de snabbt utsläckta fysiologiska svaren i utrotningsfasen beror på en metodologisk aspekt. Faktum är att de visuella stimulierna i denna fas inte presenterades i samband med den amerikanska symbolen som var fallet i förvärvsfaserna. Det är möjligt att presentationen av CS enbart kan ha påverkat CR och av den anledningen var inga signifikanta skillnader synliga under de första utrotningsförsöken. Men våra snabba släckta svar är i linje med de släckta svaren i en tidigare studie där CS+ (ansikte) presenterades i förening med USA (skrik) under förvärvet men inte under utplåningen (Lissek et al., 2008).

Sammanfattningsvis hittade vi framgångsrika aversiva och aptitliga betingade svar på en stimulans associerad med hot respektive på en stimulans associerad med belöning. Intressant nog fungerade den explicita (betygen) och den implicita (överskräckningsreflexen) nivån av svar på ett synergiskt sätt, i det att avCS+ rapporterades som negativ och inducerad skräckpotentiering och appCS+ rapporterades som positiv och inducerad skräckdämpning. Dessutom dissocierade explicit (betyg) och fysiologisk (SCR) upphetsning av appCS+, vilket återspeglar två distinkta processer.

Intresseanmälan

Författarna förklarar att forskningen genomfördes i avsaknad av kommersiella eller finansiella relationer som kan tolkas som en potentiell intressekonflikt.

Erkännanden

Detta arbete stöddes av Collaborative Research Center "Fear, Anxiety, and Anxiety Disorders," SFB-TRR 58, projekt B1.

Extramaterial

Det kompletterande materialet för denna artikel finns online på: http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fnbeh.2015.00128/abstract

Referensprojekt

Andreatta, M., Mühlberger, A., Glotzbach-Schoon, E. och Pauli, P. (2013). Smärtans förutsägbarhet vänder valensvärdena för en lindringsassocierad stimulans. Främre. Syst. Neurosci. 7:53. doi: 10.3389/fnsys.2013.00053

PubMed Abstract | CrossRef Full Text | Google Scholar

Andreatta, M., Mühlberger, A., Yarali, A., Gerber, B. och Pauli, P. (2010). En klyfta mellan implicit och explicit betingad valens efter smärtlindrande inlärning hos människor. Proc. Biol. sci. 277, 2411-2416. doi: 10.1098/rspb.2010.0103

PubMed Abstract | CrossRef Full Text | Google Scholar

Austin, AJ och Duka, T. (2010). Mekanismer för uppmärksamhet för aptitliga och aversiva resultat i Pavlovsk konditionering. Behav. Brain Res. 213, 19-26. doi: 10.1016 / j.bbr.2010.04.019

PubMed Abstract | CrossRef Full Text | Google Scholar

Blumenthal, TD, Cuthbert, BN, Filion, DL, Hackley, S., Lipp, OV, och van Boxtel, A. (2005). Kommittérapport: riktlinjer för elektromyografiska studier av mänskliga ögonblinkningar. Psychophysiology 42, 1-15. doi: 10.1111 / j.1469-8986.2005.00271.x

PubMed Abstract | CrossRef Full Text | Google Scholar

Bouton, ME och Peck, CA (1989). Kontexteffekter på konditionering, utrotning och återinförande i en aptitretande konditioneringspreparat. Anim. Lära sig. Behav. 17, 188-198. doi: 10.3758 / BF03207634

CrossRef Full Text | Google Scholar

Bradley, MM (2009). Naturlig selektiv uppmärksamhet: orientering och känslor. Psychophysiology 46, 1-11. doi: 10.1111 / j.1469-8986.2008.00702.x

PubMed Abstract | CrossRef Full Text | Google Scholar

Clark, JJ, Hollon, NG och Phillips, PEM (2012). Pavlovska värderingssystem i lärande och beslutsfattande. Curr. Opin. Neurobiol. 22, 1054-1061. doi: 10.1016/j.conb.2012.06.004

PubMed Abstract | CrossRef Full Text | Google Scholar

Delgado, MR, Jou, RL och Phelps, EA (2011). Neurala system som ligger bakom aversiv konditionering hos människor med primära och sekundära förstärkare. Främre. Neurosci. 5: 71. doi: 10.3389 / fnins.2011.00071

PubMed Abstract | CrossRef Full Text | Google Scholar

Dickinson, A. och Balleine, B. (1994). Motiverande styrning av målstyrt handlande. Anim. Lära sig. Behav. 22, 1-18. doi: 10.3758 / BF03199951

CrossRef Full Text | Google Scholar

Fendt, M. och Fanselow, MS (1999). Den neuroanatomiska och neurokemiska grunden för betingad rädsla. Neurosci. Biobehav. Varv. 23, 743-760. doi: 10.1016/j.ijpsycho.2012.09.006

PubMed Abstract | CrossRef Full Text | Google Scholar

Gottfried, JA, O'Doherty, J. och Dolan, RJ (2002). Appetitiv och aversiv luktinlärning hos människor studeras med hjälp av händelserelaterad funktionell magnetisk resonanstomografi. J. Neurosci. 22, 10829-10837. Tillgänglig online på: http://www.jneurosci.org/content/22/24/10829.full

PubMed Abstract

Grillon, C., Baas, JM, Cornwell, B. och Johnson, L. (2006). Kontextkonditionering och beteendeundvikande i en virtuell verklighetsmiljö: effekten av förutsägbarhet. Biol. Psykiatri 60, 752-759. doi: 10.1016 / j.biopsych.2006.03.072

PubMed Abstract | CrossRef Full Text | Google Scholar

Hamm, AO och Weike, AI (2005). Neuropsykologin för inlärning av rädsla och rädslareglering. Int. J. Psychophysiol. 57, 5-14. doi: 10.1016/j.ijpsycho.2005.01.006

PubMed Abstract | CrossRef Full Text | Google Scholar

Klucken, T., Schwekendiek, J., Merz, CJ, Tabbert, K., Walter, B., Kagerer, S., et al. (2009). Neurala aktiveringar av förvärvet av betingad sexuell upphetsning: effekter av beredskapsmedvetenhet och sex. J. Sex. Med. 6, 3071-3085. doi: 10.1111 / j.1743-6109.2009.01405.x

PubMed Abstract | CrossRef Full Text | Google Scholar

Klucken, T., Wehrum, S., Schweckendiek, J., Merz, CJ, Hennig, J., Vaitl, D., et al. (2013). 5-HTTLPR-polymorfismen är förknippad med förändrade hemodynamiska svar under aptitret konditionering. Brum. Brain Mapp. 34, 2549-2560. doi: 10.1002/hbm.22085

PubMed Abstract | CrossRef Full Text | Google Scholar

Koch, M. (1999). Skräckens neurobiologi. Prog. Neurobiol. 59, 107–128. doi: 10.1016/S0301-0082(98)00098-7

PubMed Abstract | CrossRef Full Text | Google Scholar

Koch, M., Schmid, A. och Schnitzler, H.-U. (1996). Nöjesdämpning av skräck störs av lesioner i nucleus accumbens. Neuroreport 7, 1442–1446. doi: 10.1097/00001756-199605310-00024

PubMed Abstract | CrossRef Full Text | Google Scholar

Krohne, HW, Egloff, B., Kohmann, C.-W. och Tausch, A. (1996). Untersuchungen mit einer tysk version av "Positive and Negative Affect Schedule" (PANAS). Diagnostica 42, 139-156.

Google Scholar

Kumar, P., Waiter, G., Ahearn, T., Milders, M., Reid, I. och Steele, JD (2008). Onormal tidsskillnad belöningsinlärningssignaler vid egentlig depression. Hjärna 131, 2084-2093. doi: 10.1093 / hjärna / awn136

PubMed Abstract | CrossRef Full Text | Google Scholar

Laux, L., Glanzmann, P., Schaffner, P. och Spielberger, CD (1981). Das State-Trait Angstinventar. Weinheim: Beltz Test.

Levy, DJ och Glimcher, PW (2011). Jämföra äpplen och apelsiner: genom att använda belöningsspecifik och belöningsgenerell subjektiv värderepresentation i hjärnan. J. Neurosci. 31, 14693-14707. doi: 10.1523 / JNEUROSCI.2218-11.2011

PubMed Abstract | CrossRef Full Text | Google Scholar

Lissek, S., Levenson, J., Biggs, AL, Johnson, LL, Ameli, R., Pine, DS, et al. (2008). Förhöjd rädslakonditionering till socialt relevanta obetingade stimuli vid social ångest. Am. J. Psychiatry 165, 124-132. doi: 10.1176 / appi.ajp.2007.06091513

PubMed Abstract | CrossRef Full Text | Google Scholar

Martin-Soelch, C., Linthicum, J. och Ernst, M. (2007). Appetitiv konditionering: neurala baser och konsekvenser för psykopatologi. Neurosci. Biobehav. Varv. 31, 426-440. doi: 10.1016 / j.neubiorev.2006.11.002

PubMed Abstract | CrossRef Full Text | Google Scholar

McDannald, MA, Lucantonio, F., Burke, KA, Niv, Y. och Schoenbaum, G. (2011). Ventral striatum och orbitofrontal cortex krävs båda för modellbaserad, men inte modellfri, förstärkningsinlärning. J. Neurosci. 31, 2700-2705. doi: 10.1523 / JNEUROSCI.5499-10.2011

PubMed Abstract | CrossRef Full Text | Google Scholar

Milad, MR och Quirk, G. (2012). Utrotning av rädsla som modell för translationell neurovetenskap: tio år av framsteg. Annu. Rev. Psychol. 63, 129-111. doi: 10.1146 / annurev.psych.121208.131631

PubMed Abstract | CrossRef Full Text | Google Scholar

Pavlov, IP (1927). Betingade reflexer: en undersökning av den fysiologiska aktiviteten i hjärnbarken. London: Oxford University Press.

Google Scholar

Prévost, C., Liljeholm, M., Tyszka, JM och O'Doherty, JP (2012). Neurala korrelat av specifik och allmän Pavlovian-till-instrumentell överföring inom mänskliga amygdalära subregioner: en högupplöst fMRI-studie. J. Neurosci. 32, 8383-8390. doi: 10.1523/jneurosci.6237-11.2012

PubMed Abstract | CrossRef Full Text | Google Scholar

Tranel, D. och Damasio, H. (1994). Neuroanatomiska korrelat av elektrodermala hudkonduktanssvar. Psychophysiology 31, 427–438. doi: 10.1111/j.1469-8986.1994.tb01046.x

PubMed Abstract | CrossRef Full Text | Google Scholar

Nyckelord: klassisk konditionering, belöning, bestraffning, skräckreflex, hudkonduktansrespons

Citat: Andreatta M och Pauli P (2015) Appetitiv vs. aversiv konditionering hos människor. Främre. Behav. Neurosci. 9: 128. doi: 10.3389 / fnbeh.2015.00128

Mottaget: 11 februari 2015; Godkänd: 05 maj 2015;
Publicerad: 19 maj 2015.

Redigerad av:

Niels Birbaumer, University of Tuebingen, Tyskland

Recenserad av:

Tim Klucken, Justus Liebig University Giessen, Tyskland
Alessandro Angrilli, Padovas universitet, Italien

Copyright © 2015 Andreatta och Pauli. Detta är en artikel med öppen tillgång som distribueras under villkoren i Creative Commons Attribution License (CC BY). Användning, distribution eller reproduktion i andra forum är tillåten, förutsatt att den ursprungliga författaren eller licensgivaren krediteras och att den ursprungliga publikationen i denna tidskrift är citerad i enlighet med godkänd akademisk praxis. Ingen användning, distribution eller reproduktion tillåts som inte överensstämmer med dessa villkor.

*Korrespondens: Marta Andreatta, Institutionen för psykologi (biologisk psykologi, klinisk psykologi och psykoterapi), University of Würzburg, Marcusstraße 9-11, D-97070 Würzburg, Tyskland, [e-postskyddad]