Effekter av brunt risspecifikt y-oryzanol vid epigenetisk modulering av dopamin D2-receptorer i hjärnstriatum i fetthalt-inducerad fetma hos möss (2017)

. 2017; 60 (8): 1502 – 1511.

Publicerad online 2017 May 20. doi:  10.1007/s00125-017-4305-4

PMCID: PMC5491592

Abstrakt

Syfte/hypotes

Att äta för mycket fett orsakar fetma hos människor och gnagare. Nyligen genomförda studier på människor och gnagare har visat att beroende av fett har en gemensam mekanism med beroende av alkohol, nikotin och narkotika när det gäller en dysfunktion i hjärnans belöningssystem. Det har framhållits att en diet med hög fetthalt (HFD) dämpar signalering av dopamin D2-receptor (D2R) i striatum, en central regulator av hjärnans belöningssystem, vilket resulterar i hedonisk överätning. Vi har tidigare rapporterat att den bruna risspecifika bioaktiva beståndsdelen γ-oryzanol dämpade preferensen för en HFD via hypotalamuskontroll. Vi undersökte därför möjligheten att γ-oryzanol skulle modulera funktionen hos hjärnans belöningssystem hos möss.

Metoder

C57BL/6J-möss av hankön som matades med en HFD behandlades oralt med y-oryzanol, och striatala nivåer av molekyler involverade i D2R-signalering utvärderades. Effekten av y-oryzanol på DNA-metylering av D2R-promotorn och efterföljande förändringar i preferenser för dietfett undersöktes. Dessutom undersöktes effekterna av 5-aza-2′-deoxycytidin, en potent hämmare av DNA-metyltransferaser (DNMT), på matpreferens, D2R-signalering och nivåerna av DNMT i striatum. De hämmande effekterna av y-oryzanol på aktiviteten av DNMT:er utvärderades enzymatiskt in vitro.

Resultat

I striatum från möss som matades med en HFD minskade produktionen av D2Rs via en ökning av DNA-metylering av promotorregionen av D2R. Oral administrering av y-oryzanol minskade uttrycket och aktiviteten av DNMTs, vilket återställde nivån av D2Rs i striatum. Farmakologisk hämning av DNMT av 5-aza-2'-deoxycytidin förbättrade också preferensen för dietfett. I enlighet med dessa fynd visade enzymatiska in vitro-analyser att y-oryzanol hämmade aktiviteten av DNMT.

Slutsatser/tolkning

Vi visade att y-oryzanol förbättrar HFD-inducerad DNA-hypermetylering av promotorregionen av D2R i striatum hos möss. Vårt experimentella paradigm framhäver γ-oryzanol som ett lovande ämne mot fetma med den distinkta egenskapen att vara en ny epigenetisk modulator.

Elektroniskt kompletterande material

Onlineversionen av den här artikeln (doi:10.1007/s00125-017-4305-4) innehåller expertgranskat men oredigerat tilläggsmaterial som är tillgängligt för behöriga användare.

Nyckelord: DNA-metylering, Dopamin, Epigenetik, Matningsbeteende, Näring, Fetma, Belöning, Striatum, Typ 2-diabetes

Beskrivning

Överätande hos överviktiga individer delar, åtminstone delvis, vanliga mekanismer med beroende av alkohol, nikotin och narkotika []. Förutom hypotalamus och hormonell reglering av aptit, är hjärnans belöningssystem, i synnerhet dopaminreceptorsignalering, nära besläktat med beroendeframkallande eller hedoniskt matbeteende []. En tidigare studie på råttor visade att nedbrytning av den striatala dopamin D2-receptorn (D2R) av lentivirusmedierad kort hårnål som stör RNA snabbt inducerade missbruksliknande belöningsunderskott och tvångsliknande matsökning []. På grund av den minskade D2R-densiteten är ryggstriatum mindre känsligt för matbelöning jämfört med magra kontrollgrupper hos överviktiga människor och gnagare [-]. I enlighet med denna uppfattning är TaqIA allel av ANKK1 genlokus (som kodar för DRD2/ankyrinupprepning och kinasdomän innehållande 1), som minskar striatal D2R-produktion, är associerad med en fet fenotyp hos människor [], medan effekterna av viktminskning efter bariatrisk kirurgi är förknippade med förhöjd striatal D2R-densitet []. Dessa data tyder starkt på vikten av striatal D2R som ett nytt terapeutiskt mål för behandling av fetma. Men vissa läkemedel som utvecklades som verkade på hjärnans belöningssystem orsakade avsevärda negativa effekter, inklusive allvarliga psykiatriska problem, vilket resulterade i att de slutligen drog sig tillbaka från kliniker [].

Epigenetiska modifieringar är avgörande inte bara för utveckling och differentiering, utan också för att de uppstår som ett resultat av miljöförändringar, inklusive i kost och livsstil []. DNA-metylering är en huvudsaklig epigenetisk händelse för stabiliteten av genuttryck []. Hos råttor förändrar moderns exponering för en diet med hög fetthalt (HFD) DNA-metylering mellan generationerna inom det centrala belöningssystemet hos avkomman, vilket leder till överkonsumtion av HFD av ungarna []. I synnerhet spelar DNA-metyltransferaser (DNMT) avgörande roller i regleringen av både matbeteende och fysisk aktivitet [, ], vilket tyder på att DNMT kan vara lovande terapeutiska mål för behandling av fetma-diabetessyndrom. Viktigt är att vissa naturliga livsmedelsbaserade ämnen, inklusive koffeinsyra och epigallokatekin, är kända för att fungera som DNMT-hämmare [, ].

Vi har nyligen visat att den bioaktiva, bruna risspecifika komponenten γ-oryzanol, en blandning av ferulinsyraester och flera fytosteroler, dämpar preferensen för dietfett genom en minskning av stress i hypotalamiskt endoplasmatiskt retikulum (ER).]. Hos möss och kaniner absorberades oralt administrerad γ-oryzanol snabbt från tarmen och distribuerades huvudsakligen till hjärnan [, ]. Om man tar dessa fynd tillsammans kan naturliga livsmedelsbaserade produkter som verkar på det centrala nervsystemet vara ett alternativ för att på ett säkert sätt lindra nedsatt matbeteende vid fetma. I detta sammanhang testade vi hypotesen att γ-oryzanol skulle förändra DNA-metyleringsstatus i hjärnans belöningssystem, vilket resulterade i en försvagning av preferensen för en HFD hos möss.

Metoder

djur

Sju veckor gamla C57BL/6J-hanmöss erhållna från Charles River Laboratories Japan (Kanagawa, Japan) hölls (3–4 per bur) i specifika patogenfria förhållanden vid 24°C under 12 h/12 ​​h ljus/ mörk cykel. Efter en veckas acklimatisering, viktmatchades 8 veckor gamla möss och delades in i två eller tre grupper för att genomgå varje experiment. Mössen fick fri tillgång till mat och vatten. Alla djurförsök godkändes av djurexperimentets etiska kommitté vid University of the Ryukyus (nr 5352, 5718 och 5943).

Administrering av y-oryzanol och 5-aza-2'-deoxycytidin

För att utvärdera preferensen för HFD administrerades γ-oryzanol (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan) till 8 veckor gamla möss genom sondmatning under matvalstestet som tidigare beskrivits [, ]. För de andra experimenten tillverkades en HFD (D12079B; Research Diets, New Brunswick, NJ, USA) innehållande 0.4 % y-oryzanol som pellets. Komponenterna i kosten visas i tabell för elektroniskt tilläggsmaterial (ESM). 1. Efter 12 veckors utfodring samlades vävnad från striatum och hypotalamus. Det dagliga intaget av γ-oryzanol, uppskattat från mössens genomsnittliga födointag, var cirka 320 μg/g kroppsvikt. Doserna av y-oryzanol bestämdes som tidigare beskrivits []. 5-aza-2'-deoxycytidin (5-aza-dC; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) injicerades intraperitonealt (0.25 μg/g kroppsvikt) tre gånger i veckan under 12 veckor [].

Uppskattning av preferens för dietfett

För att utvärdera preferenser för dietfett gav mattester ett val mellan chow och HFD (D12450B och D12451; Forskningsdieter) som tidigare beskrivits []. Kostens komponenter visas i ESM-tabellen 1. Kortfattat fick mössen fri tillgång till chow och HFD. Intag av chow och HFD mättes varje vecka och analyserades för förändringar i preferens för dietfett. HFD-preferens beräknades enligt formeln: HFD-preferens = [(HFD-intag/totalt födointag) × 100].

Bisulfitsekvensering för DNA-metylering

DNA renades med användning av ett DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN, Tokyo, Japan). DNA-lösningen blandades med nyberedd 3 mol/l NaOH, inkuberades vid 37°C under 15 minuter och sattes till 5.3 mol/l urea, 1.7 mol/l natriumbisulfit och 4.9 mmol/l hydrokinon. Lösningen utsattes för 15 cykler av denaturering vid 95°C i 30 s och inkubation vid 50°C i 15 minuter []. Det bisulfitbehandlade DNA:t renades med MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN) och amplifierades med PCR med ett KAPA HiFi HotStart Uracil+ ReadyMix PCR Kit (KAPA Biosystems, Woburn, MA, USA) och primrar runt CpG-stället i promotorregionen av D2R . Primersekvenserna var enligt följande: framåtriktad primer, 5'-GTAAGAATTGGTTGGTTGGAGTTAAAA-3'; omvänd primer, 5'-ACCCTACCCTCTAAAACCACAACTAC-3'. Därefter lades adaptersekvenserna till och rensades upp med hjälp av Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, Brea, CA, USA). Prover slogs sedan samman och laddades på en GS Junior (Roche Diagnostics, Tokyo, Japan) för sekvensering enligt tillverkarens protokoll. Metyleringsnivån uttrycktes som procentandelen metylerade cytosiner i alla cytosinrester.

DNMT-aktivitetsanalys

Den enzymatiska aktivitetsanalysen DNMT utfördes med användning av ett EpiQuik DNA Methyltransferase Activity/Inhibition Assay Kit (Epigentek Group, Brooklyn, NY, USA) och EPIgeneous Methyltransferase Assay Kit (Cisbio Japan, Chiba, Japan) enligt tillverkarens protokoll.

För att bedöma den hämmande aktiviteten av varje förening på DNA-metylering, bildandet av S-adenosyl-l-homocystein (SAH) mättes i närvaro av varje förening (20 μmol/l för screeninganalyser), S-adenosylmetionin (SAM; 10 μmol/l) och DNMT-substrat (4 ng/μl) vid 37°C i 90 min. För att utvärdera Michaelis-Menten-kinetiken inkuberades DNMT1 (20 μmol/l) med γ-oryzanol, SAM (5 μmol/l) och den indikerade koncentrationen av poly dI-dC vid 37 ° C i 90 minuter. DNMT3a (100 μmol/l) och DNMT3b (100 μmol/l) inkuberades med γ-oryzanol, SAM (5 μmol/l) och den angivna koncentrationen av poly dG·dC vid 37°C under 120 min. Analyserna utfördes i fyrdubbla exemplar. Extraherat protein (0.75 mg/ml) inkuberades med SAM (5 μmol/l), poly dI-dC (5 μg/ml) och poly dG·dC (5 μg/ml) vid 40°C under 120 minuter, och SAH-bildning mättes.

Östrogenrelaterad receptor-y-aktivitetsanalys

Den potentiella antagonistiska aktiviteten av γ-oryzanol på den östrogenrelaterade receptorn-γ (ERRγ) utvärderades med hjälp av Human Estrogen-Related Receptor Gamma Reporter Assay System (INDIGO Bioscience, State College, PA, USA) enligt tillverkarens protokoll. Kortfattat exponerades icke-humana däggdjursreporterceller som konstitutivt uttrycker aktiv ERRy för de angivna koncentrationerna av varje förening under 24 timmar i tre exemplar.

Western blotting

Detta utfördes som tidigare beskrivits [] med antikroppar mot D2R (1:500, kanin), dopamintransportör (DAT; 1:500, kanin), tyrosinhydroxylas (TH; 1:1000, kanin) (AB5084P, AB1591P och AB152, Merck Millipore, Billerica, MA, USA), signalgivare och aktivator av transkription 3α (STAT3α; 1:1000, kanin), DNMT1 (1:1000, kanin), DNMT3a (1:1000, kanin) (nr 8768, 5032 och 3598; Cell Signaling Technology Tokyo, Japan), DNMT3b (1 μg/ml, kanin), ERRγ (1:1000, kanin) och β-aktin (1:10,000 16049, mus) (ab128930, ab6276 och abXNUMX; Abcam, Cambridge, MA, USA).

Kvantitativ realtids-PCR

Genuttryck undersöktes som tidigare beskrivits []. mRNA-nivåer normaliserades till Rn18s (18S rRNA). De primeruppsättningar som används för de kvantitativa realtids-PCR-analyserna är sammanfattade i ESM-tabellen 2.

Statistisk analys

Data uttrycks som medelvärde ± SEM. Envägs ANOVA och upprepade åtgärder ANOVA följt av flera jämförelsetester (Bonferroni–Dunn-metoden) användes där så var tillämpligt. Students t testet användes för att analysera skillnader mellan två grupper. Skillnader ansågs betydande vid p <0.05.

Resultat

Farmakologisk hämning av DNMT med 5-aza-dC försvagade preferensen för dietfett hos möss

Hos möss som matades med HFD ökades DNA-metylering i promotorregionen av D2R i striatum signifikant jämfört med möss som fick en chow-diet (Fig. (Fig.1a).1a). Å andra sidan var hypotalamisk DNA-metylering i promotorregionen av D2R tydligen högre än den i striatum under en chow-diet (p < 0.01) (Fig. (Fig.1a,1a, f) och ändrades inte av HFD (Fig. ​(Fig.1f).1f). Hos möss som matades med HFD normaliserades den förstärkta DNA-metyleringen i promotorregionen av D2R i striatum genom behandling med 5-aza-dC, en potent DNMT-hämmare (Fig. (Fig.1a).1a). Däremot förändrades inte DNA-metylering i promotorregionen av D2R i hypotalamus signifikant genom behandling med 5-aza-dC (Fig. ​(Fig.1f).1f). I striatum hos 20 veckor gamla hanmöss som matades med HFD i 12 veckor, minskade mRNA- och proteinnivåerna av D2R signifikant (Fig. (Fig.1b,1b, k, l). Däremot nivåer av dopamin D1-receptorer (D1Rs, kodade av Drd1), som verkar på ett motsatt sätt till D2Rs på adenylylcyklas och cAMP-medierad intracellulär signalering, var oförändrade (Fig. (Fig. 1c).1c). Dessutom fanns det ingen förändring i nivåerna av andra molekyler relaterade till D2R-signalering, såsom TH och DAT på mRNA- och/eller proteinnivå (Fig. (Fig. 1d, 1d, e, k, m). Å andra sidan observerades inga uppenbara förändringar i hypotalamus, inklusive för D2R (Fig. ​(Fig.1g–m).1g–m). Noterbart var proteinnivåerna av D2R och TH i hypotalamus mycket lägre än de i striatum (Fig. (Fig.1l,1l, m), vilket möjligen återspeglar den relativa betydelsen av dopaminreceptorsignalering i hjärnans belöningssystem jämfört med hypotalamus.

Fig 1 

Hämning av DNMT med 5-aza-dC dämpar preferensen för en HFD genom förstärkning av D2Rs i striatum hos HFD-matade möss. DNA-metyleringsnivåer i promotorregionen av D2R i striatum (n = 3) (a) och hypotalamus (n = 3) .

För att undersöka om DNA-metylering i promotorregionen av D2R skulle ändra preferensen för dietfett analyserades ätbeteendet hos 5-aza-dC-behandlade möss. Som väntat ökade 5-aza-dC signifikant mRNA och proteinnivåer för D2R i striatum hos HFD-matade möss (Fig. (Fig.1b,1b, k, l). Å andra sidan var det ingen effekt på nivåerna av Drd1, Th och Slc6a3 (kodar DAT) i striatum, eller på nivåer av Drd2, Drd1, Th och Slc6a3 i hypotalamus (fig. (Fig.1c–e,1c–e, g–m). Medan vehikelbehandlade möss föredrog HFD, minskade preferensen för HFD signifikant hos 5-aza-dC-behandlade möss (88% av värdena för vehikelbehandlade möss) (Fig. ​(Fig.1n).1n). Följaktligen minskade behandling med 5-aza-dC ökningen i kroppsvikt (Fig. (Fig.11o).

γ-oryzanol minskar nivåerna av DNMTs i striatum hos HFD-matade möss

Som vi tidigare rapporterat [], oral administrering av y-oryzanol till hanmöss genom sondmatning försvagade signifikant preferensen för en HFD (93 % av värdena för vehikelbehandlade möss) (Fig. (Fig.2a),2a), vilket resulterar i en uppenbar dämpning av kroppsviktsökning (Fig. ​(Fig.2b).2b). Vi undersökte därför den potentiella effekten av γ-oryzanol på epigenetisk modulering av D2Rs i striatum.

Fig 2 

Hämmande effekt av y-oryzanol på DNMT i HFD-matade möss. HFD preferens (a) och kroppsvikt (b) i γ-oryzanol-behandlade möss under födovalstester av chow vs HFD (n = 4 burar; tre möss per bur). Nivåer av mRNA för .

Hos däggdjur finns det tre stora DNMT: DNMT1, 3a och 3b. DNMT1 fungerar för att upprätthålla DNA-metylering, medan DNMT3a och 3b spelar en roll för att underlätta de novo DNA-metylering []. För att utforska den potentiella effekten av γ-oryzanol på DNMTs in vivo, utvärderade vi nivåer av DNMTs i hjärnan hos HFD-matade möss. Även om HFD i sig inte hade någon effekt på mRNA och proteinnivåer av DNMT i varken striatum eller hypotalamus, minskade tillskott med γ-oryzanol signifikant nivåerna av DNMT i striatum men inte i hypotalamus (Fig. (Fig.2c–e,2c–e, g–i, k–n). Dessa data ökar möjligheten att γ-oryzanol kan reglera nivåerna av DNMT på ett striatumspecifikt sätt. På liknande sätt minskade 5-aza-dC signifikant mRNA-nivåerna av DNMT3a och 3b, företrädesvis i striatum (ESM Fig. 1a–d).

På grundval av en tidigare studie som visade att mRNA-nivån av DNMT1 var positivt reglerad, åtminstone delvis, av nukleära receptorn ERRγ [], undersökte vi den potentiella effekten av γ-oryzanol på ERRγ-aktivitet. I icke-humana däggdjursceller som konstitutivt uttrycker aktiv ERRγ, minskade 4-hydroxitamoxifen, en potent omvänd agonist av ERRγ, markant ERRγ-aktiviteten. Notera att γ-oryzanol delvis minskade ERRγ-aktiviteten (en cirka 40 % minskning av det medfödda värdet) (Fig. (Fig.3a).3a). Viktigt är att ERRγ uttrycktes starkt i striatum men inte i hypotalamus (Fig. ​(Fig.3b–d).3b–d). I motsats till situationen för striatum ökade y-oryzanol signifikant proteinnivåerna av DNMT1 endast i hypotalamus (Fig. (Fig.2k,2k, l). Dessa resultat kan förklaras, åtminstone delvis, av vår upptäckt att STAT3α, en positiv regulator av DNMT1-nivå [], uttrycktes rikligt i hypotalamus men inte i striatum (fig. (Fig.33t.ex).

Fig 3 

Inverkan av γ-oryzanol på ERRγ-aktivitet och STAT3α. (a) Hämmande effekt av γ-oryzanol på ERRγ in vitro. Dos-responskurvor för ERRγ-aktiviteter med γ-oryzanol (svarta cirklar), ferulsyra .

För att ytterligare bedöma effekten av γ-oryzanol på aktiviteten av DNMTs in vivo, utvärderades bildandet av SAH, en biprodukt av DNA-metylering och även en potent hämmare av DNMTs, i γ-oryzanol-behandlade möss som matades med HFD. Det fanns inga signifikanta förändringar i SAH-bildning i varken striatum eller hypotalamus mellan HFD-matade och chow-matade möss (Fig. (Fig.2f,2f, j). Märkbart minskade γ-oryzanol signifikant SAH-bildning i striatum (Fig. (Fig.2f)2f) men inte i hypotalamus (fig. (Fig.2j),2j), vilket tyder på att y-oryzanol kan undertrycka aktiviteten av DNMT på ett striatumspecifikt sätt i HFD-matade möss.

Enzymatiska analyser av hämmande egenskaper hos γ-oryzanol för DNMTs in vitro

Vi bedömde sedan effekten av γ-oryzanol på aktiviteten av DNMTs in vitro. Den hämmande styrkan av y-oryzanol, ferulsyra, 5-aza-dC, haloperidol (en representativ D2R-antagonist), kinpirol (en representativ D2R-agonist) och SAH mot DNMT:er utvärderades. Som en positiv kontroll dämpade SAH kraftigt aktiviteterna hos DNMT på ett dosberoende sätt (Fig. ​(Fig.4a–f).4a–f). Som förväntat visade haloperidol och kinpirol ingen effekt på DNMTs aktiviteter (ESM Fig. 2). Märkbart hämmade γ-oryzanol signifikant aktiviteterna hos DNMT1 (IC50 = 3.2 μmol/l), 3a (IC50 = 22.3 μmol/l) och 3b (maximal hämning 57%) (Fig. ​(Fig.4d–f).4d–f). Däremot var den hämmande aktiviteten för ferulsyra, en metabolit av γ-oryzanol, mycket lägre än den för γ-oryzanol (Fig. (Fig.44d–f).

Fig 4 

Hämmande effekt av y-oryzanol på DNMTs in vitro. High-throughput screeninganalyser för potentiella hämmare av DNMT1 (a), DNMT3a (b) och DNMT3b (c). Hämmande potential mot DNMT för γ-oryzanol, ferulsyra (en metabolit av γ-oryzanol), .

Vi undersökte vidare de hämmande egenskaperna hos γ-oryzanol på DNMT. Bildandet av SAH mättes för att bedöma den hämmande aktiviteten av y-oryzanol på DNMTs in vitro. Data om SAH-bildning under DNMT-medierad DNA-metylering indikerar ett mättbart mönster av Michaelis-Menten-kinetik för både närvaro och frånvaro av γ-oryzanol (Fig. ​(Fig.4g–i).4g–i). I DNMT1-medierad DNA-metylering visade Eadie–Hofstee-analys att γ-oryzanol inte visade några effekter på V max av SAH-bildning (vehikel, 597 pmol/min; γ-oryzanol 2 μmol/l, 619 pmol/min; γ-oryzanol 20 μmol/l, 608 pmol/min), medan γ-oryzanol uppenbarligen ökade K m (fordon, 0.47 μg/ml; γ-oryzanol 2 μmol/l, 0.67 μg/ml; γ-oryzanol 20 μmol/l, 0.89 μg/ml) (Fig. ​(Fig.4j).4j). Dessa resultat tyder på att y-oryzanol hämmar DNMT1 åtminstone delvis på ett konkurrenskraftigt sätt. Å andra sidan, för DNMT3a- och 3b-medierad DNA-metylering, minskade y-oryzanol V max av bildning av SAH (DNMT3a: vehikel, 85.3 pmol/min; γ-oryzanol 2 μmol/l, 63.1 pmol/min; γ-oryzanol 20 μmol/l, 42.5 pmol/min; DNMT3b: vehikel, 42.3 pmol/min; γ-oryzanol 2 μmol/l, 28.0 pmol/min; -oryzanol 20 μmol/l; 15.0 pmol/min, γ-oryzanol XNUMX μmol/l, XNUMX pmol/min) och på liknande sätt K m för denna reaktion (DNMT3a: vehikel, 0.0086 μg/ml; γ-oryzanol 2 μmol/l, 0.0080 μg/ml; γ-oryzanol 20 μmol/l, 0.0058 μg/ml; DNMT3b: vehikel, 0.0122 vehikel, 2 oryzanol 0.0097 μmol/l, 20 μg/ml; γ-oryzanol 0.0060 μmol/l, XNUMX μg/ml) (Fig. (Fig.4k,4k, l). Dessa resultat tyder på att y-oryzanol hämmar DNMT3a och 3b åtminstone delvis på ett icke-konkurrensmässigt sätt.

γ-oryzanol ökar nivåerna av D2R i striatum hos HFD-matade möss

Vi testade nästa möjligheten att γ-oryzanol skulle öka striatalt D2R-innehåll genom en hämning av DNMT. Hos HFD-matade möss minskade oral administrering av y-oryzanol signifikant striatal DNA-metylering i promotorregionen av D2Rs (Fig. (Fig.5a),5a), medan det inte gjorde detta i hypotalamus (fig. ​(Fig.5f).5f). I enlighet med dessa fynd ökade mRNA och proteinnivåer av D2R ömsesidigt (Fig. (Fig.5b,5b, g, k, l). I likhet med data om behandling med 5-aza-dC (Fig. (Fig.1),1), det fanns inga uppenbara effekter på RNA- och proteinnivåerna av Drd1, Th och Slc6a3 (DAT) i striatum, och inga effekter på nivåer av Drd1, Th och Slc6a3 i hypotalamus (fig. (Fig.5c–e,5c–e, h–k, m).

Fig 5 

Hämning av DNMTs av y-oryzanol dämpar preferensen för en HFD genom förstärkning av D2Rs i striatum hos HFD-matade möss. DNA-metyleringsnivåerna för promotorregionen av D2R i striatum (n = 3) (a) och hypotalamus .

Tidigare studier har visat att nivåerna av D2R och DNMT1 regleras av ER-stress och inflammation åtminstone delvis via NF-KB [, , ]. Vi undersökte därför nivåerna av ER-stressrelaterade och inflammationsrelaterade gener. Som tidigare visat [], HFD ökade uttrycket av generna som kodar för TNF-α (Tnfa), monocyt kemoattraktant protein-1 (MCP-1) (Ccl2), C/EBP homologt protein (Hacka), ER-lokaliserad DNAJ 4 (ERdj4) (Dnajb9) och den splitsade formen av X-box-bindande protein 1 (Xbp1s) i hypotalamus men inte i striatum (Fig. ​(Fig.6).6). Noterbart minskade tillskott av HFD med γ-oryzanol signifikant det förstärkta uttrycket av Ccl2, Hacka, Dnajb9 och Xbp1s uteslutande i hypotalamus men inte i striatum (fig. (Fig.66).

Fig 6 

Uttryck av proinflammatoriska och ER-stressrelaterade gener i striatum och hypotalamus. Nivåer av mRNA för Tnfa (a, f), Ccl2 (b, g), Hacka (c, h), Dnajb9 (d, i), och den aktiva skarvade formen av Xbp1 (Xbp1s) (e, j) i striatum (n = 8) .

Diskussion

Huvudfynden i föreliggande studie är att y-oryzanol fungerar som en potent DNMT-hämmare i striatum hos möss, och därigenom försvagar, åtminstone delvis, preferensen för en HFD via den epigenetiska moduleringen av striatum D2R. I striatum från HFD-matade möss minskade nivåerna av D2R signifikant, medan de för D1R, TH och DAT inte ändrades (Fig. (Fig.1b–e,1b–e, k–m). Dessa data överensstämmer med uppfattningen att dysreglering av striatal D2R spelar en avgörande roll i uppfattningen av matbelöning när man är på en HFD, vilket leder till hedonisk överkonsumtion av HFD hos feta djur []. I den aktuella studien ökade behandling av HFD-matade möss med 5-aza-dC signifikant nivåerna av striatal D2R (Fig. (Fig.1b,1b, k, l) möjligen genom en minskning av DNA-metyleringsnivån i promotorregionen av D2R (Fig. (Fig.1a),1a), och följaktligen dämpade preferensen för dietfett (Fig. ​(Fig.1n).1n). Detta fynd stöder också en avgörande roll för striatala D2Rs i uppfattningen av matbelöning när man är på en HFD.

Vår in vitro-analys visade att den hämmande aktiviteten av y-oryzanol mot DNMT: er uppenbarligen var starkare än den för dess metabolit ferulinsyra (Fig. ​(Fig.4d–f),4d–f), vilket antyder vikten av den fullständiga strukturen av γ-oryzanol för dess hämmande verkan på DNMT. Hos HFD-matade möss tyder våra studier på att, efter oral administrering, når γ-oryzanol hjärnan som en komplett struktur och minskar nivåerna och aktiviteterna av DNMTs företrädesvis i striatum, med en åtföljande minskning av DNA-metylering i promotorregionen av D2R i striatum. Dessutom har våra in vitro-studier visat att γ-oryzanol fungerar som en partiell antagonist mot ERRγ, som främst fungerar som en positiv regulator för DNMT1-produktion [] och minskade följaktligen aktiviteten av DNMT1 (Fig. (Fig.3a).3a). Notera att ERRγ uttrycktes starkt i striatum men inte i hypotalamus hos möss (Fig. ​(Fig.3b).3b). Dessa data tyder på att y-oryzanol har potential att minska mRNA-nivån av DNMT1, åtminstone delvis, genom hämning av ERRy. I motsats till striatum visade y-oryzanol ingen effekt på nivån av D2R i hypotalamus från HFD-matade möss (Fig. (Fig.5g,5g, k, l).

Å andra sidan visade vi att γ-oryzanol signifikant ökade nivåerna av DNMT1 i hypotalamus men inte i striatum (Fig. (Fig.2k,2k, l). Det har visat sig att STAT3 ökar halten av DNMT1 i maligna T-lymfomceller []. Noterbart har vi tidigare visat att γ-oryzanol signifikant ökade leptin-inducerad STAT3-fosforylering i hypotalamus från HFD-matade möss []. Det bör också noteras att STAT3α uttrycktes väsentligt i hypotalamus men inte i striatum hos mössen (Fig. ​(Fig.3e–g).3t.ex). Dessa data frestar oss att spekulera i att den uppenbara skillnaden i effekt av γ-oryzanol på nivåer av DNMT1 mellan hypotalamus och striatum kan tillskrivas, åtminstone delvis, till det regionspecifika innehållet av STAT3α och ERRγ i hjärnan hos möss ( Fikon. ​(Fig.3b–g).3b–g). Sammantaget verkar det finnas ett ömsesidigt uttrycksmönster av ERRγ och STAT3α mellan striatum och hypotalamus hos möss. På grundval av våra resultat är det därför rimligt att spekulera i att i striatum, där ERRγ-produktion är riklig, kan γ-oryzanol företrädesvis minska mRNA-nivån och enzymaktiviteten hos DNMT1 som en negativ regulator av ERRγ. Däremot, i hypotalamus, där STAT3α-produktionen är dominerande, kan y-oryzanol företrädesvis öka nivåerna av DNMT1.

En nyligen genomförd studie visade att en dämpning av striatal D2R-signalering inducerad av en HFD dysregulerar ätbeteende [], vilket tyder på den potentiella betydelsen av hämning av striatala DNMT för behandling av fetma. Å andra sidan visade en tidigare studie en möjlighet att statusen för DNA-metylering av melanokortinreceptorn 4-genen uttryckt i specifika hypotalamiska kärnor kunde modulera transgenerationella former av fetma hos gula möss som är livskraftiga []. Även om ytterligare studier är motiverade för att belysa de underliggande mekanismerna, antyder dessa studier vikten av vävnads-, gen- och sekvensspecifik DNA-metylering i patofysiologin för HFD-inducerad fetma.

Vi rapporterade nyligen att HFD ökade nivån av D2R i bukspottkörtelöarna hos möss [, ]. Det är troligt att sådan förstärkning medieras, åtminstone delvis, av ER-stress och inflammation via NF-KB, eftersom det finns flera NF-KB-responsiva element i promotorregionen av D2R [, ]. Dessutom har en nyligen genomförd studie visat att TNF-α och IL-1β ökar nivån och aktiviteten av DNMT1 i fettvävnad från HFD-matade möss []. Viktigt är att den aktuella studien visade att HFD inducerade ER-stress och inflammation företrädesvis i hypotalamus men inte i striatum (Fig. ​(Fig.6).6). Djupgående mekanismer för vävnads-, region- och platsspecifik DNA-metylering och demetylering i vårt experimentella paradigm måste invänta ytterligare undersökning.

Tillsammans med vår tidigare rapport som visar att γ-oryzanol dämpar preferensen för en HFD via hypotalamisk reglering av ER-stress hos möss [], representerar y-oryzanol också en unik egenskap att förbättra både hedonisk och metabolisk dysreglering av ätbeteende. Eftersom vissa läkemedel mot fetma som har utvecklats är kända för att orsaka kritiska biverkningar [], en naturlig matbaserad strategi mot hjärnans belöningssystem förväntas behandla fetma-diabetessyndrom på ett säkert sätt []. I detta paradigm är γ-oryzanol en lovande kandidat mot fetma med en distinkt egenskap att vara en epigenetisk modulator.

 

Elektroniskt kompletterande material

 

ESM(256K, pdf) 

(PDF 256 kb)

Tack

Vi är tacksamma mot S. Okamoto (University of the Ryukyus, Japan) för att ha granskat manuskriptet. Vi tackar M. Hirata, H. Kaneshiro, I. Asato och C. Noguchi (University of the Ryukyus, Japan) för sekreterarhjälp.

Förkortningar

5-aza-dC 5-aza-2'-deoxicytidin
D1R Dopamin D1-receptor
D2R Dopamin D2-receptor
DAT Dopamintransportör
DNMT DNA-metyltransferas
ER Endoplasmatiska retiklet
ERR Östrogenrelaterad receptor
HFD Kost med hög fetthalt
SAH S-Adenosyl-l-homocystein
SAM S-Adenosylmetionin
STAT3a Signalomvandlare och aktivator av transkription 3α
TH Tyrosinhydroxylas
 

Anmärkningar

Data tillgänglighet

Datauppsättningar som genereras och/eller analyseras under den aktuella studien är tillgängliga från motsvarande författare på rimliga önskemål.

Finansiering

Detta arbete stöddes delvis av Grants-in-Aid från Japan Society for the Promotion of Science (JSPS; KAKENHI Grant Numbers 15K19520 och 24591338), Council for Science, Technology and Innovation (CSTI), Cross-ministerial Strategic Innovation Promotion Program (SIP) 'Teknologier för att skapa nästa generations jordbruk, skogsbruk och fiske', Lotte Foundation, Japan Foundation for Applied Enzymology, New Energy and Industrial Technology Development Organization (NEDO), Project for Formation of Life Science Network (Farmaceutical Field) ) (Okinawa Prefecture, Japan) och Promotion Project of Medical Clustering av Okinawa Prefecture, Japan, tillsammans med ett anslag från Okinawa Prefecture för främjande av avancerad medicin (Okinawa Prefecture, Japan).

Dualitet av intresse

Författarna förklarar att det inte finns någon dualitet av intresse förknippad med detta manuskript.

Bidragsutlåtande

CK och HM utformade forskningen. CK och TK utförde experimenten och analyserade data. TK, CS-O, CT, MT, MM och KA bidrog till tolkning av data. CK och HM skrev manuskriptet. Alla författare bidrog till datatolkning. Alla författare gick med på att revidera manuskriptet och godkände dess slutliga version. HM är garanten för detta arbete, hade full tillgång till all data och tar fullt ansvar för dataintegriteten och dataanalysens noggrannhet.

fotnoter

 

Elektroniskt kompletterande material

Onlineversionen av den här artikeln (doi:10.1007/s00125-017-4305-4) innehåller expertgranskat men oredigerat tilläggsmaterial som är tillgängligt för behöriga användare.

 

Referensprojekt

1. DiLeone RJ, Taylor JR, Picciotto MR. Drivkraften att äta: jämförelser och distinktioner mellan mekanismer för matbelöning och drogberoende. Nat Neurosci. 2012;15:1330–1335. doi: 10.1038/nn.3202. [PMC gratis artikel] [PubMed] [Cross Ref]
2. Kenny PJ. Vanliga cellulära och molekylära mekanismer vid fetma och drogberoende. Nat Rev Neurosci. 2011;12:638–651. doi: 10.1038/nrn3105. [PubMed] [Cross Ref]
3. Johnson PM, Kenny PJ. Dopamin D2-receptorer i missbruksliknande belöningsdysfunktion och tvångsmässigt ätande hos överviktiga råttor. Nat Neurosci. 2010;13:635–641. doi: 10.1038/nn.2519. [PMC gratis artikel] [PubMed] [Cross Ref]
4. Stice E, Spoor S, Bohon C, Small DM. Förhållandet mellan fetma och trubbigt striatalt svar på mat modereras av TaqIA A1-allelen. Vetenskap. 2008;322:449–452. doi: 10.1126/science.1161550. [PMC gratis artikel] [PubMed] [Cross Ref]
5. Geiger BM, Haburcak M, Avena NM, Moyer MC, Hoebel BG, Pothos EN. Underskott av mesolimbisk dopaminneurotransmission vid dietfetma hos råtta. Neurovetenskap. 2009;159:1193–1199. doi: 10.1016/j.neuroscience.2009.02.007. [PMC gratis artikel] [PubMed] [Cross Ref]
6. Noble EP. Beroende och dess belöningsprocess genom polymorfismer av D2-dopaminreceptorgenen: en recension. Eur Psykiatri. 2000;15:79–89. doi: 10.1016/S0924-9338(00)00208-X. [PubMed] [Cross Ref]
7. Wang GJ, Tomasi D, Backus W, et al. Magutspändhet aktiverar mättnadskretsar i den mänskliga hjärnan. NeuroImage. 2008;39:1824–1831. doi: 10.1016/j.neuroimage.2007.11.008. [PubMed] [Cross Ref]
8. Janero DR, Makriyannis A. Cannabinoidreceptorantagonister: farmakologiska möjligheter, klinisk erfarenhet och translationell prognos. Expertuppfattning Emerg Drugs. 2009;14:43–65. doi: 10.1517/14728210902736568. [PubMed] [Cross Ref]
9. Jaenisch R, Bird A. Epigenetisk reglering av genuttryck: hur genomet integrerar inneboende och miljösignaler. Nat Genet. 2003;33(Suppl):245–254. doi: 10.1038/ng1089. [PubMed] [Cross Ref]
10. Ong ZY, Muhlhausler BS. Maternal "skräpmat" utfodring av råttdammar förändrar matvalen och utvecklingen av den mesolimbiska belöningsvägen hos avkomman. FASEB J. 2011;25:2167–2179. doi: 10.1096/fj.10-178392. [PMC gratis artikel] [PubMed] [Cross Ref]
11. Barres R, Osler ME, Yan J, et al. Icke-CpG-metylering av PGC-1alfa-promotorn genom DNMT3B kontrollerar mitokondriell densitet. Cell Metab. 2009;10:189–198. doi: 10.1016/j.cmet.2009.07.011. [PubMed] [Cross Ref]
12. Lee WJ, Zhu BT. Hämning av DNA-metylering av koffeinsyra och klorogensyra, två vanliga katekolinnehållande kaffepolyfenoler. Carcinogenes. 2006;27:269–277. doi: 10.1093/carcin/bgi206. [PubMed] [Cross Ref]
13. Fang MZ, Wang Y, Ai N, et al. Tepolyfenol (−)-epigallocatechin-3-gallat hämmar DNA-metyltransferas och återaktiverar metyleringstysta gener i cancercellinjer. Cancer Res. 2003;63:7563–7570. [PubMed]
14. Kozuka C, Yabiku K, Sunagawa S, et al. Brunt ris och dess beståndsdel, gamma-oryzanol, dämpar preferensen för diet med hög fetthalt genom att minska hypotalamisk endoplasmatisk retikulumstress hos möss. Diabetes. 2012;61:3084–3093. doi: 10.2337/db11-1767. [PMC gratis artikel] [PubMed] [Cross Ref]
15. Kozuka C, Sunagawa S, Ueda R, et al. Gamma-Oryzanol skyddar pankreatiska betaceller mot endoplasmatisk retikulumstress hos hanmöss. Endokrinologi. 2015;156:1242–1250. doi: 10.1210/en.2014-1748. [PubMed] [Cross Ref]
16. Kozuka C, Yabiku K, Takayama C, Matsushita M, Shimabukuro M, Masuzaki H. Naturlig livsmedelsvetenskap baserad ny inställning till förebyggande och behandling av fetma och typ 2-diabetes: nya studier på brunt ris och γ-oryzanol. Obes Res Clin Pract. 2013;7:e165–e172. doi: 10.1016/j.orcp.2013.02.003. [PubMed] [Cross Ref]
17. Kozuka C, Sunagawa S, Ueda R, et al. En ny insulinotropisk mekanism av fullkornshärledd gamma-oryzanol via undertryckandet av lokal dopamin D-receptorsignalering i musö. Br J Pharmacol. 2015;172:4519–4534. doi: 10.1111/bph.13236. [PMC gratis artikel] [PubMed] [Cross Ref]
18. Karahoca M, Momparler RL. Farmakokinetisk och farmakodynamisk analys av 5-aza-2'-deoxycytidin (decitabin) i utformningen av dess dosschema för cancerterapi. Clin Epigenetics. 2013;5:3. doi: 10.1186/1868-7083-5-3. [PMC gratis artikel] [PubMed] [Cross Ref]
19. Rein T, Zorbas H, DePamphilis ML. Aktiva replikationsursprung från däggdjur är associerade med ett högdensitetskluster av mCpG-dinukleotider. Mol Cell Biol. 1997;17:416–426. doi: 10.1128/MCB.17.1.416. [PMC gratis artikel] [PubMed] [Cross Ref]
20. Tanaka T, Masuzaki H, Yasue S, et al. Central melanokortinsignalering återställer skelettmuskel-AMP-aktiverad proteinkinasfosforylering hos möss som matats med en diet med hög fetthalt. Cell Metab. 2007;5:395–402. doi: 10.1016/j.cmet.2007.04.004. [PubMed] [Cross Ref]
21. Okano M, Bell DW, Haber DA, Li E. DNA-metyltransferaser Dnmt3a och Dnmt3b är väsentliga för de novo-metylering och utveckling av däggdjur. Cell. 1999;99:247–257. doi: 10.1016/S0092-8674(00)81656-6. [PubMed] [Cross Ref]
22. Zhang Y, Wang L. Nukleär receptor SHP-hämning av Dnmt1-uttryck via ERRy FEBS Lett. 2011;585:1269–1275. doi: 10.1016/j.febslet.2011.03.059. [PMC gratis artikel] [PubMed] [Cross Ref]
23. Zhang Q, Wang HY, Woetmann A, Raghunath PN, Odum N, Wasik MA. STAT3 inducerar transkription av DNA-metyltransferas 1-genen (DNMT1) i maligna T-lymfocyter. Blod. 2006;108:1058–1064. doi: 10.1182/blood-2005-08-007377. [PMC gratis artikel] [PubMed] [Cross Ref]
24. Bontempi S, Fiorentini C, Busi C, Guerra N, Spano P, Missale C. Identifiering och karakterisering av två nukleära faktor-kappaB-ställen i den regulatoriska regionen av dopamin D2-receptorn. Endokrinologi. 2007;148:2563–2570. doi: 10.1210/sv.2006-1618. [PubMed] [Cross Ref]
25. Kim AY, Park YJ, Pan X, et al. Fetma-inducerad DNA-hypermetylering av adiponectingenen förmedlar insulinresistens. Nat Commun. 2015;6:7585. doi: 10.1038/ncomms8585. [PMC gratis artikel] [PubMed] [Cross Ref]
26. Ozcan L, Ergin AS, Lu A, et al. Endoplasmatisk retikulumstress spelar en central roll i utvecklingen av leptinresistens. Cell Metab. 2009;9:35–51. doi: 10.1016/j.cmet.2008.12.004. [PubMed] [Cross Ref]
27. Waterland RA, Travisano M, Tahiliani KG, Rached MT, Mirza S. Metyldonatortillskott förhindrar transgenerationell förstärkning av fetma. Int J Obes. 2008;32:1373–1379. doi: 10.1038/ijo.2008.100. [PMC gratis artikel] [PubMed] [Cross Ref]