Insulin ökar striatal dopaminfrisättning genom att aktivera kolinerga internuroner och signalerar därigenom belöning (2015)

 

Melissa A. Stouffer,

Catherine A. Woods,

Jyoti C. Patel,

Christian R. Lee,

Paul Witkovsky,

Li Bao,

Robert P. Machold,

Kymry T. Jones,

Soledad Cabeza de Vaca,

Maarten EA Reith,

Kenneth D. Carr

& Margaret E. Rice

anknytningar

Bidrag

Motsvarande författare

Nature Communications

6,

Artikelnummer:

8543

doi: 10.1038 / ncomms9543

Mottagna

 

02 juni 2015

Godkända

 

02 September 2015

publicerade

 

  

Abstrakt

Insulin aktiverar insulinreceptorer (InsRs) i hypothalamus för att signalera mättnad efter en måltid. Den stigande förekomsten av fetma, vilket resulterar i kroniskt förhöjda insulinnivåer, innebär emellertid att insulin också kan verka i hjärncentraler som reglerar motivation och belöning. Vi rapporterar här att insulin kan förstärka verkan potentiellt beroende dopamin (DA) frisättning i nucleus accumbens (NAc) och caudate-putamen genom en indirekt mekanism som involverar striatal kolinergiska internuroner som uttrycker InsRs. Två olika kroniska dietmanipulationer hos råttor, livsmedelsbegränsning (FR) och en obesogen (OB) diet förändrar motsatt känsligheten för striatal DA-frisättning för insulin, med förbättrad lyhördhet i FR, men förlust av respons i OB. Beteendestudier visar att intakta insulinnivåer i NAc-skalet är nödvändiga för att få preferens för smaken av en parad glukoslösning. Tillsammans innebär dessa uppgifter att striatal insulinsignalisering förbättrar DA-frisläppandet för att påverka livsmedelsval.

Vid en blick

siffror

vänster

  1. Insulinberoende ökningar i framkallade [lsqb] DA [rsqb] o kräver InsRs och PI3K.
    Figur 1
  2. Insulinberoende reglering av frisatt DA-frisättning kräver ACh från ChI: er.
    Figur 2
  3. Insulininducerade ökningar i framkallade [lsqb] DA [rsqb] o förbättras av FR och förloras i OB.
    Figur 3
  4. InsAb-mikroinjektion i NAc-skalet minskar smakpreferensen.
    Figur 4

 

 

Beskrivning

Det är väl etablerat att en långvarig ökning av plasmainsulin under och efter en måltid aktiverar insulinreceptorer (InsRs) i hypotalamus, vilket ger negativ feedback till aptitliga kretsar som minskar ytterligare ätande1, 2, 3. Hjärninsulin härstammar främst från pankreatiska p-celler, med aktiv transport från plasma till hjärna vid blod-hjärnbarriären4, 5, 6, 7, 8även om det finns ökande bevis för neuronal insulinsyntes och frisättning också1, 9. Det är anmärkningsvärt att uttrycket av InsR: er inte begränsas till hypothalamus, även om funktionen för extra-hypotalamiska InsR: er förblir olöst1, 2, 3. Med tanke på den ökande förekomsten av fetma och typ II-diabetes, i vilken cirkulerande nivåer av insulin ständigt förhöjs och hjärninsulintransport och receptorkänslighet minskas3, 8, 10, 11, är det viktigt att förstå insulins funktion i hjärnregioner som reglerar motivation och belöning. Hjärnregioner av särskilt intresse inkluderar nucleus accumbens (NAc), som förmedlar de givande effekterna av både mat och droger12, 13och caudate-putamen (CPu), som spelar en roll i vanebaserade beteenden och begär13. InsR: er uttrycks i dessa regioner, med den högsta densiteten som förekommer i NAc3, 14; InsR: er uttrycks också av dopamin (DA) neuroner i mellanhinnan, inklusive de i det ventrale tegmentalområdet (VTA) och substantia nigra pars compacta (SNc)15. Insulinnivåerna i hjärnan är proportionella mot plasmain insulinkoncentrationerna och kroppens fett6, 7, 8, vilket leder till hypotesen att insulin kan verka vid InsRs i dessa hjärnregioner för att påverka matbelöningen3, 16, 17.

Tidigare studier på striatal synaptosomer, heterologa celler, hjärnskivor och in vivo- har visat att insulinaktivering av InsR leder till en ökning av DA-upptag av DA-transportören (DAT)18, 19, 20, 21, 22, 23. Denna process involverar PI3-kinas-signalvägen19, 20och resulterar i DAT-införing i plasmamembranet19. Cirkulerande insulinnivåer modulerar dynamiskt striatal DAT-aktivitet, med minskat DA-upptag och DAT-ytuttryck ses i djurmodeller av diabetes och efter matbegränsning (FR)20, 21. Insulinberoende ökningar av DAT-aktivitet har visat sig minska framkallad extracellulär DA-koncentration ([DA]o) i VTA23, vilket återspeglar en förskjutning i balansen mellan DA-frisläppande och upptag. I överensstämmelse med den etablerade rollen som insulin i mättnad kan akut mikroinjektion av insulin i VTA minska matbelöningen23, 24medan möss som saknar InsR i VTA- och SNc DA-neuroner visar ökat matintag och blir överviktiga25. Även om insulin kan inducera långtidsdepression av exciterande tillförsel till VTA DA-neuroner24, återigen i överensstämmelse med en roll i mättnad, kan insulin exponering också öka DA neuron avfyrningshastighet, möjligen genom att minska DA frisättning och autoreceptor-medierad hämning25. Därför är det svårt att förutsäga nettoeffekten av insulin på striatal DA-frisättning. Faktum är att resultaten från studier av insulinpåverkan på frisatt DA-frisläppande i ex vivo skivor19 och effekten av lokal mikroinjektion av insulin i NAc på matbelöning26 verkar vara motstridiga. För att lösa detta utvärderade vi axonal DA-frisättning och upptag i den intakta mikromiljön i NAc och CPu i ex vivo striatala skivor med snabbskannad cyklisk voltammetri (FCV) och bestämde effekterna av insulinsignalering i NAc på belöningsbeteende in vivo-.

Våra studier visar att den primära effekten av insulin i NAc och CPu är att förbättra frisättningen av DA, trots en samtidig ökning av DA-upptaget. Denna dynamiska reglering av DA-frisättning involverar en insulinberoende ökning av excitabiliteten hos striatal kolinergiska internuroner (ChI), vilket leder till förbättrad DA-frisättning via aktivering av nikotinacetylkolin (ACh) -receptorer (nAChR). Påverkan av insulin på ChI: er och på DA-frisättning medieras av InsRs. Speciellt förstärks effekten av insulin på DA-frisättning i skivor från FR-råttor, men trubbade i råttor på en obesogen diet (OB). Dessa data visar förstärkning av DA-frisläppande i ex vivo skivor med insulin leder till förutsägelsen att insulin kan fungera som en belöningssignal in vivo-. Parallellt beteendestudier visar faktiskt en roll för insulin i NAc-skalet vid smakpreferenskonditionering. Tillsammans indikerar dessa fynd en ny roll för insulin som en belöningssignal som kan påverka matvalet

 

 

Resultat

Insulin som verkar vid InsRs ökar framkallat striatal DA-frisättning

Inledande undersökning av lokalt framkallade [DA]o övervakas med FCV i ex vivo striatala skivor från råttor med AD libitum (AL) tillgång till mat och vatten avslöjade den oväntade upptäckten att akut applicering av insulin över en rad fysiologiskt relevanta koncentrationer1, 4 ökad framkallning av enpuls [DA]o (Fig. 1a-c), med insulin EC50 värden (koncentrationen där effekten var halva maximal) av 2 – 12 nM (Fig. 1b). Ökad framkallad [DA]o var särskilt förvånande med tanke på att detta åtföljdes av en signifikant ökning av den maximala hastigheten (Vmax) för DAT-medierat upptag i varje subregion (Tabell 1), vilket skulle leda till en konkurrerande minskning av framkallade [DA]o, som tidigare rapporterats22, 23. Istället fann vi att det framkallade [DA]o amplifierades maximalt 20 – 55% med 30 nM insulin; regionen med den största proportionella effekten var NAc-skalet, som är den striatala subregionen med högsta InsR-uttryck1, 14. Skivor exponerade för 30 nM insulin under identiska förhållanden visade ingen förändring i striatal DA-innehåll (Kompletterande Fig. 1a), vilket innebär att insulin förändrar reglering av dynamisk frisättning, snarare än att bara reglera DA-syntes. Speciellt framkallade effekten av insulin på [DA]o förlorades vid suprafysiologiska koncentrationer ≥100 nM (Fig. 1b). Detta var inte ett resultat av ökad frisläppande av DAT-aktivitet, eftersom effekten av insulin på Vmax förlorades också vid dessa koncentrationer (Tabell 1). Sammantaget visar dessa data att den dominerande effekten av insulin på den intakta striatala mikromiljön framkallade [DA]o är att öka frisättningen, trots en samtidig ökning av DA-upptag.

Bild 1: Insulinberoende ökningar i framkallade [DA]o kräver InsR och PI3K.
  

Insulinberoende ökningar i framkallade [lsqb] DA [rsqb] o kräver InsRs och PI3K.   

(a) Genomsnittlig enpuls framkallad [DA]o i NAc-skal, NAc-kärna och CPu före och efter insulin (Ins) illustrerade för 30 nM; felfält utelämnade, men se (b); pilarna indikerar stimulanstiden. Insulinökning framkallade [DA]o i skal (med 55 ± 10%), kärna (med 37 ± 5%) och CPu (med 20 ± 4%) (***P<0.001). (b) Effekten av insulin var koncentrationsberoende över ett fysiologiskt intervall (1 – 30 nM) i skalet (n= 22-24, F5,133= 14.471, P<0.001), kärna (n= 36-76, F5,308= 16.318, P<0.001) och CPu (n= 30-62, F5,253= 13.763, P<0.001) men förlorade vid ≥100 nM. (c) Representativa inspelningar av topp-framkallade [DA]o mot tid på en enda plats i NAc-kärnan i frånvaro av läkemedelsapplikation (Con), under applicering av insulin (30 nM) eller när insulin applicerades i närvaro av en InsR-hämmare HNMPA (5 μM). (d) Genomsnittlig topp-framkallad [DA]o data som visar förebyggande av effekten av insulin (30 nM) av HNMPA, InsR-antagonist S961 (1 μM) och PI3K-hämmare LY294002 (1 μM), men inte av IGF-1R-hämmare PPP (1 μM) (n= 29-76; P> 0.9 kontra insulin ensamt). För Fig. 1a-d, n= antal platser per subregion från 3 – 6 råttor för varje läkemedel eller insulinkoncentration; envägs ANOVA, Tukey ärlig betydelsestest (HSD). Se Kompletterande bild 1b, c för NAc-skal och CPu-data.

 

 

Tabell 1: Insulin vid fysiologiska koncentrationer (30 nM) ökar Vmax för DAT-medierat upptag i striatala skivor.
  

 

 

Eftersom insulin också kan verka vid insulinliknande tillväxtfaktor 1-receptorer (IGF-1R), om än i koncentrationer som överstiger 100 nM (ref. 1) försökte vi bekräfta att den förstärkande effekten av insulin på framkallade [DA]o var InsR-beroende. Detta visade sig vara fallet, eftersom effekten förhindrades av en intracellulär InsR-hämmare, hydroxi-2-naftalenylmetylfosfonsyra (HNMPA) och av en InsR-antagonist, S961, men inte av en selektiv hämmare av IGF-1R, picropodophyllin24 (PPP; Fig. 1c, d och Kompletterande bild 1b, c). Vi undersökte sedan involveringen av PI3-kinas, som initierar signalvägen ansvarig för insulinberoende reglering av DAT19. Vid en koncentration av 1 μM hade P13K-hämmaren LY249002 ensam ingen effekt på topp-framkallade [DA]o or Vmax (n= 29 – 76-platser (NAc-kärna) per läkemedel, P> 0.05, enkelriktad variansanalys (ANOVA); data visas inte), men förhindrade ändå effekten av insulin på framkallat [DA]o i alla striatala subregioner (Fig. 1d och Kompletterande bild 1b, c).

Lokalisering av InsR: er på DA-axoner och ChI: er

Den observerade ökningen i Vmax för DA-upptag med fysiologiska nivåer av insulin innebär närvaron av InsR på DA-axoner, liksom tidigare resultat i olika striatalberedningar18, 19, 20, 21, 22. Även om funktionellt uttryck av InsR: er på DA-nervceller i mitten av hjärnan har visats15, 23, 24, 25, InsR-uttryck på striatal DA-axoner har inte rapporterats. Vi behandlade detta med hjälp av immunohistokemi. Tät InsR-immunreaktivitet under hela striatum begränsade kvantitativ bedömning av InsR-lokalisering på DA-axoner, vilka identifierades genom immunoreaktivitet för ett DA-syntetiserande enzym, tyrosinhydroxylas (TH) Vi antog därför ett tidigare rapporterat protokoll27, som innebar att räkna InsR-punkter som överlappade med TH + -profiler i normal bildvy och räknade igen efter att InsR-bilden bara roterades med 90 °. Om den uppenbara överlappningen av InsR- och TH + -profilerna var ospecifika bör denna procedur ge statistiskt liknande räkningar, vare sig de är normala eller 90 ° ur fas. Emellertid visade denna analys en minskning i överlappningen av InsR puncta med TH + -profiler på 14 ± 9% (n= 42 fält, P<0.01, parad tvåsidig t-testa; data visas inte), vilket bekräftar InsR-närvaro på DA-axoner. Mer spännande, emellertid, avslöjade InsR-immunmärkning av striatum distinkta InsR-uttryck på stora cellkroppar som identifierades som striatal ChI genom samimmunolabling för kolinacetyltransferas (ChAT), det primära enzymet som krävs för ACh-syntes. Med hjälp av elektrofysiologiska kriterier28 för att identifiera ChI i preliminära undersökningar av hela celler, fylldes flera neuroner med biocytin och behandlades sedan för immunohistokemi; alla dessa (4 / 4) var immunopositiva för både InsR och ChAT (Fig. 2a). Efterföljande utvärdering av samlokalisering av InsR och ChAT i NAc bekräftade att praktiskt taget alla ChAT + neuroner uttryckte InsR (96%; n= 27 / 28 neuroner i fyra sektioner från två råttor).

Bild 2: Insulinberoende reglering av striatal DA-frisättning kräver ACh från ChI: er.
  

Insulinberoende reglering av frisatt DA-frisättning kräver ACh från ChI: er.   

(a) ChI fylld med biocytin, sedan immunmärkt för ChAT och InsR (representativ för 4 / 4 biocytinfylld ChI); den sammanslagna bilden visar samlokalisering; skalfält, 10 μm. (b-e) Svar från striatal ChI på en serie depolariserande strömpulser (3-varaktighet; 200, 300 och 400 pA; 120-intervall) före och efter insulin (30 nM). (b) Anpassning av piggfrekvens i en ChI (övre) ses i förlust av handlingspotential (AP) urladdning under aktuell injektion, medan spikning kvarstår genom den aktuella pulsen i insulin (nedre); komplett datauppsättning som visas i d. (c) Representativ tidskurs för den insulininducerade ökningen i AP-antal med varje aktuellt steg för ChI in b. (d) Sammanfattning av AP-nummer under strömpulser levererade före och vid toppeffekten av insulin exponering (n= 21 parade stimulationer, 7 neuroner, 5 råttor) (e) Genomsnittliga svar som visar effekten av insulin (+ Ins) under kontrollförhållanden (Con; n= 21 parade stimulationer, 7 neuroner, ***P<0.001, parad tvåsidig t-test), i närvaro av HNMPA (5 μM) (n= 12 parade stimulationer, 4 neuroner, 4 råttor, P>0.05, parade två-svansade t-test), och i närvaro av PPP (1 μM) (n= 18 parade stimulationer, 6 neuroner, 6 råttor, **P<0.01, Wilcoxon matchade par undertecknade rankningstest). (f) Genomsnittlig enpuls framkallad [DA]o i NAc-kärna före och efter insulin (30 nM) i mecamylamin (Mec; 5 μM) eller DHpE (1 μM) normaliserade till 100% toppkontroll (n= 20 – 40 platser per subregion per tillstånd från 3 – 4 råttor, P> 0.05 kontra kontroll, oparad t-testa). (g) Genomsnittlig enpuls framkallad [DA]o i förhjärnskivor från heterozygot kontroll (Het) och Chatt KO-möss före och efter insulin (30 nM), normaliserade till 100% toppkontroll. Insulinökning framkallade [DA]o i heterozygota möss med 190 ± 23% i NAc-skal, 140 ± 8% i NAc-kärna och 137 ± 12% i CPu (n= 15 – 25 platser per subregion från 3 – 4 möss per genotyp, **P<0.01, ***P<0.001 kontra oparad kontroll t-test), men hade ingen effekt på framkallade [DA]o i någon striatal subregion av Chatt KO-möss (P> 0.1).

 

 

Insulin ökar ChI-excitabiliteten

För att testa InsR: s funktionalitet på striatal ChI, undersökte vi effekten av insulin på ChI-excitabilitet med hjälp av inspelning av hela cellströmmen. ChI-excitabilitet bedömdes med användning av en serie av 3-s depolariserande strömpulser för att framkalla ett tåg av handlingspotentialer som pålitligt uppvisade spikfrekvensanpassning (Fig. 2b), ofta med förlust av spikning i slutet av den aktuella pulsen. Påfallande dämpade insulin (30 nM) anpassning av piggsfrekvens, vilket resulterade i en gradvis ökning av antalet handlingspotential över tid (Fig. 2c), med en maximal ökning (Fig. 2d, e) normalt sett mellan 20 och 50 min av insulineksponering. I frånvaro av insulin visade kontrollchlor ingen förändring i antalet framkallade handlingspotentialer (P> 0.05, ihopkopplad tvåstjärtad t-testa; data visas inte); jämfört med kontrollneuroner övervakade under samma tidsintervall, visade neuroner exponerade för insulin en signifikant större förändring i antalet framkallade handlingspotentialer (kontroll n= 12 stimulanspar från fyra nervceller, insulin n= 21 stimulanspar från sju neuroner, F1,25= 5.63, P<0.05, blandade mått tvåvägs ANOVA; data visas inte). Effekten av insulin på att öka antalet potentiella åtgärder förhindrades av HNMPA men inte av IGF-1R-selektiv hämmare PPP (Fig. 2e), vilket visade att ökad ChI-excitabilitet med insulin var InsR-medierad.

Insulinförbättring av framkallade [DA]o kräver nAChR och ACh

Tidigare studier har visat att ChIs och ACh potentiellt reglerar striatal DA-frisättning via nAChRs på DA-axoner29, 30, 31, 32, 33, 34. Överflödande InsR-uttryck på ChI och förbättringen av ChI-excitabilitet sett vid akut insulinexponering antydde att dessa neuroner kan vara nya mål för insulin som kan leda till förbättrad DA-frisättning. För att testa detta undersökte vi effekten av insulin i närvaro av mecamylamin, en icke-selektiv nAChR-antagonist eller dihydro-ß-erytroidin (DHβE), en selektiv antagonist för β2-subenhetsinnehållande (ß2 *) nAChRs som är berikade på DA-axoner35. Framkallade [DA]o upptäcktes lätt i närvaro av dessa antagonister, även om båda läkemedlen minskade amplituden av enpuls framkallat [DA]o (till exempel med 13 – 26% i NAc-kärna), som tidigare rapporterats29, 30, 31, 32. Som stöd för en roll för ACh och nAChRs framkallade effekten av insulin på [DA]o förhindrades antingen av mecamylamin eller DHpE (Fig. 2f). För att bekräfta involvering av striatal ACh-signalering i insulinförstärkt DA-frisläppande undersökte vi effekten av insulin i ex vivo striatala skivor från möss i vilka ChAT-uttryck genetiskt avlägsnades i förstrukturer (förhjärnan) Chatt KO-möss), inklusive striatum32. Även om ChI: er är intakta i dessa möss avskaffas ACh-syntesen, vilket leder till minskad men ändå lätt detekterbar enkelpuls framkallad [DA]osåsom beskrivits tidigare32. Vid kontroll av heterozygota kullkamrater ökade insulin (30 nM) framkallade [DA]o i NAc-skal och kärna och i CPu med 37 – 90% (Fig. 2g), överskridande amplifieringen som ses i råttstriatum (t.ex. Fig 1). Effekten av insulin på framkallade [DA]o var frånvarande i hela det striatala komplexet i förhjärnan Chatt KO-möss, vilket visar att insulinförmedlad förbättring av DA-frisättning kräver striatal ACh, men inte samfrisläppna sändare från ChI, såsom glutamat36.

Påverkan av insulin på framkallade [DA]o är dietberoende

Plasma- och hjärninsulinhalter är proportionella mot kroppens fett6, 7, 8och kan leda till kompensationsförändringar i hjärnkänslighet för insulin. Vi testade därför hypotesen att diet påverkar insulinets förmåga att främja DA-frisättning, med användning av striatala skivor från råttor som bibehålls antingen på en kronisk FR- eller OB-diet kontra AL-kontroller. Som väntat korrelerades plasmainsulinnivåer med kroppsvikt, med lägre insulin i FR än hos AL- eller OB-råttor (Fig. 3a och Tabell 2). Trots dessa skillnader i cirkulerande insulin, framkallades topp [DA]o i NAc skal och kärna, och CPu var betydligt lägre i ex vivo striatala skivor från båda dietgrupperna jämfört med AL (Fig. 3b och Kompletterande bild 2 a, b), vilket antyder att faktorer utöver insulin styr absolut uppmanade [DA]o. Striatal DA-innehåll skilde sig inte mellan dietgrupper, vilket indikerar en förändring i frisättningsregleringen snarare än i DA-syntes (Kompletterande bild 2c). I överensstämmelse med en förändring i dynamisk reglering var känsligheten för striatal DA-frisättning för insulin markant dietberoende. Hos FR-råttor, insulinkoncentrationer ≤1 nM, som inte hade någon effekt i AL (Fig. 1b), ökade framkallade [DA]o (Fig. 3c), vilket återspeglar ökad insulinkänslighet med EC50 värden i FR striatum (0.4 – 0.6 nM) som var ungefär en storleksordning mindre än i AL (jämför Fig. 1b och 3c). I slående kontrast förlorades effekten av insulin i OB-striatum; till och med 30 nM insulin, som hade en maximal effekt i AL striatum (Fig. 1b), hade ingen effekt i OB (Fig. 3c).

Bild 3: Insulininducerade ökningar i framkallade [DA]o förbättras av FR och förloras i OB.
  

Insulininducerade ökningar i framkallade [lsqb] DA [rsqb] o förbättras av FR och förloras i OB.   

(a) Plasmainsulinkoncentration är positivt korrelerad med kroppsvikt över matningsgrupper (R= 0.76). (b) Genomsnittlig enpuls framkallad [DA]o i NAc-kärnan (se Kompletterande Fig. 2a, b för NAc-skal och CPu) var lägre i FR (38 ± 4%) och OB (25 ± 4%) kontra AL (n= 50 – 60 platser från 5 – 6 råttor per dietgrupp, F2,156= 23.337, envägs ANOVA, Tukey HSD; ***P<0.001); OB kontra FR (P<0.08). (c) Känslighet för framkallade [DA]o till insulin förbättrades i FR, men förlorade i OB (n= 21 – 49-platser per subregion per koncentration från 2 – 4-råttor per dietgrupp, enkelriktad ANOVA, Tukey HSD), med större känslighet hos FR kontra AL-råttor i alla subregioner (P<0.001 för varje region; tvåvägs ANOVA; CPu: F(conc × diet; 3,286)= 10.253; kärna: F(conc × diet; 3,353)= 6.166; skal: F(conc × diet; 3,195)= 10.735).

 

 

Tabell 2: Slutlig kroppsvikt, viktförändring, plasmainsulin och blodglukosvärden hos råttor på AL-, OB- eller FR-diet.
  

 

 

Dessa data innebär ett omvänt samband mellan striatal InsR-känslighet och kroppsadipositet. Alternativt kan emellertid dessa dietberoende skillnader återspegla förändrad nAChR-känslighet. Vi bestämde därför koncentrationssvaret på nikotin i NAc-kärnan från varje dietgrupp. Nikotin orsakar nAChR-desensibilisering, som kan kvantifieras genom att jämföra förhållandet [DA]o framkallas av ett kort tåg med fem pulser vid 100 Hz till enpuls-framkallat [DA]o (5 p: 1 p-förhållande) som ett index för nAChR-aktivering / desensibilisering30, 31. Med hjälp av denna metod fann vi inga skillnader mellan dietgrupper i nAChR-känslighet i NAc-kärnan (Kompletterande Fig. 3a-c). Kontroll 5 p: 1 p-förhållande skilde sig inte heller mellan dietgrupper i NAc-kärnan (Kompletterande bild 3d) eller CPu (inte illustrerad), vilket innebär att diet inte förändrar nAChR-beroende DA-frisläppsreglering. Således verkar striatal InsR-känslighet förbättras i FR kontra AL-råttor, men frånvarande i OB-råttor, med förlust av reglering av striatal DA-frisättning vid fysiologiska koncentrationer av insulin.

NAc skal-insulin modulerar konditionerad smakpreferens

Matpreferenser genereras av både före och efter förtäring faktorer; mekanismerna för var och en är inte fullständigt löst, men nuvarande bevis innebär att NAc DA-signalering sker i båda37, 38. Med tanke på att plasma- och cerebrospinalvätska (CSF) ökar insulinnivåerna snabbt efter perifert glukosförhöjning6och att en ökning av insulin i striatum kan upptäckas inom 5 minuter från plasmainsulinhöjning7, är det logiskt att antaga att perifer insulinfrisättning under en måltid kan förbättra frisättningen av NAc DA och bidra till belöningsmekanismer efter intag. Vi anpassade ett tidigare beskrivet smakprioritetsprotokoll37 med sackarin-sötade glukoslösningar i råttor för att testa hypotesen att blockering av effekten av endogent insulin genom lokal applicering av en insulinantikropp (InsAb) i NAc skulle minska preferensen för den parade smaken. Effektiviteten av InsAb för att blockera effekterna av insulin testades i en vitro analys av DA-upptag i striatal synaptosomer. Insulin (30 nM) orsakade en signifikant ökning av Vmax i synaptosomer från NAc eller CPu (Kompletterande Fig. 4), i överensstämmelse med vår Vmax data från striatala skivor (Tabell 1) och med tidigare studier18, 19, 20, 21, 22, 23. I frånvaro av insulin förändrade varken InsAb eller en kontrollantikropp immunoglobulin G (IgG) Vmax för DA-upptag kontra kontroll. I närvaro av IgG orsakade insulin fortfarande en avsevärd ökning av Vmax; effekten av insulin på Vmax förlorades i närvaro av InsAb (Kompletterande Fig. 4).

För att minimera vävnadsskada och bibehålla känsligheten hos vävnadsmålet testades två grupper av individer där vi växlade intra-NAc-mikroinjektion med en hålig mikroinjektionsprocedur, snarare än att använda en enda grupp av individer och para en smaksatt lösning med InsAb och en annan med fordon. Följaktligen, under konditioneringssessioner med en flaska, fick experimentgruppen InsAb-mikroinjektioner parade med en av två smaker, och vid alternerande sessioner, håra mikroinjektioner parade med den andra smaken (Fig. 4a, vänster). Kontrollgruppen fick håliga mikroinjektioner alternerade med mikroinjektioner av antingen fosfatbuffrad saltlösning (PBS) eller IgG. Båda smaksatta lösningarna innehöll glukos under konditionering. Ingen differentiell preferens mellan smaker förväntades i den kontrollmikroinjicerade gruppen, medan preferens förväntades förskjuta sig mot den håliga mikroinjektionsparade smaken i den InsAb-mikroinjicerade gruppen.

Figur 4: InsAb-mikroinjektion i NAc-skalet minskar smakpreferensen.
  

InsAb-mikroinjektion i NAc-skalet minskar smakpreferensen.   

(a) Diagram som illustrerar konditionering med en flaska (vänster) och testet med två flaskor (höger). (b) Konsumerad volym (ml) under konditioneringssessioner med en flaska. Det fanns en signifikant interaktion mellan infusions-konditioneringssession och mikroinjektionsbehandling (n= 19 – 20 råttor per grupp, F(3,111)= 3.088, P<0.05, 2 × 4 blandad ANOVA med upprepade åtgärder vid infusionskonditioneringssession). InsAb-mikroinjektion minskade avsevärt konsumtionen jämfört med kontroll under den tredje (t(40) = 3.026, **P<0.01) och fjärde (t(40) = 3.052, **P<0.01, skyddad enstjärtad t-tester) infusioner. Mock-injektioner hade ingen effekt på konsumtionen i någon grupp (F3,111= 1.110, 2 × 4 blandad ANOVA med upprepade åtgärder vid håravkänningssession). (c) Volym förbrukad under två-flaskars smakpreferensstest. Det var en signifikant interaktion mellan smak och mikroinjektionsbehandling under konditionering (F1,37= 5.36, P<0.05, tvåvägs blandad ANOVA med upprepade mått på smak). InsAb-gruppen konsumerade betydligt mindre av den InsAb-parade smaken jämfört med den mock-parade smaken (t(18) = 2.82, ** P<0.01, skyddad enstjärtad t-testa); kontrollgruppen visade ingen smakpreferens (t(19) = 0.803, P> 0.05, skyddad t-testa). Jämfört grupper drack InsAb-råttor signifikant mindre av den infusionsparade smaken (t(40) = 1.96, *P<0.05) och betydligt mer av den mock-parade smaken (t(40) = 1.77, *P<0.05, skyddad enstjärtad t-test) än kontroller.

 

 

Under konditioneringssessionerna med en flaska minskade InsAb-mikroinjektion signifikant förbrukningen jämfört med fordonet under den tredje och fjärde infusionen (Fig. 4b). Däremot konsumerade båda grupperna samma volym lösning under alla fyra håliga injektionssessioner (F3,111= 0.127, P>0.05, blandad tvåvägs ANOVA) (Fig. 4b). Efter totalt åtta konditioneringssessioner utvärderades smakpreferensen i ett test med två flaskor där råttor hade tillgång till båda smaklösningarna samtidigt (Fig. 4a). Statistisk analys avslöjade en signifikant interaktion mellan smak och mikroinjektionsbehandlingen som erhölls under konditionering (Fig. 4c). InsAb-gruppen konsumerade signifikant mindre av den InsAb-parade smaken jämfört med den mock-parade smaken (Fig. 4c), medan fordonsgruppen inte visade någon smakpreferens (Fig. 4c), vilket antyder att intakt insulinsignalering bidrog till valet av en söt kalori-lösning. Jämfört med vehikel drack InsAb-mikroinjicerade råttor signifikant mindre av den infusionsparade smaken och signifikant mer av den håla injektionsparade smaken (Fig. 4c). Mikroinjektion av IgG (t(9) = 0.792. P>0.05, skyddad t-test) eller PBS (t(9) = 0.442. P>0.05, skyddad t-tester) hade ingen effekt på smakpreferensen (data visade inte), men argumenterade mot möjligheten att en icke-specifik effekt av InsAb-mikroinjektion minskade konsumtionen eller smakpreferensen. Det bör också noteras att preferensen för InsAb-gruppen vid testet inte är en preferens för den mindre nya smaken, eftersom det inte fanns någon interaktion mellan session och sessionstyp (faktisk infusion kontra hålig infusion) för InsAb-gruppen (F3,54= 1.584, P> 0.05, tvåvägs ANOVA). Det vill säga InsAb-gruppen konsumerade inte mer av den mock-infusion-parade smaken i förhållande till InsAb-infusionsparade smaken; snarare uppstod skillnader mellan behandlingsgrupper endast under infusionskonditioneringssessioner. Sammantaget indikerar dessa data att insulin i NAc spelar en roll för att förstärka preferensen för en smak som signalerar en glykemisk belastning.

 

 

  

Diskussion

  

Vi rapporterar här att insulin förstärker striatal DA-frisättning på ett nAChR-beroende sätt genom att modulera ChI-excitabilitet via InsRs. Våra resultat antyder att insulin kan fungera som en belöningssignal, utöver dess etablerade roll i signalering mättnad. Speciellt moduleras effekten av insulin på DA-frisättning genom diet, med markant ökad känslighet för insulin efter FR, men en fullständig förlust av insulinförstärkt reglering på en OB-diet. Dessa förändringar verkar återspegla förändringar i InsR-känslighet som är omvänt relaterade till cirkulerande insulinnivåer, med tanke på att plasmainsulinnivåer visade sig vara dietberoende, men nAChR-känslighet var inte. Slutligen innebär våra smakpreferensstudier på beteendedjur att insulinsignalering i NAc-skalet påverkar matens preferens, vilket inte bara påverkar insulin i matrelaterat inlärning utan också bekräftar dess roll som belöningssignal.

Net [DA]o återspeglar balansen mellan DA-frisläppande och DA-upptag via DAT. Tidigare bevis som visar att insulin kan reglera DAT-aktivitet18, 19, 20, 21, 22, 23 ledde till förutsägelsen att en ökning av insulin borde orsaka en nettominskning i framkallade [DA]o via ökat DA-upptag. Men vi fann att i striatum är effekten av insulin mer komplex än detta. Även om insulineksponeringen ökade Vmax för DAT var insulinets primära effekt på frisläppning av DA, inte på DA-upptag, med en jämn ökning av framkallade [DA]o över ett fysiologiskt intervall av insulinkoncentrationer i NAc-skal och kärna och i CPu. Även om ökningen i framkallade [DA]o återgick till kontrollnivåer vid en suprafysiologisk koncentration av 100 nM, Vmax var också oförändrad från kontroll, vilket eliminerar en dominerande effekt på DAT som en förklaring. Istället innebär förlust av effekten på upptag och frisättning desensibilisering av InsRs eller nedreglering av signalvägar nedströms vid höga insulinkoncentrationer. Faktiskt genomgår InsRs snabb endocytos och nedbrytning efter insulinbindning i perifera vävnader1, med nya bevis för förlust av neuronal InsR-känslighet efter kortvarig exponering för höga nivåer av insulin eller kalorifattig diet.10, 11, 39.

Den dominerande effekten av insulin för att förbättra striatal DA-frisättning som rapporterats här står i kontrast till resultaten från två andra nyligen ex vivo skivstudier. I det första orsakade insulin en minskning av det elektriskt framkallade överflödet av [3H] DA från striatala skivor, även om de ökade [3H] DA-översvämning detekterades när DAT inhiberades22. Med tanke på att släppt [3H] DA måste undgå DAT-medierat upptag i hela vävnaden som ska detekteras i superfusionslösningen, detta protokoll är särskilt känsligt för DAT-reglering. Våra resultat som visar att insulin förbättrar DA-frisättning via ChIs och nAChR-aktivering, förutom att förbättra DAT-medierat upptag, skulle förklara den till synes paradoxala ökningen av insulinförstärkt [3H] DA-översvämning sett när konkurrerande effekter på DAT blockerades22. Den andra studien använde FCV för direkt detektion av somatodendritisk DA-frisättning i VTA, men fann också en dominerande effekt av insulin på DA-upptag, vilket återspeglas i minskat framkallade [DA]o (Ref. 23). Skillnader i ett antal faktorer, från lokal mikrokrets till somatodendritisk kontra axonal DA-frisättningsmekanismer40, kan bidra till denna regionala skillnad. Som diskuteras vidare nedan är det dock troligt att regionalt beroende insulinsroller är komplementära, snarare än motstridiga.

Tidigare antogs någon roll av insulinberoende reglering av DA-signalering förmedlas genom direkt aktivering av InsR på DA-neuroner. Vi visar här att InsR: er också uttrycks på striatal ChI, och att insulin modulerar ChI-excitabilitet för att förstärka striatal DA-frisättning, vilket kan spela en avgörande roll i insulinets inflytande på diet. Striatal ChIs får prognoser från nervceller i de intralaminära kärnorna i thalamus, som uppvisar skurbränning som svar på framträdande sensoriska stimuli och hjälper till att driva språngspausspikningsmönster i ChI som är viktiga för att rikta uppmärksamhet, förstärkning och associerande lärande41. Därför kan insatsen av insulin vid InsRs på striatal ChI: er öka effekten av sensoriska matkoder på striatalens lyhördhet för talambränning, vilket kan bidra till ökad uppfattning av belöningsvärdet för en intagen måltid. Direkt främjande av striatal DA-frisläppning genom ChI-aktivering har lett till förslaget att faktorer som stimulerar ChI: er kommer att ha en privilegierad roll som triggers av DA-frisläppande33. Våra data ger det första beviset för detta, med insulinförbättrad ChI-excitabilitet och ACh-signalering som driver dynamiska ökningar i DA-frisläppande.

Förhöjd DA-frisättning i närvaro av insulin argumenterar också mot en förbättring av ACh-signalering i en utsträckning som orsakar nAChR-desensibilisering eller muskarin ACh-receptor (mAChR) aktivering, som endera kan undertrycka enpuls-framkallad [DA]o (ref 29, 30, 31, 42). Således skiljer sig de mekanismer som rapporteras här från ACh-aktivering av mAChR, som har associerats med aversion och mättnad43.

Enpuls framkallad [DA]o var lägre i både FR- och OB-råttor än i AL-råttor; även om dessa resultat överensstämmer med tidigare rapporter44, 45, 46, våra studier ger den första systematiska jämförelsen av tre striatal subregioner i de två dietgrupperna över en konstant tidsram. Mekanismerna som ligger till grund för dietberoende förändringar i DA-frisläppande har inte klargjorts och ligger utanför omfattningen av de nuvarande studierna. Med tanke på att plasmaninsulinnivåer motsatt ändras av FR- och OB-dieter, är det emellertid osannolikt att minskad framkallade [DA]o i båda grupperna är en konsekvens av dietberoende insulinnivåer.

Å andra sidan ger förändringar i InsR-känslighet med diet och därmed dietberoende plasmaininsulinnivåer den mest sannolika förklaringen för ökad känslighet för insulin i FR och förlust av respons på insulin i OB. Det fanns inga bevis för den alternativa förklaringen av förändrad nAChR-känslighet hos varken FR- eller OB-råttor kontra AL. Även om våra resultat är bland de första som tyder på ökad striatal InsR-känslighet med FR18kan viktminskning åtföljas av minskade insulinnivåer i CSF7, vilket skulle bidra till ökad känslighet för DA-frisättning för insulin i FR. Omvänt är förlust av insulinresponsivitet hos OB-råttor i överensstämmelse med tidigare bevis för minskad hjärninsR-känslighet inducerad av viktökning eller OB-dieter3, 10, 11.

Vår ex vivo skivadata stöder hypotesen att insulin kan signalera belöning och mättnad. Vi testade denna hypotes genom att blockera effekten av endogent insulin med bilateral InsAb-mikroinjektion i NAc-skalet under smakpreferenskonditionering. I överensstämmelse med en roll i belöning som blockerar effekten av insulin minskade preferensen för smaken av en parad glukosinnehållande lösning jämfört med smaken associerad med intakt insulinsignalering. Blockering av insulin i NAc-skalet minskade också konsumtionen av en parad lösning under konditionering med en flaska, medan håravfall eller kontrollinjektioner inte hade någon effekt på konsumtionen. Dessa data tyder på att insulin i NAc-skalet spelar en roll i livsmedelsförmågan. Tidigare studier har visat att intakt DA-signalering i NAc är nödvändig för förvärv av smakkonditionering37, 38, bekräftar en roll för NAc DA i att förmedla de förstärkande effekterna av näringslösningar. I detta ljus argumenterar preferensen för glukoslösningen i kombination med intakt insulintillgänglighet mot en primär effekt av insulin på DAT-medierad DA-upptag i NAc-skalet, eftersom detta skulle förväntas minska [DA]o och minskar därför konsumtionen av den kontrollparade smaken. Våra resultat överensstämmer också med de från en tidigare studie där mikroinjektion av insulin i NAc-skalet ökade tiden då djuren ägde sig åt oral administrering av sackaros, med en gränsöverskridande ökning av sackarosförbrukning26, vilket var motsatt från den förväntade konsekvensen av ökat DA-upptag. Sammantaget överensstämmer dessa beteendedata med det förutsedda inflytandet av insulin på striatal ChI och förbättrad DA-frisättning. Dessa resultat utesluter emellertid inte inblandning av andra element av striatal mikrokrets i det övervakade beteendet, med tanke på utbrett InsR-uttryck i hela striatum1, 14.

De studier som rapporteras här ger de första bevisen på att insulin spelar en roll i att kommunicera kalorievärdet, och därför de givande effekterna av en måltid, vilket har viktiga konsekvenser för inflytandet av insulin i både underviktiga och feta personer. Flera studier indikerar att matens effekter efter förtäring, oavsett om smaköverföringsvägar är intakta47, öka utsläppet av NAc DA och positiv förstärkning av beteende37, 47. Således kan det postabsorberande insulinsvaret koda det glykemiska utbytet av en måltid och bidra till förstärkning av livsmedelspreferenser och beteenden som möjliggör konsumtion. Emellertid kan extrema förändringar i cirkulerande insulinnivåer och central insR-känslighet ha en roll i såväl onormalt som adaptivt beteende. Exempelvis kan hypoinsulinaemia och kompensatorisk uppreglering av InsR-känslighet hos FR-individer vara en faktor i deras disposition till binge48. Omvänt kan central insulinkänslighet vid typ II-diabetes eller fetma, speglade här i OB-råttor, bidra till en minskad känsla av belöning efter intag, drivande intag av livsmedel med ett högt glykemiskt index som kompensation49, 50. Därför kan antingen en ökning eller en minskning av striatal insulinkänslighet bidra till patologiskt ätande, vilket resulterar i binge äta och / eller fetma.

Sammantaget avslöjar våra resultat en ny roll för insulin som belöningssignal. En sådan roll står i kontrast till dess kända funktion som en mättnadssignal, inklusive nya fynd att insulinmikroinjicerat i VTA kan minska hedonisk utfodring och preferens för signaler associerade med matbelöning23, 24. Detta ställer frågan om hur till synes motsatta roller för insulin i dessa DA-beroende funktioner kan förenas. Svaret kan vara att dessa effekter är komplementära, snarare än motstridiga. Föreliggande resultat indikerar att insulin i striatum kommunicerar belöningsvärdet för en intagen måltid. En dubbel roll i signalering av mättnad kan helt enkelt tillåta insulin att tjäna det viktiga syftet med att avsluta en måltid, samtidigt som man skapar ett minne om dess näringsmässiga och därmed belönande egenskaper, och därigenom förstärker upprepningen av intagens beteende.

 

 

  

Metoder

  

Djurhantering

Djurförfaranden var i enlighet med NIH-riktlinjerna och godkänd av NYU School of Medicine Animal Care and Use Committee. Alla djur var på 12 h ljus: mörk cykel, med ljus tänd från 06: 00 till 18: 00; ex vivo skivor bereddes mellan 08: 00 och 12: 00. Mekanistiska studier på AL-råttor och möss genomfördes i ex vivo skivor från djur inrymda i par medan råttor var enstaka inrymda för alla dietgruppsjämförelser och för beteendestudier.

Råttdietregimer

Vuxna Sprague – Dawley-råttor av hankön (Taconic) var 8 – 10 veckor gamla vid inledandet av dietregimer som varade 21 – 30 dagar. Råttor tilldelades semislumpmässigt till dietgrupperna: individer rangordnades efter initialvikt, varefter varje på varandra följande trio av råttor fördelades slumpmässigt mellan dietgrupperna. AL-råttor hade fri tillgång till råtta chow under samma period som parade råttor på FR- eller OB-dieter. Alla råttor hade fri tillgång till vatten. Matbegränsningen genomfördes som tidigare51; kort fick råttor 40 – 50% av AL-intaget av standardråttchow dagligen tills kroppsvikt minskades med 20%, varefter mat titrerades för att bibehålla denna vikt. OB-råttor hade fri tillgång till råtta chow och choklad Ensure, en mycket smaklig vätska med måttligt högt fett och socker52.

hjärnan Chatt knockout-möss

Möss med en villkorad floxerad allel av Chatt (ChattFlox) korsades med en Nkx2.1Cre transgen linje för att producera möss i vilka ablation av ACh-syntes är begränsad till förhjärnan32. Icke-mutanta transgena kullkamrater var kontroller; deras genotyper Cre+;ChattFlox / + och Cre-;Chattflox / flox kallas 'heterozygoter'. Vuxna hanmöss som användes för skivstudier hade AD libitum tillgång till chow och vatten.

Ex vivo skivberedning och fysiologiska lösningar

Råttor eller möss bedövades djupt med 50 mg kg-1 pentobarbital (intraperitoneal (ip)) och halshuggas. För voltammetri skars koronala förhjärnskivor (300 – 400-μm tjocklek) på en Leica VT1200S-vibrerande bladmikrotom (Leica Microsystems; Bannockburn, IL) i iskall HEPES-buffrad konstgjord CSF (aCSF) innehållande (i mM): NaCl (120); NaHCOa3 (20); glukos (10); HEPES-syra (6.7); KCl (5); HEPES natriumsalt (3.3); CaCl2 (2); och MgSO4 (2), jämviktad med 95% O2/ 5% CO2. Skivor hölls sedan i denna lösning vid rumstemperatur under 1 timmar före experiment30, 32, 53. För elektrofysiologi perfuderades råttor transbedövade transkardiellt med iskall lösning innehållande (i mM): sackaros (225); KCl (2.5); CaCl2 (0.5); MgCb2 (7); NaHCOa3 (28); NaH2PO4 (1.25); glukos (7); askorbat (1); och pyruvat (3) och ekvilibrerad med 95% O2/ 5% CO2. Skivor skars i denna lösning och överfördes sedan till en utvinningskammare i modifierad aCSF innehållande (i mM): NaCl (125); KCl (2.5); NaH2PO4 (1.25); NaHCOa3 (25); MgCb2(1); CaCl2 (2); glukos (25); askorbat (1); pyruvat (3); och mitt o-inositol (4), jämviktad med 95% O2/ 5% CO2; denna lösning var initialt vid 34 ° C och fick sedan svalna gradvis till rumstemperatur54. Alla voltammetri- och fysiologiexperiment genomfördes i en undersökningskammare vid 32 ° C som superfuserades vid 1.5 ml min.-1 med aCSF innehållande (i mM): NaCl (124); KCl (3.7); NaHCOa3 (26); CaCl2 (2.4); MgSO4 (1.3); KH2PO4 (1.3); och glukos (10) och bovint serumalbumin (BSA, 0.05 – 0.1 mg ml-1) jämviktad med 95% O2/ 5% CO2; skivor tilläts jämviktas i denna miljö under 30 minuter före experiment.

Snabbskannad cyklisk voltammetri

Undersökta DA-frisläppningsstudier genomfördes med FCV i hjärnskivor32, 53 framställd av hanråttor eller Chatt kontroll av möss för hjärnan i hjärnan och heterozygotkontroller (5 – 8 veckor). Studier i Chatt knockout-möss bländades, men råttdietgrupper hade uppenbara fenotyper som förhindrade bländning. Voltammetriska mätningar gjordes med en Millar Voltammeter (tillgänglig på särskild begäran till Dr Julian Miller vid St Bartholomews och Royal London School of Medicine and Dentistry, University of London). En konventionell triangelvågform användes för FCV, med ett skanningsområde av −0.7 till + 1.3 V (kontra Ag / AgCl), skanningsfrekvens för 800 Vs-1och samplingsintervall på 100 ms30, 32, 53. Data skaffades med hjälp av ett DigiData 1200B A / D-kort styrt av Clampex 7.0-programvara (Molecular Devices). DA-frisättning framkallades med användning av en koncentrisk stimulerande elektrod; stimuluspulsamplituden var 0.4 – 0.6 mA och varaktigheten var 100 μs30, 32, 53. Lokal stimulering av enstaka puls användes i NAc-kärnan och CPu; emellertid användes ett kort högfrekvent pulståg (fem pulser vid 100 Hz) för att förstärka framkallade [DA]o i NAc-skalet. Båda stimulansparadigmerna framkallar DA-frisläppande som är handlingspotential och Ca2+ beroende, påverkas inte av samtidigt frisatt glutamat och GABA42, 55och underlättas av samtidigt frisatt ACh29, 30, 31, 32, 33, 34. Att kvantifiera framkallade [DA]oelektroder kalibrerades med kända koncentrationer av DA vid 32 ° C efter varje experiment i aCSF och i närvaro av varje läkemedel som användes under ett givet experiment53.

Voltammetri-experiment för att bedöma effekten av insulin på framkallade [DA]o erhölls med användning av ett av två protokoll. Inledande experiment för att bestämma tidskursen för effekten av insulin (Sigma, I5523) utfördes genom övervakning framkallade [DA]o var 5 min på en enda webbplats. Insulin applicerades efter konsekvent framkallade [DA]o erhölls (typiskt 4 – 5 mätningar); effekten av insulin var maximal efter 50 – 60 min och framkallade sedan [DA]o förblev på denna nivå under experimentets längd (vanligtvis 90 min total insulinexponering; Fig. 1c). Därefter bedömdes effekten av insulin genom inspelning framkallade [DA]o vid 4 – 5 diskreta platser i skivor (+ 1.5 mm från bregma) i vart och ett av tre striatal subregioner under kontrollförhållanden (aCSF eller aCSF plus läkemedel) och igen vid tiden för maximal insulineffekt (provtagning över 60 – 80 min), sedan dessa prover var i genomsnitt för varje subregion. Effekten av insulin minskade med tiden efter skivberedningen; för att minimera tiden ex vivo och för att optimera djuranvändningen testades typiskt två skivor från ett givet djur i inspelningskammaren samtidigt. Läkemedel som användes för att utmana effekten av insulin applicerades 15 min innan insulin via superfusion av aCSF, inklusive HNMPA trisacetoxymetylester (HNMPA-AM3; Enzo Life Sciences), S961 (Novo Nordisk), LY294002 (Sigma), picropodophyllotoxin (PPP; Tocris), mecamylamine (Tocris) och DHpE (Tocris). Som beskrivits i resultaten testades möjlig förändrad känslighet för nikotin ACh-receptorer bland dietgrupper genom att jämföra förhållandet mellan topp [DA]o framkallas av 5 p (100 Hz) med det som framkallades av 1 p framkallat (5 p: 1 p-förhållande)30, 31 i NAc-kärna i närvaro av 0 – 500 nM nikotin (Sigma).

Bestämning av V max från framkallade [DA]o transienter i striatala skivor

För att utvärdera insulininducerade förändringar i DAT-medierad DA-upptag, framkallade den initiala delen av den fallande fasen av [DA]o kurvor monterades på Michaelis – Menten-ekvationen för att extrahera Vmax (maximal upptagningshastighetskonstant)56. Km (som är omvänt relaterat till affiniteten för DAT för DA) fixerades till 0.2 μM och är känt för att vara liknande över striatal subregioner57 och påverkas inte av insulin (se Kompletterande Fig. 4 rubrik).

Hela cellinspelning

Hjärnskivor framställdes från 29- till 35-dagar gamla råttor av han; registreringsförhållandena var identiska med dem som användes i DA-släppstudier. Hela cellströmklämmans inspelningar använde konventionella metoder54. Striatal ChIs visualiserades med användning av ett Olympus BX51WI-mikroskop (Olympus America, Center Valley, PA) med infraröd differentiell interferens kontrastoptik och ett × 40 vattenfördjupningsmål. Pipettlösningen innehöll (i mM): K-glukonat (129); KCl (11); HEPES (10); MgCb2 (2); EGTA (1); na2-ATP (2); na3-GTP (0.3); och justerades till pH 7.2 – 7.3 med KOH. För inspelade neuroner som skulle bedömas med avseende på ChAT-immunreaktivitet inkluderades 0.3% biocytin i pipettlösningen och neuronerna registrerades kort (~ 5 min) för att minimera utspädning av intracellulärt innehåll. Pipettmotstånd var ~ 3 – 5 MΩ. Inspelningar erhölls med användning av en Axopatch 200B-förstärkare (Molecular Devices, Sunnyvale CA) och lågpassfiltrerades vid 2 kHz. ChI identifierades genom etablerade elektrofysiologiska kriterier28; de flesta var toniskt aktiva initialt, men aktiviteten minskade varierande efter lappning. Reaktionskraften på aktuell injektion var dock generellt robust och konsekvent över tid, och användes därför för att undersöka effekten av insulin på ChI-excitabilitet (se resultat). I experiment för att undersöka rollen för InsR: er och IGF-1R: er i detta svar applicerades antingen HNMPA eller PPP i minst 20 min innan en ChI lappades. Maximala effekter av insulin ensam observerades vanligtvis efter ~ 16 min exponering, även om i vissa celler var ökningen inte maximal förrän 50 min eller längre. Vidare, i fyra av sex neuroner registrerade i PPP, orsakade insulin en initial minskning av spikantalet innan han återhämtade sig till och överskred startartikelnummer. Följaktligen, i alla experiment, kvantifierades effekten av insulin genom att jämföra den maximala effekten på spikantalet med antalet spikar som framkallades omedelbart före insulinapplikation. Den uppenbara skillnaden i tiden för att nå toppeffekten kan återspegla ett antal faktorer, inklusive djupet för den inspelade cellen i skivan. Framkallade handlingspotentialer registrerades också i ChI i frånvaro av insulin vid jämförbara tidpunkter.

Högpresterande vätskekromatografi

DA-innehållet i råttstriatala skivor (400-um tjocklek) bestämdes med användning av högpresterande vätskekromatografi med elektrokemisk detektion58. Skivpar para i jämvikt under 30 min vid 32 ° C i aCSF och sedan inkuberades en skiva per par under ytterligare 60 min vid 32 ° C i aCSF medan den andra inkuberades i aCSF med 10 eller 30 nM insulin. För jämförelse av dietgrupp samlades striatal vävnad mellan 30 – 60 min efter återhämtning. Efter inkubering avlägsnades överskott av aCSF försiktigt från skivor, ett prov av striatal vävnad (7 – 10 mg) vägdes, frystes på torris och lagrades sedan och lagrades sedan vid -80 ° C. På analysdagen sonikerades prover i iskallt, elueringsmedel, deoxygenerat med argon58, spunnet i en mikrocentrifug under 2 min, och supernatanten injicerades direkt på HPLC-kolonnen (BAS, West Lafayette, IN); detektorn var en glasartad kolelektrod uppsatt vid 0.7 V kontra Ag / AgCl.

immunohistokemi

För immunohistokemisk märkning bedövades råttor med natrium pentobarbital (50 mg kg-1, ip), sedan perfuserade transkardiellt med PBS (154 mM NaCl i 10 mM fosfatbuffert, pH 7.2) följt av 4% paraformaldehyd i denna PBS; hjärnor avlägsnades och koronalsektioner (20 μm) skars och behandlades konventionellt27, 59. Immunfluorescensbilder erhölls med ett Nikon PM 800 konfokalt mikroskop utrustat med en digital kamera styrd av Spot-programvara (Diagnostic Instruments Inc.) och med användning av ett × 100-mål (numerisk bländare = 1.4) eller med ett Zeiss LSM 510 konfokalt mikroskop med användning av ett X XUMUMX objektiv (numerisk bländare = 63). Lasrarna var Argon (1.2 nm), He / Ne (488 nm) och He / Ne (543 nm). Lämpliga filter valdes för varje laser med konfokalmikroskopprogramvaran. Nålhålsstorleken varierade med det mål som användes och sektionens tjocklek valdes i z-stackgenerering; vi valde det optimala hålvärdet som indikeras av programvaran (vanligtvis 30 μm). Digitala filer analyserades med deconvolution-programvara (AutoQuant Imaging), med slutliga bilder bearbetade med Adobe Photoshop 7.0. Alla bilder justerades för ljusstyrka och kontrast; sådana justeringar gjordes enhetligt i alla delar av bilden. Striatal DA-axoner identifierades med användning av två TH-antikroppar: polyklonal AB152 kanin-anti-TH (1: 800) och monoklonal MAB318-mus-anti-TH (1: 500) (båda från Chemicon). Tre InsR-antikroppar användes: sc-57342 och sc-09 (1: 100; Santa Cruz) och PP5 (en gåva från Pfizer). Specificiteten hos var och en har visats tidigare60, 61och bekräftades i föreliggande studier genom frånvaro av immunmärkning med antikroppar sc-57342 eller PP5 i närvaro av motsvarande blockerande peptid. ChAT-antikropp var AB144 (1: 200; Millipore) och biotin var från Vector (1: 200). Sekundära antikroppar som användes var åsnens anti-kanin Alexa 488 (Invitrogen) eller åsnans anti-kanin Cy2 (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME), åsnans anti-get Cy3 (Jackson) och åsnans anti-mus Cy5 (Jackson).

För att utvärdera samlokalisering av InsRs i TH + axoner, använde vi metoder som beskrivits tidigare för att identifiera närvaron av Kir6.2, den porbildande underenheten för ATP-känslig K+ kanaler i DA-axoner27. Puncta som representerar InsRs fördelades över justerade bilder, vilket indikerar att överlagring med TH-immunreaktivitet i viss mån kan inträffa. För att testa detta antagande räknade vi InsR / TH-superimpositioner i 42 oberoende fält i tre NAc-immunmärkta sektioner från två råttor. InsR-digitalfilerna roterades sedan 90 ° medurs och räkningarna upprepades; rotation minskade antalet InsR-punkter som samlokaliserats med TH i de flesta fält (se resultat). Minskningen i antalet överlagringar med rotation27 indikerade andelen InsR-punkter i varje striatalfält associerat med DA-axoner.

Blodglukos och insulin ELISA

Stamblod uppsamlades vid halshuggan vid skivstudier. Blodglukos bestämdes omedelbart med en standardblodsockermätare. För insulin uppsamlades ytterligare blod i EDTA-innehållande rör och centrifugerades vid 1,500g under 15 min; supernatant (plasma) uppsamlades och lagrades vid -80 ° C tills bearbetning med ett ALPCO Rat Insulin ELISA-kit.

Kanylplacering och histologisk verifiering

Fyrtio vuxna Sprague – Dawley-råttor av hankön (Taconic och Charles River) som ursprungligen vägde 350 – 425 g bedövades med ketamin (100 mg kg-1, ip) och xylazin (10 mg kg-1, ip) och stereotaxiskt implanterade med två kroniskt inbyggda ledningskanyler (26 mätare) placerade bilateralt 2.0 mm rygg till infusionsställen i NAc-medialskalet62 (1.6 mm anterior till bregma; 2.1 mm i sidled mot den sagittala suturen, spetsar vinklade 8 ° mot mittlinjen, 5.8 mm ventralt till skallens yta). Råttor gavs banamin (2.0 mg kg-1subkutant) som ett postkirurgiskt smärtstillande medel efter återhämtning från anestesi och morgonen efter. En vecka efter operationen placerades råttor på FR (beskrivits ovan) och hölls vid 80% av deras postkirurgiska återhämtningsvikt under resten av studien. Kanylplacering bestämdes histologiskt efter genomförandet av beteendestestning. Varje råtta dödades med CO2, avhuggades och hjärnan avlägsnades och fixerades i 10% buffrat formalin under> 48 timmar. Djupfrysta koronalsnitt (40 mikrometer tjocklek) skars på en Reichert-Jung Cryostat, tinades monterade på gelatinbelagda glasglas och färgades med cresylviolett. Data från en given råtta användes endast om båda kanylerna var inom det mediala NAc-skalet62 (inklusive skalet / kärnan eller skalet / tuberkelkanten)Kompletterande Fig. 5); baserat på dessa kriterier utesluts två råttor från den slutliga analysen.

Flavor-preferens konditionering före exponering

Råttor fick en över natten (i hemmabur) och sex 30-min-per-dagars sessioner med pre-exponering (i testkamrar) till 0.2% natriumsackarin (Sigma) i vatten med ett 48-h-intervall mellan sessionerna. Råttor fick sedan två 5-min-per-dagarsessioner med exponering för 0.2% natriumsackarin i 0.05% osötad druva eller körsbär Kool-Aid (Kraft Foods) i vatten. Under den första Kool-Aid-exponeringssessionen fick hälften av råttorna lösning med körsbärssmak och den andra hälften fick druvsmakad lösning. Smakerna vändes under den andra Kool-Aid-exponeringssessionen för att säkerställa att alla råttor tog prov på varje smak. Intaget mättes för alla sessioner före exponering. Testkamrarna var tydliga plastburar med färskt sängkläder. För alla sessioner före exponering hade råttor tillgång till samma lösning på båda sidorna av kammaren. Med undantag för den övernattande pre-exponeringssessionen genomfördes alla sessioner i ett beteendeprocedurrum med en 30-min habituationsperiod före någon träning eller testning.

Luftkonditionering

Tidigare studier har visat att mikroinjektion av InsAb i ventromedial hypothalamus kan blockera effekten av insulin på matningsbeteende och glukagonutsöndring63, 64. Här använde vi detta tillvägagångssätt för att utvärdera en möjlig roll av insulin i förstärkningen av livsmedelsvalet. Råttor tilldelades semi-slumpmässigt baserat på genomsnittligt intagningsvolym före exponering i två grupper, kontroll eller experimentell (InsAb). I kontrollgruppen fick råttor vehikel (mikroinjektion PBS; 137 mM NaCl och 2.7 mM KCl i 10 mM fosfatbuffert) eller IgG (Abcam ab81032; 0.5 μg μl-1 i PBS, som mottagen) mikroinjektion i NAc-skal före konsumtion av en av de två aromatiserade lösningarna, och en hålig mikroinjektion innan konsumtion av den andra smaksatta lösningen. I den experimentella gruppen erhöll råttor NAc-skalmikroinjektion av InsAb (Abcam ab46707; 0.5 μl 1 μg μl-1 i PBS, som mottaget) före exponering för en smaksatt lösning, och hålig mikroinjektion före exponering för den andra. Två uppsättningar försökspersoner med växling mellan fluidmikroinjektion och hålig mikroinjektion användes så att det totala antalet mikroinjektioner begränsades till fyra, varigenom möjlig vävnadsskada och förlust av känslighet på mikroinjektionsstället minimerades65. För flytande mikroinjektion laddades kontrolllösningen eller InsAb i två 30-cm-längder av PE-50-rör anslutna i ena änden till 5 μl Hamilton-sprutor fyllda med destillerat vatten och i den andra änden till 31-mätinjektionskanyler, som förlängde 2.0 mm bortom de implanterade guiderna. 0.5 μl infusionsvolymer levererades över 90 s med en hastighet av 0.005 μl s-1; injektorn lämnades på plats under ~ 60 s för att möjliggöra tid för diffusion, sedan ersattes injektorn med stylet.

Råttor överfördes direkt till beteendekamrarna inom 2 minuter efter avslutad mikroinjektion eller hålig mikroinjektion. Konditioneringslösningar innehöll 0.2% natriumsackarin, 0.05% osötad druva eller körsbär Kool-Aid och 0.8% glukos. Lösningstillgång begränsades till 30 min per session. Parad smak och sidan av kammaren med dricksåtkomst tilldelades semi-slumpmässigt och motverkades i varje grupp. Intervallet mellan mikroinjektioner var åtminstone 72 timmar, alternerande mellan infusions- och håna sessioner under totalt åtta konditioneringssessioner.

Två-flaskor preferens test

Fyrtioåtta timmar efter den sista konditioneringssessionen placerades råttor i testkamrar med samtidig tillgång till båda konditioneringssmakerna; lösningar var 0.2% natriumsackarin i 0.05% druva eller körsbär Kool-Aid, utan glukos. Testningen skedde under 2 dagar (60 min per dag). Läget för dricksröret innehållande håravkopplad eller infusionsparad lösning växlades för att säkerställa att varje råtta testades med avseende på konsumtion av varje lösning på båda sidor om buren. Intaget av varje smaksatt lösning medelvärdes i de två testdagarna för att bestämma preferens.

[3H] DA-upptag i striatal synaptosomer för att bedöma InsAb-effektiviteten

Striatal synaptosomer21, 66 framställdes av AL-råttor (hane, 350 – 400 g), med NAc (skal och kärna) och CPu dissekerades och bereddes separat. Vävnad från varje region homogeniserades i 15-volymer av en iskall 0.32 M sackaroslösning i en glashomogenisator med motordriven Teflon-stöt; efter sköljning och centrifugering suspenderades den slutliga pelleten i iskall 0.32 M sackaros21, 66. Innan du initierar [3H] DA upptagningsanalys66Synaptosomala alikvoter i en total volym 180 μl upptagningsbuffert inkuberades i en skakare under 15 min vid 30 ° C i närvaro eller frånvaro av 30 nM insulin, i vehikel (PBS) eller i InsAb (slutlig utspädning 1: 500) , i IgG (slutlig utspädning 1: 500) eller i fordonet. Upptagningsbuffert innehållande (i mM): NaCl (122); na2HPO4 (3); NaH2PO4 (15); KCl (5); MgSO4 (1.2); glukos (10), CaCl2 (1); nialamid (0.01); tropolon (0.1); och askorbinsyra (0.001), pH 7.4. Upptag av [3H] DA initierades genom att snabbt fördela 20 μl av varje synaptosomal suspension till 96-brunnsplattorna med varierande koncentrationer av DA (0.003 – 1.0 μM) och [3H] DA (5 nM); efter 5 min i en plattskakare vid 25 ° C avslutades upptagningen genom kall, snabb vakuumfiltrering66. Räkningar per brunn omvandlades till pmol och korrigerades sedan till mg totalt protein per minut. Alla analyser utfördes i tre exemplar och upprepades minst fyra gånger; Vmax och Km beräknades med användning av programvaran Biosoft Kell Radlig (Cambridge, Storbritannien).

Statistisk analys

Data ges som medel ± sem; betydelse bedömdes med hjälp av parade eller oparade studenter t-test eller ANOVA, om inte annat anges. För voltammetri-data, n är antalet inspelningswebbplatser, med tanke på att variation mellan plats och plats inom en striatal subregion är större än variationer mellan djur eller mellan segment30, 32, 55, 56; djurnummer anges för varje datauppsättning. EG50 för effekten av insulin och nikotin på topp-framkallade [DA]o beräknades med användning av Prism 6.0 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). För elektrofysiologiska data bedömdes statistisk signifikans med hjälp av parade t-test eller ett Wilcoxon-test i Prism 6.0, eller en blandad tvåvägs ANOVA i SAS 9.3 (SAS Institute Inc., Cary, NC). För utvärdering av insulininvolvering i smakpreferenskonditionering avslutades två fullständiga studier med användning av protokoll som var identiska med undantag för den använda fordonsbehandlingen. I den första studien fick 10-råttor fordonsinfusioner av PBS och 9 fick infusioner av InsAB. I den andra studien mottog 10-råttor fordonsinfusioner av IgG och 10 fick infusioner av InsAb. Det fanns ingen signifikant skillnad mellan de två fordonsgrupperna (PBS eller IgG) under infusions-konditioneringssessioner (F19= 0.619, blandad tvåvägs ANOVA) med upprepade åtgärder vid infusions-konditioneringssession) eller vid test (F19= 0.012, tvåvägs blandad ANOVA med upprepade mått på smak). Följaktligen kombinerades de två experimenten för analys. För denna analys användes en 2 × 4 blandad ANOVA (med upprepade åtgärder vid infusions-konditioneringsdag) för att bestämma effekterna av mikroinjektionsbehandling under konditionering, följt av skyddade t-tester (en tailed för att bestämma i vilka konditioneringssessioner mikroinjektionsbehandling minskade intagets volym). Samma analys avslutades för håliga konditioneringssessioner. För att bestämma effekten av konditioneringsbehandling under ett två-flaskars smakpreferensprov analyserades data med användning av en blandad tvåvägs ANOVA (med upprepade mått på smak) följt av skyddade t-tester (en tailed för att testa hypotesen att InsAb skulle minska preferensen).

 

 

  

Ytterligare information

  

Så här hänvisar du till den här artikeln: Stouffer, MA et al,. Insulin förstärker frisättningen av datal dopamin genom att aktivera kolinergiska internuroner och signalerar därmed belöning. Nat. Commun. 6: 8543 doi: 10.1038 / ncomms9543 (2015).

 

 

  

Referensprojekt

  

  1. Schulingkamp, ​​RJ, Pagano, TC, Hung, D. & Raffa, RB Insulinreceptorer och insulinverkan i hjärnan: översyn och kliniska konsekvenser. Neurosci. Biobehav. Rev 24, 855–872 (2000).
  2. Gerozissis, K. Hjärninsulin, energi och glukoshomeostas; gener, miljö och metaboliska patologier. Eur. J. Pharmacol. 585, 38 – 49 (2008).
  3. CAS
  4. PubMed
  5. Artikeln
  6. Visa sammanhang
  7. CAS
  8. PubMed
  9. Artikeln
  10. Visa sammanhang
  11. CAS
  12. PubMed
  13. Artikeln
  14. Visa sammanhang
  15. CAS
  16. PubMed
  17. Artikeln
  18. Visa sammanhang
  19. CAS
  20. ISI
  21. PubMed
  22. Artikeln
  23. Visa sammanhang
  24. ISI
  25. PubMed
  26. Artikeln
  27. Visa sammanhang
  28. CAS
  29. PubMed
  30. Artikeln
  31. Visa sammanhang
  32. Visa sammanhang
  33. CAS
  34. ISI
  35. PubMed
  36. Artikeln
  37. Visa sammanhang
  38. CAS
  39. ISI
  40. PubMed
  41. Artikeln
  42. Visa sammanhang
  43. CAS
  44. ISI
  45. PubMed
  46. Visa sammanhang
  47. ISI
  48. PubMed
  49. Artikeln
  50. Visa sammanhang
  51. CAS
  52. ISI
  53. PubMed
  54. Artikeln
  55. Visa sammanhang
  56. CAS
  57. ISI
  58. PubMed
  59. Artikeln
  60. Visa sammanhang
  61. Visa sammanhang
  62. CAS
  63. ISI
  64. PubMed
  65. Artikeln
  66. Visa sammanhang
  67. CAS
  68. ISI
  69. PubMed
  70. Artikeln
  71. Visa sammanhang
  72. CAS
  73. ISI
  74. PubMed
  75. Artikeln
  76. Visa sammanhang
  77. PubMed
  78. Artikeln
  79. Visa sammanhang
  80. Visa sammanhang
  81. CAS
  82. PubMed
  83. Artikeln
  84. Visa sammanhang
  85. ISI
  86. PubMed
  87. Artikeln
  88. Visa sammanhang
  89. CAS
  90. ISI
  91. PubMed
  92. Artikeln
  93. Visa sammanhang
  94. CAS
  95. ISI
  96. PubMed
  97. Artikeln
  98. Visa sammanhang
  99. CAS
  100. PubMed
  101. Artikeln
  102. Visa sammanhang
  103. Visa sammanhang
  104. CAS
  105. ISI
  106. PubMed
  107. Artikeln
  108. Visa sammanhang
  109. CAS
  110. ISI
  111. PubMed
  112. Artikeln
  113. Visa sammanhang
  114. CAS
  115. ISI
  116. PubMed
  117. Artikeln
  118. Visa sammanhang
  119. CAS
  120. ISI
  121. PubMed
  122. Artikeln
  123. Visa sammanhang
  124. PubMed
  125. Artikeln
  126. Visa sammanhang
  127. CAS
  128. ISI
  129. PubMed
  130. Artikeln
  131. Visa sammanhang
  132. CAS
  133. PubMed
  134. Artikeln
  135. Visa sammanhang
  136. CAS
  137. ISI
  138. PubMed
  139. Artikeln
  140. Visa sammanhang
  141. CAS
  142. PubMed
  143. Artikeln
  144. Visa sammanhang
  145. ISI
  146. PubMed
  147. Artikeln
  148. Visa sammanhang
  149. Visa sammanhang
  150. Visa sammanhang
  151. CAS
  152. ISI
  153. PubMed
  154. Artikeln
  155. Visa sammanhang
  156. CAS
  157. ISI
  158. PubMed
  159. Artikeln
  160. Visa sammanhang
  161. CAS
  162. ISI
  163. PubMed
  164. Artikeln
  165. Visa sammanhang
  166. CAS
  167. ISI
  168. PubMed
  169. Artikeln
  170. Visa sammanhang
  171. CAS
  172. ISI
  173. PubMed
  174. Visa sammanhang
  175. CAS
  176. ISI
  177. PubMed
  178. Artikeln
  179. Visa sammanhang
  180. PubMed
  181. Artikeln
  182. Visa sammanhang
  183. CAS
  184. ISI
  185. PubMed
  186. Artikeln
  187. Visa sammanhang
  188. CAS
  189. ISI
  190. PubMed
  191. Artikeln
  192. Visa sammanhang
  193. CAS
  194. ISI
  195. PubMed
  196. Artikeln
  197. Visa sammanhang
  198. CAS
  199. ISI
  200. PubMed
  201. Artikeln
  202. Visa sammanhang
  203. Visa sammanhang
  204. CAS
  205. ISI
  206. PubMed
  207. Visa sammanhang
  208. Visa sammanhang
  209. Visa sammanhang
  210. Visa sammanhang
  211. CAS
  212. ISI
  213. PubMed
  214. Artikeln
  215. Visa sammanhang
  216. CAS
  217. PubMed
  218. Artikeln
  219. Visa sammanhang
  220. CAS
  221. ISI
  222. PubMed
  223. Visa sammanhang
  224. Visa sammanhang
  225. CAS
  226. PubMed
  227. Artikeln
  228. Visa sammanhang
  229. ISI
  230. PubMed
  231. Artikeln
  232. Visa sammanhang
  233. Visa sammanhang
  234. ISI
  235. PubMed
  236. Artikeln
  237. Visa sammanhang
  238. Visa sammanhang
  239. CAS
  240. ISI
  241. PubMed
  242. Artikeln
  243. Visa sammanhang
  244. Visa sammanhang
  245. Vogt, MC & Bruning, JC CNS-insulinsignalering vid kontroll av energihomeostas och glukosmetabolism — från embryo till ålderdom. Trender Endokrinol. Metab. 24, 76–84 (2013).
  246. Havrankova, J., Schmechel, D., Roth, J. & Brownstein, M. Identifiering av insulin i råtthjärna. Proc. Natl Acad. Sci. USA 75, 5737–5741 (1978).
  247. King, GL & Johnson, S. Receptormedierad transport av insulin över endotelceller. Vetenskap 227, 1583–1586 (1985).
  248. Strubbe, JH, Porte, D. Jr & Woods, SC Insulinsvar och glukosnivåer i plasma och cerebrospinalvätska under fasta och återmatning hos råtta. Physiol. Uppför dig. 44, 205–208 (1988).
  249. Banks, WA & Kastin, AJ Differentiell permeabilitet av blod-hjärnbarriären mot två bukspottkörtelpeptider: insulin och amylin. Peptider 19, 883-889 (1998).
  250. Banks, WA Källan till cerebral insulin. Eur. J. Pharmacol. 490, 5 – 12 (2004).
  251. Nemoto, T. et al,. Ny insikt om insulinsyntes och dess sekretion i hippocampus hos råttor och hjärnbark: amyloid-ß1-42-inducerad reduktion av proinsulinnivån via glykogensyntas-kinas-3β. Cell signal. 26, 253 – 259 (2014).
  252. De Souza, CT et al,. Konsumtion av en fettrik diet aktiverar ett proinflammatoriskt svar och inducerar insulinresistens i hypotalamus. Endokrinologi 146, 4192 – 4199 (2005).
  253. Anthony, K. et al,. Dämpning av insulin-framkallade svar i hjärnanätverk som kontrollerar aptit och belöning för insulinresistens: hjärnbasen för försämrad kontroll av matintaget i metaboliskt syndrom? Diabetes 55, 2986 – 2992 (2006).
  254. Kelley, AE & Berridge, KC Den neurovetenskapliga naturliga belöningen: relevans för beroendeframkallande läkemedel. J. Neurosci. 22, 3306–3311 (2002).
  255. Koob, GF & Volkow, ND Neurocircuitry of addiction. Neuropsykofarmakologi 35, 217–238 (2010).
  256. Werther, GA et al,. Lokalisering och karaktärisering av insulinreceptorer i hjärnan i hjärnan och hypofysen med hjälp av vitro autoradiografi och datoriserad densitometri. Endokrinologi 121, 1562 – 1570 (1987).
  257. Figlewicz, DP, Evans, SB, Murphy, J., Hoen, M. & Baskin, DG Expression av receptorer för insulin och leptin i ventralt tegmentalt område / substantia nigra (VTA / SN) hos råttan. Brain Res. 964, 107–115 (2003).
  258. Daws, LC et al,. Insulin signalering och missbruk. Neuropharmacology 61, 1123 – 1128 (2011).
  259. Figlewicz, DP & Sipols, AJ Energy-regleringssignaler och matbelöning. Pharmacol. Biochem. Uppför dig. 97, 15–24 (2010).
  260. Patterson, TA et al,. Matberövande minskar mRNA och aktiviteten hos råttdopamintransportören. Neuroendocrinology 68, 11 – 20 (1998).
  261. Carvelli, L. et al,. PI 3-kinasreglering av dopaminupptag. J. Neurochem. 81, 859 – 869 (2002).
  262. Williams, JM et al,. Hypoinsulinemi reglerar amfetamininducerad omvänd transport av dopamin. PLoS Biol. 5, e274 (2007).
  263. Zhen, J., Reith, MEA & Carr, KD Kronisk livsmedelsbegränsning och dopamintransportörfunktion i råttstriatum. Brain Res. 1082, 98–101 (2006).
  264. Schoffelmeer, AN et al,. Insulin modulerar kokainkänslig monoamintransportörsfunktion och impulsivt beteende. J. Neurosci. 31, 1284 – 1291 (2011).
  265. Mebel, DM, Wong, JC, Dong, YJ & Borgland, SL Insulin i det ventrala tegmentala området minskar hedonisk utfodring och undertrycker dopaminkoncentration via ökad återupptagning. Eur. J. Neurosci. 36, 2336–2346 (2012).
  266. Labouebe, G. et al,. Insulin inducerar långvarig depression av ventrale tegmentala dopamin neuroner via endocannabinoider. Nat. Neurosci. 16, 300 – 308 (2013).
  267. Konner, AC et al,. Roll för insulinsignalering i katekolaminerga nervceller vid kontroll av energihomeostas. Cell Metab. 13, 720 – 728 (2011).
  268. Figlewicz, DP, Bennett, JL, Aliakbari, S., Zavosh, A. & Sipols, AJ Insulin verkar vid olika CNS-platser för att minska akut sackarosintag och sackaros självadministrering hos råttor. Am. J. Physiol. Regul. Integrera. Komp. Physiol. 295, R388 – R394 (2008).
  269. Patel, JC, Witkovsky, P., Coetzee, WA & Rice, ME Subsecond reglering av striatal dopaminfrisättning genom pre-synaptisk KATP kanaler. J. Neurochem. 118, 721 – 736 (2011).
  270. Tepper, JM & Bolam, JP Funktionell mångfald och specificitet hos neostriatala internuroner. Curr. Opin. Neurobiol. 14, 685–692 (2004).
  271. Zhou, FM, Liang, Y. & Dani, JA Endogen nikotin kolinerg aktivitet reglerar dopaminfrisättning i striatum. Nat. Neurosci. 4, 1224–1229 (2001).
  272. Rice, ME & Cragg, SJ Nikotin förstärker belöningsrelaterade dopaminsignaler i striatum. Nat. Neurosci. 7, 583–584 (2004).
  273. Zhang, H. & Sulzer, D. Frekvensberoende modulering av dopaminfrisättning av nikotin. Nat. Neurosci. 7, 581–582 (2004).
  274. Patel, JC, Rossignol, E., Rice, ME & Machold, RP Motsatt reglering av striatal dopaminfrisättning och utforskande motoriskt beteende genom kolinerga ingångar i hjärnan och hjärnstammen. Nat. Kommun. 3, 1172 (2012).
  275. Threlfell, S. et al,. Striatal frisättning av dopamin utlöses av synkron aktivitet i kolinerga internuroner. Neuron 75, 58 – 64 (2012).
  276. Cachope, R. et al,. Selektiv aktivering av kolinerga internuroner förbättrar ackumulerad fasisk dopaminfrisättning: ställer in tonen för belöningsprocessen. Cellrepresentant 2, 1 – 9 (2012).
  277. Jones, IW, Bolam, JP & Wonnacott, S. Presynaptisk lokalisering av nikotinacetylkolinreceptor beta2-underenhetsimmunreaktivitet i nigrostriatala dopaminerga neuroner från råtta. J. Comp. Neurol. 439, 235-247 (2001).
  278. Higley, MJ et al,. Kolinerga internuroner medierar snabb VGluT3-beroende glutamatergisk transmission i striatum. PLoS ONE 6, e19155 (2011).
  279. Touzani, K., Bodnar, R. & Sclafani, A. Aktivering av dopamin D1-liknande receptorer i nucleus accumbens är avgörande för förvärvet, men inte uttrycket, av näringsbetingade smakpreferenser hos råttor. Eur. J. Neurosci. 27, 1525–1533 (2008).
  280. Sclafani, A., Touzani, K. & Bodnar, RJ Dopamine och lärt sig matpreferenser. Physiol. Uppför dig. 104, 64–68 (2011).
  281. Mayer, CM & Belsham, DD Central insulinsignalering dämpas av långvarig insulinexponering via insulinreceptorsubstrat-1 serinfosforylering, nedbrytning av proteasomal och nedbrytning av lysosomal insulinreceptor. Endokrinologi 151, 75–84 (2010).
  282. Rice, ME, Patel, JC & Cragg, SJ Dopaminfrisättning i basala ganglier. Neurovetenskap 198, 112–137 (2011).
  283. Smith, Y., Surmeier, DJ, Redgrave, P. & Kimura, M. Thalamic bidrag till basal ganglierrelaterad beteendebyte och förstärkning. J. Neurosci. 31, 16102–16106 (2011).
  284. Threlfell, S. et al,. Striatal muskarinreceptorer främjar aktivitetsberoende av dopaminöverföring via distinkta receptorundertyper på kolinerga internuroner i ventral kontra dorsalt striatum. J. Neurosci. 30, 3398 – 3408 (2010).
  285. Hoebel, BG, Avena, NM & Rada, P. Accumbens dopamin-acetylkolinbalans i tillvägagångssätt och undvikande. Curr. Opin. Pharmacol. 7, 617–627 (2007).
  286. Pothos, EN, Creese, I. & Hoebel, BG Begränsad ätning med viktminskning minskar selektivt extracellulärt dopamin i nucleus accumbens och förändrar dopaminrespons på amfetamin, morfin och matintag. J. Neurosci. 15, 6640-6650 (1995).
  287. Geiger, BM et al,. Brister i mesolimbisk dopaminneuröverföring vid fetma hos råtta. Neuroscience 159, 1193 – 1199 (2009).
  288. Morris, JK et al,. Insulinresistens försämrar nigrostriatal dopaminfunktion. Exp. Neurol. 231, 171 – 180 (2011).
  289. De Araujo, IE et al,. Matbelöning i avsaknad av smakreceptorsignalering. Neuron 57, 930 – 941 (2008).
  290. Stice, E., Spoor, S., Bohon, C. & Small, DM Relationen mellan fetma och trubbig striatal respons på mat modereras av TaqIA A1-allelen. Science 322, 449–452 (2008).
  291. Wang, GJ et al,. Hjärndopamin och fetma. Lancet 357, 354 – 357 (2001).
  292. Johnson, PM & Kenny, PJ Dopamine D2-receptorer i missbruksliknande belöningsdysfunktion och tvångsmässig ätning hos överviktiga råttor. Nat. Neurosci. 13, 635–641 (2010).
  293. Carr, KD, Kim, G.-Y. & Cabeza de Vaca, S. Givande och rörelseaktiverande effekter av direkta dopaminreceptoragonister förstärks av kronisk matbegränsning hos råttor. Psykofarmakologi (Berl.) 154, 420-428 (2001).
  294. Levin, BE & Keesey, RE Försvar av olika inställningspunkter för kroppsvikt hos dietinducerade överviktiga och resistenta råttor. Am. J. Physiol. 274, R412 – R419 (1998).
  295. Patel, JC & Rice, ME Övervakning av axonal och somatodendritisk dopaminfrisättning med hjälp av snabbscannad cyklisk voltammetri i hjärnskivor. Metoder Mol. Biol. 96, 243–273 (2013).
  296. Lee, CR, Witkovsky, P. & Rice, ME Reglering av substantia nigra pars reticulata GABAergisk neuronaktivitet av H2O2 via flufenaminsyrakänsliga kanaler och KATP kanaler. Främre. Syst. Neurosci. 5, 14 (2011).
  297. Chen, BT, Moran, KA, Avshalumov, MV & Rice, ME Begränsad reglering av somatodendritisk dopaminfrisättning genom spänningskänslig Ca2+ kanaler i kontrast till stark reglering av frisättning av axonal dopamin. J. Neurochem. 96, 645 – 655 (2006).
  298. Li, X. et al,. Förbättrad striatal dopaminöverföring och motorprestanda med LRRK2-överuttryck hos möss elimineras genom familjär Parkinsons sjukdomsmutation G2019S. J. Neurosci. 30, 1788 – 1797 (2010).
  299. Wu, Q., Reith, MEA, Wightman, RM, Kawagoe, KT & Garris, PA Bestämning av frigörings- och upptagningsparametrar från elektriskt framkallad dopamindynamik mätt med realtids voltammetri. J. Neurosci. Metoder 112, 119–133 (2001).
  300. Chen, BT, Avshalumov, MV & Rice, ME H2O2 är en ny, endogen modulator för synaptisk dopaminfrisättning. J. Neurophysiol. 85, 2468 – 2476 (2001).
  301. Witkovsky, P., Patel, JC, Lee, CR & Rice, ME Immunocytokemisk identifiering av proteiner som är involverade i dopaminfrisättning från det somatodendritiska avdelningen av nigrala dopaminerga neuroner. Neurovetenskap 164, 488–496 (2009).
  302. Sugimoto, K. et al,. Insulinreceptor i perifer nerv från råtta: dess plats och alternativt skarvade isoformer. Diabetes Metab. Res. Rev. 16, 354 – 363 (2000).
  303. Sanchez-Alavez, M. et al,. Insulin orsakar hypertermi genom direkt hämning av värmekänsliga nervceller. Diabetes 59, 43 – 50 (2010).
  304. Paxinos, G. & Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates 6th edn Academic (2007).
  305. Strubbe, JH & Mein, CG Ökad utfodring som svar på bilateral injektion av insulinantikroppar i VMH. Physiol bete sig. 19, 309–313 (1977).
  306. Paranjape, SA et al,. Påverkan av insulin i ventromedial hypothalamus på glukagonutsöndring i bukspottkörteln in vivo-. Diabetes 59, 1521 – 1527 (2010).
  307. Wise, RA & Hoffman, DC Lokalisering av läkemedelsbelöningsmekanismer genom intrakraniella injektioner. Synaps 10, 247–263 (1992).
  308. Zhen, J., Maiti, S., Chen, N., Dutta, AK & Reith, MEA Interaktion mellan en hydroxipiperidinanalog av 4- (2-benshydryloxietyl) -1- (4-fluorbensyl) piperidin och aspartat 68 i den humana dopamintransportören. Eur. J. Pharmacol. 506, 17–26 (2004).

Hämta referenser

 

 

  

Tack

  

Dessa studier stöds av NIH-bidrag DA033811 (MER, KDC och MEAR), NS036362 (MER), DA03956 (KDC) och en NARSAD Independent Investigator Award (KDC). S961 var en generös gåva från Dr Lauge Schaffer, Novo Nordisk. PP5-antikropp var en generös present från Pfizer. Vi tackar Dr Charles Nicholson, NYU School of Medicine för programvara att extrahera Vmax värden från FCV-data.

 

 

  

upphovsmän

  

Författarens fotnoter

  1. Dessa författare bidrog lika med detta arbete.

    • Catherine A. Woods &
    • Jyoti C. Patel

anknytningar

  1. Institutionen för neurovetenskap och fysiologi, New York University School of Medicine, 550 First Avenue, New York, New York 10016, USA

    • Melissa A. Stouffer,
    • Li Bao &
    • Margaret E. Rice
  2. Institutionen för neurokirurgi, New York University School of Medicine, 550 First Avenue, New York, New York 10016, USA

  3. Melissa A. Stouffer,
  4. Jyoti C. Patel,
  5. Christian R. Lee,
  6. Li Bao &
  7. Margaret E. Rice
  8. Catherine A. Woods
  9. Paul Witkovsky
  10. Robert P. Machold
  11. Kymry T. Jones,
  12. Soledad Cabeza de Vaca,
  13. Maarten EA Reith &
  14. Kenneth D. Carr
  15. Maarten EA Reith &
  16. Kenneth D. Carr
  17. Center for Neural Science, New York University, 4 Washington Place, New York, New York 10003, USA

  18. Institutionen för ögonläkare, New York University School of Medicine, 550 First Avenue, New York, New York 10016, USA

  19. Smilow Neuroscience Program, New York University School of Medicine, 550 First Avenue, New York, New York 10016, USA

  20. Institutionen för psykiatri, New York University School of Medicine, 550 First Avenue, New York, New York 10016, USA

  21. Institutionen för biokemi och molekylär farmakologi, New York University School of Medicine, 550 First Avenue, New York, New York 10016, USA

Bidrag

MAS, MER och KDC utformade den övergripande studien och utarbetade manuskriptet; alla författare bidrog till den slutliga manuskripttexten; MAS genomförde voltammetri-experiment och dataanalys, med bidrag från LB och JCP; JCP bidrog till utformningen av voltammetri-experiment och tillhandahöll programvara och analyserade Vmax data; PW erhöll alla immunohistokemi-bilder och tillhandahöll kvantitativ analys av dessa data; CRL utformade elektrofysiologiprotokoll och erhållna biocytinfyllda neuroner; CRL och JCP utförde elektrofysiologiska studier och genomförde all associerad dataanalys; RPM utvecklades och tillhandahöll förhjärnan Chatt KO-möss; CAW och MAS utformade beteendestudier i samråd med KDC och SCdV; dessa leddes främst av CAW; SCdV bidrog också till statistisk analys av beteendedata; KTJ och MEAR konstruerade och analyserade DA-upptagningsförsök i synaptosomer för att bedöma effekten av InsAb; KTJ genomförde experimenten.