Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2011 Apr; 300 (4): R876 – R884.
Publicerad online 2011 Feb 9. doi: 10.1152 / ajpregu.00655.2010
PMCID: PMC3075076
1,2 Abstrakt
Vi har tidigare rapporterat att administration av insulin i den bågformiga kärnan i hypotalamus minskar motivationen för sackaros, bedömd med en självadministrationsuppgift, hos råttor. Eftersom mönstret för aktivering av centrala nervsystemet (CNS) i samband med självadministrering av sackaros inte har utvärderats, mätte vi i den aktuella studien uttrycket av c-Fos som ett index för neuronal aktivering. Vi tränade råttor till bar-press för sackaros, enligt ett schema med fast förhållande (FR) eller progressivt förhållande (PR) och kartlade uttryck för c-Fos immunoreaktivitet i CNS, jämfört med c-Fos uttryck i hanterade kontroller. Vi observerade ett unikt uttryck av c-Fos i den mediala hypothalamus (den bågformiga, paraventrikulära, retrochiasmatiska, dorsomediala och ventromediala kärnan) i samband med början av PR-prestanda och uttryck av c-Fos i den laterala hypotalamus och bäddkärnan. av stria terminalis i samband med uppkomsten av FR-prestanda. c-Fos-uttrycket ökades i nucleus accumbens hos både FR- och PR-råttor. Vår studie betonar vikten av både hypothalamisk energihomeostasekretskrets och limbiska kretsar i utförandet av en livsmedelsbelöningsuppgift. Med tanke på den mediala hypotalamus roll i reglering av energibalans antyder vår studie att detta kretslopp kan bidra till att belöna reglering inom det större sammanhanget med energihomeostas.
mesolimbic dopaminergic (DA) -kretsar, inklusive det ventrala tegmentalområdet (VTA) och prognoser till striatum och kortikala platser, har identifierats som att spela en kritisk roll i de motiverande eller belöna aspekterna av många klasser av missbruksläkemedel (13, 22-24, 26, 48). Nyligen genomförd forskning från vårt laboratorium och andra tyder på att det här kretssystemet också spelar en viktig roll i de motiverande eller givande aspekterna av mat. Funktionell och anatomisk interaktion med kretsar som reglerar energihomeostas föreslås av rapporter om modulering av matbelöning med djurens näringsstatus (10, 14, 16, 43). Modulering av belöning, inklusive matbelöning, genom närings- eller metabolisk status, påverkas starkt av neurala och endokrina signaler, inklusive insulin (15leptin (11, 18, 21, 30, 32), ghrelin (35), melaninkoncentrerande hormon (MCH) (45) och orexin (5, 7): närvaron av receptorer, den biokemiska och cellulära effekten och in vivo eller beteendevirkningen av dessa signaler i centrala nervsystemet (CNS) har visat sig rikligt under de senaste åren.
De utvidgade limbiska kretsarna har likaledes visat sig spela en roll i utfodring och matbelöning (2, 19, 28). Det finns dock ytterligare bidragande CNS-webbplatser. Särskilt har den laterala hypotalamusen (LH) länge varit känd för att vara en plats som förmedlar beteende och självstimuleringsbeteenden (4, 31). Orexinerga nervceller och leptinsignaler i LH har identifierats som viktiga för utfodring och matbelöning (5, 29, 30). Vi observerade nyligen att insulin som administrerades antingen i den tredje cerebrala ventrikeln eller i den bågformiga kärnan i hypotalamus (ARC) kan minska sukros självadministrering, men insulinadministrering i VTA eller nucleus accumbens hade ingen effekt på detta specifika belöningsparadigma (15). Således verkar det som att flera hypotalamiska platser kan spela en viktig roll i motiverad matsökning och förvärv, och i överensstämmelse med detta skulle man anta att hypotalamiska regioner är väsentligen aktiverade i samband med matadministration. För att börja testa den här hypotesen har vi kartlagt c-Fos-uttryck i CNS hos råttor som tränats i ett sukros-självadministrationsparadigm, efter fast-ratio-utbildning (FR), eller efter progressiv ratio (PR) -utbildning, en strängare uppgift för bedömning av motivation (20).
MATERIAL OCH METODER
Ämnen.
Försöken var Albino-råttor av hankön (325-425 g) från Simonsen (Gilroy, CA). Råttor bibehölls på chow ad libitum. De upprätthölls på en 12: 12-timmars ljus-mörk cykel med lampor på vid 6 AM och utbildades och testades mellan 7 AM och middag, i postprandial och postabsorptivt tillstånd. Alla förfaranden som utförts på råttorna följde National Institutes of Health: s riktlinjer för djurvård och godkändes av underkommittén för djuromsorg och användning av kommittén för forskning och utveckling vid VA Puget Sound Health Care System.
Sukros självadministrering.
Förfaranden baserades på vår publicerade metodik (15och genomfördes på matade råttor. Experimentet inkluderade tre faser: autoshaping för att initiera träning, FR-träning och PR-utbildning (PR) med användning av PR-algoritmen för Richardson och Roberts (38). PR-algoritmen kräver 1, 2, 4, 6, 9, 12, 16, 20, 28, 36, 48, 63, 83, 110, 145, 191, 251, 331, 437, 575, 759, 999, 999, XNUMX etc.) spakpress för att lyckas med belöningsleveranser inom en session (38). Råttor tränades för att själv administrera 5% sackaros (belöning av 0.5 ml) levererad till en vätskedroppsbehållare. Operantboxarna, kontrollerade av ett Med Associates-system (Georgia, VT), hade två spakar, men endast en spak (en aktiv, utdragbar spak) aktiverade infusionspumpen. Tryck på den andra spaken (en inaktiv, stationär spak) spelades också in. Som vi har observerat tidigare var antalet pressar på den inaktiva spaken mycket lågt (mindre än 10 pressar / session). Sackaroslösningen levererades i en vätskedroppsbehållare för oral konsumtion (Med Associates, St. Albans, VT). Grundutbildning genomfördes under 1-timmar under ett kontinuerligt förstärkningsschema (FR1: varje spakpress förstärktes). Varje session började med införandet av den aktiva spaken och belysningen av ett vitt husljus som stannade kvar under hela sessionen. En 5-ton (2900 Hz, 20 dB ovanför bakgrund) och ljus (7.5 W vitt ljus ovanför den aktiva spaken) diskret sammansatt cue åtföljde varje belöningsleverans, med en 20-time-out som börjar med sackarosleveransen. FR-träning genomfördes under 10 dagar; stabilt svar uppnås vid den femte sessionen. PR-träning genomfördes under högst möjliga 3 h / dag under 10 dagar. PR-sessioner avslutades efter 30 min utan att någon aktiv spakpress svarade, vid vilken tidpunkt husljuset stängdes automatiskt och den aktiva spaken dras tillbaka; råttor togs ut ur kamrarna och återvände till sina hemburar. "Stopptid" rapporterade i Tabell 2 representerar den tidpunkt då systemet stängdes av; därför skulle den senaste aktiva spakpressen ha inträffat 30 min före stopptiden. Uppförandedata (Tabell 2) representerar genomsnitt av sessioner 6-10 för FR-utbildning, och sessioner 1-9 för PR-utbildning. Kontrollhanterade råttor togs från husrummet och placerades i en ren operatörskammare med husljus tänd under 60 min, inom procedurrummet, för att simulera hanteringen och rumupplevelserna hos råttorna som själv administrerar sackaros. De fick inte något att äta eller dricka medan de var i operantlådorna och hade ingen tillgång till spakar.
På den sista dagen placerades råttor i kamrarna enligt träningsdagarna och hölls i kamrarna under 90 minuter, varefter de avlägsnades, för anestesi, perfusion och efterföljande immunhistokemi. Kontrollråttor fördes också in i procedurrummet och förvarades i en ren operantkammare enligt träningsdagar under 90 minuter, varefter de bedövades och perfunderades. Omedelbart efter den senaste 90-minuters sessionen bedövades råttor djupt med isofluraninhalation och perfunderades med 0.9% NaCl följt av kall 4% paraformaldehydlösning. Tidpunkten för bedövning och eutanasi baserades på den kända tidsförloppet för topputtryck av c-Fos-protein 90–120 minuter efter händelsen. Således skulle c-Fos-uttryck spegla aktiveringen av CNS vid början av beteendeuppgiften snarare än att vara resultatet av att djuren upplevde uppgiften och intog sackaros. Hjärnor avlägsnades och fixerades i paraformaldehyd i flera dagar; därefter placerades de därefter i 20% sackaros-PBS, varefter de placerades i 30% sackaros-PBS-lösning. Hjärnor delades upp på en kryostat (Leica CM 3050S kryostat) för immunhistokemi.
c-Fos immunohistokemi och kvantifiering.
Vi använde vår etablerade metodik för att kvantifiera immunreaktivt c-Fos-protein i hjärnavsnitt (12). Den inledande kvalitativa skärmen för hela hjärnan utfördes för c-Fos-uttryck. Skjutmonterade 12-um koronalsektioner av hela hjärnan tvättades 3 gånger i PBS (Oxoid, Hampshire, UK). Sektioner blockerades sedan under 1 h vid rumstemperatur i PBS innehållande 5% normalt get- eller åsnesserum. Sektioner tvättades sedan flera gånger i PBS och inkuberades över natten vid 4 ° C i primära antikroppslösningar som uppstod i PBS. Sektioner tvättades tre gånger i PBS och inkuberades sedan i mörkret vid rumstemperatur i sekundär antikroppslösning som uppstod i PBS under 1 h. Avsnitt tvättades därefter igen i PBS och monterades och höljet halkades i monteringsmedium för Vectashield-hårddisk (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Digitala bilder av sektioner förvärvades med hjälp av ett Nikon Eclipse E-800 fluorescensmikroskop anslutet till en Optiphot-kamera och med hjälp av programvaran Image Pro Plus (Media Cybernetics, Silver Spring, MD).
Därefter fokuserade vi på ett begränsat antal områden som visar en uppenbar skillnad mellan villkor, för kvantifiering och för neuronal fenotyp. Specifikt fokuserade vi på nucleus accumbens core and shell (NAc); främre och bakre bäddkärnan av stria terminalis (aBNST, pBNST); mediala hypotalamiska regioner [ventromedial kärna (VMH), dorsomedial hypothalamus (DMH), paraventrikulär kärna (PVN), retrochiasmatisk område (RCh) och ARC]; lateral hypotalamus (LH), inklusive rygg- och ventralregioner och det periforniska området (peF); VTA; hjärnstam [sämre olivolja, hypoglossal (nXII) kärna i den ensamma kanalen, lateral retikulär kärna och C1 / A1 adrenalin / noradrenalinkärnor]. Atlas-matchade 12-μm-sektioner utvärderades med avseende på c-Fos-uttryck och kvantifiering i matchade sektioner och regioner, baserat på atlasen från Paxinos och Watson (34). Snälla se Tabell 1 för specifika stereotaxiska koordinater. Analysernas primära fokus var att jämföra varje beteendeuppgift med dess respektive kontroll (PR vs. PRC; FR mot FRC). För att optimera möjliga skillnader baserade på beteende kontra kontrollförhållanden valdes toppprestatörer från PR- och FR-grupperna för analys. Således analyserades 4 / 12 PR- och 3 / 12 FR-råttor: Dessa råttor hade ett aktivt tryckpressnummer (den primära beteendeendepunkten) som var större än en standardavvikelse över medelvärdet för deras respektive beteendegrupp. En subkohort av kontrollråttorna (5 PRC och 3 FRC-råttor, närvarande i procedurrummet samtidigt som FR- eller PR-råttorna) analyserades också. En ytterligare grupp med tre råttor togs genom FR-förfarandet ("FRext") för att härma PR-procedurens tillsatta varaktighet (dvs. totalt 20 dagar, eftersom PR-råttor tas genom FR och sedan PR) för att utvärdera om skillnader mellan FR och PR berodde på beteendeuppgiften eller procedurens varaktighet. FRext-hjärnorna analyserades och screenades inte systematiskt, men specifika regioner av intresse analyserades med de andra fyra grupperna för att möjliggöra en jämförande kvantifiering, vilket specifikt anges i resultaten.
För kvantifiering (vid 40 × förstoring) valdes atlas-matchade regioner. ImagePro Plus-programvaran (Media Cybernetics) användes för att fånga en bild av det önskade området. Ett område avgränsades för räkning och en tröskel för positiva cellräkningar fastställdes. Det identiska området och bakgrunden (tröskeln) användes för sektioner från respektive experimentgrupper, och mjukvarumäkning av positiva celler (kvantifiering) utfördes i samma session för alla experimentgrupper för att förhindra mellan sessioner förändringar i bakgrundssättningen. För statistisk analys togs räkningar från en individuell råtta endast om motsvarande eller fullständiga sektioner genom varje område (som definierats i Tabell 1) var tillgängliga; data för ett specifikt område togs inte från en råtta om det fanns ofullständig bilateral representation för det området.
Kvalitativ dubbelmärkt immunofluorescensanalys.
Hjärnsektioner togs från råttorna i vilka c-Fos kvantifierades, för dubbelmärkt immunhistokemi. Eftersom vi inte ville störa djurens beteendeprestanda förbehandlades de inte med kolchicin för att optimera visualisering av peptidneurotransmittorer. Därför var visualisering av neuronala fenotyper aktiverade i samband med självadministrationsuppgiften begränsad. För att påbörja bedömningen av fenotyperna av aktiverade nervceller på ett antal CNS-platser togs dock digitala bilder (förvärvade som beskrivs i avsnittet ovan) med 20 ×, 40 × eller 60 × (som anges i figurförklaringar) förstoring . Dubbelfärgningsproceduren för glutamatdekarboxylas (GAD), tyrosinhydroxylas (TH), CRF, neuropeptid Y (NPY), Agouti-relaterad peptid (AgRP) och tryptofanhydroxylas var jämförbar med analysen av c-Fos-immunreaktivitet på dess egen, förutom att en blandning av c-Fos-Ab och en av de andra primära antikropparna användes för inkubation över natten vid 4 ° C; på samma sätt var båda sekundära antikropparna i samma lösning och inkuberades under 1 timme i mörkret vid rumstemperatur. En 20-minuters 50% etanoltvätt före blockeringssteget användes för orexinanalysen. Initiala optimeringsanalyser utfördes för att bestämma en lämplig utspädning av de primära antikropparna. Primära antikroppar som användes var kanin-anti-c-Fos (1: 500) (sc-52) och mus-anti-c-Fos (1: 800) (båda från Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA); mus-anti-GAD (1: 1,000 1), mus-anti-tyrosinhydroxylas (500: 1) och får-anti-tryptofanhydroxylas (allt från Chemicon, Temecula, CA); kanin-anti-CRF (500: 1) (gåva från Dr. Wylie Vale, Salk Institute, CA); kanin-anti-NPY (1,000: 1 1,000), kanin-anti-AGRP (1: 5,000 3) och get-anti-orexin A (488: 1 500) allt från Phoenix Pharmaceutical (St. Joseph, MO). Använda sekundära antikroppar var Cy1-konjugerad get-anti-kanin eller anti-mus (Jackson Immunoresearch; West Grove, PA), Alexa Fluor 2,500 get-anti-mus eller anti-kanin eller åsna anti-får IgG (Molecular Probes, Eugene, OR) ; alla sekundära antikroppar späddes vid 488: 1. c-Fos / MCH dubbel immunfärgning analyserades seriellt; först för MCH (500: 5 1 primär antikropp, Millipore) med Alexa-500-get-anti-kanin (3: 20) sekundär antikropp. Objektglasen låstes om med 50% normalt getserum och färgades för anti-c-Fos (XNUMX: XNUMX) och cyXNUMX-get-anti-kanin som en sekundär antikropp. En XNUMX-minuters XNUMX% etanoltvätt före blockeringssteget användes för MCH-analysen.
Statistiska analyser.
Gruppdata presenteras som medel ± SE i texten, tabellerna och siffrorna. Betydelse definieras som P ≤ 0.05. Statistiska jämförelser görs mellan experimentgrupper (FR vs. PR) eller mellan experimentgrupper och motsvarande kontroller (PR vs. PRC; FR vs. FRC) med hjälp av oparade studenters t-testa. Pearson-korrelationskoefficienter mellan aktiva hävstångspressar och c-Fos-uttryck i olika hjärnregioner, samt korrelation av c-Fos-uttryck mellan olika hjärnregioner under identiska experimentella förhållanden, beräknades med hjälp av StatPlus: mac LE statistiskt analysprogram för Mac OS-version 2009 av AnalystSoft. Vi testade för linjära korrelationer (Pearson's R statistik) mellan c-Fos-uttryck i olika CNS-regioner. Vi undersökte också samband mellan c-Fos-uttryck i olika aktiverade CNS-regioner och beteende. FR- och PR-data från råttor, för vilka c-Fos-kvantifiering genomfördes, användes för dessa korrelationer.
RESULTAT
c-Fos kvantifiering.
Som vi har observerat tidigare var antalet aktiva spakpressar betydligt större för PR kontra FR-prestanda (Tabell 2), och antalet sackarosbelöningar var större under FR-prestanda. Sessionens längd för PR-råttorna var ungefär 90 min (stopptid - 30). Tabell 3 listar c-Fos immunoreaktiva cellräkningar i alla CNS-regioner där kvantifiering utfördes. Mönstret för c-Fos-uttryck för FR- och PR-råttorna sammanfattas i Fig 1. Det var signifikant aktivering av den mediala hypotalamus (MH)totalt, en komposit av ARC, PVN, RCh, DMH och VMH) av råttor som är engagerade i PR-spaken som pressar på sackaros, men ingen total aktivering hos råttor som ingår i FR-spaken som pressar för sackaros, jämfört med respektive kontroller. Inom den mediala hypotalamusen hos PR-råttor inträffade denna aktivering i PVN, ARC och VMH (Fig 2). FR-spakpressning, men inte PR-spakpressning, var förknippad med betydande aktivering inom LH (huvudsakligen baserad på aktivering inom det periforniska området). Både aktiva spakpressar och hypotalamiska c-Fos-uttryck var jämförbara mellan FRext- och FR-grupperna (MHtotalt, 946 ± 26 och 911 ± 118; ARC, 176 ± 18 och 186 ± 10; LHtotalt, 468 ± 79 och 378 ± 34; LHpeF, 200 ± 31 respektive 173 ± 15), vilket antyder att skillnaden i uttrycksmönster mellan FR- och PR-grupper inte är relaterad till varaktigheten av utbildningen / upplevelsen utan till den instrumentella uppgifternas natur. För FR-gruppen var det en signifikant ökning av c-Fos-uttryck i BNST, observerat i både aBNST och pBNST. Både FR- och PR-spakpressning var associerade med ökade c-Fos-immunopositiva neuroner i NAc-skalet; c-Fos-antalet ökades signifikant i NAc-kärnan från råttor som var engagerade i FR-spakpressning, med en obetydlig trend mot ökat c-Fos-uttryck hos råttor som var engagerade i PR-spakpressning. c-Fos ökades inte i VTA med PR-uppgiften, även om en obetydlig trend mot en ökning observerades med FR-uppgiften. Slutligen ökades c-Fos signifikant i hypoglossal (kranial nerv XII) i hjärnstammen hos råttor tränade för PR, men inte för FR.
c-Fos-uttryck observerades i andra CNS-regioner, inklusive amygdala och hjärnbarken (Fig 3). Emellertid observerades uttryck både i kontrollförhållandena såväl som i samband med PR- och FR-uppgifter, vilket tyder på att de icke-specifika aspekterna av proceduren (hantering, rörelse in i procedurrummet) kan ha resulterat i denna aktivering. Kvantifiering i dessa regioner genomfördes inte. På samma sätt observerades aktivering i andra hjärnstammregioner än nXII men inträffade i samband med både kontroll- och arbetsrelaterade tillstånd, vilket också antyder en roll i ospecifik upphetsning eller beteendeaktivering.
Vi testade för korrelationer mellan c-Fos-uttryck i olika CNS-regioner. Genom att kombinera data från hävstångspressande grupper hittade vi en negativ korrelation mellan c-Fos-uttryck i LH och VMH; sålunda associerades aktivering av VMH med minskad totalaktivering av LH (Pearson's R, −0.7986; t = −3.7534; P = 0.0056). Vi observerade också en signifikant positiv korrelation mellan c-Fos-uttryck i den periforniska regionen av LH och VTA (Pearson's R, 0.7772; t = 3.493; P = 0.0082), i överensstämmelse med känd monosynaptisk anslutning mellan dessa två regioner (se diskussion i Refs. 2 och 13). Vi hittade en signifikant negativ korrelation mellan c-Fos-uttryck i VTA jämfört med NAc-skalet, oavsett om det testades separat för FR-prestanda (Pearson's R, −0.9262; t = −4.9125; P = 0.008) eller för PR-föreställning (Pearson's R, −0.9897; t = −9.7624; P = 0.0103), i överensstämmelse med kända ömsesidiga insatser mellan striatalregioner till substantia nigra och VTA (2, 13). Vi testade också för korrelationer mellan c-Fos-uttryck i olika CNS-regioner och beteende. Genom att kombinera data från spakpressande grupper observerade vi en signifikant positiv korrelation mellan c-Fos i ARC och aktiva spakpressar (Pearson's R, 0.8208; t = 3.8017; P =
Identifiering av neuroner aktiverade med sackarosintag och motivation för sackaros.
I hjärnstammen visade c-Fos-positiva neuroner inte positivt immunförening för TH, det hastighetsbegränsande enzymet för epinefrin och noradrenalin (och dopamin); således verkade dessa katekolaminerga nervceller inte aktiveras av FR- eller PR-uppgifterna. Vissa c-Fos-positiva neuroner visade emellertid positivt immunförsvarande för tryptofanhydroxylas, vilket indikerar att en population av serotoninneuroner aktiverades. Som visas i Fig 4I ARC omgavs c-Fos-positiva cellkroppar av AGRP-färgade fibrer, och ett liknande mönster för NPY-fiber / c-Fos immunfärgning observerades (visas inte). I PVN verkade c-Fos-positiva nervceller omge CRF-positiva neuroner, men ingen kolokalisering observerades (data visas inte). Fig 5 visar immunfargning för både orexin och MCH i LH. Orexinneuroner hittades i både dLH och peLH. Även om vi observerade MCH-positiva neuroner i peLH fanns det i huvudsak ingen kolokalisering med c-Fos i den regionen av LH. Vi observerade emellertid c-Fos-kolokalisering i orexin-positiva neuroner inom peLH (Fig 6, topp) och mycket begränsad c-Fos-kolokalisering med MCH i vLH (Fig 6, botten). Det bör påpekas att både lokalisering och kolokalisering med c-Fos kan underskattas för peptidneurotransmittorer såsom CRH, eftersom råttor inte förbehandlades med kolchicin. Slutligen, inom kärnan accumbens kärna och skalet (Fig 7c-Fos coimmunostaining med GAD, det syntetiska enzymet för neurotransmitteren GABA, observerades för både FR- och PR-råttor. Det var robust färgning för TH i VTA; emellertid observerades c-Fos-positiva neuroner sällan och verkade inte uteslutande kolokalisera med TH.
DISKUSSION
I den aktuella studien använde vi uttryck av den omedelbara tidiga genen, c-Fos, för att utvärdera mönstret av akut CNS-aktivering associerad med början av sackaros-självadministrationsspakpressningsaktivitet, antingen som en relativt krävande uppgift (FR) eller en progressivt mer utmanande uppgift tänkt att återspegla motiverad sökning av belöning, såsom sackaros, och att starkt involvera limbiska kretsar (22, 24, 49) (PR). Hypotalamiska aktiveringsmönster skilde sig åt mellan de två uppgifterna, med LH / limbisk aktivering som dominerade i FR-uppgiften och medial hypotalamisk / limbisk aktivering dominerande i PR-uppgiften (se Fig 1). Det finns flera möjliga orsaker till detta. Först kan dessa paradigmer "kartlägga" som kvalitativt olika upplevelser i CNS. Råttor tränade i FR-prestanda förväntar sig en enkel aktivitet med hög belöning. Förväntan på en givande mat bör starkt påverka c-Fos-mönstret som observerats i FR-råttorna. Den uppenbara kvalitativa skillnaden i aktiveringsmönster antyder att en andra möjlighet - att PR-djuren helt enkelt har mer erfarenhet av uppgiften - är mindre troligt, och detta stöds av vår mätning av c-Fos i hypotalamus hos råttor som fick 20 FR-sessioner , som visade aktivitet liknande FR-gruppen, inte PR-gruppen. Båda dessa möjligheter kan testas genom att systematiskt öka svårigheten med FR-utbildning och utvärdera förändringar i CNS-aktivering, i vilket fall skulle man förutsäga en kvalitativ förändring i aktiveringsmönstret. Trots att antalet träningsupplevelser kanske inte står för CNS-aktiveringsmönstret, kan det genomsnittliga antalet sackarosbelöningar i en session: PR-uppgiften kanske helt enkelt lära sig som en "mindre givande" upplevelse, och detta kan vara funktionellt kopplat till brist på LH-aktivering. Således kan CNS-aktiveringsmönstret i början av sessionen återspegla ett interoceptivt tillstånd, såsom det för det konditionerade platsparadigmet: styrka av aktivering inom limbiska kretsar är knuten till lärande och till motivation. Vi observerade variationen i uttrycket c-Fos i medial hypothalamus hos FRC-djur. Särskilt inom PVN kan denna variabilitet vara maskering av aktivering i FR-råttorna, för vilka en trend mot ökad c-Fos kontra FRC-råttor observerades (Tabell 3). Emellertid skilde sig den totala mediala hypotalamiska aktiveringen inte mellan FR och FRC djur.
Det bör noteras att även om vårt mål var att identifiera CNS-platser som bidrar till uppträdandet av beteende, är temporär upplösning något av en övervägande. Som diskuterats nedan inses det nu att olika underkomponenter av instrumentellt eller operant beteende medieras genom aktivering av olika populationer av neuroner (13, 23, 33, 49). Vi kan inte helt utesluta att aktivering på grund av mycket omedelbar barpressning eller slick av belöningar kan ha bidragit något till de aktiveringsmönster som vi observerade. Våra fynd ger grunden för ytterligare undersökning av rollerna för specifika CNS-platser i olika aspekter eller komponenter i självadministrationsuppgiften, och för sådana studier, mätning av andra omedelbara tidiga gener med olika "på" och "av" tidskurser (36) kommer att vara mycket användbart.
Korrelationerna som vi hittade i c-Fos-uttryck mellan olika hjärnregioner stödjer den kända funktionella anslutningen mellan hypotalamiska och primära limbiska regioner för denna speciella belöningsuppgift, såsom mellan LH och VMH, och mellan den periforniska regionen i LH och VTA (se diskussion i Refs. 2 och 13). Vi undersökte också samband mellan c-Fos-uttryck i olika aktiverade regioner och beteende. Korrelationen mellan c-Fos i ARC och aktiv spakpressar passar med den väl definierade rollen som ARC-aktivitet i matintaget (1); med vår tidigare iakttagelse att insulininjektion specifikt i ARC minskade självadministrering av sackaros (15); med tidigare rapporter om den kritiska rollen för ARC och dess endorfinergiska nervceller vid förvärv och prestanda av självadministrering av kokain (40-42); och med de identifierade prognoserna från ARC till NAc (17). Således spelar ARC troligen en nyckelroll i det motiverade beteendet att söka och få många typer av givande stimuli, inklusive, men inte begränsat till, mat. Slutligen observerade vi betydande aktivering av PVN och VMH med början av PR-sackarosökande. Detta överensstämmer med de välkarakteriserade rollerna för dessa mediala hypotalamiska kärnor i regleringen av livsmedelsintag, direkt synaptisk anslutning med ARC och identifierade förbindelser med de limbiska kretsarna (1, 27, 37).
Vi fann en signifikant negativ korrelation mellan c-Fos-uttryck i VTA kontra NAc-skalet, oavsett om det testades med avseende på FR eller PR-prestanda. Det var något förvånande att starkare VTA-aktivering inte observerades i samband med PR eller FR-sackaros-självadministrering (mot respektive kontroller). Kanske detta resultat speglar tidpunkten för vår mätning, med fokus på potentiella CNS-platser som var aktiva i början av uppgiften, för vilka dessa djur var välutbildade. Detta skulle vara förenligt med observationerna och avhandlingen från Schultz (44), att neuronal aktivering av dopamin fungerar som en markör för oväntade stimuli eller belöningar, och denna aktivering minskar i samband med träning. Emellertid har visat sig att striatal frisättning av dopamin under sackarostagning i utbildade djur inträffade som en mycket exakt och tillfälligt diskret händelse39). Således är det möjligt att trenderna som vi observerade skulle vara starkt signifikanta med en större studiegrupp (dvs. mer statistisk effekt). Vi observerade NAc-aktivering i samband med början av både FR- och PR-sackarostagning. Både aktivering och hämning av NAc-neuroner har rapporterats i samband med instrumentell belöningsprestanda, och mönstret av aktivering / aktivitet är beroende av träning och miljö och är associerat med olika komponenter i beteendet (t.ex. orientering, tillvägagångssätt, intag) (6, 33, 50). Som diskuterats ovan skulle mätning av c-Fos inte fånga upp sådan specifik aktivitet. Carlezon har föreslagit att ”belöning” huvudsakligen är förknippad med en minskning av aktiviteten hos NAc-neuronerna, dvs.3). Detta överensstämmer inte med våra observationer - väsentligt förbättrad NAc c-Fos jämfört med hanteringskontroller och c-Fos-positiva neuroner kolokaliserade med GAD, i överensstämmelse med aktivering av medelstora spinala neuroner (GABAergic) - men vi har inte specifikt bedömt NAc neuronal "hämning ”. NAc-aktivering och hämning kan båda ske under instrumentella uppgifter, med både anatomisk och temporär specificitet. Utifrån denna studie kan man dra slutsatsen att NAc är involverad i början av instrumentell sackarostagning, med NAc-kärnan som bidrar till motorisk aktivering och NAc-skalet bidrar till både motoriska och motiverande aspekter av uppgiften.
Vi observerade också aktivering av båda huvudregionerna i BNST (anterior och posterior) hos FR råttor. BNST är en del av limbiska kretsar som modulerar neuroendokrina svar på upprepade stimulusupplevelser (8, 9) och i större mening förknippas med lärandet om återkommande stimuli. Även om dess roll har klargjorts mest omfattande i förhållande till upprepade stressorupplevelser, tyder vårt resultat på en bredare roll för BNST: BNST kan modulera CNS-svar på återkommande positiva, samt negativa eller stressande stimuli. Eftersom vi observerade denna aktivering i början av FR, men inte PR, prestanda, kan BNST-rekrytering knytas till de ökade sackarosbelöningarna för FR-utbildning. Vår observation av ingen direkt aktivering av CRF-nervceller tyder på att instrumentellt svar på sackaros inte är en stor stressor; emellertid överensstämmer c-Fos-uttryck i andra PVN-neuroner med modulering av stresskretsar (46). I själva verket har Ulrich-Lai och kollegor rapporterat att sackarosintag modulerar PVN-funktionen genom att använda ett annat diet / utfodringsparadigm (47). Slutligen observerade vi aktivering av kärnan i hypoglossal nerven i samband med PR men inte FR-prestanda. Betydelsen av detta kan bara spekuleras på; en möjlighet är att smakrelevansen för sackaros kan höjas hos råttor som tar mindre färger av sackaros.
Sackarosökande och sackarostagande bör betraktas som en multimodalitetsupplevelse, dynamisk i tid, eftersom förtäring skulle leda till perifera signaler relaterade till kalorinnehållet i sackarosen, samt tillhörighet och allestesi inom sessionen (25). Medan vår forskning har fokuserat på påverkan av perifera endokrina signaler, dvs insulin och leptin, för att modulera matbelöning, kan deras effekter i sin tur direkt förmedlas centralt av sändare och neuropeptider som spelar en roll på kort eller lång sikt utfodring eller matbelöning (se diskussion i Ref. 14). Den nuvarande studien ger viss insikt i detta; vi observerade en viss aktivering av neuroner som uttrycker antingen MCH eller orexin, två neuropeptider som är orexigena. Dessa fynd kan faktiskt underskatta rollen som MCH eller orexin i livsmedelsbelöning, eftersom immunocytokemi i icke-kolkicinbehandlade råttor utan tvekan begränsade visualiseringen av båda dessa neuropeptider. Identifieringen av aktiverade orexinneuroner i LH överensstämmer övergripande med de många studier som implicerar orexinneuroner i utfodring, matbelöning och mer generaliserad stimulansbelöning (t.ex. 5, 7, 29). Vi observerade aktivering av peFLH-orexinneuroner. Aston-Jones och kollegor (5) har dissekerat rollerna hos olika populationer av LH-orexinneuroner i belöningsbeteende och har implicerat peFLH-orexinneuroner i upphetsning, i motsats till belöning i sig. Vårt resultat föreslår således en roll för LH-orexin i upphetsning, och kanske orientering mot den aktiva spaken eller ledtrådar för sackarostagande.
Värt att ta hänsyn till i framtiden är sackaros unikhet eller generaliserbarhet som en givande stimulans. Huruvida mönstret för tidig CNS-aktivering som vi rapporterar här är specifikt för mat som stimulans, eller generaliserar till andra givande stimuli, återstår att bestämma. Såsom ovan nämnts, särskilt i FR-uppgiften, kan intag av ett antal sackarosbelöningar förväntas ha metaboliska konsekvenser, med modulering av hormonfrisättning (till exempel kolecystokinin, ghrelin, insulin) och förändringar i perifer och CNS nervaktivisering. Dessa förändringar förväntas inte spela en direkt roll i de tidiga CNS-aktiveringsmönstren som vi mätte men kan spela en roll i lärandet om sackarosbelöning under träning. Återigen kan neuropeptider såsom orexin vara kritiskt implicerade.
Vår studie representerar, såvitt vi vet, den första demonstrationen av aktivering av specifika mediala hypotalamiska kärnor vid början av sackaros-självadministrering, inklusive både PVN, inblandat i homeostas och stressresponsivitet, och ARC, som är avgörande för energihomeostas, näringsavkänning och reglering av matintag. Det är viktigt att vi observerade aktivering av den mediala hypothalamus och NAc, i samband med PR-början, vilket tyder på att både homeostatiska och vissa limbiska platser spelar en roll i initieringen av sukros självadministrering. Ytterligare limbiska kretsställen kan rekryteras vid en senare tidpunkt i uppgiften.
Perspektiv och betydelse
Medan studier av motiverande och belöningsbeteende historiskt sett mest skulle kunna implicera limbiska kretsar i CNS, har det funnits en stor mängd bevis som betonar den kritiska funktionella interaktionen mellan limbiska och energihomeostaskkretsar. Den nuvarande studien föreslår nu sannolikt vikten av specifika mediala hypotalamiska kärnor i motiverat arbete för sackaros. Framtida studier kan utvärdera från denna studie och utvärdera huruvida medialhypotalamus roll är nödvändig och om dess aktivering är inblandad i motiverade sökningar för andra belöningar, som missbruk av droger. Dessutom ger resultaten från denna studie skälen för att studera förändringar av motiverade beteenden under omständigheter samtidigt med förändrad medial hypotalamisk fysiologi, såsom vid fetma.
BIDRAG
Denna forskning stöds av National Institute of Health Grant DK40963. Dr Dianne Figlewicz Lattemann är en senior forskar karriärforskare, Biomedical Laboratory Research Program, Department of Veterans Affairs Puget Sound Health Care System, Seattle, Washington. Dr. Sipols stöds av det lettiska rådet för vetenskapliga bidrag 04.1116.
UPPLYSNINGAR
Inga intressekonflikter, ekonomiska eller på annat sätt, deklareras av författarna.
TACK
Vi tackar Drs. Yavin Shaham, Stephen Benoit, Christine Turenius och JE Blevins för råd och hjälpsamma diskussioner.
REFERENSER
;
