PLoS One. 2014 Jul 29; 9 (7): e102524. doi: 10.1371 / journal.pone.0102524. eCollection 2014.
Abstrakt
Kronisk kokainexponering hos både mänskliga missbrukare och i gnagaremodeller av missbruk minskar prefrontal cortical aktivitet, som därefter dysregulerar belöningsprocesser och högre order verkställande funktion. Nettoeffekten av denna försämrade beteende är ökad sårbarhet för återfall. Tidigare har vi visat att kokaininducerad ökning av hjärnavledande neurotrofisk faktor (BDNF) -uttryck i den mediala prefrontala cortexen (PFC) är en neuroadaptiv mekanism som blunter den förstärkande effekten av kokain. Eftersom BDNF är känt att påverka neuronal överlevnad och synaptisk plasticitet, testade vi hypotesen att avstående från kokain självadministration skulle leda till förändringar i neuronal morfologi och synaptisk densitet i PFC. Med hjälp av en ny teknik analyserades array-tomografi och Golgi-färgning, morfologiska förändringar i råtta-PFC efter 14-dagar av kokain självadministration och 7-dagar av tvungen abstinens. Våra resultat indikerar att den totala dendritiska förgreningen och den totala synaptiska densiteten reduceras signifikant i råttan PFC. Däremot ökar densiteten hos tunna dendritiska ryggrakar signifikant på PFCs lager V-pyramidala neuroner. Dessa resultat tyder på att dynamiska strukturella förändringar uppträder vid kokainavhållande som kan bidra till PFC: s observerade hypoaktivitet hos kokainmissbrukare.
Beskrivning
Förändringar i strukturell plasticitet inom belöningskretsarna föreslås vara nyckelmekanismer som bidrar till kokainens kraftfulla förmåga att upprätthålla drogsökande beteende (granskad i [1]). Tidigare studier har visat en ökning av dendritisk arborisering och ryggradens täthet i nukleär accumbens (NAc) [2]-[4], ventralt tegmentalt område [5], och prefrontal cortex (PFC) [6] efter exponering för kokain. Medan de flesta studier har fokuserat på strukturella förändringar i samband med den dysfunktionella aktiviteten hos NAc, har betydligt färre studier granskat förändringarna i PFC. Flera bevislinjer visar dysfunktion hos PFC efter kronisk kokainexponering hos både mänskliga missbrukare [7], [8] och i gnagare modeller av beroende [9], [10]. Därför kännetecknar de strukturella förändringarna som förekommer i PFC, att de förstår de molekylära händelser som ligger till grund för missbruk.
PFC reglerar impulskontroll och beslutsfattande och spelar därmed en viktig roll i individens förmåga att kontrollera beteende, särskilt i narkotikamissbruk [8], [11]. Till exempel, hos individer beroende av kokain, är minskad prefrontal cortexaktivering associerad med drogavhoppning och störde högre order verkställande svar [7], [8], vilket kan förbättra sårbarheten för återfall. Hos gnagare är ökad neuronaktivitet i PFC associerad med kokainintag [9], [10], kompulsivt läkemedelssökande beteende [12], och återvinning av kokain efter återkallelse [13]-[15]. Dessutom avlägsnas membran bistabilitet i PFC efter kronisk kokainadministration [16]. Slutligen är läkemedelsinducerad metabolisk aktivitet i PFC stupad hos råttor som administrerats en utmaningsinjektion vid uttag från kokain självadministration [9], [17]. Tillsammans indikerar dessa studier att kronisk kokain inducerar djupa funktionella förändringar i PFC som kan associeras med en ökning av antalet hämmande synapser och / eller en minskning av excitatoriska synapser i PFC. De morfologiska förändringar som uppstår i PFC efter kronisk narkotikamissbruk har dock inte belysats.
I den här studien försökte vi undersöka om avhållande från kokain leder till strukturella förändringar i PFC. Morfologiska förändringar undersöktes med hjälp av en traditionell metod, Golgi-färgning, samt en ny teknik, array tomografi. Array-tomografi är en unik metod som kombinerar ultratunna vävnadssnitt med immunofluorescens och tredimensionell bildrekonstruktion för att möjliggöra korrekt kvantifiering av total och subtyps specifik synapsdensitet [18], [19]. Med hjälp av dessa metoder indikerade våra resultat väsentlig plasticitet i rått PFC som svar på abstinensform kokain.
Material och metoder
Djur och bostäder
Sprague-Dawley-hanråttor (Rattus norvegicus) som väger 250–300 g erhölls från Taconic Laboratories (Germantown, NY). Djur hölls individuellt med mat och vatten tillgängligt ad libitum i sin hemmabur. De experimentella protokollen var i överensstämmelse med riktlinjerna utfärdade av US National Institutes of Health och godkändes av Perelman School of Medicine vid University of Pennsylvania och University of Pennsylvania Institutional Animal Care and Use Committee.
Kirurgi
Före operationen bedövades råttorna med 80 mg / kg ketamin och 12 mg / kg xylazin (ip; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). En inbäddad silastisk kateter (innerdiameter 0.33 mm, yttre diameter 0.64 mm) infördes i höger jugularven och suturerades på plats. Katetern passerade sedan subkutant över axelbladet och dirigerades till en nätmonteringsplattform (CamCath, Cambridge, UK) som suturerades under huden direkt ovanför scapulae. Katetrar sköljdes dagligen med 0.3 ml av antibiotikumet Timentin (ticarcillindinatrium / kaliumklavulanat, 0.93 mg / ml, Henry Schein, Melville, NY) upplöst i hepariniserad saltlösning (10 U / ml). Katetrarna förseglades med plastobjektorer när de inte användes.
Kokain självadministration
Råttor fick 7 dagar att återhämta sig från operation innan kokain självadministration påbörjades. Råttor tilldelades slumpmässigt till en av två grupper: självkokande kokain och kontrollerade saltlösningar. Varje råtta som utbildades för att svara på kontingent kokaininfusioner parades med ett yoked ämne som fick samma antal och tidsmässiga infusionsmönster som självadministrerad av den parade kokain-experimentella råttan. Häftpressning för saltlösningsrotterna hade ingen planerade konsekvenser.
Initialt placerades kokain-experimentella råttor i de modulära operativa kamrarna (Med Associates, St. Albans, VT) och fick häftpress för intravenösa kokaininfusioner (0.25 mg kokain / 59 μl saltlösning, infusion över 5 s) på en fast- förhållande 1 (FR1) schemat för förstärkning. När en kokain-experimentell råtta uppnådde minst 20-infusioner av kokain i en enda operant session under FR1-schemat, överfördes svarskravet till ett FR5-schema för förstärkning. För att svara på båda fasta förhållandena var det maximala antalet kokaininfusioner begränsat till 30 per daglig självadministrationssession och en 20s time-out-period följde varje kokaininfusion, under vilken tid aktiva spakresponser tabulerades men hade inga schemalagda konsekvenser . Dagliga 2 h operative sessioner (7 dagar / vecka) genomfördes för totalt 14 dagar. Svar på den inaktiva spaken, som inte hade några planerade konsekvenser, registrerades även under både FR1 och FR5 träningssessioner.
Efter 14th Daglig operant session, kokain-experimentella och yoked saltlösning kontroll råttor återvände till sina hem burar där de genomgick 7 dagar av tvungen drogabstinens. På 7th Dag för kokainavhållande, hjärnor avlägsnades och PFC dissekerades på is. Sju dagar av kokainavhållande valdes för att göra direkta jämförelser med vår tidigare publicerade studie som undersökte kokaininducerade förändringar i PFC BDNF-uttryck [20].
dropp
Råttor anesteserades (100 mg / kg, ip natriumpentobarbital) och perfusionerades med iskall 4% paraformaldehyd i 0.1 M PB, pH 7.4 (PFA). En halvklot från varje hjärna användes för golgifärgning och den andra halvklotet för array-tomografi. Array hemisfärer fanns efter fix i 4% PFA med 2.5% sackaros för 2 timmar och Golgi hemisfärer fästes efter 48 h i 4% PFA.
Array Tomography
Array-tomografiska experiment utfördes som tidigare beskrivits [19], [21]. I korthet var PFA-fixad vävnad inbäddad i harts och koronal (70 nm) sektioner vid nivån av mPFC skuren och uppsamlades som ett band. Band blev hydratiserade i 50 mM-glycin i Tris och blockerades i blockeringslösning (0.05% Tween / 0.1% bovint serumalbumin i Tris-buffert (50 mM Tris / 150 mM NaCl, pH 7.6). Banden färgades med primära antikroppar, GAD65 Chemicon), PSD95 (cellsignalering) eller synaptofysin (Abcam) i blockerande lösning över natten vid 4 ° C. Banden tvättades med Tris-buffert och färgades med sekundära antikroppar vid 1![[förhållande]](http://www.ncbi.nlm.nih.gov/corehtml/pmc/pmcents/x2236.gif){kind=small}
50 i blockerande lösning (get-anti-mus Alexa-mjöl 488 och get anti-kanin cy3 eller åsna anti-kanin cy5). Band färgades mot DAPI för att underlätta att hitta samma platser på varje sektion. Tile-scan bilder samlades med ett Zeiss AxioImager Z2 epifluorescensmikroskop. Bilder från samma webbplats på var och en av 20-30-serieavsnitt per band förvärvades vid 63x med automatiserade program specialiserade på matris tomografi.
Array Tomography Analysis
Seriebilderna från varje band öppnades i följd, konverterades till en stapel och anpassades med plugins MultiStackReg och StackReg (med tillstånd av B. Busse vid Stanford University och [21], [22]. Skärlådor (19.5 μmx19.5 μm) användes för att välja regioner av intresse (ROI) i neuropilen för kvantifiering. Valet var att utesluta neuronala cellkroppar eller andra dunklande egenskaper. För automatiserad bildanalys tröskades grödor av intresse (eller ROI) för synaptofysin, glutaminsyradekarboxylas-65 (GAD65) och PSD95 automatiskt med automatiska algoritmer i ImageJ. Växter kodades och analysen kördes blind för tillstånd. Ett automatiserat tröskelbaserat detekteringsprogram för att kvantifiera antalet puncta identifierade som positiva synapser användes såsom tidigare beskrivits [23]. Densiteter av presynaptiska terminaler, excitatoriska postsynaptiska terminaler och procentandelen av GAD-positiva (inhiberande) synapser beräknades från ett medelvärde av 75-provplatser per djur uppsamlat från två olika vävnadsblock från PFC (n
=5-kokainbehandlade djur, 5-saltbehandlade djur) för totalt 29,154 postsynaptisk puncta och 53,565 presynaptisk puncta från 818-provtagningsställen över 5-saltbehandlade djur och 29,662 postsynaptiska och 17,034-presynaptiska puncta från 588-provtagningsställen över de 5-kokainbehandlade djuren. Medianvärdena för synapsdensitet och procentandelen hämmande synapser per djur beräknades och t-testen kördes med användning av djurmedianerna för att testa om det var skillnad mellan gruppmedlemmar.
Rapid-Golgi-metoden
Golgi-färgning med enkel sektion utfördes såsom beskrivits tidigare [24], [25]. I korthet skars mPFC från en halvklot av varje djur i 100 / m koronala sektioner och efterfixerades i 1% osmiumtetraoxid följt av tre tvättar i 0.1 M PB, pH 7.4. Sektioner inkuberades i 3.5% kaliumdikromat över natten, tvättades kort och infiltrerades med 1.5% silvernitrat med sandwichmetoden [25]. Sektioner monterades på gelatinbelagda glidbanor med 20% sackaros och dehydrerades genom en serie alkoholkoncentrationer följt av avfettning i xylen och täckning.
Golgi Analys
Golgi-bilderna kodades och analyserades blinda för skick och alla analyserades av samma experimentator. Neuronala bilder och spår och representativa bilder av dendritiska spines samlades med ett upprätt BX51 Olympus-mikroskop med ett integrerat motoriserat stadium (Prior Scientific, Rockland, MA) med ett 20 × 0.7 NA-objekt. För dendritisk förgreningsanalys valdes 7-neuroner för analys per djur. Vi mätade neuritlängden och komplexiteten med hjälp av makronerna NeuronJ och Advanced Sholl Analysis. Antalet korsningar (grenpunkter) i koncentriska cirklar i radier mellan 5-250 μm (inklusive basala och apikala dendriter) mättes och jämfördes mellan grupper. För analys av ryggradens täthet analyserades 4-5-segment med minst 20 μm i längd från tredje ordningens basaldenditer per neuron från 5-7-neuroner per djur med användning av ett Zeiss AxioImager Z2-epifluorescensmikroskop med ett 63x-oljedimersionsmål. Ryggmärgsmorfologi klassificerades som beskrivits tidigare [26]. Linjär ryggradensitet för varje dendritiskt segment och ryggradsmorfologi (tunt, stubby, svamp, koppform) av varje ryggrad jämfördes mellan grupper. Open source-programvara från National Institutes of Health (ImageJ) användes för Golgi och array tomography data analysis.
Resultat
Avhållande från kokain minskar total synapsdensitet
Arraytomografi användes för att mäta förändringar i både excitatoriska och hämmande synapser för att bestämma de specifika morfologiska förändringar som uppträder i PFC som svar på abstinens från kokain självadministration. Array-tomografi är en hög genomströmningsmetod som möjliggör en korrekt kvantifiering av totalt, hämmande och excitatoriska synapser i strukturer som är för små för att vara korrekt identifierade eller lokaliserade med traditionella konfokala mikroskopiska metoder [19]. Eftersom både inhiberande och excitatoriska synapser är väsentliga komponenter i läkemedelsbelöningskretsarna [13], [27], [28] Vi använde denna nya metodik för att bedöma morfologiska förändringar i PFC under avhållande från kokain. Sjuttio nm PFC-sektioner från en hjärnhalvkula av 5-yoked-saltlösning och 5-kokain-erfarna råttor färgades med antikroppar mot PSD95, en postsynaptisk excitatorisk markör, synaptofysin, en presynaptisk markör och GAD65, som märkt inhiberande neuroner och synapser. Synapsdensiteter och procentandelen hämmande synapser bestämdes i kortikala skiktet V (Figur 1A och 1B). Våra resultat indikerar att under abstinens från kokain var en signifikant minskning av synaptofysindensiteten (Figur 1C), som mäter alla presynaptiska terminaler [t (7)=2, p <0.05]. Det fanns ingen signifikant minskning av excitatorisk synapsdensitet [t (8)=0.48, sid=0.32] som uppmätt genom att räkna PSD95 puncta (Figur 1D). Intressant var det en icke-signifikant trend mot en ökning av andelen GAD65-positiva hämmande synapser [t (8)=-1.39, sid=0.9] (Figur 2E).
Avhållande från kokain minskar dendritisk förgrening medan övergående ökad ryggradensitet i PFC
Golgi-metoden användes för att undersöka förändringar i neuronförgrening och dendritisk ryggradens densitet för att bekräfta de ultrastrukturella förändringar som observerades vid synapsdensitet (Figur 1). Vi utförde en enkel sektion med snabb Golgi-impregnering på en delmängd av neuroner i PFC från de andra halvkärmarna av samma djur som användes för matrittomografistudierna. Dendritisk förgrening, dendritisk ryggrad och ryggradsmorfologi bedömdes. Två representativa pyramidala neuroner från PFC av en yoked-saltlösningskontroll och en kokain-exponerad råtta visas i Figur 2A. Sholl-plot mätt antalet korsningar (grenpunkter) inom koncentriska cirklar i radier mellan 5-250 μm. Våra resultat visar att efter 7-dagar av tvungen abstinens från kokain självadministration var det en signifikant minskning av dendritisk komplexitet (Figur 2B). Tvåvägs upprepade åtgärder ANOVA-analys av sholl-plotdata avslöjade signifikanta huvudeffekter av behandling [F(1,738)=30.59, p <0.0001] och radie [F(245, 738)=289.6, p <0.0001] (Figur 2B), bekräftar en förlust av dendriter som överensstämmer med förlusten av synapser mätta i matrisstudier (Figur 1C). Analys av andra och tredje ordning basila dendriter avslöjade en signifikant ökning av dendritiska spines efter 7-dagar av kokainavhållande [t (6)=−3.12, p <0.05] (Figur 2D). Mer specifikt ökade abstinens från kokainexponering antalet tunna ryggradssubtyp, men hade ingen signifikant effekt på andra ryggsubtyper (Figur 2E), vilket avslöjas av tvåvägs upprepade åtgärder ANOVA med huvudsakliga effekter av behandling [F(1,30)=11.9, sid=0.0017], ryggradssubtyp [F(4,30)=57.7, p <0.0001], och en signifikant behandling x ryggradssubtypinteraktion [F(1, 4, 30)=8.8, p <0.0001].
Diskussion
I den aktuella studien visar vi att det finns uttalade strukturella och synaptiska förändringar i lager V i PFC efter 7-dagar av tvungen abstinens från kokain självadministration. Specifikt finns en signifikant minskning av dendritisk förgrening av pyramidala neuroner och en allmän förlust i synapsdensitet, mätt med minskad densitet av övergripande presynaptiska boutoner märkta med synaptofysin. Trots förlusten av presynaptisk densitet genomgick basala dendriter av skikt V pyramidala neuroner en ökning av dendritisk ryggradens densitet, särskilt av tunna plastpinnor. Eftersom vi inte upptäckte signifikanta förändringar i densiteten hos PSD95 kan det spekuleras att minskningar i presynaptiska terminaler, men ökningen i ryggradens densitet kan bero på en ökning av antalet flersynaptiska boutons. Dessutom är det också värt att notera att vi observerade en trend mot ökade hämmande synapser i PFC. Eftersom tunna spines är inblandade i plasticitet [29], kan ökningen i dessa ryggar representera kompensationsplasticitet för att upprätthålla synaptiska ingångar på dessa denervaterade neuroner som har förlorat dendritiska grenar.
Tidigare studier visade att kokain ökar dendritisk arborisering och ryggradens densitet i NAc [2]-[4]. Nyligen Dumitriu et al., 2012 [30] visade att kokain dynamiskt förändrar proximala spines i NAc-kärnan och skalet. Specifikt, i skalet, ökade uttag från kokain tunna ryggrad, medan minskningen av svamphudens huvuddensitet i NAc-skalet [30]. Till skillnad från studier av NAc finns det bara ett fåtal studier som har undersökt kokainens effekter på neuronal morfologi i PFC [6], [31]. Våra data är förenliga med en ny studie som visar att kokain inducerar en ökning av ryggradens densitet i PFC [31]. Möss som hade en större ökning av ihållande och stabila ryggrader, dvs spines närvarande 3 dagar efter uttagning, på apikala dendriter visade högre kokainkonditionerade ställföreträdande poäng och kokaininducerad hyperaktivitet [31]. En tidigare studie i råtta PFC-skikt II-III-neuroner rapporterade värden på ungefär 3-ryggrader per μm dendrit på både apikala och basala dendriter, en överraskande tät nivå av ryggrad, som var modifierbar av stress [32]. Våra värden i kontrollratter av ~2 spines / 10 μm av dendritiska segment är lägre, vilket kan bero på olika analyserade neuronal populationer (lag V-basaldenditer) eller skillnaden i bildteknik. I den föreliggande studien använde vi den enkla sektionen Snabb Golgifärgningsmetod medan jontoforetiska injektioner av Lucifer gult färgämne kombinerat med konfokal bildbehandling användes av Radley och kollegor [32] att visualisera neuronal och dendritisk morfologi. Dessutom framhäver våra resultat också vikten av avhållandet från kokain självadministration som leder till strukturella förändringar i hjärnan. En tidigare publicerad rapport visade en ökning av dendritisk arborisering efter långvarig (24-25-dagar) uttag från kokain hos kvinnliga råttor [6], i motsats till vår observerade minskning efter 7 dagar av tvungen abstinens hos hanrotter. Trots dessa metodologiska skillnader och skillnader i förgreningsdata observerades ökat antal spines i båda studierna, vilket bekräftar storskalig omorganisation under kokainavhållandet. Framtida studier kommer att belysa tidsförloppet för dessa händelser för att avgöra om dessa strukturella förändringar är övergående eller långvariga.
Våra resultat tyder på att tvångsavbrott från kokain självadministration inducerar dynamiska strukturförändringar och orsakar synaptisk omorganisation i PFC. Dessa resultat kan förklara hypoaktiviteten i PFC som uppstår som en följd av upprepad kokainexponering [8], [33]. Vidare stöder våra resultat tidigare studier som visar att deaktiveras av PFC [7], [8], och ökat extracellulärt GABA i medial PFC under kokainuttagning [34]. Mekanismerna redovisar således PFC-hypoaktivitet efter kronisk kokainexponering [8], [10] kan inkludera (1) en ökning av GABAergic, (2) reduktion i glutamatergisk och / eller (3) reduktion i dopaminerg synaptisk ingång till PFC. Den föreliggande studien visar att abstinens från kokain minskar signifikant den totala synapsdensiteten som indikeras av en minskning av antalet synaptofysin-positiva synaptiska puncta. Dessa data tyder på att det finns en minskning av postsynaptisk respons i PFC, eventuellt medierad av minskad glutamat eller dopamininmatning. Det finns faktiskt studier som tyder på att kokain inducerar minskningar av glutamatergisk ton [35], [36]. Med hjälp av Golgi-metoden observerades emellertid en ökning av antalet tunna dendritiska ryggrader på basala dendriter av pyramidala neuroner, vilket tyder på en ökning av excitatorisk inmatning i PFC till återstående neuriter. Dessa uppenbarligen motstridiga data kan återspegla en övergripande förlust av synapser associerade med den stora förlusten av dendriter som vi observerar med ett kompensationssvar, eventuellt medierat av ökat BDNF, vilket framgår av våra tidigare upptäckter [20], för att öka densiteten hos dendritiska spines på kvarvarande neuriter.
Sammantaget visar våra resultat dynamisk omorganisation i PFC under kokainavhållandet. Specifikt är det en signifikant minskning av synaptisk anslutning, förlust av dendritisk förgrening och en ökning av antalet tunna ryggrad i råtta-PFC efter 7-dagar av tvångsmedvetenhet från kokain självadministration. Dessa resultat kan ge den strukturella grunden för den observerade hypoaktiviteten som observerats i PFC hos kroniska missbrukare av kokain och kanske förklarar förlusten av kognitiv kontroll som uppträder vid kokainberoende.
Erkännanden
Författarna vill tacka Gavin Sangrey för hans hjälp med att förbereda de inbyggda kapslarna.
Finansieringsdeklaration
Detta arbete stöddes av NIDA-bidrag DA22339 och DA033641 (RCP & GSV) och DA18678 (RCP). HDS stöddes av en enskild K01-utmärkelse (DA030445). Finansierarna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera eller förbereda manuskriptet.
Referensprojekt
;
