Främre psykiatri. 2018; 9: 81.
Publicerad online 2018 Mar 12. doi: 10.3389 / fpsyt.2018.00081
PMCID: PMC5858605
PMID: 29593587
Minho Lee,1,† Hyeyoung Cho,2,3,† Seung Hyun Jung,2,4 Seon-Hee Yim,2 Sung-Min Cho,2,3 Ji-Won Chun,5 Soo-Hyun Paik,5 Yae Eun Park,6,7 Dong Huey Cheon,7,8 Ji Eun Lee,7 Jung-Seok Choi,9 Dai-Jin Kim,5,* och Yeun-Jun Chung1,2,3,*
Abstrakt
Bakgrund
Beroendeframkallande användning av Internet och onlinespel är en potentiell psykiatrisk störning benämnd Internet Gaming Disorder (IGD). Förändrade mikroRNA (miRNA) uttrycksprofiler har rapporterats i blod och hjärnvävnad hos patienter med vissa psykiatriska störningar och föreslagits som biomarkörer. Det har dock inte gjorts några rapporter om blod-miRNA-profiler i IGD.
Metoder
För att upptäcka IGD-associerade miRNA: er analyserade vi miRNA-uttrycksprofilerna för 51-prover (25 IGD- och 26-kontroller) med hjälp av TaqMan Low Density miRNA Array. För validering utförde vi kvantitativ PCR med omvänd transkription med 36 oberoende prover (20 IGD och 16 kontroller).
Resultat
Genom upptäckt och oberoende validering identifierade vi tre miRNA (hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-652-3p) som signifikant nedreglerades i IGD-gruppen. Individer med alla tre miRNA-förändringar hade en mycket högre risk för IGD än de som inte hade någon förändring [oddsförhållande (OR) 22, 95% CI 2.29 – 211.11], och OR: erna ökade dosen beroende med antalet förändrade miRNA. De förutsagda målgenerna för de tre miRNA: erna var associerade med neurala vägar. Vi undersökte proteinuttrycket för de tre nedströms målgenerna med western blot och bekräftade att expression av GABRB2 och DPYSL2 var signifikant högre i IGD-gruppen.
Slutsats
Vi observerade att uttryck av hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p och hsa-miR-652-3p nedreglerades i IGD-patienterna. Våra resultat kommer att vara till hjälp för att förstå patofysiologin för IGD.
Beskrivning
Beroendeframkallande användning av Internet och internetbaserade spel är inte bara ett socialt fenomen i länder med omfattande infrastruktur för Internet-åtkomst, utan en potentiell psykiatrisk störning benämnd Internet Gaming Disorder (IGD) (1-3). Enligt epidemiologiska rapporter varierar prevalensgraden för IGD hos ungdomar mellan länder, från 0.8 till 26.7% (4). I synnerhet visar studier prevalensnivåer över 10% hos ungdomar i många asiatiska länder som Sydkorea, Kina, Taiwan, Hong Kong och Singapore (4). IGD är förknippat med nedsatt kognition, psyko-sociala relationer och vardagslivet; till exempel minskande akademiska eller yrkesmässiga prestationer (4-7). IGD ingår nu i avsnitt III (Villkor för ytterligare studier) av den femte revisionen av den diagnostiska och statistiska manualen för mentala störningar (DSM-V) (8). Trots sin klinisk-sociala betydelse är dock lite känt om den molekylära genetiska mekanismen bakom IGD.
Nyligen storskaliga tvillingstudier har föreslagit en genetisk bakgrund till IGD (9, 10). Vink et al. undersökte individuella skillnader i tvångsmässig Internetanvändning med 5,247 monozygotiska och dizygotiska tonåriga tvillingar i det nederländska tvillingregistret och rapporterade att 48% av skillnaderna förklarades av genetiska faktorer (9). Li et al. observerade 825-par kinesiska tonårstvillingar och rapporterade att genetiska faktorer förklarade 58 – 66% av skillnaderna (10). Följaktligen är polymorfismer av generna involverade i neurotransmission, kognition och uppmärksamhet såsom dopaminreceptor D2-genen (DRD2), katekolamin-O-metyltransferasgen (COMT), serotonintransportgen (5HTTLPR) och kolinerg receptor nikotin alfa 4-gen (CHRNA4) har rapporterats vara väsentligt associerade med internetberoende (11-13). Nyligen har Kim et al. screenade varianter av mer än 100 kandidatgener relaterade till produktion, verkan och metabolism av neurotransmittorer genom nästa generations sekvensanalys och rapporterade att rs2229910 av NTRK3 genen är associerad med IGD (14).
Utöver de genetiska faktorerna är det också väl känt att neurobeteende fenotyper är epigenetiskt kontrollerade av icke-kodande RNA inklusive mikroRNA (miRNA) (15, 16). miRNA är små icke-kodande enkelsträngade RNA-molekyler (ungefär 20 – 23 nukleotider i längd), som negativt reglerar uttrycket av proteinkodande gener genom att nedbryta mRNA och spela en kritisk roll i den patofysiologiska processen för olika sjukdomar (17). Bevislinjer har visat att miRNA finns rikligt i det mänskliga centrala nervsystemet (CNS) och verkar för att finjustera uttrycksnivåerna för deras målgener, som är involverade i utvecklingen och mognaden av CNS-systemet15). Nyligen visade studier har visat att miRNA-uttrycksprofiler förändras i hjärnvävnad hos patienter med psykiatriska störningar, vilket antyder att deras uttrycksprofiler kan vara biomarkörer för psykiatriska störningar (15, 16, 18). Till exempel, genom postmortem-analys, Lopez et al. rapporterade att uttryck av miR-1202, som reglerar uttrycket av metabotropisk glutamatreceptor-4-gen och förutsäger svaret på antidepressiva medel, nedreglerades i prefrontala cortexvävnader hos patienter med stor depressionsjukdom (19). När det gäller screening av biomarkörer har detta tillvägagångssätt en tydlig begränsning eftersom det är omöjligt att utföra en biopsi av CNS-vävnad för screening. Eftersom miRNA kan detekteras i blod (plasma eller serum), har cirkulerande miRNA en bestämd fördel som icke-invasiva biomarkörer vid neuropsykiatriska störningar. Men hittills har det inte gjorts några studier om cirkulerande miRNA-profiler i IGD. Bättre förståelse för cirkulerande miRNA-uttrycksprofiler kan hjälpa till att klargöra mekanismen för IGD-utveckling och underlätta klinisk översättning.
I denna studie syftade vi till att identifiera IGD-associerade miRNA-markörer genom att observera differentiellt uttryckta plasma-miRNA mellan IGD och kontrollgrupper och utforska deras biologiska implikationer.
Material och metoder
Studieämnen
Vi undersökte 3,166 tonåringar (åldrarna 12 – 18 år) med DSM-V IGD-poäng. Bland dem diagnostiserades 251 (168-män och 83-kvinnor) som IGD enligt DSM-V-kriterierna (8). Totalt 91 individer (49 IGD och 42 kontroller) gav det informerade samtycket för denna studie. Bland dem var fyra individer uteslutna enligt kriterierna för uteslutning. Slutligen registrerades 87 individer (45 IGD-individer och 42 friska kontrollindivider) för denna studie. Bland dem rekryterades 51-deltagare (25 IGD-patienter och 26-kontroller) som upptäcktsuppsättningen från 2014 till 2016. De andra 36-deltagarna (20 IGD-patienter och 16-kontroller) rekryterades som den oberoende valideringen från 2016. Alla deltagare var koreanska individer, inskrivna från Seoul St. Mary's Hospital (Seoul, Sydkorea) och Seoul National University Boramae Hospital (Seoul, Sydkorea). Alla deltagare genomgick en strukturerad intervju av en psykiater baserad på det koreanska Kiddie-schemat för affektiva störningar och schizofreni (K-SADS-PL) (20). Alla deltagare avslutade Block Design och Vocabulary-undersökningar av Korean-Wechsler Intelligence Scale for Children, 4th edition (K-WISC-IV) (21). Impulsivitet bedömdes med Barratt Impulsiveness Scale (BIS) (22). Beteelsinhibitionssystem (BInS) och beteendeaktiveringssystem (BAS) skalor mättes för att bedöma personlighetsdimension (23). Uteslutningskriterier inkluderade tidigare eller nuvarande stora medicinska störningar (t.ex. diabetes mellitus), neurologisk störning (t.ex. anfallssjukdomar, huvudskada), psykiatriska störningar (t.ex. stor depressionsstörning, ångeststörningar), psykisk retardering eller något missbruk (t.ex. , tobak, cannabis, alkohol). De allmänna kännetecknen för studiepersonerna sammanfattas i tabell Table1.1. Denna studie godkändes av Institutional Review Board vid Korea University Medical College of Korea (MC16SISI0120). Alla deltagare och deras föräldrar gav skriftligt informerat samtycke.
Tabell 1
Allmänna egenskaper hos studieämnen.
| Discovery | Validering | Kombinerad | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| kontroll | IGD | P-värde | kontroll | IGD | P-värde | kontroll | IGD | P-värde | |
| N | 26 | 25 | 16 | 20 | 42 | 45 | |||
| Ålder (år) | |||||||||
| Median (min – max) | 13 (12 - 17) | 13 (12 - 15) | 0.759 | 15 (13 - 18) | 14.5 (12 - 18) | 0.628 | 14 (12 - 18) | 14 (12 - 18) | 0.509 |
| Veckotidspel på Internet (h) | |||||||||
| Median (min – max) | 5.25 (2 - 17) | 18 (6 - 46) | 1.27E-6a | 5.5 (2 - 23) | 8 (1 - 112) | 0.374 | 5.5 (2 - 23) | 14 (1 - 112) | 1.63E-5a |
| Månatlig hushållsinkomst (miljoner KRW) | |||||||||
| Median (min – max) | 5 (1 - 9) | 3 (1 - 9) | 0.588 | 4 (4 - 4) | 2 (2 - 2) | 1.000 | 5 (1 - 9) | 3 (1 - 9) | 0.460 |
| Utbildning (år) | |||||||||
| Median (min – max) | 8 (7 - 9) | 8 (7 - 9) | 0.584 | 12 (12 - 12) | 6 (6 - 13) | 0.305 | 8 (7 - 12) | 8 (6 - 13) | 0.269 |
| K-WISC: blockdesign | |||||||||
| Median (min – max) | 10.5 (4 - 17) | 10 (4 - 16) | 0.544 | 10 (3 - 16) | 12.5 (4 - 15) | 0.125 | 10 (3 - 17) | 11 (4 - 16) | 0.598 |
| K-WISC: ordförråd | |||||||||
| Median (min – max) | 9 (5 - 17) | 7 (5 - 13) | 0.174 | 9.5 (8 - 15) | 11.5 (5 - 15) | 0.595 | 9 (5 - 17) | 9 (5 - 15) | 0.527 |
| KS | |||||||||
| Median (min – max) | 24 (17 - 36) | 37 (22 - 51) | 3.81E-6a | 29 (17 - 34) | 59 (22 - 108) | 1.2E-5a | 25 (17 - 36) | 40 (22 - 108) | 2.05E-10a |
| BIS | |||||||||
| Median (min – max) | 63 (35 - 75) | 67.5 (45 - 81) | 0.080 | 61 (45 - 79) | 63 (32 - 82) | 0.835 | 62 (35 - 79) | 65 (32 - 82) | 0.240 |
| BAS | |||||||||
| Median (min – max) | 31 (15 - 40) | 31 (13 - 51) | 0.558 | 36.5 (22 - 48) | 34 (27 - 52) | 1.000 | 32 (15 - 48) | 34 (13 - 52) | 0.637 |
| bINS | |||||||||
| Median (min – max) | 18 (10 - 26) | 17.5 (13 - 27) | 0.642 | 18.5 (12 - 25) | 20 (13 - 21) | 0.138 | 18 (10 - 26) | 19 (13 - 27) | 0.302 |
IGD, patienter med internet-spelsjukdomar; KS, koreansk Internet Addiction Proneness Scale; BIS, Barratt Impulsivity Scale; BAS, beteendeaktiveringssystem; BINS, Behavioral Inhibition System; KRW, koreanska vann.
aP <0.05 (Mann – Whitney – Wilcoxon-test).
TaqMan-experiment med låg densitet, miRNA Array (TLDA)
Perifert blod uppsamlades från varje deltagare och överfördes till laboratoriet inom 4 h för att minimera blodcellslysningen. Provet centrifugerades vid 3,000 rpm under 10 min vid rumstemperatur. Sedan uppsamlades supernatant (plasmaskikt) utan att förorena blodcellerna. Cirkulerande miRNA extraherades med användning av TaqMan miRNA ABC Purification Kit (Human Panel A; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) enligt tillverkarens instruktioner. I korthet blandades 50 | il plasmaprov och 100 | il ABC-buffert. Efter hybridisering med målspecifika anti-miRNA magnetiska pärlor eluerades avgränsade cirkulerande miRNA från pärlorna med 100 pl elueringsbuffert. I upptäcktsfasen undersöktes 381 miRNA från 51 plasmaprover (25 IGD och 26 kontroller) med användning av TaqMan miRNA ABC Purification Kit (Human Panel A; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) enligt tillverkarens instruktioner. Megaplex omvänd transkription och pre-amplifieringsreaktioner utfördes för att öka mängden cDNA för miRNA-expressionsanalys med användning av MegaplexPreAmp Primers Human Pool A och TaqManPreAmp Master Mix (Thermo Fisher Scientific). TLDA-panelen A v2.0 (Thermo Fisher Scientific) kördes på ViiA7 realtids PCR-system (Thermo Fisher Scientific) för att utvärdera uttrycket av miRNA. Rå data behandlades med ExpressionSuite Software v1.0.4 (Thermo Fisher Scientific) för att bestämma Ct-värden för varje miRNA.
Dataanalys för TLDA
Vi mätte först tröskelcykler (Ct-värde) för varje miRNA. miRNA med ett Ct-värde> 35 ansågs vara oupptäckbart och undantogs från efterföljande analys. Alla Ct-värden normaliserades till Ct-värdet av miR-374b (ΔCt-värde), ett av de mest stabilt uttryckta miRNA som cirkulerar i human plasma (24). Ett log2 vikningsförändringsförhållande (ΔΔCt-värde) för uttryck beräknades med användning av medelvärden för kontrollprover som en kalibrator i HTqPCR-paketet i Bioconductor (25). Den relativa kvantifieringen (RQ) för varje miRNA-mål definierades som 2-ΔΔCt. För hypotetisk testning av skillnaden i uttryck mellan två grupper använde vi surrogatvariabelanalys (SVA) för att fånga heterogeniteter såsom satseffekter i experimenten med användning av sto paket i bioledare (26). miRNA med en P-värde <0.05 ansågs vara signifikant olika mellan två grupper.
Genuppsättning anrikningsanalys
För genuppsättning anrikningsanalys, använde vi ToppFun i ToppGene Suite (27) att dra slutsatsen betydligt berikad Gene Ontology (GO) (28) termer, sökväg och sjukdomar. Som input för detta tillvägagångssätt använde vi 1,230 förutsagda målgener för kandidat-miRNA. Pathway-analys användes för att hitta betydande vägar för de förutsagda målgenerna enligt KEGG, BioCarta, Reactome, GeneMAPP och MSigDBin ToppGene-vägarna. Betydelsen av funktionella anrikningsvillkor bestämdes baserat på den Bonferroni-justerade P-värde.
Kvantitativ omvänd transkription PCR (qRT-PCR) Validering och replikering
För att validera 10-miRNA som uttrycks differentiellt i upptäcktssteget, utfördes qRT-PCR med användning av TaqMan MicroRNA-analysen (miR-15b-5p, #000390; miR-26b-5p, #000407; miR-29b-3, 000413; miR-125b-5p, #000449; miR-200c-3p, #002300; miR-337-5p, #002156; miR-411-5p, #001610; miR-423 # 5-002340 -483p, #5; och miR-002338-652p, #3) och ViiA002352-systemet (Life Technologies) enligt tillverkarens protokoll. Tio nanogram av totalt RNA omvandlades till första-sträng cDNA med miRNA-specifika primrar med användning av TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (#7, Life Technologies), följt av PCR i realtid med TaqMan Probes. RQ för varje miRNA definierades som 4366596-ΔCt, där ΔCt är skillnaden i tröskelcykler för provet i fråga, normaliserat mot det endogena miRNA (miR-374b-5p, #001319). Alla PCR-reaktioner genomfördes i tre exemplar och deras Ct-värden var i genomsnitt. Vi beräknade ett log2 vikningsförändringsförhållande (ΔΔCt) för varje miRNA på samma sätt som i den matrisbaserade analysen. Ett icke-parametriskt Mann – Whitney – Wilcoxon-test utfördes för att testa skillnaderna i uttrycksnivåer av miRNA i två grupper med en tröskel P-värdet av 0.05.
Western Blot Analysis
Varje serumprov tappades först ut av de översta 14-proteinerna med högt överflöd (albumin, immunglobulin G, immunoglobulin A, serotransferrin, haptoglobin, alfa-1 antitrypsin, fibrinogen, alfa-2 makroglobulin, alfa-1 syra glycopolotein-immunogloppinprotein, , apolipoprotein A-II, komplement C3 och transthyretin) med användning av MARS-14-kolumnen (4.6 × 50 mm, Agilent Technology, Santa Clara, CA, USA) före Western blot-analys. Den obundna fraktionen erhållen från MARS-14-kolonnen koncentrerades med användning av ett Amicon Ultracel-3-centrifugalfilter (3 kDa-avskärning), och därefter bestämdes proteinkoncentrationen med användning av bikinkoninsyra-metoden. Samma mängder (från 10 till 30 μg) kontroll- och IGD-serumprover separerades på ett 4 – 20% Mini-PROTEAN TGX-förfilm gel (Bio-Rad, CA, USA) och överfördes till ett polyvinyliden-difluoridmembran. Därefter blockerades membranet i TBS-T (190 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl, pH 7.5 och 0.05% Tween 20) med 5% icke-fett torrmjölk vid rumstemperatur under 30 min. Membranen inkuberades sedan med primära antikroppar mot DPYSL2 (1: 500, Novus Biologs, Littleton, CO, USA), GABRB2 (1: 1000, Abcam, Cambridge, MA, USA) och CNR1 (1: 100, Cruz Santa , Inc., Santa Cruz, CA, USA), DUSP4 (1: 500, MybioSource, San Diego, CA, USA), och PI15 (1: 500, MybioSource, San Diego, CA, USA) i TBS-T med 5 % icke-fett torrmjölk vid 4 ° C över natt, och sedan med lämpliga sekundära antikroppar antingen bovin anti-mus (1: 1,000, Santa Cruz Biotechnology) eller get-anti-kanin (1: 1,000, Cell Signaling, Beverly, MA, USA ) konjugerad till pepparrotsperoxidas vid rumstemperatur under 1 timmar. Signaldetektion utfördes med användning av kemiluminescens med ECL-reagens (GE health, Piscataway, NJ, USA). Vi kvantifierade Western blot-resultaten med hjälp av analysprogramvaran TotalLab 1D (Non-linear Dynamics, Newcastle upon Tyne, UK). Därefter beräknades densitometri-förhållandet genom att dela upp densitometri-värdet för varje prov som beskrivits på annat håll (29). Som en kontroll för normalisering användes ett serumprov sammansatt från 46 IGD och kontrollprover för varje experiment. Statistisk betydelse bestämdes med användning av ett icke-parametriskt Mann – Whitney – Wilcoxon-test med en tröskel P-värdet av 0.05.
Resultat
Egenskaper för studieämnen
De demografiska och kliniska särdragen hos studiepersonerna visas i tabell Table1.1. När vi jämförde IGD och kontrollgrupper enligt den koreanska Internet Addiction Proneness Scale (K-Skala) som beskrivs någon annanstans (20, 30), IGD-gruppen visade ett signifikant högre median K-Scale-värde än kontrollgruppen (37 vs. 24, P = 3.81 × 10-6) (Tabell (Table1) .1). Median veckotid som spenderades på internet-spel i IGD-gruppen var betydligt längre än kontrollerna (18 vs. 5.25 h, P = 1.27 × 10-6). Medan det inte fanns någon signifikant skillnad mellan två grupper i ålder, månatlig hushållsinkomst, utbildningens varaktighet, blockdesign och undersökningsresultat för K-WISC, BIS, BInS och BAS
Differentiellt uttryckta miRNA mellan IGD och kontroller
För att upptäcka IGD-associerade miRNA antog vi en tvåstegsstrategi (upptäckt och oberoende validering). Studiens design och övergripande strategi illustreras i figur S1 i kompletterande material. I upptäcktssteget analyserade vi miRNA-expressionsprofiler av 51-prover (25 IGDs och 26-kontroller) med användning av miRNA-arrayen som innehåller 384 miRNA. Det visade sig att expressionsnivåerna av 10 miRNA var signifikant olika mellan IGD och kontrollgrupperna (tabell (Table2) .2). Relativa uttrycksnivåer för dessa 10 miRNA visas i figur Figure1.1. Bland dem var två (hsa-miR-423-5p och hsa-miR-483-5p) uppreglerade och åtta (hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-29b-XNX hsa-miR-3b-125p, hsa-miR-5c-200p, hsa-miR-3c-337p, hsa-miR-5-411p och hsa-miR-5-652p) nedreglerades i IGD-gruppen.
Tabell 2
Olika uttryckta mikroRNA (miRNA) och vikningsförändringar.
| miRNA | Discovery | Validering | Kombinerad | |||
|---|---|---|---|---|---|---|
| P-värde | Faldig förändring | P-värde | Faldig förändring | P-värde | Faldig förändring | |
| hsa-miR-15b-5p | 0.033 | 0.829 | 0.694 | 1.119 | 0.381 | 0.947 |
| hsa-miR-26b-5pa | 0.008 | 0.871 | 0.049 | 0.841 | 0.013 | 0.857 |
| hsa-miR-29b-3p | 0.005 | 0.400 | 0.560 | 1.187 | 0.089 | 0.647 |
| hsa-miR-125b-5p | 0.021 | 0.582 | 0.290 | 0.950 | 0.069 | 0.723 |
| hsa-miR-200c-3pa | 0.011 | 0.336 | 0.003 | 0.542 | 2.93 × 10-5 | 0.415 |
| hsa-miR-337c-5p | 0.009 | 0.385 | 0.582 | 0.872 | 0.020 | 0.553 |
| hsa-miR-411-5p | 0.004 | 0.322 | 0.336 | 1.282 | 0.158 | 0.595 |
| hsa-miR-423-5p | 0.026 | 1.387 | 0.189 | 0.955 | 0.518 | 1.175 |
| hsa-miR-483-5p | 0.018 | 1.861 | 0.765 | 1.413 | 0.211 | 1.647 |
| hsa-miR-652-3pa | 0.019 | 0.715 | 0.049 | 0.877 | 0.011 | 0.782 |
amiRNA signifikant förändrats i både upptäckts- och valideringsuppsättningar på ett konsekvent sätt.
qRT-PCR Validering av kandidatens miRNA
För att validera 10-kandidat-miRNA utförde vi qRT-PCR med en oberoende valideringsuppsättning (20 IGD och 16-kontroller) (Tabell S1 i kompletterande material). Tre av dessa miRNA (hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p och hsa-miR-652-3p) signifikant nedreglerades i IGD-gruppen i valideringsuppsättningen (tabell (Table2) .2). Tre andra miRNA (hsa-miR-337c-5p, hsa-miR-125b och hsa-miR-423-5p) nedreglerades också i IGD-gruppen men inte signifikant. Återstående fyra miRNA (hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-29b-3p, hsa-miR-411-5p och hsa-miR-423-5p) uttrycktes motsatt i valideringsuppsättningen. När vi kombinerade upptäckts- och valideringsuppsättningarna (totalt 45 IGD-individer och 42-kontroller) var de tre validerade miRNA: erna konsekvent signifikanta (tabell (Table2) .2). Detaljerad information, kromosomala placeringar, mogna sekvenser och expressionsnivåer i CNS för dessa tre miRNA finns i tabell S2 i kompletterande material.
Synergistisk effekt av samtidig ändring av de tre miRNA: erna på IGD-risk
För att utvärdera den kombinerade effekten av de tre miRNA: erna, observerade vi oddsförhållandena (OR) för de fyra undergrupperna (med 0, 1, 2 eller 3 miRNA-förändringar). miRNA-förändring definierades av RQ-värdet som beskrivs i avsnitt "Material och metoder. ”Eftersom alla tre miRNA-markörer nedreglerades i IGD-gruppen, trotsades ett miRNA vars RQ-värde var under ett som förändrat. Detaljerad information om varje studiepersons RQ-värde för de tre miRNA: erna finns i tabell S3 i kompletterande material. För varje undergrupp beräknades oddsen som förhållandet mellan antalet kontroller och det för IGD: er, varpå varje OR beräknades genom att dela odds för varje undergrupp med odds för undergruppen utan några miRNA-förändringar. Individer med tre miRNA-förändringar uppvisade en 22 gånger högre risk än de utan någon miRNA-förändring (ELLER 22, 95% CI 2.29 – 211.11). OR visade en ökande trend med antalet förändrade miRNA från 0 till 3 (r2 = 0.996) (Figur (Figure22).
GO och Pathway-analys av målgener för kandidat-miRNA: er
För att få insikt i funktionerna hos de tre miRNA-markörerna som signifikant nedreglerades i IGD-gruppen, förutsagdes deras målgener med användning av miRWalk 2.0-databasen (31). Totalt 1,230-gener förutsogs konsekvent som nedströmsmål av fyra algoritmer (miRWalk, miRanda, RNA22 och Targetscan) med användning av databasen miRWalk (32-34) (Tabell S4 i kompletterande material). Genuppsättning anrikningsanalys med användning av ToppFun i ToppGene Suite visade att målgenerna för dessa miRNA var signifikant associerade med neurala utvecklingsvägar såsom "Axon vägledning" och GO termer som "neurogenesis" (tabell S5 i kompletterande material).
Uttryck av de förutsagda målgenerna
Bland de nedströms målgenerna för de tre miRNA: erna förutsagdes 140 samtidigt för två eller flera miRNA: er (Tabell S4 i kompletterande material). För att undersöka om deras proteinuttrycksnivåer för nedströms målgener skiljer sig mellan IGD och kontrollgrupper, valde vi 2 gener (DUSP4 och PI15), som förutsägs som nedströmsmål för alla 3-miRNA och ytterligare 3-gener (GABRB2, DPYSL2och CNR1) från de som förutses för 2 miRNA och utförde Western blot-analys med plasmaproverna från 28 IGD och 28 kontroller tillgängliga för experimentet. Vi jämförde uttryck för de fem målen mellan IGD och kontrollgrupper genom att mäta bandintensiteten och området som beskrivits på annat håll (29). Bland dem uttrycks nivåerna för DPYSL2 (28 IGD och 28 kontroller, P = 0.0037) och GABBR2 (27 IGD och 28 kontroller, P = 0.0052) var signifikant högre i IGD-gruppen (Figur (Figure3) .3). Vi kunde dock inte observera olika uttryck för CNR1 (P = 0.0853), DUSP4 (P = 0.5443) och PI15 (P = 0.6346).
Diskussion
Det har rapporterats att miRNA är involverade i neuronal utveckling (35, 36) och differentiellt uttryck av hjärn-miRNA observeras i psykiatriska sjukdomar såsom schizofreni (37). Därför är det troligt att cirkulerande miRNA-profiler kan vara användbara biomarkörer för IGD. Cirkulerande miRNA har föreslagits som biomarkörer för olika neuropsykiatriska störningar (38-40); emellertid är molekylmekanismerna bakom IGD-utveckling fortfarande till stor del okända trots dess kliniska och sociala betydelse. Specifikt har det inte gjorts några studier på IGD-associerade miRNA. Syftet med denna studie var tvåfaldigt. Först försökte vi upptäcka plasma-miRNA associerade med IGD. För det andra utvärderade vi den biologiska implikationen av miRNA-kandidaterna genom att utforska proteinuttryck och GO av målgener nedströms. Genom genomgående screening av miRNA-expressionsprofiler och nedströms validering av kandidaterna upptäckte vi att uttrycket av tre miRNA (hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p och hsa-miR-652-3p) var betydligt lägre hos IGD-patienter än kontroller. Även om uttrycksmönstren för andra sju miRNA-kandidater inte replikerades i valideringen, kan det vara falskt negativt på grund av liten provstorlek i denna studie. Så vitt vi vet är detta den första rapporten om möjligheten att blod-miRNA-uttrycksprofiler kan vara användbara biomarkörer för IGD. Kombination av de tre miRNA-markörerna kan fungera som ett minimalt invasivt verktyg för tidig identifiering av personer med risk för IGD.
De miRNA som identifierats i denna studie har rapporterats vara involverade i olika neuropsykiatriska störningar. Expression av hsa-miR-200c i blod har rapporterats vara nedreglerat vid flera psykiatriska störningar såsom schizofreni (41) och stora depressiva avsnitt (42). miR-200c rapporterades vara mer uttryckt i synaptiska fraktioner än i total förhjärna (43) och även förknippas med neuronal celldöd (44). Baserat på dessa tidigare rapporter är miR-200c involverad i neuroutveckling och kan associeras med neuropsykiatriska störningar om dess uttryck störs. Flera studier har föreslagit samband mellan miR-652 och risken för neuropsykiatriska störningar. Liknar vår metod, för att identifiera blodbiomarkörer för schizofreni, Lai et al. genomförde TLDA-analys med schizofrenipatienter och normala kontroller och fann att sju miRNA inkluderande hsa-miR-652 uttrycktes differentiellt i schizofrenipatienter (45). I den efterföljande studien utformade de en prediktionsmodell med användning av miRNA-uttrycksdata och skilde framgångsrikt schizofreni från normal kontroll (46). Förändrat uttryck av hsa-miR-652 observerades också hos alkoholister (47). Hsa-miR-26b befanns vara aktiverat under neuronell celldifferentiering (48). Perkins et al. rapporterade att hsa-miR-26b nedreglerades i den prefrontala cortex hos schizofrenipatienter (49).
Även om det inte finns några direkta bevis som stöder förhållandet mellan det störda uttrycket av dessa miRNA och patofysiologin för IGD, kan vi dra slutsatsen att dysregulering av dessa miRNA kan vara associerad med patofysiologin för IGD baserat på olika tidigare rapporter om de nedströms gener som vi förutspådde . Några av de nedströms generna för de tre miRNA: erna GABRB2, CNR1, NRXN1och DPYSL2 rapporteras vara associerade med neuropsykiatriska störningar. Gamma-aminobutyric acid (GABA) är en viktig hämmande neurotransmitter i CNS. Dysregulering av GABA-receptorn är inblandad i neuropsykiatriska störningar inklusive beroende, ångest och depression (50), som också är huvuddragen i IGD (8). Genetiska polymorfismer i GABA-receptorgener rapporteras vara associerade med alkoholberoende och schizofreni (51, 52). Dihydropyrimidinasliknande 2 (DPYSL2) är medlem i kollapsinresponsmedlarproteinfamiljen, som spelar en roll i mikrotubulmontering, synaptisk signalering och reglering av axonal tillväxt. Följaktligen har denna molekyl föreslagits som en biomarkör för psykiatriska störningar (53, 54). Polymorfism i DPYSL2 genen rapporterades också vara associerad med alkoholanvändningsstörning (55). Tidigare rapporter och våra data antyder att överuttryck av GABRB2 och DPYSL2, nedströmsmål för de nedreglerade miRNA: erna, har konsekvenser för patogenesen av neuropsykiatriska störningar inklusive IGD. Cannabinoidreceptor typ 1 (CNR1) är en presynaptisk heteroreceptor som modulerar frisättning av neurotransmitter och störningar i signalering av cannabinoid är associerade med olika neuropsykiatriska störningar (56). Genetisk polymorfism av CNR1 gen är känd för att vara associerad med substansberoende hos kaukasier (57). I en råttmodell stör aktivering av ventral hippocampus CNR1 normalt socialt beteende och kognition (58). Genetisk förändring i NRXN-familjen är känd för att vara involverad i olika neuropsykiatriska störningar inklusive missbruk (59).
För att undersöka den biologiska implikationen av de tre miRNA-kandidaterna på ett mer direkt sätt undersökte vi proteinuttryck av deras nedströms målgener. På grund av den begränsade tillgängligheten av plasmaprover av de vanliga 140-kandidaterna (förutsagda nedströms om 2 eller fler miRNA), undersökte vi 5-mål (GABRB2, DPYSL2, CNR1, DUSP4 och PI15) med western blot och bekräftade uttrycket av GABRBXUM och DPYSL2 var signifikant högre i IGD-gruppen. Tidigare rapporter och våra data antyder att överuttryck av GABRB2 och DPYSL2, nedströmsmål för nedreglerade miRNA, kan ha konsekvenser för patogenesen av neuropsykiatriska störningar inklusive IGD. Resultaten av GO och sökvägsanalys av neurala utvecklingsvägar stöder också den neurobiologiska implikationen av miRNA-markörerna. Ett annat intressant fynd var den synergistiska effekten av samtidig förändring av miRNA: er. Individer med nedreglering av alla 2 miRNA visade 3 gånger högre risk än de utan nedreglering, och OR ökade på ett dosberoende sätt. Även om CI för dessa tre förändringar var brett på grund av begränsad provstorlek, var den tydliga positiva korrelationen (r2 = 0.996) stöder den synergistiska effekten av de tre miRNA.
Även om vi upptäckte de IGD-associerade miRNA-markörerna och individer med alla tre miRNA-förändringarna hade en risk 22 gånger högre än de utan några miRNA-förändringar, finns det flera begränsningar i denna studie. Först ökade den lilla provstorleken sannolikheten för att sakna andra betydande miRNA-markörer. För det andra, eftersom våra data inte räckte för att klargöra om miRNA-profilerna i plasma antingen är orsak eller effekt, kan vi inte bekräfta de biologiska rollerna för dessa icke-invasiva markörer i en klinisk miljö. Ytterligare miRNA-profilering och deras nedströms genanalys med human hjärnvävnad från hjärnvävnadsbank kan ge ett mer direkt svar. Hjärnvävnadsanalys med en djurmodell med en spelstörning skulle också vara till hjälp. För det tredje undersökte vi endast fem nedströms kandidatmolekyler på grund av den begränsade tillgängligheten av plasmaprover. Att utforska fler nedströmsmål med en större provuppsättning kommer att vara till hjälp för att ytterligare förstå den molekylära mekanismen för IGD.
Sammanfattningsvis upptäckte vi genom genombredd screening av miRNA-expressionsprofiler och oberoende validering tre IGD-associerade miRNA (hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p och hsa-miR-652-3p). Många av deras nedströmsgener rapporteras vara involverade i olika neuropsykiatriska störningar, och experimentell validering av förändrat uttryck för dessa nedströmsgener stödjer implikationen av miRNA: er som identifierats i denna studie. Vi fann att individer med nedreglering av alla tre miRNA löper hög risk för IGD. Tillsammans med de kända kliniska eller miljömässiga riskfaktorerna och diagnostiska kriterier kan våra resultat underlätta tidig intervention för att hjälpa människor med högre risk för IGD.
Etikförklaring
Denna studie godkändes av Institutional Review Board vid Korea University Medical College of Korea (MC16SISI0120). Alla deltagare och deras föräldrar gav skriftligt informerat samtycke.
Författarbidrag
ML och HC bidrog lika till denna artikel. ML, D-JK och Y-JC utformade studien. SJ, S-MC, YP, DC och JL utförde experiment och datagenerering. J-WC, S-HP, J-SC och D-JK samlade blodprover och klinisk information. ML, HC, S-HY och Y-JC analyserade data. ML, HC, S-HY och Y-JC beskrev manuskriptet. Y-JC övervakade projektet.
Intresseanmälan
Författarna förklarar att forskningen genomfördes i avsaknad av kommersiella eller finansiella relationer som kan tolkas som en potentiell intressekonflikt.
fotnoter
Finansiering. Detta arbete stöds av ett bidrag från hjärnforskningsprogrammet genom National Research Foundation of Korea (NRF), finansierat av ministeriet för vetenskap och IKT och framtidsplanering (NRF-2015M3C7A1064778).
Extramaterial
Det kompletterande materialet för denna artikel kan hittas online på http://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpsyt.2018.00081/full#supplementary-material.
Referensprojekt
;
