Indian J Pharmacol. 2016 jan-feb; 48 (1): 53 – 58.
PMCID: PMC4778208
Abstrakt
Mål:
Nucleus accumbens (NAcc) har en roll i beroende och intagande beteende. För att bedöma orexinergiskt system som är inblandat i detta, infuserade vi Orexin A-antagonist och bedömde effekten på matintagets vätskeintag och alkoholpreferens hos Wistar-råttor.
Material och metoder:
Inavlade Wistar-råttor (n = 54) delades in i kontroll- och experimentgrupper (låg dos och hög dos). Med hjälp av stereotaxisk metod sattes ledkanyler på plats bilateralt för att nå NAcc. Låg dos (3 ng) och hög dos (6 ng) av Orexin A-antagonist (SB-334867) infunderades, och livsmedelskonsumtionen, vattenintaget och alkoholintaget, och två flaskor med fritt val för alkoholprov utfördes i experimentell grupp. Kontrollgruppen fick saltlösning och resten av de metoder som följdes var desamma. Mätningarna utfördes omedelbart efter infusionen, vid 1 h, 2 h, 4 h, och under hela dagen och representerade i figuren och tabellerna.
Resultat:
En minskning av vattenintaget observerades omedelbart efter infusionen i 1st h (P <0.05) och 2nd h (P <0.01), vilket var mer i högdosgrupp jämfört med lågdos och kontroller. Alkoholintaget följde också samma mönster. I två flaskor fritt val visade råttor ingen specifik preferens framför alkohol.
Slutsats:
Det var dosberoende minskning av intaget av mat och vätskor hos behandlade råttor. Detta antydde en möjlig roll för orexinergiskt system i intagande beteende. Emellertid kanske Orexin A inte har någon roll i moduleringen av alkoholberoende av det givande centrumet NAcc.
Beskrivning
accumbens (NAcc) är känt för att påverka intagande beteende och beroende av ämnen. [1,2] Det har också varit inblandat i belöning och motivation. [3] Två distinkta subregioner har beskrivits i NAcc, och det verkade mycket överlappning i funktionen i dessa två regioner. [4] Mikroinjektion av beroendeframkallande läkemedel i NAcc visade en dosberoende ökning av dopaminnivåer. Dopamin är en neurokemisk involverad i belöningskretsar. Intranukleär självadministrering av amfetamin visade en ökad belöningskänsla. [5] Andra delar i det subkortiska området påverkar alltför intagens beteende, som kan vara nära kopplat till åkare. Matintag och vattenintag visade sig påverkas av flera delar av basalhjärnan, såsom lateral hypotalamus, [6] paraventrikulär kärna, septum pellucidum, [7] och basolateral amygdala. [8] Det finns omfattande neurala nätverk i regleringen av intagande beteende. NAcc har visat sig vara väl anslutna till de stora subkortikala centra, såsom ventral tegmental area (VTA); [9] basolaterala amygdala och andra centra. [10] Viktiga neurotransmittorer involverade i moduleringen av alkoholintag, belöning och matintag rapporterades från nervkretsarna i denna region. [11]
Nyligen har hypokretiner, en grupp heterogena peptider, identifierats från hypotalamus, hypocretin 1 och 2 (Orexin A och B), peptider med 32 aa respektive 29 aa. [12] Ursprungligen har dessa ämnen varit inblandade i regleringen av sömnvakencykeln, vilket framgår av den ökade Orexin A som finns i hypothalamus under den aktiva fasen av vakenhet. [13] I vårt laboratorium fann vi att Orexin A ökade mat- och vätskeintaget när det injicerades i NAcc. [14] Den centralt administrerade orexin-antikroppen hämmar dosintaget matintag i 24 h-fasta råttor, och intraperitoneal administration av orexin-antikropp misslyckades med att undertrycka livsmedelskonsumtionen, representerar att orexin-antikropp verkar i det centrala nervsystemet men inte i perifer vävnad. [15] Vidare bekräftade de att endogena orexiner har en fysiologisk roll när det gäller foderbeteende. Även om ursprungligen Orexins postuleras att påverka intagande beteende, bevisen för roll för Orexin A i utfodring beteende och alkoholintag och även alkohol preferens är skissartade. I vår tidigare studie har vi visat att Orexin A ökade mat- och vätskeintaget hos fasta råttor. [14] För att klargöra orexin A: s roll i intagningsaktiviteten på ett entydigt sätt genomförde vi denna uppsättning experiment i Wistar-råttor som fanns över en natt genom att infoga Orexin A-antagonisten SB-334867 i NAcc. [16] Vi testade också alkoholpreferensen hos behandlade råttor för att belysa effekten av Orexin A-antagonist på alkoholintaget. Resultaten från experimenten om intag av mat, vatten och alkohol och alkoholpreferens diskuteras här.
Material och metoder
Fyra och fyra manliga Wistar albino råttor (n = 54) vägning (250 ± 10 g), 3-4 månader gamla valdes för studie. De delades in i tre grupper, nämligen. Vattengrupp, alkoholgrupp och grupp med två flaskorn = 18 vardera). De delades in i tre undergrupper, dvs. Grupp 1 - Kontroll (saltlösning); Grupp 2 - Låg dos SB-334867 (3 ng); Grupp 3 - Hög dos SB-334867 (6 ng, n = 6 vardera). Mat och vätska tillhandahölls till alla grupper AD lib, utom när det nämns för fasta över natten.
Alla djur hölls individuellt i polypropylenburar, med korrekt skalbäddar och hölls på en 12-timmars ljus / mörk cykel i temperaturstyrd miljö. Djur upprätthölls enligt kommitténs riktlinjer för kontroll och övervakning av djurförsök och Indiens regering för riktlinjer för användning av laboratoriedjur. Institutional Animal Ethical Committee har godkänt detta studieprotokoll.
Läkemedel och apparater
Saltlösning 0.9%, SB-334867 (Från: Tocris bioscience) löstes i 2% cyklodextran i sterilt vatten. När de inte användes lagrades lösningar vid 4 ° C upp till 3 veckor. Harvard Pico plus (USA) infusionspump användes för att leverera läkemedel. Kranvatten tillhandahölls i plastflaskor och råtta matpellets (Hindustan Unilever Ltd.) tillhandahölls. Etylalkohol (Absolute) anskaffades (Hayman Ltd., Eastways Park, Witham, Essex, CM83YE, UK) och utspäddes för att göra en 10% alkohol (Denna koncentration valdes på grundval av en pilotstudie om preferensen för alkoholkoncentration) . Ketamin (NEON Laboratories limited, Thane, MS) och xylazin (Indian immunological Ltd., Hyderabad) användes för anestesi.
Kirurgisk procedur
Wistar-albino-råttor av han bedövades genom att injicera en blandning av ketaminhydroklorid (60 mg / kg), xylazinhydroklorid (6 mg / kg) och monterades på en stereotaxisk apparat (Inco, Indien). Ett snitt gjordes i hårbotten, desinficerades noggrant med kirurgisk anda. Området städades upp med bomull och väteperoxid. Koordinatpunkter markerades på skallen i motsvarande områden för att nå NAcc, med hänvisning till Paxinos och Watson hjärnatlas [17] (Från Bregma: Anteroposterior + 2.2 mm, lateral ± 1 mm och vertikal 7.4 mm). Burrhål gjordes och ledningskanyl av rostfritt stål (22 gasväv) implanterades enligt stereotaxiska koordinater. När kanylen är på plats säkras den med hjälp av skruvar och tand akryl. Styrkanylen var utrustad med stylet, och råttor fick återhämta sig i minst 7 dagar före experimentet. Infusionskanyl (inre kanyl) tillverkades av Septoject rostfritt stål-nål med 30-mätare som har ett nav, bekvämt att hantera. [18] Infusionskanyl sträcker sig 1 mm bortom respektive ledningskanyl. Innan experimenten började fick alla råttor två träningspass där de hölls på 24 h fastande och fick sedan mat, vatten och 10% alkohol. Under denna session fick råttor lära sig fasta.
Experimentell procedur
Normal saltlösning och SB-334867 (i två doser) infunderades respektive i separata grupper av råttor efter 24 h-fasta; oestetiserade (fritt rörliga) råttor genom den säkrade ledkanylen. Infusionen utfördes med 10 μl Hamilton-spruta kopplad till polyetenrör och inre kanyl. Denna spruta monterades på Harvard-pumpen. Sedan avlägsnades stiletten som placerades i styrkanylen. Den inre kanylen sattes in i styrkanylen och säkrades. Sedan startades pumpen för att leverera lösningen till höger och vänster sida av NAcc efter varandra, 1 μl / min (efter infusion inre kanyl kvar i ungefär 10 s för att tillåta läkemedelsdiffusion). Två doser SB-334867 infunderades vid 3 ng (låg dos) och 6 ng (hög dos). Vid slutet av infusionen avlägsnades den inre kanylen och stylet placerades tillbaka i läge och tiden noterades. Efter infusion, omedelbart förmätt mängd mat, vatten och 10% alkohol tillhandahölls i respektive grupper. Effekten av SB-334867 på konsumtionen mättes och noterades noggrant vid infusionstidsintervall 1, 2, 4 respektive 24 h. Resterande pellets, vatten och alkohol avlägsnades, och den konsumerade mängden beräknades (mängd konsumerat = förmätt mängd kvar kvar kvantitet, t.ex. i slutet av 1 h).
Efter avslutad studie avlivades råttorna genom dödlig anestesidos och hjärnan dissekerades och bevarades för histologisk bearbetning. Sju mikronavsnitt skivades och färgades med cresylviolett för att bekräfta infusionsstället [Figur 1].
Statistisk analys
Analys av data utfördes med användning av den statistiska programvaran SPSS version - 16 (SPSS för Windows, version 16.0. Chicago, SPSS Inc. USA); envägs ANOVA gjordes för att jämföra det fullbordade beteendet mellan grupperna. Inter jämförelse gjordes av post-hoc Tukeys test (Konsumtion per timme jämfört separat, t.ex. 1 timmars kontroll av matintag jämfört med 1 timme SB-334867 behandlat matintag). Data uttrycktes som medelvärde ± standardfel av medelvärde P <0.05 ansågs betydande.
Resultat
Experiment I
Mat- och vattenförbrukning mättes (n = 18) i denna grupp, NAcc kanylerade djur (n = 18), delades upp i undergrupper, grupp 1 (0.9% saltlösning), grupp 2 (SB-334867-3 ng), grupp 3 (SB-334867-6 ng). Läkemedel injicerades bilateralt i NAcc [Data visades i Tabell 1 och figur Figure1a, 1a, , bb].
Matintag
Jämfört med kontroll vid 1 h efter SB-334867-behandling uppvisade signifikant minskning (F [2, 15] = 9.171 p = 0.003) i livsmedelsintaget (dvs. grupp 1 kontra grupp 3, p <0.002); medan ingen signifikant förändring märktes vid 2 timmar (F [2, 15] = 0.190 p = 0.829); 4 h (F [2, 15] = 0.160 p = 0.854); 24 h postinfusionstidsintervall (F [2, 15] = 4.873 p = 0.023) (Grupp 1 vs. grupp 3, p <0.028; Grupp 2 vs. Grupp 3, p <0.05).
Vattenintag
SB-334867-behandling visade ingen effekt på vattenintaget vid 1 h (F [2, 15] = 0.957 p = 0.406); 2 h (vatten 2 h F [2, 15] = 0.773 p = 0.479); 4 h (F [2, 15] = 0.288 p = 0.753) tidsintervall efter infusion; men totalt 24 h vattenintag minskade (F [2, 15] = 10.688 p = 0.001) jämfört med kontroll (grupp 1 vs. grupp 3, p <0.002; Grupp 2 vs. Grupp 3, p <0.006).
Experiment II
Alkohol (10%) och livsmedelskonsumtion mättes [n = 18, data in Tabell 2 och Figur 2].
NAcc kanylerade råttor delades in i tre undergrupper, grupp 1 (0.9% saltlösning) n = 6), grupp 2 (SB-334867-3 ng, n = 6) och grupp 3 (SB-334867-6 ng, n =
10% alkoholintag resultat
Vid 1 h och 2 h SB-334867-behandling dämpades alkoholkonsumtionen signifikant vid 1st h (F [2, 15] = 4.457 p = 0.030), (grupp 1 vs. grupp 3, p <0.004), 2nd h (F [2, 15] = 11.122 p = 0.001) (Grupp 1 vs. grupp 3, p <0.001; Grupp 2 vs. Grupp 3, p <0.038). Det fanns dock ingen signifikant förändring i alkoholkonsumtionen vid 4 timmar (F [2, 15] = 0.709 p = 0.508) och 24 h (F [2, 15] = 2.631 p = 0.105) -intervall.
Matintag
Vid 1 h och 2 h SB-334867 behandling signifikant (F [2, 15] = 4.230 p = 0.035) dämpat matintag (grupp 1 vs. grupp 3, p <0.03); (F [2, 15] = 16.558 p = 0.000) (Grupp 1 vs. grupp 2, p <0.000; Grupp 2 vs. Grupp 3, p <0.021), jämfört med kontroll. Inga signifikanta förändringar märktes vid 4 timmar (F [2, 15] = 0.070 p = 0.933). Medan det totala matintaget minskade (0 – 24 h) (F [2, 15] = 4.457 p = 0.030) (Grupp 1 vs. grupp 3, p <0.025).
Experiment III
Mat, 10% alkohol och vatten [två flaskor, Tabell 2] konsumtion mättes. NAcc kanylerade råttor subgrupperades som grupp 1 (0.9% saltlösning, n = 6), grupp 2 (SB-334867-3 ng, n = 6) och grupp 3 (SB-334867-6 ng, n = 6), injicerades.
Matintag
SB-334867-behandling vid 1 h (F [2, 15] = 5.111, p = 0.02) dämpat matintag (grupp 1 vs. grupp 3, p <0.011) men ingen signifikant skillnad observerades vid 2 timmar, 4 timmar (F [2, 15] = 0.093 p = 0.911), (F [2, 15] = 0.797 p = 0.469) respektive och vid 24 h uppvisade båda antagonistens dos minskning av matintaget (F [2, 15] = 12.698 p = 0.001) (Grupp 1 vs. grupp 2 och grupp 3, p <0.039, p <0.000 respektive) jämfört med kontrollgruppen.
Vattenintag
SB-334867-behandling gav ingen förändring i vattenintaget i någon grupp med tidsintervall vid 1 h (F [2, 15] = 0.584 p = 0.578), 2 h (F [2, 15] = 0.662 p = 0.530), 4 h (F [2, 15] = 1.655 P = 0.224) och 24 h (F [2, 15] = 0.513 p =
Alkoholintag (10%)
SB-334867 behandling dämpat alkoholintag vid 1 h (F [2, 15] = 9.098 p = 0.003), (grupp 1 vs. grupp 2 och grupp 3, p <0.004, p <0.008 respektive). Ingen signifikansförändring i någon grupp vid 2 timmar (F [2, 15] = 0.854 p = 0.446), 4 h (F [2, 15] = 0.931 p = 0.416) och 24 h (F [2, 15] = 0.349 p = 0.711).
Totalt vätskeintag
Ingen signifikant förändring i någon av grupperna vid 1st h (F [2, 15] = 2.064 p = 0.161), 2nd h (F [2, 15] = 1.023 p = 0.383), 4th h (F [2, 15] = 1.205 p = 0.327) och 24 h (F [2, 15] = 0.484, p =
Diskussion
Modulering av mat- och vattenintag av olika neurokemikalier har granskats. Bland flera kandidatmolekyler som har visat sig påverka matningsbeteendet, inklusive alkoholintag, är Orexiner också inblandade. [19Orexiner antogs ursprungligen vara stimulantia för matintaget och reglering av intagningsaktivitet; senare befanns de påverka sömnen och vakna tillstånd. [20] Dube et al,. har visat att central administration av Orexins har modulerande roll i intagande beteende, främst centrerat i hypothalamus. [21] I vårt nuvarande experiment testade vi effekten av Orexin A-antagonist (SB-334867) på NAcc. NAcc har tilldelats en avgörande roll i beroende och utfodringsrelaterade aktiviteter. [22] Orexiner har också varit inblandade i medling av denna åtgärd av NAcc. [4] NAcc visade dock två histologiskt distinkta distrikt, [23] som kan ha funktionella skillnader [24] och deras funktioner tycktes överlappa betydligt. [25] I våra tidigare experiment fann vi att infusion av Orexin A i NAcc med hjälp av mikroinjektionsteknik ökade mat- och vattenintaget i timmarna omedelbart efter infusion, men det fanns ingen speciell preferens för alkohol när testades med två flaskor fritt val. [14] Därför försökte vi injicera Orexin A-antagonist i NAcc och analyserade matintaget, vattenintaget och alkoholintaget hos råttor, som fastades över natten.
Förbrukningen i 1st h minskade signifikant hos orexinantagonistbehandlade djur. Vår studie visar vidare Orexin A: s roll i utfodringsbeteendet. Orexinreceptor typ 1 (OX1R) antagonist SB-334867 infusion dämpar matningen och drickningen. Orexin A visade konsekvent den stimulerande effekten på matning och dricka. OX1R-antagonist har 10 gånger större affinitet för Orexin A än B. [26,27]
Orexinergiska neuroner projicerar till AccSh och båda orexinreceptorerna (OX1R och OX2R) finns i NAcc, med OX2R uttryckt i större utsträckning. [28,29] Orexin A ökade GABAergiska strömmar och minskade N-metyl-D-aspartatströmmar i isolerade accumbens neuroner. [30] Dessutom väcker orexiner dopaminerge VTA-neuroner. [31] Eftersom dopaminerga VTA-neuroner innerverar och väcker AccSh GABAergic (hämmande) nervceller, kan orexinsignalering ytterligare öka lokal hämning i Acc genom att öka neuronal aktivitet i VTA, vilket resulterar i ytterligare förbättring av fulländande beteende. Men detta motsades av Baldo och Kelley, [32] som inte hittade någon effekt på utfodring eller lokomotorisk aktivitet med intra-AccSh Orexin A.
Vi testade möjligheten att Orexin A fungerar som modulator för alkoholkonsumtion [Tabell 2] tillsammans med mat. Från vår tidigare studie konstaterade vi att råttor föredrog att konsumera alkohol med 10% -lösning vilket har bekräftats i vår egen tidigare studie. [33] I den här studien tillhandahöll vi därför alkohol i denna utspädning efter infusion av läkemedel till NAcc. Vi fann en signifikant minskning av alkoholintaget i timmarna omedelbart efter infusionen av Orexin A-antagonist. Minskningen av mat- och vattenintag var lägre i infusionsgruppen för låg dos (3 ng) medan den var högre i gruppen med hög dos (6 ng). För att testa alkoholpreferensen tillhandahöll vi råttorna två flaskvalskondition, där en flaska vatten och en annan innehållande 10% alkohol tillhandahölls samtidigt. Efter infusion av Orexin A gav antagonisten en betydande minskning av matintag och alkoholintag. Denna typ av minskning konstaterades både i låg och hög dos men begränsades till 1st h efter infusionen. Minskningen av matintaget var dock mer markant jämfört med vattnet eller alkoholen. Detta bevis ger stöd för Orexin A: s deltagande i regleringen av antingen matintag men stöder inte möjligheten till Orexin A-deltagande i preferensen för alkohol.
Ekonomiskt stöd och sponsring
Institutionen för bioteknik, del av DBT-finansierat projekt, Ref: Ref: BT / PR14012 / MED / 30 / 315 / 2010 daterad 30.09.2010 Indiens regering.
Intressekonflikt
Det finns inga intressekonflikter.
Tack
Författarna är tacksamma till Institutionen för bioteknik, Indiens regering, för det ekonomiska stödet. Kasturba Medical College, Mangalore, Manipal University, för de tillhandahållna faciliteterna.
Referensprojekt
;
