Hypokretin (orexin) underlättar belöning genom att dämpa de motstridiga effekterna av dess cotransmitter-dynorfin i ventral tegmental area (2014)

John W. Muschamp,^a,1 Jonathan A. Hollander,^b Jennifer L. Thompson,^c George Voren,^b Linda C. Hassinger,^a Sara Onvani,^a Theodore M. Kamenecka,^b Stephanie L. Borgland,^c Paul J. Kenny,^b och William A. Carlezon, Jr.^a

Författarinformation ► Upphovsrätt och licensinformation ►

Hypokretin (orexin) och dynorfin är neuromodulatorer som spelar en viktig roll för att reglera påverkan och motivationen. Orexin är kritisk för belöning och är inblandad i läkemedelssökande, medan dynorfin medierar negativ humör och är implicerad i depressiva-liknande tillstånd. Med tanke på dessa motsatta effekter rapporterar att båda peptiderna uttrycks i samma neuroner och är koreleas, är kontraintuitiva. Här visar vi att orexin och dynorfin samexpresseras inom samma synaptiska vesiklar och att denna kolokalisering har ett djupt inflytande på belöning, drogupptagning och impulsivt liknande beteende. Det faktum att orexin utesluter de depressiva liknande motstridiga effekterna av dynorfin förändrar signifikant hur vi ser den funktionella rollen som orexin i hjärnan.

Hypokretin (orexin) och dynorfin är neuropeptider med motsatta handlingar på motiverat beteende. Orexin är inblandat i upphetsningstillstånd och belöning, medan dynorfin är implicerad i depressiva tillstånd. Vi visar att dessa peptider, trots sina motsatta handlingar, förpackas i samma synaptiska vesiklar inom hypotalamusen. Störning av orexinfunktionen blunter de givande effekterna av stimulering av lateral hypothalamus (LH), eliminerar kokaininducerad impulsivitet och minskar kokain självadministration. Samtidig störning av dynorfinfunktionen reverserar dessa beteendeförändringar. Vi visar också att orexin och dynorfin har motsatta åtgärder för excitabilitet hos ventrikel-tegmental-området (VTA) -dopaminneuroner, ett framträdande mål för orexininnehållande neuroner, och att intra-VTA-orexinantagonism orsakar minskningar av kokain självadministration och LH-självstimulering som reverseras av dynorfinantagonism. Våra fynd identifierar en unik cellulär process genom vilken orexin kan utesluta belöningens tröskelhöjande effekter av coreleased dynorphin och därmed agera på ett tillåtet sätt för att underlätta belöning.

Orexin och Dynorphin är cotransmittorer.

Vi bekräftade koexression av orexin och dynorfin inom samma neuroner hos musen lateral, perifornisk och dorsomedial hypotalamus med användning av fluorescensmikroskopi (18) (Fig 1A). Förekomsten av neuroner som uttrycker multipla sändare har beskrivits i andra hjärnkretsar och kan representera den neurala grunden för filtreringsmekanismer genom vilken frisättning av samuttryckta neurotransmittorer uppträder vid differentiella avfyrningshastigheter (19). Med hjälp av EM fann vi emellertid att orexin och dynorfin är kolokaliserade inom samma synaptiska vesiklar. De flesta förekomsterna av copackaging observerades i omyelinerade axelprocesser med varicose, där immuno-märkning hittades i eller nära blåsor. Inom neuronala cellkroppar var betydande märkning associerad med Golgi-komplexet, medan ingen hittades i angränsande kärnor (Fig 1 B och C). Dendriter innehöll även vesikelassocierad märkning för båda peptiderna, vilket föreslår potentiell dendritisk frisättning av dessa sändare. Ett litet antal mikrostrukturprofiler fångade axonterminaler med märkning för båda peptiderna i stora (~100 nm) blåsor placerade utanför frisättningszonen av asymmetriska synapser (Fig 1 B och C), vilket ger stöd för slutsatsen att orexin och dynorfin fungerar som kotransmittorer och att de under normala förhållanden frisätts tillsammans i stället för differentiellt som en funktion av cellbränningsfrekvensen.

 

Fig. 1.

Orexin och dynorfin är cotransmittorer i hypotalamusens neuroner. (A, Längst till vänster) Ljusfältfotomikrografi visar området för hypotalamus undersökt för orexin (röd) och dynorfin (grön) immunreaktivitet. (A, längst till höger) Sammanslagd tvåsidig bild .

Belönings tröskel-höjande effekter av orexinblåsan reverseras av Dynorphin Blockade.

För att undersöka den funktionella betydelsen av detta unika mönster av sändaruttryck undersökte vi huruvida störningar i orexin och dynorfin signalering kan påverka komplexa beteenden som återspeglar normal och avvikande motivation. I C57BL / 6-möss som utbildats för att utföra intrakraniell självstimulering (ICSS) förstärkt med stimulering av lateral hypotalamus (LH) (20), blockering av OX₁Rs med N- (2-metyl-6-bensoxazolyl) -N "-1,5-naftyridin-4-ylkarbamid (SB334867) under ljusfasen orsakade dosberoende ökningar i belöningsgränser (Fig 2A; envägs upprepade åtgärder ANOVA för dos: F_3,12 = 4.44, P <0.02). Ökningar av ICSS-trösklar speglar behandlingsinducerad minskning av stimulansens givande effekt, ett depressivt liknande tecken som indikerar minskad känslighet för belöning (20). Denna effekt berodde inte på sedering eller andra icke-specifika beteendestörningar, eftersom ICSS-svarsfrekvenserna var opåverkade (Fig 2B; envägs upprepade åtgärder ANOVA för dos: F_3,24 = 0.33, P > 0.80).

 

Fig. 2.

Belönings tröskelhöjande effekter av orexin-blockad reverseras genom dynorfin-blockad. (A) Blockering av orexinsignaler vid OX₁R genom SB334867 (0-30 mg / kg, ip) höjer belöningsgränserna i ICSS-testet, vilket indikerar minskad belöning. Denna effekt .

Förhöjningar i belöningsgränser orsakade av SB334867 förebyggdes genom förbehandling med nor-binaltorphimin (norBNI) [tvåvägs upprepade åtgärder ANOVA för läkemedel (mellan ämnesfaktor) × Dos SB (inom ämnesfaktor) interaktion: F_3,24 = 3.98, P <0.01], som producerar långvarig blockad av dynorfinåtgärder vid KORs (10). Dessa data tyder på att förlusten av orexinsignaler avslöjar latenta, motstridiga effekter av coreleased dynorphin. Förvaltningen av norBNI ensam minskade inte belöningsgränserna. Fastän denna effekt kan relateras till den unika farmakodynamiken hos norBNI och andra prototypiska KOR-antagonister (10) kan det också indikera att det finns redundans i processer som modulerar aktiviteten hos hjärnbelöningskretsar eller att fashöjningar i orexinton ensam (obehandlad av coreleased dynorfin) är otillräckliga för att förmedla en belöningssignal från stimuleringsplatsen i lateral hypotalamus. Dessa resultat kan i början verka oförenligt med andras arbete som undersökte SB334867 på ICSS-tröskeln under den mörka fasen (21). Det finns emellertid avsevärda bevis för att minskningen av orexinfunktionen kan få konsekvenser som beror på huruvida djur testas under sin ljus- eller mörka fas. Till exempel behåller mat och vatten sina givande effekter i orexin-KO-möss när testning utförs under den mörka fasen men inte under ljusfasen (22), den tid då vi utförde alla våra beteendestest.

För att lokalisera effekterna av systemisk SB334867- och norBNI-administrering på ICSS, implanterades en separat kohort av möss med LH-stimulerande elektroder och VTA-styrkanyler. Mikroinfusion av SB334867 till VTA orsakade markanta ökningar i belöningsgränser, vilket indikerar minskad belöningskänslighet. Även om intra-VTA norBNI ensamt inte hade någon effekt på ICSS-trösklar, blockerade den tröskelhöjande effekterna av efterföljande SB334867-infusion (Fig 2C; envägs upprepade åtgärder ANOVA för läkemedel: F_3,9 = 10.98, P <0.01). Även om intrakraniella läkemedelsinfusioner tenderade att ge blygsamma minskningar av de maximala svarhastigheterna jämfört med systemiska läkemedelsinjektioner, nådde dessa effekter inte statistisk signifikans (Fig 2D; envägs upprepade åtgärder ANOVA för läkemedel: F_3,9 = 1.03, P =

Impulsivitet reglerad av Orexin och Dynorphin Transmission.

Impulsivitet präglas av underskott i undertryckandet av belöningssökande beteenden, med höga impulsivitetsnivåer som ett vanligt inslag i många psykiatriska sjukdomar (23). Narkotika av missbruk, inklusive kokain, kan också utlösa ökad impulsivitet, vilket är hypotes för att driva utvecklingen av missbruk (24). Med tanke på nyckelrollen för coreleased orexin och dynorphin för att kontrollera känsligheten för den givande effekten av LH-stimulering i ICSS-testet, antog vi att interaktioner mellan dessa två neuropeptider kan påverka baseline impulsivitet och kokaininducerad underskott i detta beteende. Impulsivitet kan kvantifieras hos gnagare genom att mäta prematura svar i 5-valet seriell reaktionstid uppgift (5-CSRTT) (25), en djurmodell som är analog med det kontinuerliga prestandatestet som används för att studera uppmärksamhet hos människor. Tidig respons i detta test tenderar att vara låg under normala förhållanden och förvärras av läkemedel som höjer DA-överföring (26). Vi använde 5-CSRTT för att undersöka bidraget från orexin-dynorfinsystemet till spontant och kokaininducerat impulsivt beteende. Vid administrering ensam reducerade SB334867 det redan låga antalet spontana prematura svar (Fig 3A; F_3,21 = 4.89, P <0.01). Dessa minskningar inträffade i avsaknad av effekter på svarsnoggrannheten (F_3,21 = 1.45, P = 0.25), pelletshämtnings latens (F_3,21 = 0.91, P = 0.44), eller antalet stimulansförsök som avslutats (F_3,21 = 1.46, P = 0.25), vilket indikerar att de inte berodde på försämrad vaksamhet eller motorisk förmåga. Administrering av norBNI reverserade emellertid SB334867s effekter vid för tidig reaktion (Fig 3B; F_3,18 = 0.45, P = 0.71), vilket tyder på att oöverträffad dynorfinöverföring är kritisk för att förmedla dessa antiimpulsiva effekter. Givet ensam eller i kombination med SB334867, producerade norBNI inga effekter på åtgärder av responsnoggrannhet (F_3,18 = 0.66, P > 0.58), latens (F_3,18 = 3.09, P > 0.06), eller antalet genomförda stimulusförsök (F_3,18 = 2.38, P > 0.10). Förbehandling med SB334867 förhindrade också den dubbla ökningen av för tidigt svar inducerad av kokain (Fig 3C; F_6,24 = 5.84, P <0.01). Dessa uppgifter ger bevis för att orexin-neurotransmission kan reglera impulsivt beteende under både baslinje- och kokainstimulerade förhållanden på ett dynorfinkänsligt sätt.

 

Fig. 3.

Impulsivitetsbeteende regleras av balans av orexin och dynorfin. (A) SB334867 dämpar prematura svar i 5-CSRTT-råttmodellen av motorimpulsivitet. Precisionsåtgärder, latens att hämta matpelleten och antalet försök utelämnade var .

Dynorphin Medier Reducerad Kokain Självförvaltning i OX₁R-Null-möss.

Sårbarhet för missbruk ökas markant i impulsiva individer, och kokaininducerad ökning av impulsivitet antas att bidra till uppkomsten av missbruk (23, 27). Dessutom har orexinöverföring och dynorfinöverföring varit oberoende involverade i reglering av de givande effekterna av kokain och andra missbruksmissbruk (28-32). Vi förutspådde att interaktioner mellan orexin och dynorfinöverföring direkt kan kontrollera drogen. För att undersöka denna möjlighet undersökte vi iv kokain självadministration i genetiskt modifierade möss som saknade OX₁Rs (OX₁R^{- / -}). Möss av denna genotyp uppvisar signifikant lägre kokain självadministration över ett brett spektrum av doser (0.1-1 mg / kg per infusion) men visar oförändrad respons för matfördelar enligt samma förstärkningstider (33), vilket tyder på att minskningar av kokainintag inte är sekundära för underskott i beteendemässig prestanda. Dessutom OX₁R^{- / -} möss visar normala satser på kokain självadministration under de cirka tre första sessionerna av kokainåtkomst men visar sedan snabbt minskningar av kokain som tar (33). Vi bekräftade denna fenotyp i en dos av 0.3 mg / kg per infusion, vilket indikerar att signalering via OX₁Rs spelar en avgörande roll för att upprätta och upprätthålla kokain självadministrationsbeteende [Fig 4; tvåvägs upprepade åtgärder ANOVA, Genotyp (mellan ämnesfaktor) × Läkemedelsbehandling (inom ämnesfaktor): F_1,12 = 12.91, P <0.01]. Precis som förbehandling med norBNI återställde normalt ICSS och impulsivt beteende hos möss som ges SB334867, återställde det också delvis kokain-självadministrering i OX₁R^{- / -} möss, vilket ger ett unikt exempel där ett beteendeunderskott producerat genom genetisk ablation i funktionen av ett neurotransmittorsystem räddas genom blockering av en annan. Dessa resultat tyder på att i OX₁R^{- / -} möss dämpar de oupplösliga åtgärderna av dynorfin de kokande egenskaperna hos kokain och därigenom minskar självförvaltningen av läkemedlet. Intressant, i OX₁R^{+ / +} (kontroll) möss, norBNI oväntat minskad kokain självadministration. En möjlig förklaring till denna effekt är att dynorfin frisläppt av nonorexinneuroner, såsom det så kallade "direkta" striatonigralmediet snygga neuroner, har motsatta effekter på kokainintag och kan faktiskt underlätta de givande effekterna av kokain. Förekomsten av två populationer av KORs med motsatta roller i kokainbelöning skulle också förklara varför norBNI endast delvis reverserade underskotten i kokainbeteendet som detekterades i OX₁RKO-möss. Alternativt reducerar KOR-antagonismen de aversiva eller stressiga effekterna av kokainavbrott (34), vilket bidrar till läkemedelsintagsmönster (17). Oavsett att dessa data tyder på att de depressiva effekterna av dynorfin råder i avsaknad av intakt orexinsignalering, vilket ger minskningar av de givande effekterna av kokain, medan effekterna av orexin underlättar de givande effekterna av kokain, förlänger deras varaktighet i frånvaro av dynorfin signalering.

 

Fig. 4.

Minskad självhantering av kokain i OX₁RKO-möss återställs med KOR-blockad. Försämring av orexinsignaler vid OX₁R genom genetisk deletion av denna receptor minskar iv självbehandling av kokain (0.3 mg / kg per infusion). Detta underskott är delvis .

Orexin och Dynorphin kan utöva balanserade motsatta effekter på excitabiliteten hos VTA DA Neurons.

Hjärnstrukturer som tar emot ingrepp från hypotalamiska orexin och dynorfin-neuroner är potentiellt utsatta för båda peptiderna och därmed utsatt för deras motsatta effekter på neuronal excitabilitet (35, 36). I vilken utsträckning effekterna av en peptid råder över den andra av den andra sannolikt beror på många faktorer, inklusive den relativa överflödet av varje peptid, livslängden i det extracellulära utrymmet och receptorexpression i olika populationer av målneuroner samt interaktioner mellan receptorerna och deras intracellulära signalmekanismer i postsynaptiska celler. Impulsivitet och kokainbelöning regleras, åtminstone delvis, av DA neuroner i VTA (26), ett framträdande mål för hypotalamiska orexininnehållande celler (37). Vidare förbättrar infusionen av orexin i VTA läkemedelssökande (6). För att bedöma de relativa bidragen från varje peptid på aktiviteten av VTA-neuroner gjorde vi elektrofysiologiska inspelningar från DA-celler i C57BL / 6-musshjärnskivor utsatta för orexin och dynorfin applicerade ensamma eller tillsammans. Som förväntat var orexin enhetligt exciterande när den applicerades separat, medan dynorfin endast producerade hämmande effekter (Fig 5 A och B; F_2,50 = 18.95, P ≤ 0.01). I populationen av DA neuroner registrerade svarade de flesta på mättande koncentrationer av båda peptiderna, fastän en liten minoritet endast var selektivt mottaglig för orexin eller dynorfin (Fig 5B). Anmärkningsvärt, när båda peptiderna applicerades på de dubbel-responsiva neuronerna (n = 10), det fanns ingen nettoeffekt på avfyringshastigheten (Fig 5Avilket antyder att de motsatta effekterna av varje peptid vid mättande koncentrationer effektivt avlägsnar varandra vid corelease. Fyra av de 10 neuronerna visade föredragen inhibering av dynorfin trots närvaron av orexin, medan en cell företrädesvis var upphetsad (> 1.5-faldig förändring) av orexin trots närvaron av dynorfin (Fig 5 A och C). Sammantaget, trots att flera celler svarade på orexin än dynorfin, hade de celler som var mottagliga för båda peptiderna ingen nettoförändring i avfyrningsfrekvensen när orexin och dynorfin sammankopplades, vilket tyder på att de motstående influenserna av varje peptid balanserades inom uppsättningen VTA DA neuroner studerade.

 

Fig. 5.

Orexin och dynorfin utövar balanserade men motsatta effekter på VTA DA neuroner. (A, Vänster) Coapplied orexin och dynorphin resulterar i ingen nettoförändring i bränningsgraden av VTA DA neuroner (n = 10). Applicerades singel, dynorfin var hämmande och orexin var excitatorisk. .

För att ytterligare klargöra de potentiella orexin-dynorfininteraktionerna inom VTA DA-neuroner som var känsliga för både orexin och dynorfin, försökte vi alternativt att öka de inhiberande effekterna av bad-applicerad dynorfin genom behandling med SB334867 (Fig. S2A; F_5,25 = 2.13, P <0.01) eller för att förbättra de excitatoriska effekterna av orexin som appliceras på badet genom behandling med norBNI (Fig. S2B; F_3,27 = 5.48, P <0.01). I båda experimenten, OX₁R- och KOR-blockaden lyckades inte producera dessa effekter, vilket tyder på att SB334867 och norBNI inte utövar effekter via icke-specifika åtgärder. Viktigare är att dessa data tyder på att tonen hos varje peptid in vitro är otillräcklig för att påverkas av användning av småmolekylantagonister som SB334867 och norBNI. Detta resultat är förenligt med tidigare arbete som indikerar att exocytos av stora peptidinnehållande vesiklar normalt endast uppträder vid högvariga bränningsfrekvenser som normalt inte är närvarande i skivberedningar (38).

För att verifiera att norBNI inte påverkade beteendet genom "off-target" -åtgärder direkt på OX₁R, vi undersökte därefter effekterna av denna antagonist på OX₁R-signalering. Specifikt använde vi en fluorometrisk bildskärmsläsare (FLIPR) -analys för att bestämma förmågan hos badapplicerad orexin A, SB334867 eller norBNI att inducera intracellulära kalciumtransienter i odlade CHO-celler som uttrycker humant OX₁Rs. Även om orexin A producerade de förväntade ökningarna av intracellulärt kalcium (EC₅₀ = 0.01 μM) och SB334867 dämpade beroende av dosen denna effekt (EC₅₀ = 0.035 μM), norBNI misslyckades med att ge några effekter på antingen baseline eller orexin A-framkallad ökning av intracellulärt kalcium. Detta föreslår att effekterna av norBNI på VTA DA neuronal fysiologi är enbart via föreslagna KOR-signalmekanismer och läkemedlet har ingen direkt effekt vid OX₁R (39) (Fig. S3 A-C).

Orexin-Dynorphin-interaktioner i VTA Reglera Kokain Självförvaltning.

Våra elektrofysiologiska studier visar att dynamiska interaktioner mellan orexin och dynorfin reglerar VTA DA-aktiviteten, och att VTA-neuroner troligen fungerar som ett nyckelunderlag för effekterna av orexin-dynorfinsystemet på motiverade beteenden. För att testa denna hypotes direkt undersökte vi effekterna av intra-VTA-infusion av SB334867 på iv-kokain självadministration hos råtta. Jämfört med intra-VTA-vehikelinfusion gav intra-VTA SB334867 en markant minskning av kokainintaget som blockerades av norBNI (Fig 6; envägs ANOVA: F_3,24 = 11.56, P <0.01), vilket tyder på att oöverträffade dynorfinåtgärder inom detta hjärnområde försvagar kokainbelöningen. Dessa resultat verkar vara i strid med de som har visat frånvaron av intra-VTA SB334867 vid kokain-självadministrering i förstärkningsscheman med lågt ansträngningsförhållande 1 (FR1) (40). Flera rapporter har emellertid visat att SB334867 är effektivare när det gäller att minska antalet droger (2, 33). Eftersom råttor i detta experiment utförde ett högre ansträngning FR5 schema, är de föreliggande resultaten förenliga med denna litteratur. Dessa data ger direkt bevis för att den motsatta naturen av orexin och dynorfin på VTA DA neuronal fysiologi kan utöva betydande effekter på belöningsdrivet beteende.

 

Fig. 6.

Orexin-dynorfin-interaktioner i VTA medierar läkemedelsupptagning. Kokain självadministration minskar med intra-VTA SB334867 (3 μg per sida), medan denna effekt reverseras genom förbehandling med norBNI (10 mg / kg, ip) (n = 9). ***P < .

Djur.

De vuxna manliga C57BL / 6J mössen (8 wk i ålder, Jackson Laboratory) som användes i EM-experiment, grupphushades (tre till fem per bur); de som användes för ICSS hölls ensamma efter operationen. Vuxna manliga (350 g) Sprague-Dawley-råttor (Charles River Laboratories) användes i experimenterna 5-CSRTT och kokain och administrerades i grupper om fyra. De vuxna manliga C57BL / 6J mössen (postnatala dagar 19-21) som användes för elektrofysiologiska experimenten var grupphushållna (tre till fem per bur). OX1^{- / -} möss och deras OX1^{+ / +} littermates (6 wk av ålder) som användes för självadministrationsstudierna erhölls från Jackson Laboratory och backkrossades mer än sju generationer till C57BL / 6-möss. Dessa möss var grupphus (två per bur). Alla djur hölls under temperaturstyrda betingelser på en 12-h ljus / mörk cykel, och beteendestestning inträffade 4-5 h i ljuscykeln; mat och vatten var tillgängliga ad libitum om inte annat anges. Procedurer utfördes i enlighet med National Institutes of Health Guide till vård och användning av laboratoriedjur (50) och godkändes av institutionella djurvård och användning kommittéer i McLean Hospital, University of British Columbia, och Scripps Florida.

Immunohistokemi och mikroskopi.

Fluorescens och silverförstärkt guldimmunmabellering för orexin A eller prodynorfin utfördes på alternativa mushjernsektioner enligt tidigare rapporterade förfaranden (51) och bearbetas enligt standard EM-protokoll. Nonoverlappande regioner av immunomärkt vävnad valdes sedan slumpmässigt och fotograferades för kvantifiering av partiklar med hjälp av ImageJ-programvara (National Institutes of Health) (SI-material och metoder, immunhistokemi och mikroskopi).

Elektrofysiologi.

Patchpipetter (3-5 MΩ) fylldes med 143 mM kaliumglukonat, 10 mM Hepes, 0.2 mM EGTA, 2 mM MgATP, 0.3 mM NaGTP (med ett pH av 7.2) och 270-280 mM mOsmol. Data förvärvades vid 20 kHz och filtrerades vid 2 kHz med användning av pClamp 10.0-mjukvara (Molecular Devices). Efter att ha fått en helcells konfiguration spänns cellerna vid -70 mV och en serie spänningssteg (250 ms, från -60 till -130 mV i 10-mV-steg) applicerades för att detektera hyperpolariserande (I_h) strömmar. I_h bestämdes som strömförändringen mellan ~30 ms och 248 ms efter det att spänningssteget applicerades. Intrinsisk aktivitet hos VTA DA-neuroner mättes i strömklämma. Experimenten började när en stabil baslinjespyrningsgrad uppnåddes; substrat applicerades därefter för 5 min och tvättades därefter ut med artificiell cerebrospinalvätska. Den sista 3-minen i varje 5-min-segment användes för dataanalys. Dynorphin A (1-17; 200 nM) och orexin A (100 nM) erhölls från amerikansk peptid och löstes i destillerat vatten. Dessa koncentrationer har tidigare visat sig utöva mättnadseffekter på VTA-cellaktivitet (5, 52). Thiorphan (1 ^ M) och bestatin (10 ^ M) erhölls från Sigma-Aldrich, löst i destillerat vatten och applicerades tillsammans med dynorfin A (SI Material och Metoder, Elektrofysiologi).

FLIPR-analys.

OX₁R-aktivitet bedömdes genom mätning av intracellulära kalciumnivåer genom FLIPR-analys såsom beskrivits tidigare (53) (SI Material och Metoder, Fluorometrisk Imaging Plate Reader Analys).

ICSS.

Möss implanterades med monopolära stimulerande elektroder eller kanyler (PlasticsOne) under ketamin / xylazin (80 respektive 10 mg / kg, ip; Sigma) riktade stereotaktiskt till LH (18) och / eller kontralaterala VTA [från bregma: anteroposterior (AP), -3.2 mm; mediolateral (ML), -0.5 mm; dorsoventral (DV), -4.7 mm från dura]. Efter en 7-d-återhämtningsperiod utbildades möss för att svara på hjärnstimulering såsom beskrivits tidigare (18). Den lägsta frekvensen som stöddes svarande (tröskelvärde) beräknades med hjälp av minsta kvadrater med den bästa analysen. När möss uppfyllde stabilitetskriterier för ICSS-tröskelvärden (± 10% över 5 på varandra följande dagar) uppmättes effekter av läkemedelsbehandlingar. SB334867 (Scripps Florida) eller DMSO-vehikeln gavs på alternativa dagar med hjälp av en Hamilton-spruta (0.1 mL / kg ip) och tröskelvärden kvantifierades omedelbart i 15-min test sessioner. NorBNI (10 mg / kg ip; Sigma) gavs i saltlösning (10 mL / kg) 48 h före starten av ICSS-testningen.

5-CSRTT.

Råttor var livsmedelsbegränsade (till 85% av fodervikt) och utbildades i datorstyrda operativa kamrar inrymda inuti ventilerade ljuddämpande skåp (Med Associates) och 5-CSRTT-procedurer utförda enligt beskrivningen (25). SB334867 (i DMSO, 0.1 mL / kg) och / eller kokain (i saltlösning, 1 mL / kg; Sigma) gavs med ip-injektion 10 min före testning, som i andra experiment och norBNI gavs minst 48 h före teststart (SI-material och metoder, Den 5-Val Serie Reaction Time Task).

IV Kokain Självförvaltning.

Råttor och möss bedövades med en isofluran (1-3% vol / vol) syrgasångblandning och framställdes kirurgiskt med Silastic (VWR Scientific) katetrar i halsen i enlighet med etablerade förfaranden (54). Omedelbart efter implantering av kateter i råttorna implanterades bilaterala rostfria stålkanyler (23 gauge, 17 mm långa) i VTA (från bregma: AP, 5.3 mm; ML, ± 0.7 mm; DV, -7.5 mm från dura ). Testning med SB334867 eller norBNI under 60 minuter dagliga sessioner utfördes efter att stabilt kokainintag uppnåddes (<20% variation i svar under tre på varandra följande dagar; SI Material och Metoder, IV Kokain Självförvaltning).

Statistik.

Data uttrycks som medelvärde ± SEM. För ICSS-experiment användes tvåvägsrepeterande åtgärder ANOVA för att jämföra medel mellan SB334867-behandlade och norBNI + SB334867-behandlade betingelser. Envägs upprepade åtgärder ANOVA med Newman-Keuls post hoc-tester användes för att jämföra medel inom SB334867- och norBNI + SB334867-förhållandena. Envägsrepeterade åtgärder ANOVA och Newman-Keuls-tester användes också för att jämföra medel i alla 5CSRTT-experiment. Tvåvägs upprepade åtgärder ANOVA användes för att jämföra medel mellan behandlingsgrupper i kokain självadministrationsexperiment med OX₁RKO-möss. Envägsrepeterade åtgärder ANOVA- och Newman-Keuls-tester användes för att jämföra genomsnittliga svar på orexin och dynorfin genom VTA DA-neuroner. Envägsrepeterade åtgärder ANOVA- och Newman-Keuls-tester användes också för att jämföra medel för kokainintag hos råttor behandlade med SB334867 och norBNI. Skillnader betraktades som betydande om P <0.05.

Vi tackar Dr. Garrett Fitzmaurice för användbara kommentarer på manuskriptet och Miranda S. Gallo och Melissa Chen för hjälp i datainsamling. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health Grants F32-DA026250 och K99-DA031767 (till JWM), F32-DA024932 och K99-DA031222 (till JAH), R01-DA023915 (till. PJK) och R01-MH063266 (till WAC ) och av ett forskningsbidrag för naturvetenskapliga och tekniska forskningsråd (till SLB).

Intresset om intressekonflikt: WAC har patent (US Patent 6,528,518; Assignee: McLean Hospital) relaterat till användningen av kappa-opioidantagonister för behandling av depressiva störningar. Alla andra författare förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.

Denna artikel är en PNAS Direct Submission.

Se kommentar på sidan 5765.

Den här artikeln innehåller stödinformation online på www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1315542111/-/DCSupplemental.