PMCID: PMC2820240
NIHMSID: NIHMS174679
சுருக்கம்
மரபணு வெளிப்பாடுகளில் கோகோயின் தூண்டப்பட்ட மாற்றங்கள் கோகோயின் போதைக்கு அடிபணிவதாக இருக்கும் நரம்பியல் உருவகம் மற்றும் நடத்தையில் மாற்றங்கள் ஏற்படுகின்றன. கோகோயின் தூண்டுதலான கட்டமைப்பு மற்றும் நடத்தை வளைந்து கொடுக்கும் தன்மை உள்ள எக்ஸ்ஸன் லைசின் எக்ஸ்எம்எல் லைசின் (H3K9) டிமெத்திலேசன் மற்றும் லைசின் டிமிதில் டிரான்ஸ்ஃபரேஸ் G3a ஆகியவற்றிற்கான முக்கிய பங்கை நாங்கள் அடையாளம் கண்டோம். மீண்டும் மீண்டும் கோகோயின் நிர்வாகம் நியூக்ளியஸ் அக்யூபன்களில் H9K9 டிமெத்திலேசனின் உலகளாவிய அளவைக் குறைத்தது. டிஇந்த மூளை மண்டலத்தில் G9A இன் அடக்குமுறை மூலம் ஹிஸ்டோன் மெத்திலேஷஸில் உள்ள அவரது குறைப்பு, கோகோயின் தூண்டிய படியெடுத்தல் காரணி ΔFosB கட்டுப்படுத்தப்பட்டது. நிபந்தனை மரபணு மாற்றம் மற்றும் வைரஸ்-சார்ந்த மரபணு பரிமாற்றத்தைப் பயன்படுத்தி நாம் கண்டறிந்ததைக் கண்டறிந்தோம், கோக்யினுக்கு அணுவின் நரம்புகள் மற்றும் மேம்பட்ட விருப்பம் ஆகியவற்றைக் கண்டறிந்து, கோகோயின் நீண்ட கால நடவடிக்கைகளில் ஹிஸ்டோன் மெத்திலேஷன் ஒரு முக்கியமான பாத்திரத்தை உருவாக்குகிறது.
அறிமுகம்
மீண்டும் மீண்டும் கோகோயின் வெளிப்பாடு மரபணு வெளிப்பாடு மற்றும் மூளையின் வெகுசன சுற்றுச்சூழல் ஒரு முக்கிய கூறு, நியூக்ளியஸ் accumbens (NAc) உள்ள மாற்றப்பட்ட நரம்பியல் உருமாற்றத்தின் மூலம் தொடர்ந்து மாற்றங்கள் வகைப்படுத்தப்படும் (1-2). கோகோயின் அடிமையாக்கத்தின் அம்சங்களைக் கொண்டிருக்கும் இந்த மூளையின் பகுதியில் உள்ள ஒழுங்கற்ற டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனல் மாற்றங்களில் குரோமடின் மறு வடிவமைப்பு முக்கியம் (3-9). குரோமடின் கட்டமைப்பின் கோகோயின் ஒழுங்குமுறை, NAC இன் விளைவாக, கோகோமைன் என்சைமிக் இயந்திரத்தின் நேரடி கோகோயின் தூண்டுதலின் மாற்றங்களிலிருந்து, ஹிஸ்டோன் அசிடைலேஷன் மற்றும் பாஸ்போரிலேசன் (4, 7-9); இருப்பினும், ஹிஸ்டோன் மெத்திலேஷன் கட்டுப்படுத்தும் என்சைம்களைப் பாத்திரங்கள் இன்னும் ஆராயப்படவில்லை.
க்ரோமடின் தடுப்பாற்றலைப் பயன்படுத்தி சமீபத்திய மரபணு பரவலான புரோட்டோட்டர் பகுப்பாய்வு நுண்ணுயிரைக்களுடன் (சிஐபி-சிப்) இணைந்திருக்கிறது. மீண்டும் மீண்டும் கோகோயின் சிகிச்சையில் NAC இல் குறிப்பிட்ட மரபணு விளம்பரதாரர்களில் ஒடுக்கப்பட்ட ஹிஸ்டோன் H3 லைசின் XXX (H9K3) மற்றும் 9 (H27K3)6). எனவே, H3K9 அல்லது H3K27 மெத்திலேஷன் கட்டுப்படுத்த அறியப்பட்ட பல லைசின் மெதில்ட்ரான்ஸ்பெரேசேஸ் (KMT கள்) மற்றும் டெமேடிலைஸ் (KDM கள்)படம்). இரண்டு என்சைம்கள், ஜிஎக்ஸ்எஎஎஎஎஎஎஎஎஎஎஎஎஎஎஎஎஎஎ மற்றும் ஜி.எல்.பி., மீண்டும் மீண்டும் கோகோயின் நிர்வாகத்திற்குப் பிறகு, தொடர்ச்சியான டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் ரெகுலேஷன் 9 மணிநேரங்களைக் காட்டின. இரண்டு மரபணுக்களின் வெளிப்பாடு கணிசமாக கீழ்நிலைப்படுத்தப்பட்டது. G9A மற்றும் GLP குறிப்பாக H3K9 (H3K9MXXX) என்ற டைமெயிலேஷனை வினையூக்கியுள்ளதால், கோகோயின் மூலம் அவை குறைத்து மதிப்பிடுவது, இந்த நேரத்தின் போது H2K3 எக்ஸ்எம்எக்ஸ்எக்ஸின் குறைவான உலகளாவிய அளவைக் கொண்டிருக்கும்.படம்). இதற்கு நேர்மாறாக, உலகளாவிய அளவில் ஹெக்டொக்ரோமிராமிக் H3K27 மெத்திலேஷன் மீண்டும் கோகோயின் வெளிப்பாட்டால்ஆன்லைனில் உள்ள பொருட்களை ஆதரிப்பதில் S1). அதன் உயர்ந்த அளவிலான வினையூக்கி நடவடிக்கை காரணமாக ஆய்வுக்கூட சோதனை முறையில் மற்றும் விவோவில் (10), நாம் NAC மீண்டும் மீண்டும் கோகோயின் வெளிப்பாடு தொடர்ந்து G9a அடக்குமுறை செயல்பாட்டு முக்கியத்துவம் விசாரிக்க வெளியே அமைக்க. அதன் mRNA அளவுகளைப் போன்ற G9A புரதத்தின் அளவுகள் கணிசமான அளவு கோகோயின் நிர்வாகத்திற்குப் பிறகு,படம்). G9A mRNA வெளிப்பாடு NAc இல் 35% குறைக்கப்பட்டது என்றாலும், தடுப்பாற்றல் தடுப்பு ஆய்வுகள் G15a புரத அளவுகளில் மிகச் சாதாரணமான 9% குறைப்பைக் கண்டறிந்தது, தொடர்ந்து கோகோயின் நிர்வாகத்திற்குப் பிறகு XXXXXXXXXXXX இல் காணப்பட்ட 21% குறைவுபடம்). கோகோயின் திரும்பத் திரும்ப சுய-நிர்வாகம் தொடர்ந்து வந்த பிறகு, இந்த மூளை மண்டலத்தில், G9A mRNA வெளிப்பாடு,படம்).
NHC இல் உள்ள மரபணு வெளிப்பாட்டில் மரபணு அளவிலான மாற்றங்கள் கொண்ட எக்சிரமடிக் H3K9 எக்ஸ்எம்என்எல்எல் மாதிரியான மாற்றங்களை அடையாளம் காண, முன்னர் கோகோயின் வெளிப்பாட்டின் வரலாறு அல்லது இல்லாமல் விலங்குகளில் கோகோயின் ஒரு சவாலாகும் டோக்கீயின் மரபணு வெளிப்பாட்டு சுயவிவரங்களை ஆய்வு செய்ய மைக்ரோரேரே பகுப்பாய்வுகளை நாங்கள் பயன்படுத்துகிறோம். மரபணு பட்டியல்கள் அட்டவணைகள் S1-S3). திரும்ப திரும்ப கோகோயின் பெற்ற விலங்குகள் காட்டுமிராண்டித்தனமான விலங்குகளை ஒப்பிடுகையில் கோகோயின் சவாலுக்குப் பிறகு,படம்). இந்த அதிகரித்த மரபணு வெளிப்பாடு மீண்டும் கோகோயின் திரும்பப் பெறும் வாரம் வாரத்திற்கு பிறகு கொடுக்கப்பட்ட கோகோயின் சவாலுக்கு பதிலளித்தது. முந்தைய அறிக்கைகளுடன் தொடர்ந்து, ஒரு சிறிய சதவீத மரபணுக்கள் (~ 1%) மீண்டும் மீண்டும் கோகோயின் நிர்வாகத்திற்குப் பிறகு,படம்; பார்க்க அட்டவணை S1) (5). மீண்டும் மீண்டும் கோகோயின் பிறகு அதிகரித்த மரபணு வெளிப்பாட்டில் G9a downregulation பங்கு நேரடியாக விசாரிக்க, எலிகள் GFP அல்லது ஜிஎக்ஸ்எஎஎன்ஏ அல்லது வெளிப்படையான ஹெர்பெஸ் சிம்ப்ளக்ஸ் வைரஸ் (ஹெச்எஸ்வி) வெக்டாரின் இன்ரா-என்.சி. மீண்டும் கோகோயின் தூண்டப்பட்ட மரபணு வெளிப்பாட்டைத் தடுக்க போதுமானது. தொடர்ச்சியான கோகோயின் தொடர்ந்து வெளிப்படையான வெளிப்பாட்டைக் காண்பிக்கும் XENX தோராயமாக தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட மரபணுக்களின் தொகுப்பிலிருந்து, இந்த மரபணுக்களில் உள்ள 9% இன் அதிகரித்த வெளிப்பாட்டை G9A கணிசமாகக் குறைத்துள்ளதை நாங்கள் கவனித்தோம் (அட்டவணை S4).
G9A வெளிப்பாடு மீண்டும் மீண்டும் கோகோயின் தூண்டப்பட்ட அடக்குமுறையை இடைநிறுத்துவதற்கான அப்ஸ்ட்ரீம் படியெடுத்தல் நிகழ்வுகள் அடையாளம் காண, ΔFosB க்கு ஒரு சாத்தியமான பாத்திரத்தை ஆய்வு செய்தோம், இது உடனடியாக ஆரம்பகால மரபணுக்களின் fosB. கோகோயின் மீண்டும் மீண்டும் வெளிப்படுத்திய பின்னர், டி.சி.எஃப்.சி. என்.ஏ.சி இல் குவிந்துள்ளது, இது அதிகரித்த கோகோயின் வெகுமதிக்கு இணைக்கப்பட்டுள்ளது11). ΔFOSB என்பது இலக்கு டிரான்ஸைப் பொறுத்து ஒரு டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் செயலி அல்லது ஒடுக்கியாக செயல்பட முடியும் (3, 5, 6, 12). பிட்ரான்ஸ்ஜெனிக் என்எஸ்இ-TTA × tetOP-ΔFosB எலிகள், இதில் ΔFosB வெளிப்பாடு NAC மற்றும் வயது முதிர்ந்த விலங்குகளின் பிரித்தெடுத்தல் (13), நாங்கள் NACD இல் H3K9MXXXXXXXXXXXXXXXXXX மற்றும் KMT க்கள் கோகைன் கட்டுப்பாடு மீது ΔFosB வெளிப்பாடு தாக்கத்தை ஆய்வு செய்தோம். ΔFosB அதிகப்படியான அளவுகோல் H2X3XXXXXXX இன் இரண்டு அளவுகளை குறைக்க போதுமானதாக இருந்தது (படம். 1D) மற்றும் G9A வெளிப்பாடு (படம்), இதனால் மீண்டும் மீண்டும் கோகோயின் விளைவுகளை பின்பற்றுவதாகும். இதற்கு மாறாக, ΔFosB இந்த மூளை பகுதியில் ஜிஎல்பி வெளிப்பாட்டை குறைக்கவில்லை, மேலும் முறையே H39XXX மற்றும் H1K2 க்காக முக்கிய ட்ரிமிதிலைட்டிங் என்சைம்கள் SUV3H9 மற்றும் EZH3 ஆகியவற்றில் எந்த விளைவும் இல்லைபடம்). ஒரு சுயாதீன ΔFosB அதிகப்படியான ஆக்ஸிஜனேற்ற முறையைப் பயன்படுத்தி இந்தத் தரவை உறுதிப்படுத்த, காட்டுமிராண்டித்தனமான வயது வந்தோர் எலிகள், GFP அல்லது ΔFosB ஐ வெளிப்படுத்தும் ஏடெனோ-தொடர்புடைய வைரஸ் (ஏஏவி) வெக்டார்ட்ட்களின் இருதரப்பு உள்ளுறை-என்.சி. ΔFosB இன் வைரல்-மத்தியஸ்தம் அதிகரித்த அளவில் இந்த மூளை மண்டலத்தில் G9A வெளிப்பாடு குறைந்துவிட்டது (படம்).
G9A இன் இத்தகைய உச்சரிப்பு மற்றும் குறிப்பிட்ட கட்டுப்பாடு, NAC நியூரான்களில் குறிப்பாக G9A வெளிப்பாடு மாற்றுவதை கோகோயின் நடத்தை ரீதியான பதில்களை ஒழுங்குபடுத்துகிறது என்பதை விசாரிக்க எங்களுக்குத் தூண்டியது. வைல்டு டைப் எலஸ் GHP அல்லது G9A ஐ வெளிப்படுத்தி HSV வெக்டாரின் இன்ரா-என்.சி.சிங்ஸைப் பெற்றது, பின்னர் ஒரு முறைகேடான கோகோயின் உட்கிரகிக்கப்பட்ட இட முன்னுரிமையைப் பயன்படுத்தி ஆய்வு செய்யப்பட்டது, இது ஒரு மறைமுக அளவிலான மருந்து வெகுமதியை வழங்குகிறது. NAc நியூரான்களில் G9A வைரல் பரவலானது நடத்தை சோதனைக்கு பிறகு உறுதி செய்யப்பட்டது (படம்). G9A அதிகப்படியான அதிகப்படியான விலங்குகளை ஒப்பிடுகையில் கோகோயின் விருப்பம் கணிசமாக குறைந்தது GFPபடம்), மற்றும் NAC இல் அதிகரித்த H3X9XXXXX அளவு (படம்). G9A (G9AH1093) இன் வினையுடனான பிறழ்ந்த மியூச்சுவேட்டின் மிகப்பெரிய அதிர்வு14) கோகோயின் விருப்பத்தை பாதிக்கவில்லை (படம்) மற்றும் மூளை மண்டலத்தில் H3X9XXXX அளவுகளை பாதிக்காது (படம்).
கோகோயின் நடத்தை விளைவுகளில் G9A பாத்திரத்தை மேலும் படிக்க மேலும் மேலும் குறிப்பாக NAAC உள்ள G9A வெளிப்பாடு மீண்டும் மீண்டும் கோகோயின் தூண்டப்பட்ட அடக்குமுறையை பிரதிபலிக்கும் வகையில், வயது வந்தோர் G9FL / FL எலிகள்14) AA காசோலைகளை Intra-NACD ஊடுருவல்கள் பெற்றது. NAAC இல் G9A இன் AAV-Cre knockdown, இது தடுப்பாற்றலால் உறுதிப்படுத்தப்பட்டது (படம்), கணிசமாக இடத்தில் கண்டிஷனிங் சோதனைகள் கோகோயின் விளைவுகளை அதிகரித்தது மற்றும் NAC உள்ள குறைந்து H3X9XXXXX (படம். 2D, E). G9A மற்றும் GLP இன் வர்த்தக ரீதியாக கிடைக்கக்கூடிய மருந்தியல் தடுப்பானாக, BIX01294 (15-16), நொதி தடுப்புத்திறன் இதேபோல் கோகோயின் நடத்தை ரீதியான பதில்களை பாதிக்கும் என்பதை அறிய பயன்படுத்தப்பட்டது. உண்மையில், G9A மற்றும் GLP மருந்தியல் தடுப்பு கணிசமாக கோகோயின் அதிகரிப்பை அதிகரித்தது மற்றும் NAC இல் H3X9XXXX குறைக்கப்பட்டது (படம். 2F, ஜி).
கோகோயின் மீண்டும் மீண்டும் நிர்வாகம் NAc நடுத்தர ஸ்பைனி நியூரான்கள் மீது dendritic முதுகெலும்புகளின் அடர்த்தி அதிகரிக்கிறது (17), இந்த நரம்பணுக்களில் உற்சாகம் குளுட்டமடகெகிஜிக் ஒத்திசைவுகளில் செயல்பாட்டு மாற்றங்களுடன் தொடர்புடைய ஒரு செயல்முறை (18-19) மற்றும் போதை பழக்கவழக்கங்களின் உணர்ச்சிகளை உணர்திறன் (17, 20). NAAC இல் உள்ள G9A செயல்பாட்டின் கீழ்பகுதி மீண்டும் மீண்டும் கோகோயினைக் குறைத்து மதிப்பிடுவதால், NAC நியூரான்களின் dendritic முதுகெலும்பு அடர்த்தியை கட்டுப்படுத்துவதற்கான கோகோயின் திறனைத் தணிக்கும் என்று நாங்கள் கருதுகிறோம். குரோமடின் தடுப்பாற்றலுக்கான (சிஐபி) ஒரு ஜி -என்என்எக்ஸ்எக்ஸ் ஆன்டிபாடி மூலம், நாங்கள் NAC இல் பல உள்ளார்ந்த G9A மரபணு இலக்குகளை அடையாளம் கண்டோம், இவை ஒவ்வொன்றும் கோகோயின் தூண்டப்பட்ட dendritic plasticityபடம்) (20-26). மீண்டும் மீண்டும் கோகோயின் நிர்வாகம் கணிசமாக குறைந்து போனது என்று கண்டறிந்தது, அதேபோல் H9X3XXXX, இந்த மரபணு விளம்பரதாரர்கள் (படம்). இதற்கு மாறாக, கடுமையான கோகோயின் நிர்வாகம், G9A ஐ இந்த ஒரே மரபணு ஊக்குவிப்பாளர்களுக்கு விரைவில் நியமனம் செய்தது, கோகோயின் ஒரு கடுமையான டோஸின் பின்னர் NAC 9 இல் காணப்பட்ட அதிகரித்த G1A வெளிப்பாடுடன் இணையும்படம்). குறிப்பிட்ட மரபணு விளம்பரதாரர்களில் G9A பிணைப்பு அதன் வெளிப்பாட்டில் மாற்றங்களுடன் தொடர்புபடுத்தப்பட்டாலும், இது போன்ற நிகழ்ச்சிகள் NAC மற்றும் / அல்லது G9a ஆட்சேர்ப்பில் உள்ள வேறுபாடுகளால் மாற்றப்பட்ட G9A இன் உலகளாவிய அளவுகள் எதிராக மீண்டும் கோகோயின் நிர்வாகம்.
NAC இல் உள்ள பல நுண்ணுயிர் தொடர்பான மரபணுக்களின் G9A கட்டுப்பாட்டின் அடிப்படையில், கோகோயின் தூண்டுதல் முதுகெலும்பு உருவாவதைத் தடுக்க மீண்டும் மீண்டும் கோகோயின் சிகிச்சையைத் தொடர்ந்து இந்த மூளை மண்டலத்தில் G9A வெளிப்பாடு பராமரிப்பதை நேரடியாக ஆய்வு செய்தோம். ஒரு கோகோயின் சிகிச்சை நெறிமுறையைப் பயன்படுத்தி முன்னர் NAc இல் dendritic spine தூண்டுதலை ஊக்கப்படுத்தியது20), நாங்கள் HSV-GFP அல்லது HSV-G9A மூலம் உட்செலுத்தப்பட்ட விலங்குகளில் முதுகெலும்பு அடர்த்தி ஆய்வு செய்தோம். முந்தைய கண்டுபிடிப்புகள் உடன்பாட்டில், நாம் NAC பின்வரும் கோகோயின் சிகிச்சையில் dendritic முதுகெலும்பு அடர்த்தி குறிப்பிடத்தக்க அதிகரிப்பு கண்டது, G9a overexpression முற்றிலும் தடை என்று ஒரு விளைவு (படம்). கோகோயின் இல்லாத நிலையில் என்.சி. டென்டிரிடிக் முதுகெலும்பு அடர்த்தியை குறைக்க போதிய அளவு மட்டும் இல்லை. இந்த தரவை பூர்த்தி செய்ய, G9FL / FL எச்.சி.வி-க்ரை மற்றும் முதுகெலும்பு அடர்த்தியின் இன்ரா-என்.சி. ஊசி பெறும் எலிகள் அளவீடு செய்யப்பட்டு, கோகோயின் இல்லாத நிலையில் HSV-GFP பெற்ற விலங்குகளுடன் ஒப்பிடப்பட்டது. ஜிஎக்ஸ்எஎஎஎஎஎஎஎஎஎக்ஸ்ஏவின் வெளிச்செடிவு கணிசமாக NAc நடுத்தர ஸ்பைனி நியூரான்களின் மீது முதுகெலும்பு அடர்த்தி அதிகரித்துள்ளது (படம்).
மீண்டும் மீண்டும் கோகோயின் பிறகு NAC உள்ள G9a downregulation ΔFosB மூலம் மத்தியஸ்தம் என்று சான்றுகள், நாம் இந்த டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் காரணி இதேபோல் NAC dendritic தண்டை regulation உள்ள ஈடுபாடு என்பதை ஆய்வு. ΔFOSB முன்னர் அத்தகைய dendritic plasticity காரணமாக இணைக்கப்படவில்லை என்றாலும், அதன் இலக்குகள் பல, Cdk5 மற்றும் NFKB உபகுணங்கள் உட்பட, (20-23), மற்றும் NAC நியூரான்களில் ΔFosB யின் தொடர்ச்சியான வெளிப்பாடு தொடர்ச்சியான கோகோயின் சிகிச்சையின் பின்னர் அதிகரித்த dendritic முதுகெலும்பு அடர்த்தி (27). முதலாவதாக, கோகோயின் இல்லாத பிட்ரான்ஜெனிக் எலியில் ΔFosB இன் தூண்டுதல், இது கண்டறிந்த G9A மற்றும் H3K9XXXXX வெளிப்பாடு (படம். 1D, E), G9A ஆனது பல நுண்ணுயிர் தொடர்பான மரபணுக்களுக்கு பிணைப்பு குறைக்கப்பட்டது, அவற்றில் பலவும் ΔFosB இன் நேரடி இலக்குகளாகவும் காட்டப்பட்டுள்ளன (படம். 3D) (3, 6). என்.சி.யில் உள்ள ΔFosB இன் வைரஸ் பரவலானது basal நிலைமைகளின் கீழ் dendritic முதுகெலும்பு அடர்த்தியை கணிசமாக அதிகரித்துள்ளது என்று அடுத்ததாக, இதேபோல் கோகோயின் நிர்வாகத்தின் தொடர்ச்சியான பின்பும்படம்). மாறாக, ΔJunD இன் NAC இல் மிக அதிகமான அளவில், ΔFosB டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் செயல்பாட்டை எதிர்க்கும் ஒரு மேலாதிக்க எதிர்மறையான மாற்றமடைந்த புரோட்டீன், NAC இல் dendritic spine formation ஐ அதிகரிக்க மீண்டும் மீண்டும் கோகோயின் திறனை தடுக்கிறது (படம்).
ΔFosB ஆனது NAC இல் G9A வெளிப்பாட்டை ஒழுங்குபடுத்துகிறது, மற்றும் ΔFosB மற்றும் G9A ஆகியவை அதே இலக்கு மரபணுக்களில் சிலவற்றை ஒழுங்குபடுத்துகின்றன, மேலும் ΔFosB மற்றும் G9A க்கும் இடையேயான மற்ற இடைவினைகளை ஆய்வு செய்ய எங்களுக்கு உதவியது. கடுமையான கோகோயின் பிறகு, G9a அளவுகள் அதிகரித்தபோது, G9A இன் பிணைப்பு fosB G9A வெளிப்பாடு நசுக்கப்பட்டபோது மீண்டும் கோகோயின் பிறகு, மரபணு அதிகரித்தது, G9A fosB மரபணு குறைந்துவிட்டது (படம்). திரும்ப திரும்ப கோகோயின் பிறகு அத்தகைய குறைவான G9a பிணைப்பு காணப்படவில்லை இ-Fos, G9A பிணைப்பு மீண்டும் கோகோயின் மூலம் அதிகரிக்கப்படுகிறது (படம்). இது போலல்லாமல், இது உண்மையாக உள்ளது fosB, இ-Fos நாள்பட்ட மனோலிமாமினேட் வெளிப்பாடு மூலம் தூண்டப்படுகிறது, தூண்டப்படுகிறது5). பிட்ரான்ஜெனிசிக் எலிகளில் ΔFOSB அதிகப்படியான அளவு அதிகரித்தது, கணிசமாக குறைக்க G9A பிணைப்பு fosb மரபணு (படம். 3D). மேலும் கோகோயின் நிர்வாகம் தொடர்ந்து அதிகரித்த ΔFosB வெளிப்பாட்டைக் குறைப்பதற்காக அதிகபட்சமாக அதிகமான அளவு அதிகரித்தது (அட்டவணை S4). இந்த தரவு ஒரு autoregulatory சுழற்சியை பரிந்துரைக்கிறது, இதன் விளைவாக G9a தீவிரமாக கோகோயின் நிர்வாகத்தால் ΔFosB இன் தூண்டலை கட்டுப்படுத்துகிறது. எனினும், ΔFosB மீண்டும் போதை மருந்து வெளிப்பாடுடன் இணைந்தால், இது G9A ஐ மீண்டும் ஒடுக்குகிறது, மேலும் அதனுடைய கூடுதலான தூண்டுதலை அதிகரிக்கிறது.
முடிவில், நாக்கிலுள்ள ஹிஸ்டோன் லைசைன் மெத்திலேஷன் கோகோயின் காரணமாக நியூரான்களின் மரபணு வெளிப்பாட்டை கட்டுப்படுத்துவதில் விமர்சனமாக ஈடுபட்டுள்ளது என்பதை நிரூபித்துள்ளோம். G9A மற்றும் H3K9M2 இன் தொடர்ச்சியான கோகோயின் நிர்வாகத்தின் அடக்குமுறை கோகோயின் முன்னுரிமையை மேம்படுத்துகிறது, பகுதியாக, பல்வகைப்பட்ட மரபணுக்களின் ஒழுங்கற்ற வடிவங்களை ஒழுங்குபடுத்தும் எண்ணற்ற மரபணுக்களின் படியெடுத்தல் செயல்பாட்டின் மூலம். இத்தகைய வழிமுறைகளால் ஒழுங்குபடுத்தப்பட்ட மரபணுக்களை நன்கு புரிந்து கொள்வதன் மூலம், போதைப் பழக்கத்தின் சிக்கலான உயிரியல் அடிப்படையைப் பற்றிய நமது அறிவை மேம்படுத்துவதோடு போதைப் பொருள் சீர்குலைவுகளின் மிகவும் பயனுள்ள சிகிச்சையின் வளர்ச்சியில் உதவலாம்.
பொருட்கள் மற்றும் முறைகள்
விலங்குகள் மற்றும் சிகிச்சைகள்
வேறுவிதமாக கூறாவிட்டால், எக்ஸ் ஒரு மணி நேரத்திற்கு நான்கு முதல் ஐந்து கூண்டுகளில் ஒரு காலனிக்குள் ஒரு மணிநேரமும், ஒரு மணிநேரமும் இருண்ட / இருண்ட சுழற்சியை (12: வெள்ளி முதல் வெள்ளி வரை: 9-10 ° C வரை) விளம்பரம் இலவசம் தண்ணீர் மற்றும் உணவு அணுகல். அனைத்து விலங்கு நெறிமுறைகளும் IATUC ஐ UT தென்மேற்கு மருத்துவ மையம் மற்றும் மவுண்ட் சினாய் மெடிக்கல் மெடிக்கல் ஆகியவற்றில் அங்கீகரிக்கப்பட்டது.
கோகோயின் சோதனைகள் [தடுப்பாற்றலுக்காக, மேற்கு குண்டுவீச்சு, அளவு PCR (qPCR), நுண்ணுயிர் பகுப்பாய்வு மற்றும் குரோமடின் தடுப்பாற்றல் (சிபிஐ)], 8- முதல் வார வயதுடைய ஆண் C10BL / 57J எலிகள் பயன்படுத்தப்பட்டன. 'கடுமையான' கோகோயின் (6 சிகிச்சைகள் உப்பு + ஒரு சிகிச்சை 7 mg / கிலோ கோகோயின்- HCl, ஐபி) அல்லது 'மீண்டும் மீண்டும்' கோகோயின் (6 சிகிச்சைகள் XMX mg / கிலோ தினசரி உட்செலுத்துதல்) கோகோயின்- HCl, ஐபி). இறுதி சிகிச்சையைத் தொடர்ந்து சுறுசுறுப்பான நேரங்களில் 20 அல்லது 7 மணிநேரத்தில் தியாகம் செய்யப்பட்டது. நுண்ணுயிரியல் ஆய்வுகள், விலங்குகள் 'உப்பு' (20 சிகிச்சைகள் உப்பு, ஐபி), 'கடுமையான' கோகோயின் (1 சிகிச்சைகள் உப்பு + 24 சிகிச்சை XXX mg / கிலோ கோகோயின்- HCl, ஐபி), 'மீண்டும் மீண்டும் + கடுமையான' கோகோயின் கோகோயின்- HCL, XXX மில்லி / கோகோயின்- HCl + XXX சோதனையின் சணல் + XXX சவால் சிகிச்சைகள் XXX mg / kg கோகோயின்- HCl, XXX சிகிச்சைகள் கோழி- ஐபி) மற்றும் இறுதி சிகிச்சைக்கு பிறகு எக்ஸ்எம்எல் மணி தியாகம். நடத்தை சோதனைகள், எலிகள் தனித்தனியாக பிந்தைய அறுவைசிகிச்சைகளை கொண்டிருந்தன மற்றும் கீழே விவரிக்கப்பட்டவாறே 15 mg / kg கோகோயின்- HCl, ip உடன் சிகிச்சையளிக்கப்பட்டன. HSV-GFP மற்றும் HSV-G14A-GFP தொற்றுக்குப் பின் dendritic முதுகெலும்பு பகுப்பாய்வு மற்றும் மைக்ரோராய்டு மதிப்பீட்டிற்கு, எலிகள் 'சலான்' (1 சிகிச்சைகள் உப்பு, ஐபி) அல்லது 'மீண்டும் மீண்டும் கோகோயினை' (20 சிகிச்சைகள் XMX mg / kg கோகைன்- HCl, ip) ) இந்த உட்செலுத்துதல் நெறிமுறை முன்னர் ஹெர்பெஸ் சிம்ப்ளக்ஸ் வைரஸ் (HSV) டிரான்ஸ்ஜென் வெளிப்பாட்டின் காலத்திற்குள் நியூக்ளியஸ் அகும்பென்ஸ் (NAc) நியூரான்கள் மீது முதுகெலும்பு அடர்த்தியை அதிகரிக்க நிரூபிக்கப்பட்டுள்ளது.துணை குறிப்பு S1). கடைசி சிகிச்சையைத் தொடர்ந்து DENINTITIC முதுகெலும்பு பகுப்பாய்வில் பயன்படுத்தப்படும் எலிகள் 4 மணிநேரத்தை தியாகம் செய்தன.
என்.கே. நியூரான்களைக் கட்டுப்படுத்தும் G9A டிரான்ஸ்கிரிப்டின் உள்ளூர் நீக்குதலைத் தூண்டுவதற்கு, நாங்கள் பிறழ்ந்த எலிகளான ஹோலோசிக்யூஸ் ஒரு floxed G9A அலைலையைப் பயன்படுத்தினோம்,S2). கிரன்-தூண்டிய ரெக்லேபினேஷன் XONX-X-XXX அவுட்-ஃப்ரீ பிளெட் டிரிங்க்டை உற்பத்தி செய்கிறது. நாங்கள் C22BL / 25J எலிகளுக்கு முழுமையாக backcrossed என்று G9a floxed எலிகள் பயன்படுத்தப்படுகிறது. எலிகள், ஏஎஸ்டி-தொடர்புடைய வைரஸ் (AAV) வெக்டாஸ் (செரோட்டிப் 57) உடன் GFP அல்லது க்ரீ- GFP ஐ 6 மற்றும் XXX வாரங்களுக்கு இடையில் வெளிப்படுத்தும் NAC க்கு தூண்டுதலாக செலுத்தப்பட்டது. கிரீம்-மையப்படுத்தப்பட்ட மறுஇணைப்புக்கான செயல்திறனை சரிபார்க்க இம்முனோஹிஸ்தோகெமிக்கல் பகுப்பாய்வு பயன்படுத்தப்பட்டது (பார்க்க துணை படம்). நாங்கள் எச்.ஏ.எம்.எல்.எக்ஸ் எலக்ட்ரானிக் எலெக்ட்ரான்களில் ரெக்பாம்பினேஷன்ஸ் ஆனது இந்த கால கட்டத்தில் நிலையான மற்றும் அதிகபட்சமாக வெளியிடப்பட்ட அறிக்கையுடன் பொருத்தப்பட்டதால், ஏ.ஏ.வி.S3-S4). G9A மற்றும் ΔJunD அதிகப்படியான ஆய்வுகள் பரிசோதனைகள் இதேபோல் ஹெச்எஸ்பி வைரஸ் வெக்டார்களை GFP, காட்டு வகை G9A-GFP, தாராளமாக இறந்த G9AH1093K-GFP அல்லது ΔJunD-GFP S2 G9A கட்டடங்களின் மேம்பாட்டு பற்றிய விவரங்கள்). HSV அதிகப்படியான எலிகளுக்கு இந்த அறுவை சிகிச்சையின் மூலம் அதிகபட்சமாக அதிகபட்சமாக அதிகபட்சமாக 3 நாட்களுக்கு பிந்தைய அறுவை சிகிச்சையைப் பயன்படுத்தியது. HSV வெளிப்பாட்டின் இடைநிலை இயல்பு மற்றும் ஏஏவி வெளிப்பாட்டின் கணிசமான அதிக உறுதிப்பாடு ஆகியவற்றின் காரணமாக, HSV வெக்டார்கள் வேகமாகவும், குறுகிய கால இடைவெளியும் வெளிப்பாடு தேவைப்படும் பரிசோதனையில் பயன்படுத்தப்பட்டன, அதேசமயம் ஏஏவி வெக்டர்கள் பரிசோதனைகள் நீண்ட காலத்திற்கு தேவைப்படும் பரிசோதனையில் பயன்படுத்தப்பட்டன. பரந்த முன்கூட்டிய ஆய்வுகளில், இரு பரப்புகளிலும், நரம்பு மண்டல பகுதிக்குள் நுரையீரல் உயிரணுக்களை மட்டுமே பாதிக்கின்றன.
மருந்தாக்கியல் G9A / GLP இன்ஹேடிய்டர், BIX01294 (25 ng / μl) ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தும் நடத்தை சோதனைகள், எலிகள் இரண்டு subcutaneous மினி பம்புகள், அதே போல் இருதரப்பு வழிகாட்டி கன்னுலெய் உடன் NAC இல் ஸ்டெரோடாக்சிக்காக பொருத்தப்பட்டன. மினி-பம்ப்ஸ் (12 μl / மணி) வாகனத்தை (0.25 ஹைட்ராக்ஸிபிரைபிள் β-cyclodextrin) அல்லது மருந்துகள் 5 நாட்களுக்கு மருந்து தயாரிப்பதற்கு முன்னதாக, XMSX மணிநேரம் செயல்படுத்துவதற்கு முன்னர், நடத்தை மதிப்பீடுகள் செய்யப்பட்டன.
ΔFosB அதிவிரைவு பரிசோதனைகள் [மேற்கு சூடு, QPCR மற்றும் ChIP], ஆண் பிட்ரான்ஜெஞ்ஜிக் என்எஸ்இ-TTA × tetOP-ΔFosB எலிகள் பயன்படுத்தப்பட்டன (10 வார வயது), இதன் விளைவாக டெட்ராசைக்லைன் டெரிவேடிவ் டாக்ஸிசைக்ளின் (டாக்ஸிசைக்ளின் XXX வாரங்கள்) இல்லாத நிலையில், விலங்குகள் ΔFosB இன் வலுவான பிரகாசமான கட்டுப்படுத்தப்பட்ட வெளிப்பாட்டை வெளிப்படுத்தின.S5). இந்த எலிகளின் ΔFOSB அதிகப்படியான குவிப்பு QPCR வழியாக உறுதி செய்யப்பட்டது. என்எஸ்இ-TTA × tetOP-ΔFosB எக்ஸ், வார்ன் வகை XXXXXLL / 8J ஆண் எலிகள் GFP அல்லது ΔFosB-GFP ஐ வெளிப்படுத்தும் ஏஏவி வெக்டர்களுடன் ஸ்டெரோடாக்சிக்காக செலுத்தப்பட்ட உள் நாக்கு. ஏ.ஏ.வி. வெக்டர்கள் இந்த வழக்கில், அதிகபட்சம் ΔFOSB வெளிப்பாடு 57 வாரங்களுக்கு பிந்தைய அறுவை சிகிச்சையில் உறுதி செய்ய, வைரஸால் பாதிக்கப்பட்ட மற்றும் பிட்ரான்ஜெக்டிக் ΔFosB மிக அதிகமான எலெக்ட்ரெஷனிங் எலிகளுக்கு இடையே நேரடி ஒப்பீட்டை அனுமதிக்கிறது. வைரஸ் பரவலானது QPCR ஐ 6 வாரங்களுக்கு பிந்தைய அறுவை சிகிச்சை மூலம் உறுதிப்படுத்தியது (8-gauge NAc குத்துக்கள் உட்செலுத்தல் தளத்தின் கீழ் துண்டிக்கப்பட்டது). AVI-GFP மற்றும் AAV-ΔFosB-GFP ஆகியவை QPCR க்குப் பயன்படுத்தப்படாத மிகையான எலிகளுக்கு (சணல், ஐபி) அல்லது மீண்டும் மீண்டும் கோகோயின் (8 சிகிச்சைகள், அறுவை சிகிச்சை. இறுதி சிகிச்சையைத் தொடர்ந்து, 15 நாட்களுக்கு மூளையில், ஒரு Vibratome இல் பிரித்தெடுக்கப்படும் மற்றும் Dendritic முதுகெலும்பு பகுப்பாய்வில் பயன்படுத்தப்பட்டது, 14% paraformaldehyde.
மேற்கத்திய வெடிப்பு பகுப்பாய்வு
ஒரு எஃகு சுட்டி மூளை மேட்ரிக்ஸை பயன்படுத்தி பெறப்பட்ட 14 மிமீ பன்னிரண்டு பிரிவுகளில் இருந்து எக்ஸ் குத்துக்கள் எடுக்கப்பட்டன மற்றும் XMX M HEPES லேசிங் பஃப்பரில் (1% SDS) புரதமாக்கல் மற்றும் பாஸ்பேடாஸ் இன்ஹிபிட்டர்களைக் கொண்டிருக்கும். 1-மொத்த புரதத்தின் XMX μg மாதிரிகள் 30% SDS ஜெல்ஸில் எலக்ட்ரோஃபோகஸ் செய்யப்பட்டன. புரதங்கள் PVDF சவ்வுகளுக்கு மாற்றப்பட்டு H18K3XXXXX (மவுஸ் மோனோக்ளோனல், 9: 2), எதிர்ப்பு β- டூபுலின் (மவுஸ் மோனோக்ளோனல், 1: 500), எதிர்ப்பு மொத்த ஹிஸ்டோன் H1 (முயல் polyclonal, 60,000: 3), (குடலிறக்கக் குழாயில் சமமான வைரல் வெளிப்பாடு சரிபார்க்கப் பயன்படுகிறது) (முயல் பாலிக்ளோணல், 1: XXX), எதிர்ப்பு H5,000K1XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX அல்லது ஆன்டி-ஆன்டின் ஆன்டிபாடிகள் (சுமோ மோனோக்லோன்னல், ஜேன்: 9) 1000 ° C (அனைத்து சவ்வுகளிலும் 3% பால் அல்லது 27% போவின் செம்மை ஆல்பம்) தடுக்கப்பட்டது. மெம்பரான்கள் பின்னர் பெராக்ஸிடேஸ்-பெயரிடப்பட்ட இரண்டாம்நிலை ஆன்டிபாடிகளால் (3: 1) அடைக்கப்பட்டு விட்டன-1: XX பயன்படுத்தி முதன்மை ஆன்டிபாடி) மற்றும் பட்டைகள் SuperSignal West Dura மூலக்கூறு பயன்படுத்தி காட்சிப்படுத்தப்பட்டது. NIH Image J மென்பொருளோடு ஒப்பிடுகையில் Bands ஐ அளவிடப்பட்டன, மேலும் Actin அல்லது β-tubulin அல்லது சமமான ஏற்றுமதியைக் கட்டுப்படுத்த மொத்த Histone H60,000 ஆகியவற்றிற்கு NX H3XXXXXXXX பாங்குகள் இயல்பானன. மீண்டும் கோகோயின் நடிப்பின் அளவுகளில் எந்த விளைவும் இல்லை (படம்) அல்லது மொத்த ஹிஸ்டோன் 3 (படம்) NA இல். மேலும், HSV-G9A-GFP மற்றும் HSV-G9AH1093K-GFP தொற்று, NA-படம்).
இம்முனோஹி்ஸ்டோகெமிஸ்ட்ரி
எலிகள் குளோரல் ஹைட்ரேட்டின் ஒரு இறப்பு அளவைக் கொண்டு மயக்கமடைந்தன மற்றும் முன்னர் விவரிக்கப்பட்டபடி ஒற்றை அல்லது இரட்டை இம்யூனோஹிஸ்டோகேமிரினால் ஆய்வு செய்யப்படுவதற்கு முன்னர் 4%S6). சுருக்கமாக, பிந்தைய நிலையான மூளை 30 சதவிகிதம் பிரித்தெடுக்கப்படுவதற்கு முன்னர், செவ்வாயில் சுழற்சிக்கான சுழற்சியில் சுவாசிக்கவும், 35 சதவிகிதம் சுக்ரோஸில் அடைக்கப்படுகிறது. (டைன்டரிடிக் முதுகெலும்பு பகுப்பாய்வுக்கு பயன்படுத்தப்படும் மூளைகளை 100% சுக்ரோஸில் இல்லாத XMX μm பிரிவுகளில் பிரித்தெடுக்கப்பட்டது). இலவசமாக மிதக்கும் NA க்கள் (30% சாதாரண கழுதை சீரம், XXL% ட்ரைடோன்க்ஸ், 1X பிபிஎஸ்) தடுக்கப்பட்டது, பின்னர் GFP (கோழி polyclonal, 3: 0.1) மற்றும் / அல்லது ஜி- ஜிஎன்எஎஎஎஎஎஎ (முயல் பாலிட்கானல்) , 1: XX) தீர்வு தடுப்பதில் ஆன்டிபாடிகள். Dendritic spines க்கு பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்ட பிரிவுகள் ஒரு முயல் polyclonal-GFP ஆன்டிபாடிடன் 1: 8000 உடன் இணைக்கப்பட்டுள்ளன. சுமார் ஒரு மணிநேர காப்பீட்டிற்கு பிறகு, 9 நிமிடங்களுக்கு 1 நிமிடங்கள் 500 பி.பீ.எஸ் பி.பீ.எஸ் உடன் சுழற்றுதல், 1 மணி நேரத்திற்கான 200X பிபிஎஸ் தடுப்பதைத் தீர்வுக்கான Cy3 மற்றும் / அல்லது சுஎக்ஸ்என்எக்ஸ் ஃப்ளூரொரெச்ட்-இணைந்த இரண்டாம் நிலை ஆன்டிபாடிகளை கொண்டிருக்கும். அறை வெப்பநிலையில் ஒரே நாளில் இரண்டாம்நிலை ஆன்டிபாடிகளில் உருமாற்றவியல் படிப்புகளுக்குப் பயன்படுத்தப்படும் பிரிவுகள். 10 நிமிடங்கள் DAPI (1: 2) கொண்ட 3 பிபிஎஸ் உள்ள பிரிவுகளை அடைப்பதன் மூலம் அணுசக்தி இணைப்பினை அடைந்தது. பிரிவுகள் மீண்டும் மீண்டும் கழுவி, பின்னர் எத்தனோல் நீரிழிவு மற்றும் DPX உடன் பெருகி வருகின்றன. அனைத்து பிரிவுகளும் குரல்வளை நுண்ணோக்கி பயன்படுத்தி பிரதிபலிக்கப்பட்டன.
ஆர்.என்.ஏ தனிமை மற்றும் குவிஆர்சிஆர்
இருதரப்பு 14-கேஜ் என்ஏசி குத்துக்கள் ட்ரைசோலில் ஒரே மாதிரியாக மாற்றப்பட்டு உற்பத்தியாளரின் அறிவுறுத்தல்களின்படி செயலாக்கப்பட்டன. ஆர்.என்.ஏ ஆர்.என்.ஏ மைக்ரோ நெடுவரிசைகளுடன் சுத்திகரிக்கப்பட்டது மற்றும் ஸ்பெக்ட்ரோஸ்கோபி ஆர்.என்.ஏ 260/280 மற்றும் 260/230 ரேஷன்கள்> 1.8 என்பதை உறுதிப்படுத்தியது. ஆர்.என்.ஏ பின்னர் ஒரு பயோ-ராட் ஐஸ்கிரிப்ட் கிட் பயன்படுத்தி தலைகீழ் படியெடுத்தது. சி.டி.என்.ஏ ஐ எஸ்.ஒய்.பி.ஆர் கிரீன் பயன்படுத்தி qPCR ஆல் அளவிடப்பட்டது. ஒவ்வொரு எதிர்வினையும் நகல் அல்லது மும்மடங்காக இயக்கப்பட்டன மற்றும் கிளைசெரால்டிஹைட் -3-பாஸ்பேட் டீஹைட்ரஜனேஸ் (ஜிஏபிடிஹெச்) ஐ இயல்பாக்குதல் கட்டுப்பாட்டாக (முன்பு பயன்படுத்தியது போல describedCt முறையைப் பின்பற்றி பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டதுS7). பார்க்க துணை அட்டவணை S5 mRNA முதன்மையான காட்சிகளுக்காக.
டிஎன்ஏ நுண்ணுயிர் பகுப்பாய்வு
நான்கு குழுக்கள் (ஒரு குழுவினருக்கான 3 சுயாதீனமான உயிரியல் பிரதிகளை) நுண்ணறிவு படிப்புக்காகப் பயன்படுத்தப்பட்டன, இவை மொத்தம் 12 மைக்ரோரெயேஸ். கடந்த கோகோயின் உட்செலுத்தலைத் தொடர்ந்த சுமார் மணி நேரத்திற்குள், விலங்குகள் விரைவில் அழிக்கப்பட்டன, மூளங்கள் அகற்றப்பட்டு பனிப்பகுதியில் வைக்கப்பட்டன. NAc இன் dissections ஒரு 1-gauge ஊசி பஞ்ச் பயன்படுத்தி எடுக்கப்பட்ட மற்றும் ஆர்.என்.ஏ பிரித்தெடுத்தல் வரை விரைவாக உலர் பனி மீது உறைந்தனர். இருதரப்பு குத்துச்சீலைகள் ஒவ்வொன்றிற்கும் நான்கு விலங்குகளில் இருந்து குவிக்கப்பட்டன. ஆர்.என்.ஏ தனிமைப்படுத்தி, மைக்ரோரேய் செயலாக்கம் மற்றும் தரவு பகுப்பாய்வு முன்னர் விவரிக்கப்பட்டதுS8). சுருக்கமாக, மேலே விவரிக்கப்பட்டபடி ஆர்.என்.ஏ தனிமைப்படுத்தப்பட்டு சுத்திகரிக்கப்பட்டது மற்றும் அஜிலெண்டின் பயோஅனாலிசரைப் பயன்படுத்தி தரத்திற்காக சோதிக்கப்பட்டது. இல்லுமினா மவுஸ் டபிள்யூ -6 வி 2.0 வரிசைகளுக்கு தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன், பெருக்கம், லேபிளிங் மற்றும் கலப்பினமாக்கல் ஆகியவை யு.டி. தென்மேற்கு மைக்ரோ அரே கோர் மூலம் நிலையான நடைமுறைகளைப் பயன்படுத்தி நிகழ்த்தப்பட்டன. மூல தரவு பின்னணி கழிக்கப்பட்டு பீட்ஸ்டுடியோ மென்பொருளைப் பயன்படுத்தி அளவு இயல்பாக்கப்பட்டது. ஜீன்ஸ்ப்ரிங் மென்பொருளைப் பயன்படுத்தி இயல்பாக்கப்பட்ட தரவு பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது மற்றும் 1.3 மடங்கு மாற்ற வெட்டுக்கான முக்கியத்துவ அளவுகோல்களைப் பயன்படுத்தி மரபணு பட்டியல்கள் உருவாக்கப்பட்டன, அதோடு p <0.05 இன் கடுமையான பி-மதிப்பு வெட்டுடன் இணைக்கப்பட்டது.
பல காரணங்களுக்காக இந்த தரவுகளில் உயர்ந்த நம்பிக்கையை நாங்கள் வைத்திருக்கிறோம். முதலாவதாக, அனைத்து விலங்குகளும் அதே சூழ்நிலையில், ஒரே நேரத்தில் கையாளப்பட்டு சிகிச்சை அளிக்கப்பட்டு கொல்லப்பட்டனர். அதே சமயத்தில், அனைத்து ஆர்.என்.ஏ மற்றும் வரிசை செயலாக்கமும் ஒரே நேரத்தில் நடத்தப்பட்டன. இரண்டாவதாக, மூன்று மடங்கு வரிசைகள் நிகழ்த்தப்பட்டது மற்றும் வரிசை மாதிரி ஒன்றுக்கு பல மிருகங்களைப் பாய்ச்சினோம், இதனால் தனிப்பட்ட மாறுபாடு மற்றும் அதிகரிக்கும் புள்ளியியல் சக்தி (S9). மூன்றாவதாக, எங்கள் ஆய்விற்காக பயன்படுத்தப்படும் தரவு பகுப்பாய்வு அளவுகோல்கள் MicroArray தரக் கட்டுப்பாட்டு திட்டத்தால் பரிந்துரைக்கப்படுகின்றன, ஏனெனில் இந்த அளவுகோல்கள் உயர்ந்த அளவிலான மறுபயன்பாட்டு மற்றும் இடை-S10-S11).
வைரல் வெக்டாக்களின் கட்டுமானம்
வைரஸ் வெக்டர் செருகும் அளவு குறைப்புக்கள், வன்தரவு G9A (G9A) அல்லது வினைத்திறன் மிக்க மந்த G9A (G9AH1093K) ஆகிய இரண்டிற்கான குறியீட்டு சீட்டுகள் மனித உடனடி சைட்டோமெலகோவிஸ் புரோட்டோட்டர் (CMV) (GVNUMXA) கட்டுப்பாட்டின் கீழ் GFP ஐ வெளிப்படுத்திய பைக்ஸ்டிரோனிக் P1005 + HSV பிளாஸ்மிட் செருகும் அளவு ~ 9 kb ஆகும், இது AAV-3.96 வெக்டர்களுக்கான அதிகபட்ச செருகும் அளவை மீறுகிறது). IE2 / XHTML ப்ரோட்டோடர் G4A எக்ஸ்பிரஷன் இயக்கப்படுகிறது. பி.என்.ஐ. மற்றும் ஈக்கோஆர்ஐஐ (பிசிடிஎன்என்என்என்னிலிருந்து) மற்றும் சி.ஐ.ஐ.எக்ஸ் எக்ஸிகிரீ டைஜெசீசினை பின்பற்றிய சிஐபி ஆகியவற்றிற்கு சிகிச்சையளித்த க்ளெனோ சிகிச்சையுடன் க்ளௌனோவின் முதுகெலும்புகள் மூலம் பிஸ்கிரிட்டோனிக் பாக்ஸ்ரோனிக் பாக்டீரியாக்களாக பிரித்தெடுக்கப்பட்டன. HSV-ΔJunD-GFP உற்பத்திக்காக, ECORI கட்டுப்பாட்டு தளங்களால் சுற்றியுள்ள ΔJunD இன் குறியீட்டு வரிசை ECRRI தளத்தைக் கொண்ட முதன்மையான oligonucleotides ஐ பயன்படுத்தி பி.ஆர்.ஆர் உருவாக்கப்பட்டது. PCR தயாரிப்பு பின்னர் P5 + வெக்டரின் EcoRI தளத்திற்குள் செலுத்தப்பட்டது. NAC நியூரான்களில் கிராக் ரெக்க்பினேஸின் உள்ளூர் வெளிப்பாடு விவரிக்கப்பட்டது என AAV வெக்டாரைப் பயன்படுத்தி வைரஸ்-மையப்படுத்தப்பட்ட மரபணு விநியோகம் மூலம் அடையப்பட்டது (S12). GFP அல்லது கிரெடினுக்கு GFP இன் N- டெர்மினல் இணைவு ஒரு சி.வி.வி புரொமோடரைக் கொண்ட ரெகுபோபன்ட் AAV-2 வெக்டராக இணைக்கப்பட்டுள்ளது. இது Splice வழங்கி ஏற்பு வரிசை மற்றும் பாலிடேன்டைலேஷன் சிக்னலுடன். அனைத்து வெக்டார் செருகல்களும் dideoxy-sequencing மூலமாக உறுதிப்படுத்தப்பட்டன. வைரல் வெக்டாட்கள் மூன்று விதமான டிரான்ஸ்ஃபர்ஃபிகேஷன், உதவி இல்லாத முறை,S13). சுத்திகரிக்கப்பட்ட வைரஸ் -80 ° C இல் சேமிக்கப்பட்டது. HEK293 செல்கள் மதிப்பிடப்பட்ட தொற்றுத் திடல் மூலம் வைரல் தரம் மதிப்பீடு செய்யப்பட்டது. AAV-ΔFosB-GFP வைரஸ்கள் இதேபோல் தயாரிக்கப்பட்டன. HSV-Cre க்கு, கிரெக் வெளிப்பாடு ஐஈஎஸ்எல்எக்ஸ் / 4 ஊக்குவிப்பாளரை எதிர்த்து, ஒரு ஐ.எஸ்.எஸ்.ஈ. ப்ரமோடரால் இயக்கப்படுகிறது, Cre expression ஐ குறைத்து, நரம்பியல் நச்சுத்தன்மையை தடுக்கிறது (பார்க்க S14 வைரஸ் கட்டுமானத்திற்காக). அனைத்து சந்தர்ப்பங்களிலும், வைரஸ் பரவலானது இரண்டும் சரிபார்க்கப்பட்டது ஆய்வுக்கூட சோதனை முறையில் மற்றும் விவோவில் QPCR வழியாக, மற்றும் வைரஸ்கள் அறுவைச் சிகிச்சைக்குப் பிறகு NAC- கட்டுப்படுத்தப்பட்ட வெளிப்பாட்டைக் காண்பிக்க உறுதியளித்தனர்.
ஸ்டீரியோடாக்சிக் அறுவை சிகிச்சை
கெட்டமைன் (100 மிகி / கி.கி) / xylazine (10 mg / kg) மயக்கமருந்து கீழ், எலிகள் ஒரு சிறிய-விலங்கு ஸ்டீரியோடாக்சிக் கருவியில் வைக்கப்பட்டுள்ளன, மற்றும் மூளை மேற்பரப்பு வெளிப்படும். 0.5 μl / min என்ற விகிதத்தில் ஒரு 10 ° கோணத்தில் (AP + 1.6; ML + 1.5; DV - 4.4) உள்ள NAC இல் XMX μl வைரஸ் பரவலாக முப்பத்தி மூன்று கேஜ் சிரிங்கின் ஊசிகள் பயன்படுத்தப்பட்டன. HSV ஊசி பெறும் விலங்குகள் அறுவை சிகிச்சைக்குப் பிறகு XNUM நாட்களுக்கு மீட்க அனுமதிக்கப்பட்டன, அதே நேரத்தில் ஏஏவி வெக்டரைப் பெறுவதற்கான நடத்தை சோதனைக்கான எலிகள் கண்டிப்பாக வைக்கப்படுவதற்கு முன்னதாகவே 0.1 நாட்களுக்கு மீட்க அனுமதிக்கப்பட்டன. இந்த முறை இரண்டு திசையர்களுக்கான அதிகபட்ச வைரஸ்-இடைப்பட்ட டிரான்ஸ்ஜென் வெளிப்பாட்டின் காலகட்டங்களுக்கு இசைவானதாக இருக்கிறது. BIX2 வடிகுழாய்களுக்கு, இரண்டு மினி பம்புகள் ஒவ்வொன்றும் சுட்டிக்கு பின்புறத்தில் சுருக்கமாக அமைந்தன. கன்குலா வேலைவாய்ப்புகள் NAC க்கு மேலே உள்ள இரண்டு சிறிய மூட்டு துளைகளை துளையிடும், மற்றும் ப்ரெக்மா (AP + 20; ML + 01294; DV - 1.5) ஆகியவற்றிலிருந்து கேனால்களை வழங்குவதன் மூலம் அடைய முடிந்தது. கீழே விவரிக்கப்பட்டபடி கோகோயினுக்கு இடநிலை சீரமைப்பு நடைமுறையைத் தொடங்குவதற்கு முன், சுறுசுறுப்பு அறுவைச் சிகிச்சையில் இருந்து 1.0 to 5.4 நாட்களுக்கு மீட்டெடுக்க அனுமதிக்கப்பட்டன.
கண்டிஷன் இட விருப்பம்
முன்னர் விவரித்தபடி, இடம் மாற்றுவழி நடைமுறை பின்பற்றப்பட்டது, பின்வரும் மாற்றங்கள் (S7). சுருக்கமாக, HSV-G3a-GFP, HSV-G9aH9K-GFP அல்லது HSV-GFP இன் இன்ட்ரா-என்ஏசி உட்செலுத்தலுக்கு 1093 நாட்களுக்குப் பிறகு, எலிகள் கண்டிஷனிங் அறைகளில் வைக்கப்பட்டன, அவை மூன்று தனித்துவமான சூழல்களைக் கொண்டிருந்தன. இரண்டு கண்டிஷனிங் அறைகளில் குறிப்பிடத்தக்க முன்னுரிமையைக் காட்டிய எலிகள் ஆய்வில் இருந்து விலக்கப்பட்டன (<அனைத்து விலங்குகளிலும் <10%). கண்டிஷனிங் குழுக்கள் பின்னர் இருக்கும் எந்த அறை சார்புகளையும் சரிசெய்ய சமப்படுத்தப்பட்டன. அடுத்தடுத்த நாட்களில், விலங்குகளுக்கு உமிழ்நீர் செலுத்தப்பட்டு பிற்பகலில் ஒரு அறையில் 30 நிமிடங்கள் அடைத்து வைக்கப்பட்டு பின்னர் கோகோயின் (10 மி.கி / கி.கி, ஐ.பி) செலுத்தப்பட்டு 30 நிமிடங்கள் மற்ற அறைக்கு மாலையில் 2 நாட்கள் (இரண்டு உமிழ்நீர் மற்றும் இரண்டு கோகோயின் இணைப்புகள்). சோதனையின் நாளில், எலிகள் 20 நிமிடங்களுக்கு சிகிச்சையின்றி மீண்டும் எந்திரத்திற்குள் வைக்கப்பட்டு, அவை எந்தப் பக்கத்தை விரும்புகின்றன என்பதை மதிப்பீடு செய்ய சோதிக்கப்பட்டன. கோகோயினுக்கு லோகோமோட்டர் பதில்கள் கோகோயின்-இணைக்கப்பட்ட அறைகளில் உள்ள பீம் முறிவுகள் மூலம் மருந்து சிகிச்சையின் செயல்திறனை உறுதிப்படுத்த மதிப்பீடு செய்யப்பட்டன. AAV மற்றும் BIX01294 CPP சோதனைகளுக்கு, சற்று மாற்றியமைக்கப்பட்ட நெறிமுறை பயன்படுத்தப்பட்டது. விலங்குகள் மீண்டும் உமிழ்நீர் அல்லது கோகோயின் (10 மி.கி / கி.கி, ஐ.பி) மூலம் செலுத்தப்பட்டு 30 நிமிட அமர்வுகளுக்கு குறிப்பிட்ட அறைகளில் மட்டுப்படுத்தப்பட்டன, ஆனால் அதற்கு பதிலாக 4 நாட்களுக்கு ஒரு நாளைக்கு ஒரு முறை மட்டுமே நிபந்தனை விதிக்கப்பட்டது, அதன்பிறகு 5 ஆம் நாள் சோதனை செய்யப்பட்டது (விலங்குகள் நிபந்தனைக்கு உட்படுத்தப்பட்டன மாலை மற்றும் கண்டிஷனிங் சிகிச்சைகள் மாற்றப்பட்டன). அனைத்து குழுக்களுக்கும், உமிழ்நீருக்கு பதிலளிக்கும் அடிப்படை லோகோமொஷன் வைரஸ் அல்லது தடுப்பான சிகிச்சையால் லோகோமொஷன் பாதிக்கப்படாது என்பதை உறுதிப்படுத்த மதிப்பிடப்பட்டது.
நரம்பு கோகோயின் சுய நிர்வாகம்
பரிசோதனையின் ஆரம்பத்தில் எக்ஸ் எக்ஸ்என்எக்ஸ் எக்ஸ் எடையைக் கொண்ட இளம் பருவ வயது நீண்ட-எவான்ஸ் எலிகள் பெறப்பட்டன. அவர்கள் ஒரு ஈரப்பதத்தில் அமைக்கப்பட்டிருந்தனர்- மற்றும் வெப்பநிலை கட்டுப்பாட்டிற்குள்ளான சூழலில் ஒரு தலைகீழ் 230 மணி நேர ஒளி / இருண்ட சுழற்சியில் (ஜேன்: ஆஃப் ஆஃப் லைட் ஆஃப் ஜேன்: 9 ஆம்) விளம்பரம் இலவசம் உணவு மற்றும் நீர் அணுகல். எலிகள் தங்கள் புதிய சூழ்நிலையில் பழக்கப்படுத்திக்கொள்ள அனுமதிக்கப்பட்டு, பரிசோதனையின் தொடக்கத்திற்கு முன்னதாக தினமும் சுமார் ஐந்து வாரங்களுக்கு கையாளப்பட்டன. அனைத்து நடைமுறைகளும் ஆய்வக விலங்குகளின் பராமரிப்பு மற்றும் பயன்பாட்டிற்கான தேசிய கல்வி நிறுவனத்தின் வழிகாட்டலின் கீழ் நடாத்தப்பட்டது மற்றும் மவுண்ட் சினாயின் விலங்கு பராமரிப்பு மற்றும் பயன்பாட்டுக் குழுவால் அங்கீகரிக்கப்பட்டது. சுய நிர்வாகம் உபகரணங்கள் அகச்சிவப்பு நடத்தை அளவிட அகச்சிவப்பு துளைகள் மூலம் பொருத்தப்பட்டிருந்தது. முன்னர் விவரிக்கப்பட்டபடி சுய நிர்வாகம் மேற்கொள்ளப்பட்டது (S15-S16) ஐசோஃப்ளூரேன் (2.4–2.7%) மயக்க மருந்துகளின் கீழ் வலது ஜுகுலர் நரம்புக்குள் வடிகுழாய்கள் பொருத்தப்பட்டுள்ளன. 0.1 யு ஹெபரின் மற்றும் ஆம்பிசிலின் (10 மி.கி / கிலோ) கொண்ட உப்பு கரைசலில் 50 மில்லி வடிகுழாய்கள் சுத்தப்படுத்தப்பட்டன. அறுவை சிகிச்சையிலிருந்து மீண்டு ஒரு வாரம் கழித்து, ஒளி / இருண்ட சுழற்சியின் இருண்ட கட்டத்தில் சுய நிர்வாக பயிற்சி தொடங்கியது. ஒரு நிலையான விகிதம் -3 (FR0.75) வலுவூட்டல் அட்டவணையின் கீழ் கோகோயின் (1 மிகி / கிலோ / உட்செலுத்துதல்) விலங்குகளுக்கு 1 மணிநேர தினசரி அணுகல் அனுமதிக்கப்பட்டது, அங்கு 1 செயலில் நெம்புகோல் பத்திரிகை விளைவாக ஒரு ஒற்றை உட்செலுத்தலுக்கு வழிவகுத்தது. எலிகள் 6 நாட்களுக்குப் பிறகு தங்கள் கோகோயின் உட்கொள்ளலை உறுதிப்படுத்தின (தொடர்ச்சியான 15 நாட்களில் <3% மறுமொழி விகிதத்தில் மாறுபாடு, குறைந்தது 75% வலுவூட்டப்பட்ட நெம்புகோலில் பதிலளித்தது). இறுதி சுய நிர்வாக அமர்வுக்கு 24 மணி நேரத்திற்குப் பிறகு, எலிகள் விரைவாக தலைகீழாக மாற்றப்பட்டன, மூளை விரைவாக அகற்றப்பட்டு ஆர்.என்.ஏ தனிமைப்படுத்தலுக்கும் qPCR க்கும் செயலாக்கப்பட்டன.
க்ரோமடின் தடுப்பாற்றல் (சிபிஐ)
புதிய NAC குத்துக்கள் முன்னதாக விவரிக்கப்பட்டபடி, சிஐபிக்கு குறுக்கு-இணைக்கப்பட்ட மற்றும் தயாரிக்க வடிவமைக்கப்பட்டவை (S17-S18) சிறிய மாற்றங்களுடன். சுருக்கமாக, XXX XX-XG-NAC விலங்குகளால் துண்டிக்கப்பட்டது (மாதிரியைப் பற்றிக் கொண்டிருக்கும் விலங்குகள்) சேகரிக்கப்பட்டன, 4% பார்மால்டிஹைட் உடன் குறுக்கு-இணைக்கப்பட்டவை மற்றும் 14 M கிளைசினுடன் முடக்குவதற்கு முன்பாக- 5 ° C. மாதிரி sonication முன், செம்மறி எதிர்ப்பு முயல் / சுட்டி (மழை ஆண்டிபாடி பொறுத்து) IgG காந்த மணிகள் உட்செலுத்துதல் காந்த மணிகள் அல்லது ஜிஎன்என்எஎஎஎஎஎக்ஸ்ஏ (முயல் பாலிட்கானல் சிப் தர) அல்லது H1X2XXXXX (மவுஸ் மோனோக்லான்னல் சிப் தர) தடுப்பூசியில் நிலையான சுழற்சியின் கீழ் 80 ° C மணிக்கு ஆன்டிபாடிகள் ஒரே இரவில். முன்பு விவரிக்கப்பட்டபடி, திசு லேசர் மற்றும் க்ரோமடின் வெட்டுதல் ஆகியவை மேற்கொள்ளப்பட்டன (S17). Sonication தொடர்ந்து, குரோமடினின் சமச்சீர்திருத்தங்கள் புதிய குழாய்களுக்கு மாற்றப்பட்டன, இறுதி தயாரிப்புகளின் ~ 5% 'உள்ளீடு' கட்டுப்பாடுகள் என வழங்கப்பட்டன. இணைக்கப்பட்ட பீட் / ஆன்டிபாடி கலவையின் முழுமையான கழுவுதல் மற்றும் மறுபயன்பாட்டின் பின்னர், ஒவ்வொரு குரோமடின் மாதிரியிலும் ஆன்டிபாடி / மணிப்பூ கலங்களின் (~ 7.5 μg ஆன்டிபாடி / மாதிரி) சமமான அளவுகள் சேர்க்கப்பட்டன, மேலும் 16 ° C இல் தொடர்ந்து சுழற்சியின் கீழ் ~ 4 மணிநேரங்களுக்கு அடைக்கலம் புகுந்தன. சி.என்.ஆர் சுத்திகரிப்பு கருவியைப் பயன்படுத்தி டி.என்.ஏ. சுத்திகரிப்புக்கு முன்னதாக, மாதிரிகள் மேலும் கழுவி, சுருக்கமாக இணைக்கப்பட்டன. டி.என்.ஏ. சுத்திகரிப்புக்குப் பிறகு, மாதிரிகள் qPCR க்கு உட்படுத்தப்பட்டன, முன்னர் விவரித்தபடி அவற்றின் பொருத்தமான 'உள்ளீட்டு கட்டுப்பாடுகள்'S17). ஒரு சுட்டி polyclonal எதிர்ப்பு IgG ஆண்டிபாடி பயன்படுத்தி இயல்பான சுட்டி IgG immunoprecipitations மேலும் சமிக்ஞை பெருக்கம் பொருத்தமான செறிவூட்டல் கட்டுப்படுத்த மேற்கொள்ளப்பட்டன. கொக்கெயின் மற்றும் ΔFosB அதிவிரைவு பரிசோதனையின் எதிர்மறை கட்டுப்பாட்டுடன் Adenine phosphoribosyltransferase (APRT) பயன்படுத்தப்பட்டது. பார்க்க துணை அட்டவணை S5 விளம்பரதாரர் முதன்மையான காட்சிகளுக்காக.
Dendritic முதுகெலும்பு பகுப்பாய்வு
விவாகோவில் நரம்பியல் உருமாற்றலின் ஒழுங்குபடுத்தலில் G9A இன் பங்கைப் படித்த பின், பின்வரும் மாற்றங்களைக் கொண்டு முன்னர் விவரிக்கப்பட்ட முறைகளைப் பயன்படுத்தினோம் (S1). HSV-GFP, HSV-G9A-GFP, HSV-ΔJunD-GFP (அனைத்து வைரஸ்கள் காட்டு வகை C57Bl / 6J எலிகளிலும் பயன்படுத்தப்பட்டன) அல்லது HSV-Cre-GFP (G9AFL / FL எலிகள்), வைரஸ் வெளிப்பாடு அதிகபட்சமாக இருந்த போது, எலிகள் perfused, மூளைகளை cryoprotected மற்றும் பின்னர் பிரிவில் ஒரு Vibratome மீது XMX μm பிரித்து. மேலே குறிப்பிடப்பட்டுள்ளபடி, GFP க்கு எதிரான ஆன்டிபாடினைப் பயன்படுத்தி, உடற்காப்பு ஊக்கிகளுக்கு உட்படுத்தப்பட்டன (பார்க்க Immunohistochemistry). முதுகெலும்புகளின் எண்ணிக்கையிலும், முதுகெலும்புகளின் எடை அதிகரிப்பின் விளைவுகளையும் மதிப்பிடுவதன் மூலம், ΔJunD அதிகப்படியான வெளிப்பாட்டின் விளைவு, நாம் GFP- வெளிப்படுத்தும் NAc நடுத்தரத்திலிருந்து குறைந்தபட்சம் 100 μm இரண்டாம்நிலை dendrites சமமாக நியூரானுக்கு சமமான சுமார் 9- ஸ்பைனி நியூரான்கள் (MSNs). எம்எல்எஸ் NA களில் மற்ற நரம்பு மக்களிடமிருந்து உருமாற்ற ரீதியாக வேறுபட்டது, அதே போல் HSV முதன்மையாக இந்த மூளை மண்டலத்தில் நரம்பணுக்களை வெளிப்படுத்தும் DARPP-S19), எம்எஸ்எஸ்க்கள் இந்த ஆய்வுகளில் பிரத்தியேகமாக மதிப்பீடு செய்யப்பட்டுள்ளன என்று நாங்கள் நம்புகிறோம். ஒவ்வொரு விலங்குக்கும், நாங்கள் XXX-6 நரம்பணுக்களில் ஒரு குழுவினருக்கு (8 குழுக்களில்) ஆய்வு செய்தோம், அதன் பிறகு புள்ளிவிவர பகுப்பாய்விற்கான ஒவ்வொரு விலங்குக்கும் சராசரி மதிப்பு பெறப்பட்டது. என்.சி. ஸ்பைன் அடர்த்தியின் மீது ΔFosB அதிகப்படியான அடர்த்தியின் விளைவுகளை ஆய்வு செய்ய பரிசோதிக்கப்பட்ட பரிசோதனைகள் மேலே விவரிக்கப்பட்டதைப் போலவே எடுத்துக் கொள்ளப்பட்டன. தவிர, ஏஏவி வெக்டர்கள் GFP அல்லது ΔFosB-GFP ஐ நீண்ட காலத்திற்கு (3 வாரங்கள்) வெளிப்படுத்த பயன்படுத்தப்பட்டன. எக்ஸ்என்எக்ஸ்எக்ஸ் எண்ணெய்-மூழ்கியது நோக்கம் கொண்ட ஒரு குரல் நுண்ணோக்கி பயன்படுத்தி அனைத்து HSV படங்களும் கைப்பற்றப்பட்டன (AAV படங்கள் எக்ஸ்எம்எல்எக்ஸ் எண்ணெய்-மூழ்கியது நோக்கம் கொண்டது). படங்கள் எக்ஸ்எம்எல் தன்னிச்சையான அலகு மற்றும் ஒரு எக்ஸ்எம்எல் எக்ஸ்எம்எல் ஃப்ரேம் அளவுகளில் உள்ள பைனோல் தொகுப்புடன் வாங்கப்பட்டது. NIH Image J மென்பொருள் பயன்படுத்தி Dendritic நீளம் அளவிடப்படுகிறது, மற்றும் சோதனை ஸ்கேனிங் முன் ஸ்லைடுகளை குறியிடப்படும் என முதுகெலும்பு எண்கள் முதன்மை பரிசோதனையாளர் மூலம் குருட்டு கணக்கிடப்படுகிறது. DNDrite இன் 4 μm க்கு ஸ்பின்னன்களின் சராசரி எண்ணிக்கை கணக்கிடப்பட்டது.
புள்ளிவிவர பகுப்பாய்வு
ஒன்று மற்றும் இரண்டு வழி ANOVA க்கள் இரு பிரிவுகளுக்கும் மேலான நிலையில் கட்டப்பட்ட இடம் விருப்பம் மற்றும் dendritic முதுகெலும்பு பகுப்பாய்வு ஆகியவற்றிற்கு முக்கியத்துவம் அளிக்கும். QPCR, மேற்கு blotting, dendritic முதுகெலும்பு பகுப்பாய்வு HSV-GFP ஒப்பிடுகையில் HSV-Cre இல் ஒப்பிடுகையில், மற்ற ஒப்பீடுகளுக்கு மாணவரின் t சோதனை பயன்படுத்தப்பட்டதுFL / FL எலிகள், மைக்ரோஅரே பகுப்பாய்வு (மேலே காண்க) மற்றும் குரோமாடின் இம்யூனோபிரெசிபிட்டேஷன் சோதனைகள். DrugFosB அதிகப்படியான அழுத்தத்திற்குப் பிறகு டென்ட்ரிடிக் முதுகெலும்பு அடர்த்தியின் இருவழி ANOVA பகுப்பாய்வைத் தொடர்ந்து திட்டமிடப்பட்ட மாணவரின் டி-சோதனைகள் பயன்படுத்தப்பட்டன, மருந்து சிகிச்சை மற்றும் வைரஸின் குறிப்பிடத்தக்க முக்கிய விளைவுகளை உறுதிப்படுத்தியது. எண்ணிக்கை புனைவுகளில் சேர்க்கப்பட்டுள்ள அனைத்து மதிப்புகளும் சராசரி ± SEM (* p ≤ 0.05; ** p <0.001) ஐக் குறிக்கும். க்கான விரிவான புள்ளிவிவர பகுப்பாய்வு அத்தி. 1-3 முக்கிய உரையில் கொடுக்கப்பட்டிருக்கும்: புள்ளிவிவரங்களை உள்ளடக்கிய விரிவான படம் லெஜண்ட்ஸ்.
அடிக்குறிப்புகள்
கையெழுத்துப் பிரதியினுள் உள்ள எந்தவொரு பொருட்களும் ஏதும் இல்லை என்று நான் சான்றளிக்கிறேன் கோகோயின் தூண்டப்பட்ட பிளாஸ்டிக் உள்ள Histone Methyltransferase G9a அவசியமான பங்கு முன்னர் வெளியிடப்பட்ட அல்லது இணையத்தில் உள்ளிட்ட பிற இடங்களில் கருத்தில் கொள்ளப்பட்டுள்ளன.
விலங்குகளின் பயன்பாடு சம்பந்தப்பட்ட அனைத்து வேலைகளும் டெக்சாஸ் பல்கலைக்கழக தென்மேற்கு மருத்துவ மையம் மற்றும் மவுண்ட் சினாய் மெடிசின் மெடிக்கல் ஆகியவற்றில் நிறுவப்பட்ட மற்றும் IACUC வழிகாட்டுதல்களுக்கு ஏற்ப நடத்தப்பட்டது.
குறிப்புகள் மற்றும் குறிப்புகள்
;