Прокуратураи ИМА 2005 феврали 1; 102(5): 1737-1742.
мавҳум
Кокаин, ки маводи мухаддири таҷҳизотро дар сатҳи стоматологӣ, ки аз ҷониби терапевтҳои axon параграфи допамин ба даст меоранд, баландтар мекунад. Кино-вобаста ба кинематографияи 5 (Cdk5) ва фаъолкунандаи он p35, сафедаҳо, ки дар фосфватсияи субттатсияҳо дар нетронти постетсерҳо машғуланд, баъд аз муоинаи ранга ба кокаин танзим мешаванд. Барои санҷидани таъсири Cdk5 ва p35 induction on signal dopamine стриалалиро, мо ду хатти мустақили transgenicро ба даст овардем, ки дар он Cdk5 ё p35 хусусан махсус дар нейронҳо тасвир шудааст. Мо дар ин ҷо гузорем, ки фаъолияти Cdk5-ро зиёд карда, дар натиҷаи p35, вале на аз Cdk5 бартараф карда шуда, боиси азхудкунии нишондиҳандаи допамини кокаин вобастааст. Зиёдшавии фосфоридаи Cdk5-mediated dopamin ва phosphoprotein cAMP, омма molecular 32 kDa (DARPP-32) дар Тр-75, бо камшавии фосфорори DARPP-32 дар Т-34 ҳамроҳ карда шуд. Зиёдшавии фишори Cdk5-миёнаравии кино-критерияи кино-танзимшудаи кинематографии 1 дар Тр-286 бо камшавии фаъолшавии кинематсионии танзими ғайримутамарказ 1 / 2 ҳамроҳ карда шуд. Ин таъсирот ба сустшавии фосфатизатсияи кокаин, ки протеин-элементии энергияро дар бар мегиранд, инчунин кам кардани к-досро дар стриатсия овардааст. Натиҷаҳои мазкур ба фикри он, ки фаъолиятҳои Cdk5 бо тағир додани генҳои тағйирёбандаи генетикӣ пас аз мушаххасшавии коэффисиалӣ алоқаманд мешаванд ва аз ин рӯ тағйироти дарозмӯҳлатро дар функсияҳои неврализатсияшудаи марбут ба ғадуди кокаин таъсир мерасонад.
Кокаин сатҳҳои синоптикии допаминро дар стриатсия афзоиш медиҳад ва таркиби генограммаҳоро дар таркиби dopaminoceptive neuron by activating paths of intracellular, ки сигналҳои ибтидоӣ аз таркиби D1-ро ба nucleus (1). Коэффисиентҳои даврӣ ба кокаин чандин омилҳои трансплантатсияро мефиристанд, ки боиси тағйироти дарозмӯҳлат дар ифодаи ген, ки дар зери таъсири мутобиқати ниқоб дар кокаин ба назар мерасанд2). ΔFosB, ки ҳамчун чунин як transcription transcription (3), барои баланд бардоштани масъулияти рафтори ҳайвонҳо ба кокаин (4, 5). Бинобар ин, муайян кардани генҳои мақсадноке, ки аз ҷониби ΔFOSB танзим карда мешаванд, бояд ба фаҳмиши бештар дар бораи механизми молекулавии марбут ба нармафзори Кокаин мусоидат намояд. Ба наздикӣ, табобати музмини ҳайвонот бо кокаин нишон дод, ки тасвири кино-вобаста ба кинематографии 5 (Cdk5) ва фаъолкунандаи он p35 дар стриатсия тавассути таваллуди ΔFosB (6, 7).
Cdk5 аъзои оилаи Cdk kinines / threonine аст. Баръакси дигар Cdks, ки танзимгари асосии пешрафти пневматикӣ мебошанд, Cdk5 асосан ба фосфорпазии дандонҳо дар нетронти постетникӣ машғул аст (8). Таъсири мушакии Cdk5 бо роҳи пайвастан бо фаъолони он, ё p35 ё p39, ки асосан дар нишонаҳои ноткарнографӣ (8). Илова бар нақши муҳим дар бораи Cdk5 дар рушди рӯҳонӣ (9, 10), iТип низ дар интиқоли dopaminergic дар пӯсти постулятсия (11, 12). Пешгирӣ кардани фаъолияти Cdk5 ба афзоиши допамин дар стриатом, ки нишон медиҳад, ки функсияи препаратори Cdk5 ҳамчун танзимгари манфии таркиби допамен (11). Инчунин, Cdk5 самаранокии пањншавии пањншавии пањншавии пањншавии допаминро бо фосфлоринги фосфопротеин ва фишори функсионалии phosphoprotein, омехтаи молекулаи 32 kDa (DARPP-32) дар Thr-75, ки ба DARPP-32 ба пешгирандаи CINP-dependence kinase (PKA) (12).
Ин мушоҳидаҳо нишон медиҳанд, ки Cdk5 ва p35 танзимкунандаи поёнии фаъолсозии допамини нишондиҳандаҳои дарозмуддат ба кокаин ва аз ин рӯ, дар саноати коксӣ мебошанд. Барои минбаъд нақши нақши Cdk5 оид ба нишондиҳандаи допамини стриалалалӣ, мо ду хатҳои мобилии transgenicро, ки дар он ҷо Cdk5 ё p35 махсусан дар нейронҳо зери назорати пешбарандаи P35 мушоҳида карда шуда буд, истеҳсол кардем. Натиҷаҳои мо нишон доданд, ки фаъолияти Cdk5 бо баланд бардоштани сатҳи сафедаи P35, вале на сафедаи Cdk5, ки тавсия дода мешавад, ки сатҳи сафедаи P35 ба фаъолияти Cdk5 маҳдуд аст. Мо дар ин ҷо таъмин мекунем дар вирус Кадом далелҳо, ки фаъолияти Cdk5-ро баланд бардоштан мумкин аст, ки дар натиҷаи зиёдшавии p35 боиси сустшавии нишондиҳандаи допамини координатсионӣ ба nucleus тавассути интиқоли PKA ва сақичҳои сигнали танзимшудаи kinase (ERK) мегардад.
Мавод ва усул
Антибиотикҳо. Микроэлементҳои поликлонӣ ба Cdk5 (C-8) ва p35 (C-19) аз Санта Криз Biotechnology хариданд. Нишондиҳандаҳои мутобиқаткунанда ва муқовимати фосфорӣ ба киностудияи ERK (MEK) 1 / 2, ERK1 / 2, ва энергияи элементҳои компонентии CAMP-ро аз Технологии Sign Signaling Technology (Beverly, MA) гирифтаанд. Antibodies ба phospho-Thr-34 DARPP 32 (13), phospho-Thr-75 DARPP-32 (12), умумии DARPP-32 (12), ва c-fos (14) ҳамчун тавсиф шудаанд. Аналитик ба actin аз Sigma харидорӣ шуд.
Ҳайвоноти таҷрибавӣ. Мо қаблан генони p35 мӯйро клип карда будем Cdk5r1, ки онро сафедаи P35 encoded ва сохтори геномикии он (15). Барои эҷоди суръати транзистор бо энергияи кинофилмии p35 (Tgp35), 6-kb экоРИ-экоПарчами RI, ки дорои як минтақаи 1.2-kb потенсиалро ба pGEM9Z (-) плазмик карда мешавад ва аз тарафи SV45, ки аз SV40 ба даст меояд, XNUMX-bp KpnМан дар поёни поёни полис (А+) сигнал (Намоиши 1A). Тафсилот дорои як SpeМан барои генотипини ҳайвонот сайт ҳастам. Параграфи 6-kb аз плазмайд тоза карда шуд ва пас аз он, ки витамини варидии transgene барои истеҳсоли функсияи transgenic. Барои тафтиш кардани ифодаи ифодаи ифодаи transgene дар зери назорати танзимкунандаи promoter 1.2-kb p35 дар вирус, трафики дугаи транзикӣ (Tgp35; p35 - / -) бо истифода аз стратегияи чорводории чорводорӣ, ки тавассути он Tgp35 мӯй дар поёни P35-сарфи хотираи охирин барқарор шуд. Дигар моделҳои муш, ки дар ин тадқиқот истифода мешуданд, p35 +/-, p35 - / -, Cdk5 +/-, ва мӯйҳои transgenic бо эффектҳои невонокии Cdk5 (TgCdk5) (9, 16, 17). Генотипҳои ин мушҳо тавассути гузаронидани таҳлили клиникии клиникӣ ё PCR дар бораи DNA геломикӣ аз блокҳои деликатсионӣ муайян карда шуданд. Чизҳо дар зери 12-h сабук / 12-h торикӣ фаро гирифта шудаанд. Ҳамаи ғамхорӣ ба мувофиқа расид, ки мувофиқи Дастурамалҳои Миллии Саломатӣ оид ба ғамхорӣ ва истифодаи ҳайвоноти лабораторӣ ва таҷрибавӣ.
Таҳлили Blood Southern ДНК-и генетикӣ аз ғадуди думҳо бо ғизо гирифта шудааст экоРИ ва SpeМан, дар як 0.9% jel-agarose electrophoresed ва дар як мембранаи nylon интиқол. Мембрана бо як тасодуфи селексионӣ бо гибридизатсия шуд 32Шабакаи P-қайдшуда дар шабона 42 ° C. Санҷиши 485-bp барои зӯроварии p35 knockout (p35 - / -) ва миқдори Tgp35 аз ҷониби PCR бо истифода аз зерини зерсистемаҳои зерин истеҳсол карда шудаанд: 5'-ACATCCTGCTGCCACGGGGGGGG-3 ва 5-CCACTGTAAAAGCAACAAGA-3. Зарфҳои гибридӣ ду маротиба дар 2 × SSC / 0.1% SDS дар 42 ° C барои 10 min ва ду маротиба дар 0.1 × SSC / 0.1% SDS дар 65 ° C барои 20 min ва дучор ба филми рентгенӣ ду маротиба шуста шуданд.
Муносибати маводи мухаддир. Кокаин (Сигма) дар шӯрии sterile баста шудааст. Ҳайвонот баъди рагҳои коксини (15 мг / кг) ё ҳаҷмии шабонарӯзӣ дар синну солҳои 3 ва рагҳои хунрезиҳо (15, 30, 60 ва 120 min) баъд аз тазриқи он рехтанд. Сиёҳҳо зуд зуд бартараф карда шуданд ва дар яхбандии PBS хунук карда шуданд. Стипендҳо баъд аз таҳримҳо ва таҳлили квотаи шимолӣ ё ғарбӣ таҳти сарпараст қарор гирифтанд. Барои таҳлили immunohistochemical, қисмҳои striatal аз шиша 2 пас аз тазриқи.
Таҳлили Blood Northern. Ҳамагӣ RNA аз striata бо реаксияи TRIOLO (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) гирифта шуда, таҳлил карда шуд, ки таҳлили қабати шимолӣ ҳамчун тавсиф шудааст (18). Барои ошкор намудани м-коса мRNA, фишори 189-bp-и c-fos cDNA ҳамчун шарти ҳамчун тавсифшуда истифода шудааст (19). Сатҳи C-Фос mRNA бо андозагирии зичии оптикии блоки махсус бо истифода аз системаи таҳлили тасвир бо нармафзори nih image, Version 1.62.
Таҳлили ғарбӣ. Бӯйҳои шиддати дар 1% SDS ҳалқанд ва барои 10 min. Консентратсияи сафеда дар ҳар як намуна аз ҷониби протеин протеин BCA муайян карда шуд (Пирс). Миқдори баробарии сафедаҳо аз ҷониби SDS / PAGE ҷудо карда шуда, то он даме ки ба мембранаи нитрогенолит дода шудааст. Зарфҳо дар 1 × PBS дорои шири СННМО% ширин ва 5% Tween 0.05 баста шуданд ва дар як шабонарӯзи шабақа дар 20 ° C пайваст карда шудаанд. Истеҳсоли энергияи помидор ё фарбеҳро IgG (Sigma) дар ҳарорати хонагӣ барои 4 min анҷом дод. Шабака аз тарафи кимиёвии пурқувват (Пирс) ошкор карда шуд, ва зичии оптикии бандҳо, чунон ки дар боло тавсиф шудаанд.
Cdk5 Kinase Assay. Лексияҳои шиддат бо лимис лотерея, ки иборат аз 50 mM Tris · HCl, pH 7.4 / 50 mM NaCl / 5 mM EDTA / 1% Triton X-100 / 1mMDTT / 1 мммммммм флммметрсфлулил фтордор / 1 μg / ml aprotinin / 1 μg / mL leupeptin / phosphatase inhibitors (омехтаи фосфатик консентратор I ва II, Sigma). Лексияҳо бо анти-Cdk5 (C-8) ё antibodies anti-p35 (C-19) immunoprecified. Системаи Cdk5 immunoprecipitates бо ташаббуси HNUMX μl аз лотат (бо 300 μg сафеда), бо antibody anti-Cdk300 (5 μg) дар як шабонарӯз дар 3 ° C бо таҳлили минбаъдаи бо 4 μl аз Protein A-agarose (25 % slurry дар листис лимит; Санта Круз Биотехнология) барои 50 h дар 3 ° C. Барои тайёр кардани иммунопрозитҳои P4, 35 миқдори лотат (ба миқдори миқдори сафеда 500) бо antibody anti-p1 (35 μg) тавре, ки дар боло тасвир шудааст, баста шуд. Иммунопрофилитҳо ду маротиба бо лимос лизинг ду маротиба шустанд ва ду маротиба бо сегмент кинозаи иборат аз 3 mM Tris · HCl, pH 50 / 7.4 mM MgCl2/ 1 mM EDTA / 1 mM EGTA / 1 mM DTT, дар 60 μг аз интерфейси kinase resuspended. Фаъолияти функсия бо ёрии histone H1 ҳамчун substrate (18).
Иммунохогохимия Фариштаҳо бо ёрии ip-ро бо ёрии ip (250 мг / кг, Флюка) анализатсия намудаанд ва бо ёрии 0.1 M sodium phosphate tampon, pH 7.4, пас аз он, Стрек Текст Fixative (лабораторияҳои Strike, La Vista, NE), як услуби ғайримаъмулӣ. Меъёрҳои пинҳоншуда дар як шабонарӯзии шифобахш дар 37 ° C минбаъд низ буданд. Сипас, ғадуди сипаршакл дар paraffin, қисмҳои coronal 5-μм-пурдарахтро буриданд ва бо истифода аз усули комплексии провайдери биогин-peroxidase (варақаҳои виртуалӣ) бо диаминобenzidine ҳамчун асфалт истифода бурда шуданд. Қисматҳо бо антиоди поликлиникии осебпазирии муқовимати зидди C-фос дар як шабонарӯз дар 4 ° C пайваст карда шудаанд. Хусусияти шиддатнокӣ бо сабаби беэътибории antibody баҳогузорӣ карда шуд.
Натиҷаи
Насли фисаҳои Transgenic бо пневматикӣ NURONAL P35. Трансгенз барои истифода бурдани ифодаи нихоналии p35 fragment 6-kb аз рентгени p35 гентаи кинофестивали 1.2-kb ва пайдоиши рамзи P35 (Намоиши 1 A). Генотипҳои функсияҳо аз ҷониби таҳлили калий муайян карда шуданд, ки бо истифода аз скане, ки барои фарқ кардани p35 - / - ва мушакҳои Tgp35 аз фонт дар намуди мушакҳо (Намоиши 1 A ва B). Барои тафтиш кардани ифодаи транзенсия дар зери назорати ПРОФО-кb p1.2, мо формулаи дуҷонибаи transgenic (Tgp35; p35 - / -), ки дар он ифодаи p35 танҳо аз transgene интишор шудааст, пайдо кардем. Намоиши P35 дар Tgp35; p35 - / - мушакҳо танҳо дар мағзи сар мушоҳида мешуд (Намоиши 1C), ки дар он намунаи тасвирӣ ба он намуди мушакҳои ваҳшӣ монанд буд (Намоиши 1D). Набудани p35 нишон дод, ки ба сохтори қабати ғайримуқаррарӣ дар cortex мағзи ва hippocampus мушҳо (10). Бо вуҷуди ин, Tgp35; p35 - / - мушакҳо пурра наҷот ёфтани функсияи p35 - / - phenotype (Намоиши 1E). Ин маълумотҳо нишон доданд, ки promoter 1.2-kb p35 ифодаи transgene -ро бо намуди экрани монанд ба p35 аз gene p35 endogen назорат мекунад.
Сатҳи сафедаи P35-ро шарҳ додан - маҳдуд кардани қоидаҳои Cdk5. Мо таъсири ген-протеинро аз генҳои параметрҳои p35 ва Cdk5 бо тасвири сафедаҳо дар экспрессҳо аз p35 - / -, p35 +/-, намуди ваҳшӣ, Tgp35, Cdk5 +/- ва TgCdk5 дар синни моҳҳои 3 баррасӣ намуданд. Сатҳи сафедаҳои P35 ва Cdk5 инчунин бо навбатҳои генӣ мутаносибан (Намоиши 2 A ва B). Часпҳои Tgp35 нишон доданд, ки сатҳи баланди сафедаи p1.6-ро дар муқоиса бо мушакҳои вирусии намудҳои ≈35 нишон дод, аммо сатҳҳои сафедаи Cdk5 бо сатҳи гуногуни сафедаҳои P35 бетағйир монданд. Часпонҳои TgCdk5 нишон доданд, ки сатҳи баланди сафедаҳои Cdk1.9-ро дар муқоиса бо мушакҳои намуди вирусӣ нишон додаанд, аммо сатҳҳои гуногуни сафеда бо P5 бо сатҳи гуногуни протеин Cdk35 бетағйир монданд. Барои санҷиши таъсири миқдори гуногуни сафедаи P5 ба фаъолияти Cdk35, Cdk5 аз протсесҳои стриолиталӣ бо antibody anti-Cdk5 immunoprecipeded ва фаъолияти кинозатиро муайян карда шуд. Ҳамчунин, барои муайян кардани таъсири миқдори гуногуни сафедаҳои Cdk5 оид ба фаъолиятҳои кинематсионӣ, p5 аз протезаҳои стриолиталӣ бо antibody anti-p35 immunoprecipeded ва кинематсия фаъолият карда шуд. Фаъолияти Cdk35 хуб бо сатҳи сафедаи P5 алоқаманд аст, аммо бо сатҳи сафедаи Cdk35 (Намоиши 2 C ва D). Натиҷаҳои мазкур нишон доданд, ки миқдори сафедаҳои P35 омили суръатбахшии фаъолияти Cdk5 аст. Бинобар ин мо мушакҳоро барои Tgp35 истифода мебарем, то ки натиҷаҳои фаъолияти Cdk5-ро баланд бардоранд.
Phosphorylation of Cocaine-Induced DARPP-32 дар Тр-34 Дар Мавлуди Tgp35 ҷудошуда. Функсияи DARPP-32 вобаста ба фосфоригенти он дар якчанд сайтҳо вобаста аст (20). PKA fosforylates DARPP-32 дар Тр-34, дар ҳоле, ки Cdk5 fosforylates DARPP-32 дар Thr-75. Ҳамин тариқ, мо фосфатизатсияи ҳолати DARPP-32-ро дар экспертизаҳои стротатсионӣ аз мушакҳои ваҳшӣ ва Tgp35 тафтиш кардем. Дараҷаи phospho-Thr-75 DARPP-32 дар мушҳои Tgp35 баландтар буд (Намоиши 3A; 1.6 ± 0.2-ҳаҷм аз арзиши фисади намуди зот). Мо минбаъд ба таъсири фаъолияти Cdk5 оид ба нишондиҳандаи допамини стриаленталӣ арзёбӣ карда шуд. Мо аз фаъолшавии кокаин ба сабаби ПКК дар масофаи Tgp35 бо роҳи таҳлили ҳолати фосфорори DARPP-32 дар Т-34 тафтиш кардем. Дараҷаи phospho-Thr-34 DARPP-32 дар миқдори намуди зардобӣ 15 min баъди пошидани кокаин (Намоиши 3B; 1.8 ± 0.2-ҳаҷор аз сатҳи асосӣ). Бо вуҷуди ин, таъсири кокаин дар фоксортиқии Thr-34 аз DARPP-32 дар Tgp35 мушакҳо (1.2 ± 0.3 қитъаи асосӣ дар сатҳи асосӣ) зада шудааст. Натиҷаҳои мазкур нишон доданд, ки афзоиши фаъолияти Cdk5 фаъолшавии кокаин вобаста ба PKA метавонад ба воситаи фосфораи DARPP-32 дар Тр-75 (6, 12). Инчунин имконпазир аст, ки афзоиши фаъолии Cdk5-ро пешгирӣ карда, ба таркиби таркиби допамини коҳиш дода шавад ва ин ба пастшавии таъсири кокаин мусоидат мекунад. Яке аз вирусҳои кокси ба як воҳиди экологи (P35 ва Cdk5), инчунин фаъолияти киноНамоиши 3 C ва D). Ин дар муқоиса бо таҳқиқоти қаблӣ аст, ки дар он ранги сурх ба кокаин нишон дода шудааст - танзими ифодаи p35 ва Cdk5 (6).
Низомнома оид ба фаъолияти Cdk5 Агроинопатсияҳои фаъолсозии ERK1 / 2. Далелҳои охирин нишон медиҳанд, ки фаъолсозии допамин дар стриатор низ дигар сандуқҳои огоҳкуниро фаъол мекунад, аз ҷумла роҳи роҳи ERK (21, 22), ки дар аксуламали рафтор ба кокаин нақши муҳим дорад (23). Аз ин рӯ, мо тафтиш мекунем, ки оё фаъолияти Cdk5 ба фаъолшавии кокаин вобастааст. Пас аз фишори равонӣ аз фитнаи кокаин дар фиттаҳои гуногунрангии намудҳои заҳролудшуда, ки аз ҷониби зиёдшавии фосфорори MEK1 / 2 дар Ser-217 ва Сер-221 (1.5 ± 0.2-ҳаҷортар аз сатҳи асосӣ) ва ERK1 / 2 дар Тр-202 ва Tyr-204 (фосфор: ERNXXXXX-ҳо аз сатри поёнӣ) (Намоиши 4 A ва B). Бо вуҷуди ин, фаъолшавии кокаин ба сабаби MEK1 / 2 (1.2 ± 0.2-катӣ аз сатҳи асосӣ) ва ERK1 / 2 (ERK2 фосфатизат: 1.2 ± 0.2 қитъаи асосӣ аз сатҳи асосӣ) дар Tgp35 fares (Намоиши 4 A ва B). Илова бар ин, сатњи базавии phospho-ERK1 / 2 дар масофаи Tgp35 пасттар буданд (0.8 ± 0.2-кат аз арзиши фиттаҳои намуди ваҳшӣ), аммо ин тамоюли оммавӣ ба назар нарасид. Натиҷаи охирин ин метавонад ба фосфорияи вобаста ба Csk5 аз MEK1 дар Тр-286, ки боиси кам шудани фаъолияти catalytic шавад24). Барои арзёбии ин имконият, мо фосфатори MEK1 -ро дар Тр-286 тафтиш намуда, муайян кард, ки сатҳҳои баландтарини phospho-Thr-286 MEK1 дар массивҳои стриал аз мушакҳои Tgp35 мавҷуданд (Намоиши 4C; 1.3 ± 0.1-ҳаҷм аз арзиши фисади намуди зот). Ғайр аз ин, ҳолати фосфории MEK1 дар Тр-286 бо як муолиҷаи ягона кокаин бо тағйир ёфтани фаъолияти Cdk5 тавассути муолиҷа (Намоиши 3D).
Нашрияи Допам Signalро ба нусхабардорӣ аз ҷониби фаъолнокии Cdk5 суст карда шудааст. Фаъолияти коркарди Кокаин бо сабабҳои гуногуни сигналҳо бо иштироки PKA ва ERK боиси фаъолсозии минбаъдаи омилҳои транспепсияи CREB дар нусхабардорӣ тавассути фосфорааш дар Сер-133 (22, 25). Барои санҷидани он ки оё таъсири Cdk5-мутаносиби таъсири PKA ва пайвастшавии пайвастаи ERK метавонад ба функсияи CREB флюорогенӣ дар нуклеус алоқаманд бошад, мо функсияи функсияи CREB-ро дар Сер-133 дар намуди изолятсия аз намуди вирусӣ ва Tgp35 мушоҳида намудем. Сатҳи базавии фосфои-CREB дар масофаи Tgp35 паст буд (0.7 ± 0.1-пули арзиши мушакҳои намуди зард) (Намоиши 5). Дар ҷавоб ба вируси кокаин, сатҳи phospho-CREB дар стриатори мушакҳои намуди зард (1.5 ± 0.1-пӯст аз сатҳи асосӣ) афзоиш ёфт, аммо ин ҷавоб ба кокаин дар Tgp35 мушоҳида шуд (1.2 ± 0.1- қабат аз сатҳи асосӣ) (Намоиши 5).
Phosphorylation of CREB at Ser-133 фаъолияташро дар шакли крап дар ҷамоаи пешбарандаи генҳои алоҳида, аз он ҷумла гено-ген (26). Аз ин рӯ, мо пасандозҳои кокаинро дар истилоҳи Стратегияи навъи T-Type ва Tgp35 мушоҳида мекунем. Дар сатрҳои вирусӣ, сатҳии m-коса mRNA ба арзиши баландтарин (1.8 ± 0.2-ҳаҷортар аз сатҳи сатҳӣ) баъд аз тазриқи кокаин, сипас баъд аз насб (30 min) ба сатҳи поёнӣ баргаштНамоиши 6 A ва B). Бо вуҷуди ин, сатҳҳои c-fos mRNA ≈30% камтар дар фиссаҳои Tgp35 камтар аз даруни массиви ваҳшӣ то 30 пас аз тазриқӣ (Намоиши 6 A ва B). Маблағи камтар аз C-фос дар фисади Tgp35 минбаъд аз тарафи immunohistochemistry (Намоиши 6 C-F). Маъмурияти Кокаин ба immunoreactivity c-fos immuneoreactivity, қавӣ дар қисмҳои dorsomedial-dorsocy-striatum ва заиф дар қисмҳои lateral, дар ҳам дар намуди ваҳшӣ ва Tgp35 мушоҳида. Бо вуҷуди ин, афзоиши шумораи коэффисиенти кокаин, ки дар ҳуҷайраҳои Tgp35 ба мушоҳида мерасад,Намоиши 6G). Якљоя бо ин натиљањо нишон доданд, ки аломати коэффисиенталии допаменти нопелинї дар нуќтањои Tgp35, ки натиљаи фаъолияти Cdk5 ба вуљуд меояд, бартараф карда шуд.
мубоҳиса
Cdk5 ва фаъолкунандаи он p35 ҳамчун гендерҳои мақсаднок муайян карда шудаанд, ки онҳо бо косинус ба мушоҳида мерасанд (6). Мо дар ин ҷо нишон медиҳем, ки фаъолияти Cdk5, ки дар натиҷаи танзими P35, ба монанди танзимоти Cdk5 зиёд шуда истодааст, боиси сустшавии нишондиҳандаи допамини координатсионӣ дар нуриҳои стриаталалӣ мегардад. Барои фаҳмидани оқибатҳои таркиби танзимшавандаи Cdk5 ё p35 дар бораи нишонаи допамини стриаталиро, ду хатҳои миёнаи мобилии TgCdk5 ва Tgp35 тафтиш карда шуданд. Мо фаҳмидем, ки фаъолияти Cdk5 дар муқоиса бо сатҳи баландтарини сафедаи P35-ро танзим мекард, вале бо афзоиши баланди сафедаи Cdk5 таъсир нарасонид. Ҳисоботи пешакии мо ҳамчунин нишон дод, ки фаъолияти Cdk5 дар миқдори TgCdk5 миқдори каме аз мағзи сарчашмаҳои фосиқи пӯст, вақте ки фаъолият бо ёрии immunoprecipitates Cdk5 (17), тавсия дода мешавад, ки Cdk5 баландии изофӣ дар сатҳи баландтарини Cdk5 monomeric, агар сатҳи p35 зиёд нашавад. Натиҷаҳои мазкур нишон доданд, ки сатҳи сафедаи P35 омили суръатбахшии фаъолияти Cdk5 аст.
Часпонҳои Tgp35 нишондиҳандаи пасттарини фосилаи CREB ва функсияи C-fos дар стриатсия баъд аз пошидани шадиди кокаин, нишон доданд, ки аксуламали стротатсионӣ ба кокаин аз ҷониби фаъолшавии Cdk5 бартараф карда шуд. Натиҷаи нишондиҳандаи коэффисиентии кокаин вобаста ба допамен дар масофаи Tgp35 эҳтимолан тавассути Cdk5-мутаносиби пешгирии садамаҳои гуногунро дар бар мегирад, ки дар он DARPP-32, PKA ва ERK. Маъмурияти Кокаин фосфатсияи PARF-32-ро дар Тр-34 дар мушакҳои ваҳшӣ, ки ин рақам дар Tgp35 мушоҳида шудааст, афзоиш дод. Фаслияи PKA аз DARPP-32 дар Тр-34 нишон дод, ки фаъолияти фосфататори 1 (PP1), фермент, ки барои фишорбаландии Сер-133 CREB (27). Ҳамин тариқ, фаъолияти PP1 аз тариқи гузариши DARPP-32 / PP1 дар масофаи Tgp35 муқобил нест.
Фаъолияти Кокаин ба истиснои ERK1 / 2 низ дар масофаи Tgp35 низ афтод. Якчанд механизмҳои гуногун мавҷуданд, ки бо он Cdk5 фаъолкунии фаъолшавии ERC1 / 2 -ро дар бар мегирад. Аввалан, фосфории вобастагии Cdk5 аз DARPP-32 дар Тр-75 метавонад PKA-ро пинҳон кунад, ки минбаъд низ фаъолияташро ба MECHXXUMX / 1-ро, ки барои фаъолшавии ERK2 / 1 талаб карда мешавад, пешгирӣ кунад. Таҳқиқоти нав ҳамчунин муайян намудааст, ки фосфорори DARPP-2 дар Тр-32 барои фаъолшавии кокаин вобаста ба ERK34 / 1 бо роҳҳои гуногун бо ҷалби ғайримустақими фаъолияти фаъолонаи МЕК, инчунин ҷалби таносуби фосфат, фосфат, фосфат, ки бевосита ба ERK2 / 1 амал мекунад (28). Дастрасӣ ба ин имконият аз ҷониби дарёфти фосфатизатсияшудаи MEK1 / 2 дар Сер-217 ва Сер-221 дар мушҳо Tgp35 бекор карда шудааст. Роҳи дигари эҳтимолӣ аз фосфори тавлиди Cdk5 аз MEK1 дар Тр-286, ки боиси коҳиши фаъолияти catalytic он мегардад ва ба пешгирии фаъолияти ERK1 / 2 (24).
Пешгирии фаъолияти Cdk5 дар стриатсия нишон дод, ки таъсири таъсирноки рафтори хоси музмини кокси дар ҳайвонот (6). Мутобиқи гипотеза, танзими танзими фаъолияти Cdk5 метавонад ба мутобиқати ноқилӣ барои муқовимат бо таъсири маъмури кокси такрорӣ мусоидат кунад. (6), мо мефаҳмем, ки фосфоринатсияи Cdk5-mediated DARPP-32 ва MEK1 ба тақвият додани фаъолшавии кокаин вобаста ба ERK1 / 2, ки боиси кам шудани лавозимоти CREB ва c-fos дар стратата гардид. Натиҷаҳои мо дастгирии идеяро дастгирӣ мекунанд, ки фаъолияти Cdk5-ро дар натиҷаи тағйирёбандаи P35-ро баланд намуда, метавонад аз ранги сурх ба кокаин ба таври даврӣ дар экрани тағйир ёбад. Ин метавонад ба воситаи тағйирот дар фаъолияти омилҳои transcription, ба монанди CREB ва c-fos. Ҳамин тариқ, фаъолкунандаи Cdk5 p35, бо сабаби таъсири манфии он ба фаъолияти Cdk5, метавонад ба тағйироти дарозмуддат дар функсияҳои неврализатсионӣ дар соҳаи кокаин вобаста.
тасдиыот
Мо Д. Мария Ҷон Донон, Филип Грант ва Саши Кававапан барои хондани бениҳоят дастхат. Ин корҳо аз ҷониби Донишкадаи миллии тандурустии Грант Z01DE00664-05 (ба ABK), Грант DA10044, Хазинаи умумиҷаҳонии тандурустии ИМА ва грантҳо, Бунёди Симсон, Фонди Ҷ. Шарп ва Бунёди Порк (ба PG) дастгирӣ карда шуданд.
Заметки
Кадомҳо: Cdk5, kinin-dependence kinase 5; ERK, kinase танзими сигналҳои танзимшаванда; DARPP-32, допамин ва фосфопротетаи cAMP, омехтаи молекулавии 32 kDa; PKA, кинофестивали вобаста ба CAMP; MEK, kinase ERK; CREB, протеин-элементҳои элементҳои CAMP-ҷавоб.
Адабиёт
;