DeltaFosB ควบคุมกิจกรรมโปรโมเตอร์ Cck ทางอ้อม (2010)

ความต้านทานของสมอง 2010 อาจ 6; 1329: 10 – 20

เผยแพร่ออนไลน์ 2010 March 11 ดอย:  10.1016 / j.brainres.2010.02.081

PMCID: PMC2876727

John F. Enwright, III,¹ เมแกนวัลด์,¹ Madison Paddock,¹ Elizabeth Hoffman,¹ Rachel Arey,² Scott Edwards,² ซาดสเปนเซอร์,² Eric J. Nestler,³ และ Colleen A. McClung^{2 *}

ข้อมูลผู้แต่ง► ข้อมูลลิขสิทธิ์และใบอนุญาต►

ฉบับแก้ไขล่าสุดของผู้เผยแพร่บทความนี้มีอยู่ที่ สมอง Res

ดูบทความอื่น ๆ ใน PMC ที่ กล่าวถึง บทความที่ตีพิมพ์

ไปที่:

นามธรรม

การเปลี่ยนแปลงทางชีวเคมีโครงสร้างและพฤติกรรมที่สำคัญบางอย่างเกิดขึ้นจากการสัมผัสกับยาเสพติดอย่างไม่เหมาะสมปรากฏว่ามีการไกล่เกลี่ยโดยปัจจัยการถอดรหัสที่มีความเสถียรสูง BFosB งานก่อนหน้าแสดงให้เห็นว่าการแสดงออกของΔFosBในหนูเป็นระยะเวลานาน 2 ทำให้เกิดการแสดงออกของยีนหลายชนิดใน striatum ซึ่งส่วนใหญ่จะลดลงหลังจาก 8 สัปดาห์ต่อมาของการแสดงออกΔFosB สิ่งที่น่าสนใจคือยีนจำนวนมากเหล่านี้ถูกควบคุมในหนูที่แสดงออกถึงปัจจัยการถอดรหัสมากเกินไป ไม่ชัดเจนจากการศึกษาครั้งนี้ว่า whetherFosB ระยะสั้นควบคุมยีนเหล่านี้ผ่าน CREB หรือไม่ ที่นี่เราพบว่า 2 สัปดาห์ของ expressFosB การแสดงออกมากเกินไปจะเพิ่มการแสดงออกของ CREB ใน striatum ซึ่งเป็นเอฟเฟกต์ที่กระจายโดย 8 สัปดาห์. การเหนี่ยวนำเร็ว ๆ นี้เกี่ยวข้องกับ CREB ที่เพิ่มขึ้นซึ่งมีผลผูกพันกับโปรโมเตอร์ยีนเป้าหมายในพื้นที่สมองนี้ น่าแปลกที่ยีนหนึ่งตัวที่เป็นเป้าหมายของ CREB ที่น่าสงสัยตามรายงานก่อนหน้านี้ cholecystokinin (Cck), ไม่ได้ถูกควบคุมโดย CREB ใน striatum เพื่อตรวจสอบกฎระเบียบของ CCK ดังต่อไปนี้ expressFosB การแสดงออกมากเกินไปเรายืนยันว่าการแสดงออกในระยะสั้น expressFosB จะเพิ่มขึ้นทั้งคู่ CCK กิจกรรมโปรโมเตอร์และการแสดงออกของยีน นอกจากนี้ยังเพิ่มกิจกรรมที่มีผลผูกพันที่เว็บไซต์ CREB binding ผูกพัน (CRE) ใน CCK โปรโมเตอร์ อย่างไรก็ตามในขณะที่ไซต์ CRE จำเป็นสำหรับนิพจน์พื้นฐานปกติของ CCKไม่จำเป็นสำหรับการเหนี่ยวนำΔFosB CCK. เมื่อนำมารวมกันผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าในขณะที่การเหนี่ยวนำ BFosB ในระยะสั้นจะเพิ่มการแสดงออกของ CREB และกิจกรรมที่ยีนโปรโมเตอร์บางตัวนี่ไม่ใช่กลไกเดียวที่ยีนจะถูกควบคุมภายใต้เงื่อนไขเหล่านี้

คำสำคัญ: นิวเคลียส accumbens ถอดความติดยาเสพติด

ไปที่:

บทนำ

การได้รับสารเสพติดอย่างเรื้อรังทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงทางชีวเคมีและโครงสร้างในหลายพื้นที่ของสมอง การเปลี่ยนแปลงเหล่านี้เป็นความคิดที่เกี่ยวข้องกับการเปลี่ยนแปลงในโปรไฟล์การแสดงออกของยีนในระบบ mesolimbic ระบบนี้ประกอบด้วย dopaminergic neurons ซึ่งโครงการจาก ventral tegmental area (VTA) ใน midbrain ไปจนถึง spiny neurons กลางในนิวเคลียส accumbens (NAc) (ventral striatum) รวมถึงบริเวณอื่น ๆ ของสมอง การเปลี่ยนแปลงในกิจกรรมของสองปัจจัยการถอดความองค์ประกอบโปรตีนตอบสนองค่าย (CREB) และΔFosB (โปรตีนครอบครัว Fos) ได้รับการเสนอเพื่อเป็นสื่อกลางในการเปลี่ยนแปลงทางชีวเคมีโครงสร้างและพฤติกรรมที่เห็นด้วยยาเสพติดเรื้อรัง ( ตรวจสอบโดย Nestler, 2005).

CREB เป็นปัจจัยการถอดความที่แสดงออกอย่างแพร่หลายซึ่งเป็นสมาชิกของตระกูล CREB / ATF CREB homodimers เชื่อมโยงกับความแตกต่างของลำดับ CRE (ฉันทามติ: TGACGTCA) ที่พบในโปรโมเตอร์ของยีนหลายชนิด การสร้างฟอสฟอรัสของ CREB (มีอิทธิพลเหนือซีรีน 133 แม้ว่าจะมีการระบุตำแหน่งอื่น) สามารถถูกกระตุ้นโดยการส่งสัญญาณลดหลั่นหลาย ๆ อันรวมไปถึงตัวรับโดปามีน (ดาวน์สตรีม)Cole et al., 1995) เมื่อ phosphorylation ที่ serine 133, CREB รับสมัคร co-activator CREB binding protein (CBP) หรือโปรตีนที่เกี่ยวข้องซึ่งนำไปสู่การแสดงออกของยีนที่เพิ่มขึ้น (ทบทวนโดย Johannessen และคณะ, 2004). การได้รับสารเรื้อรังจากยาเสพติดหรือยาเสพติด psychostimulant ของการละเมิดทำให้เกิดการเพิ่มขึ้นชั่วคราวของกิจกรรม CREB ในนิวเคลียส accumbens (Barrot และคณะ, 2002; Shaw-Lutchman และคณะ, 2002, 2003), การปรับความคิดเพื่อลดคุณสมบัติที่คุ้มค่าของยาเหล่านี้และนำไปสู่ภาวะอารมณ์เชิงลบของการถอนยา (Nestler, 2005).

Lการดัดแปลงยาเสพติดเป็นเวลานานนั้นถือว่าเป็นส่วนหนึ่งของΔFosBซึ่งเป็นตัวแปรต่อเนื่องที่มีความเสถียรสูงของ FosB (Nestler et al., 1999; McClung และคณะ, 2004; Nestler, 2008) สมาชิกในครอบครัว Fos ลดขนาดลงกับสมาชิกของตระกูล Jun เพื่อสร้างโปรตีน activator 1 (AP-1) คอมเพล็กซ์การถอดรหัส AP-1 เชื่อมโยงกับการเปลี่ยนแปลงขององค์ประกอบการตอบสนอง AP-1 (ฉันทามติ: TGACTCA) เพื่อควบคุมการถอดความ (ตรวจสอบโดย Chinenov และ Kerppola, 2001) ในขณะที่การสัมผัสกับยาเสพติดอย่างรุนแรงนำไปสู่การเหนี่ยวนำอายุสั้น ๆ ของสมาชิกในครอบครัว Fos (รวมถึงกิจกรรม CREB ที่เพิ่มขึ้น) การได้รับยาซ้ำ ๆ จะทำให้เกิดการสะสมของ stableFosB ที่เสถียรสูงความหวังและคณะ, 1994; Perrotti et al., 2008) การแสดงออกซึ่งยังคงมีอยู่หลายสัปดาห์

หนู bi-transgenic ที่กระตุ้นให้เกิดการแสดงออกมากเกินไปเช่นΔFosBหรือ CREB ใน striatum สำหรับผู้ใหญ่แสดงฟีโนไทป์ทางชีวเคมีและพฤติกรรมหลายอย่างที่เห็นในสัตว์ที่สัมผัสซ้ำ ๆ กับ psychostimulants หรือยาอื่น ๆ ในทางที่ผิด การวิเคราะห์การแสดงออกของยีนในสัตว์ดัดแปลงพันธุกรรมเหล่านี้ระบุว่ายีนจำนวนมากถูกควบคุมโดยการแสดงออกในระยะสั้น (2 สัปดาห์) การแสดงออกของΔFosBการเปลี่ยนแปลงที่เกี่ยวข้องกับการลดลงของรางวัลยาเสพติด การเปลี่ยนแปลงของการแสดงออกของยีนและการตอบสนองเชิงพฤติกรรมกับΔFosBระยะสั้นมีความคล้ายคลึงกับที่เห็นในสัตว์มากเกินไป CREB สำหรับ 2 หรือ 8 สัปดาห์ (McClung และ Nestler, 2003) ในทางตรงกันข้ามที่โดดเด่นการแสดงออกในระยะยาว (8 สัปดาห์) ของΔFosBลดการแสดงออกของยีนเดียวกันเหล่านี้จำนวนมากและนำไปสู่การเพิ่มขึ้นของรางวัลยา (Kelz และคณะ, 1999; McClung และ Nestler, 2003).

ยีนหนึ่งที่ระบุในการศึกษาเหล่านี้คือ cholecystokinin (CCK) neuropeptide ที่เกิดขึ้นในบริเวณสมองหลายแห่งรวมถึง striatum (Hokfelt และคณะ, 1980) CCK สามารถปรับส่ง dopaminergic (Vaccarino, 1992) มีส่วนร่วมในการให้รางวัลและการสนับสนุนยา (Josselyn et al., 1996; Josselyn et al., 1997; แฮมิลตันและอื่น ๆ 2000; Beinfeld et al., 2002; Rotzinger และคณะ, 2002) และเหนี่ยวนำให้เกิดใน striatum โดยโคเคนเรื้อรัง (Ding และ Mocchetti, 1992) นอกจากนี้ CCK โปรโมเตอร์ได้รับการแสดงเพื่อตอบสนองต่อทั้งคอมเพล็กซ์ CREB และ AP-1 (Haun และ Dixon, 1990; Deavall และคณะ 2000; Hansen, 2001) เนื่องจากมียีนหลายตัว (รวมถึง CCK) ที่แสดงการแสดงออกที่เพิ่มขึ้นตามทั้ง CREB และการแสดงออกระยะสั้นΔFosBเป็นที่รู้จักหรือสงสัยว่ายีนเป้าหมายของ CREB (McClung และ Nestler, 2003) เราต้องการตรวจสอบว่าการแสดงออกของΔFosBระยะสั้นนำไปสู่การควบคุมยีนเหล่านี้หรือไม่ CCK) ผ่านการควบคุมของ CREB หรือผ่านกลไกที่ซับซ้อนมากขึ้นของการควบคุมยีน

ไปที่:

ผล

expressFosB การแสดงออกมากเกินไปเพิ่มระดับ CREB ชั่วคราว

เราใช้ blotting ตะวันตกเพื่อตรวจสอบว่า expressFosB overexpression เพิ่มระดับโปรตีน CREB ใน striatum ของหนู สำหรับการศึกษานี้เราใช้หนูสองพันธุ์ (สาย 11A) ซึ่งมีทั้งยีน NSE-tTA และยีน TetOp-ΔFosB ในกรณีที่ไม่มี doxycycline หนูเหล่านี้แสดงการเพิ่มขึ้นอย่างแข็งแกร่งในการแสดงออกของΔFosBในนิวรอนบวกของเซลล์ประสาท dynorphin ใน striatum (Kelz และคณะ, 1999) วิธีการ overexpressing นี้ΔFosBได้รับการบันทึกอย่างกว้างขวางและอนุญาตให้มีการแสดงออกมากเกินไปเฉพาะภูมิภาคซึ่งมีความคล้ายคลึงกับการเหนี่ยวนำΔFosBที่เห็นในสัตว์ที่สัมผัสกับโคเคนเรื้อรัง (ความหวังและคณะ, 1994; Kelz และคณะ, 1999) เราพบว่าในหนู 11A ที่แสดงออกมาเกินΔFosBระดับโปรตีน CREB ได้รับการควบคุมอย่างมีนัยสำคัญหลังจากสัปดาห์ที่ 2 แสดงออกและระดับเหล่านี้กลับสู่ระดับพื้นฐานหลังจากสัปดาห์ที่ 8 แสดงออกมา (รูปที่ 1A, n = 8) เพื่อตรวจสอบว่าการเปลี่ยนแปลงของระดับ CREB ที่มีการแสดงออกมากเกินไปΔFosBในระยะสั้นสามารถจำลองแบบในระบบอื่นได้หรือไม่เราได้แสดงΔFosBในเซลล์ PC12 มากเกินไปชั่วคราวและพบว่าระดับ CREB เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ (p <0.05) เมื่อเปรียบเทียบกับการควบคุม (รูปที่ 1B, n = 4) ผลลัพธ์เหล่านี้แสดงให้เห็นว่าการแสดงออกΔFosBระยะสั้นเพิ่มระดับโปรตีน CREB

รูป 1

ระดับ CREB เพิ่มขึ้นด้วย expressFosB การแสดงออกมากเกินไป การวิเคราะห์ blot ตะวันตกของ lysates จาก (A) เม้าส์ striata จากหนู 11A off dox สำหรับ 2 หรือ 8 สัปดาห์หรือ (B) เซลล์ PC12 แสดงผลมากเกินไปΔFosB ข้อมูลใน A แสดงเป็นเปอร์เซ็นต์การเปลี่ยนแปลงใน off dox ที่เปรียบเทียบ ...

ทั้งΔFosBและ CREB ผูกกับโปรโมเตอร์ของยีนเป้าหมายที่เฉพาะเจาะจงใน striatum หลังจากการแสดงออกของΔFosBในระยะสั้น

เราใช้การตรวจ ChIP (การกระตุ้นด้วยโครมาตินโครมาติคอล) เพื่อตรวจสอบว่ามีการจับΔFosBหรือ CREB ในการส่งเสริมยีนเป้าหมายที่แน่นอนหรือไม่และถ้าการจับนี้เพิ่มขึ้นหลังจากการแสดงออกของ overFosB เราวิเคราะห์ความผูกพันที่ BDNF และ CCK โปรโมเตอร์เนื่องจากยีนทั้งสองมี upregulated สูงหลังจากระยะสั้น expressFosB overexpression, CREB overexpression หรือการรักษาโคเคนเรื้อรัง (McClung และ Nestler, 2003) นอกจากนี้เรายังวิเคราะห์ความผูกพันที่ CDK5 ผู้ก่อการเนื่องจากเป็นเป้าหมายโดยตรงที่เป็นที่รู้จักของΔFosB (เฉินและคณะ, 2000; Bibb et al., 2001; Kumar et al., 2005) ในที่สุดเราก็วัดความผูกพันที่ prodynorphin ผู้ก่อการเนื่องจากการศึกษาก่อนหน้านี้พบว่ามันสามารถผูกพันได้ทั้งΔFosBและ CREB ภายใต้เงื่อนไขที่แตกต่างกัน (Andersson และคณะ, 2001; Zachariou และคณะ, 2006).

การวิเคราะห์ ChIP ได้ดำเนินการกับ striata จากหนู 11A ที่ส่งเสียงเกินจริงΔFosBเป็นเวลา 2 สัปดาห์โดยใช้แอนติบอดีที่รู้จัก CREB หรือΔFosB ภายใต้สภาวะปกติเราพบว่าΔFosBเชื่อมโยงกับ CDK5 และ prodynorphin ผู้สนับสนุนในขณะที่ไม่มีการเชื่อมโยงที่ตรวจพบได้ที่ BDNF or CCK ผู้สนับสนุน1 ตาราง) นอกจากนี้ΔFosBการแสดงออกที่มากขึ้นเพิ่มการเชื่อมโยงของΔFosBที่ CDK5 ผู้ก่อการ แต่ไม่ได้อยู่ที่ prodynorphin โปรโมเตอร์ ต่อไปเราวัดค่า CREB ผูกพันที่ผู้สนับสนุนเหล่านี้และพบว่า CREB ผูกกับ CDK5, BDNF และ prodynorphin โปรโมเตอร์ แต่ไม่ถึง CCK โปรโมเตอร์, ใน striatum ปกติ, และΔFosBการแสดงออกมากเกินไปสำหรับ 2 สัปดาห์เพิ่ม CREB ผูกพันที่ BDNF และ prodynorphin โปรโมเตอร์ แต่ไม่ใช่ CDK5 โปรโมเตอร์ เมื่อนำมารวมกันผลลัพธ์เหล่านี้แสดงให้เห็นว่าΔFosBและ CREB สามารถผูกกับผู้สนับสนุนยีนบางอย่างเช่น prodynorphin และ CDK5อย่างไรก็ตามการผูก CREB นั้นมีลักษณะเฉพาะสำหรับโปรโมเตอร์อื่นเช่น BDNF. นอกจากนี้ expressFosB การแสดงออกที่มากเกินไปนำไปสู่การเพิ่มขึ้นของ bindingFosB ที่ผู้สนับสนุนบางรายตามที่คาดไว้ แต่ยังรวมถึง CREB ที่ผูกมัดกับผู้สนับสนุนที่เฉพาะเจาะจงซึ่งสอดคล้องกับการเหนี่ยวนำ CREB-mediated ที่สังเกตได้ในเวลานี้

1 ตาราง

การเชื่อมโยงโปรตีนควบคุมตามกฎเกณฑ์ให้กับโปรโมเตอร์ต่างๆในหนูที่มีการแสดงออกมากเกินไปΔFosBเป็นเวลาสองสัปดาห์

งานก่อนหน้าแสดงให้เห็นว่าการเปลี่ยนแปลงในการแสดงออกของยีนที่เกิดจากการแสดงออกในระยะยาวของΔFosBเกี่ยวข้องกับการดัดแปลงโครมาตินโดยเฉพาะ acetylation ของฮิสโตน H3 ที่โปรโมเตอร์ยีนเฉพาะ (Kumar et al., 2005) เพื่อตรวจสอบว่าสิ่งนี้สามารถบัญชีสำหรับการเปลี่ยนแปลงในการแสดงออกของยีนในระยะสั้น expressFosB overexpression เราวัดการรวมของ acetylated histone H3 (การดัดแปลงฮิสโตนที่เกี่ยวข้องกับ transcriptionally active chromatin) หรือ methylated histone H3 (Lys9 chromatin ที่ไม่ใช้งาน) เราพบว่าการแสดงออกของΔFosBมากเกิน 2 เป็นเวลาหลายสัปดาห์ทำให้ไม่มีการเปลี่ยนแปลงในการเชื่อมโยงของ acetylated H3 ที่ใด ๆ ของยีนโปรโมเตอร์ที่ศึกษา (1 ตาราง) เราพบว่าการลดลงอย่างมีนัยสำคัญในการจับของ methylated histone H3 ที่ prodynorphin ผู้ก่อการ แต่ไม่มีผลผูกพันกับ CCK ผู้ก่อการและไม่มีการเปลี่ยนแปลงในการผูกพันที่ CDK5 และ BDNF ผู้สนับสนุนบอกว่านี่ไม่ใช่กลไกทั่วไปที่ byFosB ในระยะสั้นควบคุมการแสดงออกของยีน เรารู้สึกประหลาดใจและให้ความสนใจกับความจริงที่ว่าเราไม่พบความแตกต่างในการทดสอบ ChIP ของเราซึ่งสามารถอธิบายถึงการเพิ่มขึ้นของ CCK การแสดงออก mRNA ในหนู 11A หลังจาก 2 สัปดาห์ของการแสดงออกΔFosBและตัดสินใจที่จะตรวจสอบกลไกนี้ต่อไป

ระยะสั้นΔFosBเพิ่มขึ้น CCK การแสดงออกในหลายระบบ

การจำแนกลักษณะของ microarray ของหนู 11A bi-transgenic overexpressing ΔFosBใน striatum พบว่า CCK ระดับการแสดงออกเพิ่มขึ้นตาม 2 สัปดาห์ของการแสดงออกมากเกินไปและจากนั้นค่อยๆลดลงด้วยระยะเวลานานของการแสดงออกΔFosB (รูปที่ 2A, n = 3) เราตรวจสอบผลกระทบนี้สำหรับ CCK ใช้ PCR แบบเรียลไทม์ในกลุ่มสัตว์แยกกลุ่มที่ 2 และ 8 สัปดาห์และพบผลลัพธ์ที่จุดสองจุดที่คล้ายคลึงกับการวิเคราะห์ microarray (ไม่แสดงข้อมูล)

รูป 2

การแสดงออกในระยะสั้นของ increasesFosB เพิ่มขึ้น CCK การแสดงออกของยีน (A) CCK การแสดงออก mRNA ใน striatum หลังจากΔFosB overexpression ในหนู 11A สำหรับ 1, 2, 4 หรือ 8 สัปดาห์ การวิเคราะห์ไมโครเรย์ดำเนินการกับตัวอย่างของการคลอดและ CCK ระดับ ...

เพื่อตรวจสอบเพิ่มเติมความสามารถของΔFosBในการควบคุม CCK การแสดงออกเราใช้เซลล์ PC12 transfected transiently กับ CCK-luciferase นักข่าวพลาสมิดและพลาสมิดนิพจน์ΔFosBหรือ pCDNA จำนวนเท่ากัน ทั้งสอง (n = 5-9) และสาม (n = 11-13) วันของ overFosB การแสดงออกมากเกินไปทำให้เกิดการเพิ่มขึ้นอย่างมากใน CCKการแสดงออก -luciferase นอกจากนี้สามวันของ expressFosB การแสดงออกมากเกินไปส่งผลให้มีความหมายมากขึ้น CCK-luciferase เหนี่ยวนำเมื่อเปรียบเทียบกับสองวันของการแสดงออกมากเกินไป (รูปที่ 2B) การแสดงออกที่มากเกินไปของΔFosBไม่ได้ทำให้เกิดการแสดงออกของโปรโมเตอร์ luciferase ที่ไม่สามารถสร้างได้ (ไม่แสดงข้อมูล) ภายใต้เงื่อนไขที่ไม่มีการรักษาก็ลดลง CCKกิจกรรม -luciferase ชัดเจน ผลลัพธ์เหล่านี้แสดงว่าการแสดงออกระยะสั้นΔFosBช่วยเพิ่มกิจกรรมของ CCK โปรโมเตอร์และยังไม่ได้ตอบกลไกโดยที่ΔFosBระงับการแสดงออกในระยะยาว CCK การแสดงออก

expressFosB overexpression เพิ่มการเชื่อมโยงที่เว็บไซต์ CREB ที่มีผลผูกพันสมมุติใน CCK โปรโมเตอร์

การวิเคราะห์ของเราพบว่า CCK การแสดงออกเพิ่มขึ้นหลังจากการแสดงออกในระยะสั้น BFosB อย่างไรก็ตามการตรวจสอบ ChIP ของเราพบว่าทั้ง CREB และΔFosBไม่ได้ผูกกับ CCK โปรโมเตอร์ เพื่อตรวจสอบว่ามีการเปลี่ยนแปลงใด ๆ ในการจับโปรตีนที่ CCK โปรโมเตอร์ดังต่อไปนี้ expressFosB มีการแสดงออกมากเกินไปเราใช้ electrophoretic mobility shift assays (EMSA) กับโพรบที่มีไซต์เหมือน CRE CREATIVE อยู่ภายใน CCK โปรโมเตอร์ การใช้สารสกัดจากนิวเคลียร์จาก striata ของหนู 11A overexpressing ΔFosBสำหรับ 2 สัปดาห์เราพบการเพิ่มขึ้นของการผูกกับไซต์ CRE สมมุติใน CCK ผู้ก่อการรูปที่ 3 A, C, n = 4) สิ่งที่น่าสนใจคือหนู 11A ที่ส่งเสียงเกินจริงΔFosBเป็นเวลา 8 สัปดาห์ซึ่งแสดงการลดลงของ CCK การแสดงออกยังแสดงให้เห็นถึงความผูกพันที่เพิ่มขึ้นในเว็บไซต์นี้ (รูปที่ 3B, C, n = 4) จากการเปรียบเทียบเราตรวจสอบการเชื่อมโยงไปยังไซต์ CRE cons ฉันทามติในหนู overexpressing ΔFosBสำหรับ 2 สัปดาห์และพบว่า CRE ที่มีประสิทธิภาพในสารสกัดจาก striatal แต่ไม่มีการเพิ่มขึ้นของการผูกพันตามΔFosBเหนี่ยวนำ (รูปที่ 3F, n = 4) ดังนั้นแม้จะมีระดับเพิ่มขึ้น osFosB ในระดับ CREB ทั้งหมดที่เห็น ณ จุดนี้ผลลัพธ์เหล่านี้สอดคล้องกับ ChIP assays ของเราซึ่งพบว่าการเพิ่ม CREB ผูกพันที่โปรโมเตอร์ต่อไปนี้ overFosB overexpression นั้นเฉพาะยีนบางตัวเท่านั้น . เพื่อตรวจสอบว่า CREB ถูกผูกไว้กับ CCK โปรโมเตอร์ในการวิเคราะห์ EMSA ของเราเราทำการตรวจวิเคราะห์ด้วย supershift ด้วยแอนติบอดีจำเพาะ CREB ตามข้อตกลงกับการตรวจ ChIP ของเราเราไม่พบการผูกมัดของ CREB กับ a CCK โพรบที่มีไซต์ putative CRE ในการตรวจ EMSA ในขณะที่ CREB ทำการผูกและสร้างไซต์ cons CRE CRE ที่สอดคล้องกันอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 3D, E, n = 4) กิจกรรมจับดีเอ็นเอที่ CCK โปรโมเตอร์ไม่ได้รับผลกระทบจากแอนติบอดีต่อΔFosB (ไม่แสดงข้อมูล) ภายใต้เงื่อนไขที่แสดงในการศึกษาหลายครั้งก่อนหน้าในการปิดกั้นΔFosBที่เชื่อมโยงกับไซต์ AP-1 โดยสุจริต เฉินและคณะ, 1995, Hiroi et al., 1998) นอกจากนี้เรายังทำการทดสอบ ChIP กับชุดสัตว์ 11A หลังจาก 8 สัปดาห์ของการแสดงออกΔFosBและยังไม่พบ CREB หรือ bindingFosB ที่ CCK โปรโมเตอร์ (ไม่แสดงข้อมูล) ดังนั้นการแสดงออกของΔFosBจะนำไปสู่การเพิ่มขึ้นของการจับโปรตีนที่ CCK ก่อการหลังจากทั้ง 2 และ 8 สัปดาห์ของการแสดงออก อย่างไรก็ตามตัวตนของปัจจัยเหล่านี้ยังไม่ทราบ

รูป 3

การจับโปรตีนที่ CCK โปรโมเตอร์ (A, B) การทดสอบการเคลื่อนย้ายด้วยไฟฟ้าโดยใช้ CCK เว็บไซต์ที่มีลักษณะคล้าย CRE ที่มีเนื้อเยื่อจากต้นกำเนิดจากสัตว์ที่มีการแสดงออกมากเกินไปΔFosBเป็นเวลา 2 สัปดาห์ (A) หรือ 8 สัปดาห์ (B) ใน (A) การแข่งขันกับคู่แข่งที่ไม่มีป้ายกำกับส่วนเกิน ...

เว็บไซต์ CRE สมมุติใน CCK ผู้ก่อการจะไม่รับผิดชอบต่อกิจกรรมของผู้ก่อการที่เพิ่มขึ้น

เนื่องจากเราพบการเพิ่มขึ้นของโปรตีนที่จับกันโดยใช้ชิ้นส่วนของ CCK ผู้ก่อการซึ่งมีเว็บไซต์สมมุติสมมุติดังต่อไปนี้ expressFosB แสดงออกมากเกินไปเราต้องการที่จะตรวจสอบว่าเว็บไซต์นี้มีความจำเป็นสำหรับการเพิ่มขึ้น CCK นิพจน์ติดตามΔFosB เพื่อทดสอบความเป็นไปได้นี้เราแปลงเซลล์ PC12 ด้วย a CCK-luciferase พลาสมิดที่มีเว็บไซต์เหมือน CRE หรือไม่ก็มีการกลายพันธุ์ในเว็บไซต์ที่จะยกเลิกการมีปฏิสัมพันธ์กับ CREB สิ่งที่น่าสนใจคือการกลายพันธุ์ของเว็บไซต์ที่คล้าย CRE นั้นทำให้ฐานลดลง CCK กิจกรรมโปรโมเตอร์โดย 32% (รูปที่ 4A, n = 9) แต่ไม่มีผลต่อ CCK การเหนี่ยวนำของผู้ก่อการโดยการแสดงออกมากเกินไปΔFosB (รูปที่ 4B, n = 11-13) สิ่งนี้แสดงให้เห็นว่าถึงแม้ว่า CCK โปรโมเตอร์ต้องการไซต์ที่เหมือน CRE แบบไม่บุบสลายสำหรับกิจกรรมพื้นฐานเต็มรูปแบบกิจกรรมโปรโมเตอร์ที่เพิ่มขึ้นซึ่งเกิดจาก BFosB การแสดงออกมากเกินไปไม่ต้องการลำดับ CRE คล้าย

รูป 4

พื้นที่ CCKไซต์ CREAT ที่เหมือนกันไม่จำเป็นสำหรับ CCK การเหนี่ยวนำโดยΔFosB (A) CCK-luciferase วัดกิจกรรม 2 วันหลังจากการถ่ายเลือดด้วยวิธีปกติ CCK-luciferase หรือไซต์ที่มีลักษณะคล้าย CRE ถูกกลายพันธุ์ * หน้า <0.05 (B) CCK-luciferase ...

cFos เชื่อมโยงกับ CCK โปรโมเตอร์

การศึกษาก่อนหน้านี้ได้พบว่า cFos mRNA เพิ่มขึ้นด้วยการแสดงออกในระยะสั้นΔFosBอย่างไรก็ตามหลังจากการแสดงออกΔFosBเป็นเวลานานความสามารถในการรักษาโคเคนเพื่อกระตุ้น cFos ใน striatum จะลดลง (McClung และ Nestler, 2003; Renthal et al., 2008) ดังนั้นอาจเป็นไปได้ว่า cFos มีส่วนช่วยในการเพิ่มขึ้น CCK นิพจน์ตามนิพจน์ΔFosBระยะสั้น เราทำการทดสอบ ChIP ด้วยแอนติบอดี้ที่เฉพาะเจาะจงสำหรับ cFos และวัดการผูก cFos ที่ CCK โปรโมเตอร์ที่มีและไม่มีนิพจน์ΔFosBระยะสั้น ในขณะที่เราพบว่า cFos เชื่อมโยงกับ CCK โปรโมเตอร์การรวมนี้ไม่เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญหลังจาก expressFosB overexpression (รูป 5, n = 5) สิ่งนี้ชี้ให้เห็นว่าตั้งแต่ cFos ผูกมัด CCK ผู้ก่อการอาจนำไปสู่กฎระเบียบทั่วไปของ CCK การแสดงออก แต่มันอาจจะไม่เกี่ยวข้องกับการควบคุมของ CCK โปรโมเตอร์โดยΔFosB

รูป 5

cFos เชื่อมโยงกับ CCK โปรโมเตอร์ การตรวจหาระดับโครโมโซมโดยใช้แอนติบอดีจำเพาะสำหรับ cFos โดยใช้เนื้อเยื่อที่อยู่ในลักษณะเด่นจากΔFosBที่หนูแสดงออกมากเกินไปทั้งบน dox หรือหลังจาก 2 สัปดาห์ของการกำจัด dox การวิเคราะห์ PCR แบบเรียลไทม์คือ ...

ไปที่:

อภิปราย

การศึกษานี้ยืนยันและขยายผลการค้นพบก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่าΔFosBควบคุมการแสดงออกของยีนใน striatum และเราพบว่ามันทำเช่นนั้นผ่านกลไกหลายอย่างหลังจากการแสดงออกในระยะสั้น เราแสดงให้เห็นว่าหลังจาก 2 หลายสัปดาห์ของการแสดงออกมากเกินไปΔFosBเชื่อมโยงโดยตรงกับโปรโมเตอร์ในยีนบางตัวที่นำไปสู่การเปลี่ยนแปลงในการแสดงออก (เช่น CDK5) ยิ่งไปกว่านั้นมันจะเพิ่มโปรตีนในระดับ CREB ซึ่งเป็นผลที่สังเกตได้ในเซลล์ที่เพาะเลี้ยงเช่นเดียวกับใน striatum ซึ่งนำไปสู่การเพิ่ม CREB ผูกพันกับยีนตัวอื่น ๆ (เช่น dynorphin และ BDNF) ในการศึกษาก่อนหน้านี้เราพบว่าการแสดงออกเกินระยะสั้นของΔFosBใน striatum นำไปสู่การเปลี่ยนแปลงการแสดงออกของยีนเดียวกันหลายครั้งที่พบเมื่อ CREB แสดงออกมากเกินไปและนำไปสู่การตอบสนองพฤติกรรมที่คล้ายกันในการวัดโคเคนMcClung และ Nestler, 2003) ดังนั้นการค้นพบในปัจจุบันที่ΔFosBนำไปสู่การเหนี่ยวนำของ CREB รวมถึงการจับ CREB กับโปรโมเตอร์ยีนบางตัวช่วยอธิบายว่าทำไมการเปลี่ยนแปลงการแสดงออกของยีนจำนวนมากจึงถูกแบ่งปันโดยปัจจัยการถอดรหัส

การชักนำของ CREB โดยΔFosBเป็นสิ่งที่น่าสนใจเนื่องจากมันแสดงให้เห็นว่ายาเสพติดทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงในระดับ 133-phosphorylated CREB ในซีรีน (Mattson et al., 2005) และเพิ่มการถอดความ CRE-mediated (Barrot และคณะ, 2002; Shaw-Lutchman และคณะ, 2002, 2003) โดยไม่เปลี่ยนระดับโดยรวมของ CREB มีความเป็นไปได้ว่าการเปลี่ยนแปลงในระดับ CREB อาจเป็นแบบชั่วคราวและอาจพลาดได้ง่ายในการศึกษาอื่น ในมือของเราเราได้เห็นการเพิ่มขึ้นของโคเคน mRNA ในการทดลองโดยเฉพาะอย่างยิ่งอย่างไรก็ตามผลนี้เป็นตัวแปรสูง (การสังเกตที่ไม่ได้เผยแพร่) เนื่องจากทั้งหนูพันธุ์ 11A และเซลล์ PC-12 แสดงการเหนี่ยวนำ CREB หลังจากการแสดงออกของΔFosBในระยะสั้นแสดงให้เห็นว่า CREB นั้นถูกเหนี่ยวนำโดยΔFosB (หรือเป้าหมายของΔFosB) ซึ่งเป็นกลไกอีกวิธีหนึ่งในการอธิบายการเปลี่ยนแปลงที่เกิดจากยา การแสดงออก

น่าแปลกที่เราพบว่าทั้ง CREB และΔFosBไม่มีผลผูกพัน CCK ผู้ก่อการแม้ว่า CCK การแสดงออกชัดเจน upregulated ต่อไปนี้การแสดงออกระยะสั้นΔFosB Cck เป็นนิวโรเป็ปไทด์ที่มีอยู่มากมายทั้งใน VTA และ NAcHokfelt และคณะ, 1980) และมีแนวโน้มที่จะมีส่วนร่วมในการตอบสนองพฤติกรรมต่อยาเสพติด (Josselyn et al., 1996; Josselyn et al., 1997; แฮมิลตันและอื่น ๆ 2000; Beinfeld et al., 2002; Rotzinger และคณะ, 2002) ในการทดสอบเซลล์เพาะเลี้ยง CCK ผู้ก่อการได้รับการยอมรับอย่างกว้างขวางและแสดงให้เห็นว่าตอบสนองต่อสมาชิกในครอบครัว CREB และ AP-1 (ตรวจสอบโดย Hansen, 2001). Haun and Dixon (1990) แสดงให้เห็นว่าคอมเพล็กซ์ AP-1 สามารถผูกกับ CCK เว็บไซต์ที่เหมือน CRE ในหลอดทดลองและต่อมาก็แสดงให้เห็นว่าการใช้เซลล์ neuroblastoma ของ SK-N-MC นั้นการกลายพันธุ์ของไซต์ที่คล้าย CRE จะลดการตอบสนองของโปรโมเตอร์เพื่อลดการแสดงออกของ cFos / cJunRourke et al., 1999) แน่นอนเราก็พบว่าเพิ่มขึ้นเช่นกัน CCK กิจกรรมโปรโมเตอร์รูป 2) และผูกที่หรือรอบองค์ประกอบเหมือน CRE (รูป 3) จากการแสดงออกของΔFosBซึ่งเป็นสมาชิกในครอบครัว AP-1 อีกคนหนึ่ง แต่เราไม่พบข้อผูกพันโดยตรงของΔFosBกับ CCK โปรโมเตอร์ ในร่างกาย or ในหลอดทดลองแม้จะแสดงออกมากเกินไป

งานจำนวนมากแสดงให้เห็นถึงบทบาทของ CREB ในการควบคุม CCK กิจกรรมโปรโมเตอร์ CCK เว็บไซต์ที่มีลักษณะคล้าย CRE ถูกสงวนไว้ในสัตว์มีกระดูกสันหลัง (Hansen, 2001) และในบางวัฒนธรรมการทดสอบเซลล์ทั้ง CREB และ AP-1 คอมเพล็กซ์ผูกกับเว็บไซต์นี้และมีความจำเป็นสำหรับ CCK กิจกรรมโปรโมเตอร์Haun และ Dixon, 1990; Deavall และคณะ 2000; Hansen, 2001) นอกจากนี้ activators ที่รู้จักกันหลายแห่ง CCK การแสดงออก (รวมถึง bFGF, PACAP, peptones และการสลับขั้ว) ได้รับการแสดงเพื่อดำเนินการผ่าน CREB (Hansen และคณะ 1999; Deavall, et al, 2000; เบอร์นาร์ดและอื่น ๆ 2001; Gevrey และคณะ 2002; Hansen และคณะ 2004) ของเรา CCKข้อมูลยีนนักข่าว -luciferase สนับสนุนบทบาทสำคัญสำหรับไซต์ที่คล้าย CRE ในระเบียบ CCK กิจกรรมโปรโมเตอร์เนื่องจากการกลายพันธุ์ของไซต์นี้จะช่วยลดพื้นฐาน CCK กิจกรรมผู้ก่อการและ CCKนิพจน์ -luciferase ที่เกิดจาก VP16-CREB ซึ่งเป็นรูปแบบที่ใช้งานได้อย่างสร้างสรรค์ของ CREB จะหายไปเมื่อไซต์นี้กลายพันธุ์ (การสังเกตที่ไม่ได้เผยแพร่) ดังนั้นเราจึงประหลาดใจที่พบว่า CREB ไม่ได้ผูกติดกับ CCK ก่อการในสารสกัดจาก striatal ทั้งที่พื้นฐานหรือเมื่อระยะสั้นเกินไป overFosB การแสดงออกเมื่อระดับ CREB จะเพิ่มขึ้น สิ่งนี้ระบุว่าระดับของ CREB ต่อ se ไม่ได้เป็นเพียงปัจจัยเดียวในการกำหนดจำนวนผูกพันที่ไซต์นี้และสนับสนุนโดยงานของผู้อื่น (Cha-Molstad, et al., 2004) เนื่องจากโปรโมเตอร์ของคนอื่น ๆ ก่อนหน้านี้ได้ระบุยีนเป้าหมายของ CREB เช่น BDNF และ prodynorphinผูกมัด CREB เรามั่นใจในการค้นพบของเราว่า CREB ไม่ผูกพันกับ CCK ก่อการในสารสกัดจากนิวเคลียร์ striatal นอกจากนี้การเหนี่ยวนำของ CCK-luciferase activity โดยΔFosBไม่ได้ขึ้นอยู่กับเว็บไซต์เหมือน CRE ที่ยังอยู่ในสภาพสมบูรณ์แนะนำว่าΔFosBไม่ได้ควบคุม CCK นิพจน์โดยควบคุมการเชื่อมโดยตรงของ CREB กับ CCK โปรโมเตอร์

เราไม่สามารถตรวจจับ CREB ที่มีปฏิสัมพันธ์กับ CCK ผู้สนับสนุนได้รับการสนับสนุนโดย เรนธาลและคณะ (2009)ซึ่งใช้วิธี ChIP-chip เพื่อดูการเปลี่ยนแปลงทั่วโลกใน phosphorylated CREB (pCREB) และΔFosBผูกพันใน striatum หลังจากได้รับโคเคนเรื้อรัง ในการทดลองเหล่านี้ DNA-complex complexes ถูกสร้างภูมิคุ้มกันให้กับแอนติบอดีΔFosBหรือ pCREB และ DNA ที่ตกตะกอนหลังจากที่ติดฉลากแล้วถูกผสมกับโปรโมเตอร์ microarray ในขณะที่ยีนเป้าหมาย CREB หลายตัวก่อนหน้านี้ถูกระบุด้วยวิธีนี้ (เช่น BDNF, prodynorphin), CCK ไม่ได้ระบุ นอกจากนี้ยังแสดงให้เห็นว่าการเชื่อมโยงของ CREB กับไซต์ CRE ที่สอดคล้องกันนั้นแตกต่างกันอย่างมากระหว่างเซลล์ที่เพาะเลี้ยง (Cha-Molstad, et al., 2004) การศึกษาก่อนหน้านี้ทั้งหมดที่พบการโต้ตอบ CREB กับ CCK โปรโมเตอร์ดำเนินการในเซลล์เพาะเลี้ยง (ไม่ใช่สมองที่ได้รับตัวอย่าง EMSA และ ChIP ของเรา) และใช้การตรวจเจลกะเพื่อตรวจสอบปฏิกิริยาระหว่างโปรตีนและดีเอ็นเอ ในขณะที่ EMSA สามารถประเมินศักยภาพของปัจจัยที่จะผูกกับลำดับ DNA, ChIP assays ให้ดูนวนิยายที่โต้ตอบเหล่านี้ ในร่างกาย. นอกจากนี้ข้อมูลจำนวนมากแสดงให้เห็นถึงการเหนี่ยวนำ CCK กิจกรรมโปรโมเตอร์หรือ CREB ผูกพันกับ CCK ก่อการได้มาจากเซลล์ที่ถูกกระตุ้นโดยปัจจัยต่าง ๆ เช่น peptones (Bernard et al., 2001) การสลับขั้ว (Hansen และคณะ 2004) หรือความหลากหลายของตัวกระตุ้นของการส่งสัญญาณภายในเซลล์รวมถึง cAMP และ ERK (Hansen และคณะ, 1999) ในการทดลองของเราการใช้ "สิ่งเร้า" เพียงอย่างเดียวคือการแสดงออกของΔFosBที่มากเกินพอที่จะชักนำให้เกิด CCK การแสดงออก เมื่อนำมารวมกันสิ่งนี้แสดงให้เห็นว่าความสามารถของ CREB ในการผูกมัด (และอาจควบคุม) CCK ก่อการขึ้นอยู่กับชนิดของเซลล์และการเปิดใช้งานของเส้นทางการส่งสัญญาณโดยเฉพาะอย่างยิ่ง นอกจากนี้ CCK องค์ประกอบโปรโมเตอร์คล้าย CRE (อย่างน้อยในเซลล์ที่ไม่มีการเหนี่ยวนำ PC12 และใน striatum ของเมาส์) ไม่ใช่เป้าหมายโดยตรงของ CREB หรือΔFosB ที่น่าสนใจคือกฎระเบียบของ FosB การแสดงออกโดย CREB นั้นก็เฉพาะกับประเภทของเซลล์และประเภทของการกระตุ้น การศึกษาโดย Andersson อัล et. พบว่าการฉีด CREB antisense oligonucleotides เข้าสู่ striatum ของเมาส์ยับยั้งการเหนี่ยวนำบางส่วนของ FosB การบริหารโคเคนดังต่อไปนี้Andersson และคณะ, 2001) อย่างไรก็ตามพวกเขายังพบว่าความสามารถของ L-Dopa ในการชักนำให้เกิด FosB การแสดงออกใน striatum 6-OHDA-lesioned ไม่ได้รับอิทธิพลจากการปรากฏตัวของ CREB antisense oligonucleotides

เนื่องจาก CREB และΔFosBดูเหมือนจะควบคุมทางอ้อม CCK โปรโมเตอร์และการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างโครมาตินได้รับการบันทึกไว้เพื่อตอบสนองต่อสิ่งเร้าต่าง ๆ ที่กระตุ้นΔFosB (Tsankova และคณะ, 2004; Kumar et al., 2005; Renthal et al., 2008) เราให้เหตุผลว่าΔFosBอาจปรับกิจกรรมโปรโมเตอร์ทางอ้อมโดยการเปลี่ยนโครงสร้างโครมาติน อย่างไรก็ตามในหนูที่แสดงออกมา expressFosB เป็นเวลา 2 สัปดาห์ไม่มีการเปลี่ยนแปลงในฮิสโตน H3 acetylation ที่ CCK ผู้ก่อการ1 ตาราง) สิ่งนี้ได้รับการสนับสนุนโดยข้อมูล ChIP-chip ของ เรนธาลและคณะ (2009)ที่รายงานว่าไม่มีการเปลี่ยนแปลงใน acetylated H3 ที่มีผลผูกพัน CCK ก่อการในหนูที่สัมผัสกับโคเคนเรื้อรัง ตั้งแต่ CCK โปรโมเตอร์มีการใช้งานใน striatum ไม่คาดว่าจะมีการผูกหรือ methylated histone H3 histone ที่น่าสนใจคือเรายังไม่เห็นการเปลี่ยนแปลงเนื่องจากΔFosBแสดงออกมากเกินไปใน acetylated H3 ที่มีผลผูกพัน BDNF ผู้ก่อการ (ซึ่งแสดงการผูกมัด CREB เพิ่มขึ้น) หรือที่ CDK5 และ prodynorphin ผู้สนับสนุน (ซึ่งแสดงให้เห็นว่ามีผลผูกพันΔFosBเพิ่มขึ้น) เนื่องจากมีการแก้ไขฮิสโตนนับไม่ถ้วนที่เกี่ยวข้องกับการเปลี่ยนแปลงในกิจกรรมโปรโมเตอร์ (ตรวจสอบโดย Rando and Chang, 2009) มีการดัดแปลงอื่น ๆ ที่เกี่ยวข้องกับการเหนี่ยวนำของยีนเหล่านี้ การดัดแปลงโครมาตินเดี่ยวใด ๆ แม้ว่าบ่อยครั้งที่คาดการณ์ระดับกิจกรรมโปรโมเตอร์อาจไม่เปลี่ยนแปลงระหว่างการเปิดใช้งานของยีนเฉพาะ ในการทำงานในอนาคตมันจะน่าสนใจที่จะดูการเปลี่ยนแปลงที่อาจเกิดขึ้นในโครงสร้างโครมาตินรอบ ๆ CCK โปรโมเตอร์ดังต่อไปนี้ น่าสนใจโคเคนเรื้อรัง (น่าจะเป็น ผ่านทาง induction การเหนี่ยวนำ FosB) แสดงให้เห็นว่ามีการแสดงออกของ sirtuin 1 และ 2, deacetylases คลาส III ฮิสโตนที่ดูเหมือนจะเปลี่ยนสรีรวิทยาของเซลล์ประสาท, สัญญาณ ERK และการตอบสนองเชิงพฤติกรรมต่อโคเคน (Renthal et al., 2009) การเหนี่ยวนำของฮิสโตนดีอาเซติเลสจะมีความสามารถในการควบคุมการแสดงออกของยีนจำนวนมากในเวลาเดียวกัน ผ่านทาง การเปลี่ยนแปลงระดับโลกในโครงสร้างโครมาติน

หนึ่งในผู้สมัครที่เป็นไปได้มีส่วนร่วม CCK กฎระเบียบดังต่อไปนี้ osFosB การแสดงออกมากเกินไปคือสมาชิกในตระกูล AP-1 cFos นิพจน์ของ cFos ถูกควบคุมโดย CREB (Sheng และคณะ, 1990; Impey et al., 2004), และ cFos overexpression (สอดคล้องกับ overexpression ของ cJun ที่มีผลผูกพันมากขึ้น) จะเพิ่มขึ้น CCK กิจกรรมโปรโมเตอร์Rourke et al., 1999) ดังนั้นระดับ CREB ที่เพิ่มขึ้นเนื่องจากการแสดงออกในระยะสั้น osFosB สามารถเพิ่มระดับ cFos และส่งผลให้เพิ่มการเชื่อมโยงกับ CCK เว็บไซต์ที่เหมือน CRE cFos mRNA เกิดขึ้นในหนูหลังจากสองสัปดาห์ของ expressFosB overexpression (McClung และ Nestler, 2003) และลดลงในหนูที่สัมผัสกับโคเคนเรื้อรังหรือการแสดงออกในระยะยาว BFosB (Renthal et al., 2008) ที่นี่เราพบว่า cFos เชื่อมโยงโดยตรงกับ CCK โปรโมเตอร์ในเนื้อเยื่อ striatal อย่างไรก็ตามการแสดงออกของ BFosB ไม่ได้เพิ่มความผูกพันอย่างมีนัยสำคัญ สิ่งนี้ชี้ให้เห็นว่าในขณะที่ cFos อาจเกี่ยวข้องกับการควบคุม CCK การแสดงออกโดยทั่วไปการเปลี่ยนแปลงในการผูก cFos เพียงอย่างเดียวไม่น่าเป็นไปได้ที่กลไกที่ΔFosBควบคุม CCK การแสดงออก อย่างไรก็ตามเป็นไปได้ที่ΔFosBอาจชักนำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงหลังการแปลใน cFos (เช่นการเปลี่ยนฟอสโฟรีเลชั่น) หรือทำให้เกิดการแสดงออกของพันธมิตรที่ผูกพัน (เช่น cJun) หรือโปรตีน co-activator อย่างไรก็ตามเนื่องจากไซต์เหมือน CRE ที่เหมือนเดิม (ซึ่งก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่าเป็นไซต์ที่มีผลผูกพันสำหรับคอมเพล็กซ์ AP-1 ให้ดู Haun และ Dixon, 1990) ไม่จำเป็นสำหรับการเพิ่มขึ้น CCK กิจกรรมโปรโมเตอร์ที่เห็นด้วยการแสดงออกของ BFosB มากเกินไป (ตามการประเมินในการทดลองยีนของนักข่าวของเรา) ทำให้มีเหตุผลว่าปัจจัยการถ่ายโอนอื่น ๆ นั้นควบคุมโดยΔFosB

พื้นที่ CCK ส่วนโปรโมเตอร์ที่ใช้ในการทดลองยีนนักข่าว luciferase ของเรามีไซต์ Sp1 ที่ได้รับการอนุรักษ์และ E-box (ตรวจสอบโดย Hansen, 2002) โดยเฉพาะอย่างยิ่งลำดับ E-box แสดงให้เห็นถึงการผูกปัจจัยการถอดความจำนวนมาก (ตรวจสอบโดย Forrest and McNamara, 2004) เมื่อใช้เซลล์ PC12 เราจะเห็นว่าการกลายพันธุ์ของ E-box ลดลง CCK กิจกรรมโปรโมเตอร์ แต่ไม่เปลี่ยนการตอบสนองของโปรโมเตอร์เป็นΔFosB (ไม่แสดงข้อมูล) ที่น่าสนใจ CCK-luciferase นักข่าวที่มีการกลายพันธุ์ทั้งในไซต์ CRE และ E-box ไม่มีกิจกรรมพื้นฐานที่ตรวจพบได้และไม่ตอบสนองต่อΔFosB overexpression (การสังเกตที่ไม่ได้เผยแพร่) สื่อกลางที่มีศักยภาพอีกอันของการกระทำ ofFosB บน CCK ก่อการคือ ATF รูปแบบบางอย่างซึ่งเป็นที่รู้กันว่าถูกชักนำให้เกิดใน striatum จากการสัมผัส psychostimulant เรื้อรัง (Green et al., 2008) อย่างไรก็ตามเราไม่พบหลักฐานสำหรับการเหนี่ยวนำΔFosBของ ATF เหล่านี้ (ไม่แสดงข้อมูล) และคาดว่า ATF จะไม่ถูกผูกไว้กับไซต์ที่มีลักษณะคล้าย CRE บนเว็บไซต์ CCK โปรโมเตอร์

ข้อแม้ประการหนึ่งของการศึกษานี้คือเรากำลังใช้ระบบ bi-transgenic เพื่อแสดงออกอย่างมากΔFosBและดังนั้นเราจะต้องระมัดระวังในการวาดแนวเปรียบเทียบระหว่างกระบวนทัศน์นี้กับการบริหารโคเคนเรื้อรัง อย่างไรก็ตาม 11A หนูพันธุ์ดัดแปลงพันธุกรรมมีโอกาสที่ไม่ซ้ำกันในการดูผลกระทบเฉพาะของΔFosBใน striatum เนื่องจากการแสดงออกมากเกินไปนั้น จำกัด เฉพาะบริเวณสมองนี้ (เฉินและคณะ, 1998) ในขณะที่การบริหารโคเคนทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงในบริเวณสมองอื่น ๆ ที่หลากหลายซึ่งอาจส่งผลทางอ้อมต่อ striatum นอกจากนี้ยังมีงานวิจัยหลายชิ้นที่ได้บันทึกฟีโนไทป์ของพฤติกรรมและโมเลกุลที่คล้ายคลึงกันในหนู 11A เมื่อเปรียบเทียบกับสัตว์ที่ไม่ได้ถ่ายยีนที่รักษาด้วยโคเคนเรื้อรัง (Kelz และคณะ, 1999; McClung และ Nestler, 2003; Renthal et al., 2009) นอกจากนี้ Bibb และคณะ (2001) รายงานระดับที่คล้ายกันของ striatal Cdk5 mRNA และการเหนี่ยวนำโปรตีนในสายพันธุ์ 11A เดียวกันนี้เมื่อเปรียบเทียบกับ littermates ที่ได้รับโคเคนที่ไม่ได้ถ่ายยีนรวมถึงการเปลี่ยนแปลงที่คล้ายกันในเป้าหมาย CDK5, p35 และ DARPP-32

โดยสรุปเราพบว่าการแสดงออกของΔFosBระยะสั้นนำไปสู่การเหนี่ยวนำของยีนใน striatum ผ่านกลไกหลายอย่าง เหล่านี้รวมถึงการผูกโดยตรงโปรโมเตอร์, การเหนี่ยวนำของโปรตีนและกิจกรรม CREB, การดัดแปลงโครมาติน, นอกจากเส้นทางสู่ยังไม่ได้กำหนด.

ไปที่:

ขั้นตอนการทดลอง

สัตว์

ใช้สัตว์ 11A (NSE-tTA x TetOP-ΔFosB) ในการศึกษาครั้งนี้และใช้ในการศึกษาครั้งนี้ Kelz และคณะ, 1999. ในการ overexpress ΔFosBหนูจะถูกลบออกจาก doxycycline ระหว่าง 3 และ 6 ของอายุในขณะที่หนูควบคุมยังคงอยู่ใน doxycycline หนูทุกตัวถูกรวมตัวเป็นกลุ่มและคงไว้ใน 12: 12 รอบแสง / มืด, เปิดไฟที่ 7 am และปิดไฟที่ 7 pm, ด้วย ad lib การเข้าถึงอาหารและน้ำ การทดลองใช้เมาส์ทั้งหมดสอดคล้องกับโปรโตคอลที่ได้รับอนุมัติจากคณะกรรมการดูแลสัตว์และการใช้สัตว์ของศูนย์การแพทย์มหาวิทยาลัยเท็กซัสตะวันตกเฉียงใต้ที่ดัลลัส

พลาสมิดนักข่าวและการแสดงออก

The wildtype (WT) CCK ผู้จัดทำโปรโมเตอร์ -Luciferase นักข่าวถูกจัดทำขึ้นโดยการแทรกส่วน 200 bp PCR โดยประมาณลงในเวกเตอร์ pGL3-luc (Promega) แฟรกเมนต์นี้ได้มาจาก DNA genomic ของเม้าส์ (ไพรเมอร์: 5 'TATCCTCATTCACTGGGACGC 3' upstream และ 5 'TACCTTTGGATGGGGGAATCG 3' ดาวน์สตรีม) และเริ่มแทรกลงใน pGEM-T Easy เวกเตอร์ (Promega, #NAXX) ส่วนโปรโมเตอร์ถูกโคลนในไซต์เอนไซม์ที่ จำกัด Kpn1360 / Xho1 ของ pGL1-luc

เพื่อสร้างการกลายพันธุ์ของจุด CRE ใน CCK โปรโมเตอร์ซึ่งเป็นไพรเมอร์สำหรับการกลายพันธุ์ที่มุ่งต่อต้านไซต์ที่มีลักษณะคล้าย CRE ที่รายงานไว้ก่อนหน้านี้ (ไพรเมอร์ความรู้สึก: 5'CGTGTCCTGCTGGACTGAGCTCGCACTGGGTAAACA 3 ', ไพรเมอร์ป้องกันการเกิดอาการ: 5'CTGTTTACCCAGTGCGCGCTGAGTCCAGCAGGACACG3 ชุดคำสั่งในการเปลี่ยนแปลงของชั้นเรียน (Change) . ซึ่งจะแปลงไซต์ที่มีลักษณะคล้าย CRE (ACTGCGTCAGC) ที่รายงานเป็น ACTGAGCTCC พลาสมิดของผู้สื่อข่าวทั้งหมดได้รับการยืนยันโดยการจัดลำดับดีเอ็นเอ พลาสมิดนิพจน์ΔFosBประกอบด้วยลำดับΔFosBแบบเต็มความยาวที่แทรกลงในไซต์โคลนหลายไซต์ของ pCDNA 3.1 และได้อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (Ulery และ Nestler, 2007).

การเพาะเลี้ยงเซลล์และการแปลงดีเอ็นเอ

เซลล์ pheochromocytoma ของหนู (PC12) ได้รับการบำรุงรักษาใน E-12 ขนาดกลางที่ได้รับการดัดแปลงของ Dulbecco เสริมด้วยซีรั่มม้า 10% ซีรั่มวัวทารกในครรภ์ 5% และเพนิซิลลิน / สเตรปโตมัยซิน 1% ที่ 37 ° C และ 5% CO₂. เซลล์ถูกถ่ายโอนโดยการอิเล็กโทรโพเรชันโดยใช้เครื่องอิเล็กโทรโพเรเตอร์ BTX 360 (350V, 0 โอห์มและ 850 μF) ในน้ำเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟต 800 L ของ Dulbecco ใน cuvettes ช่องว่าง 4 มม. โดยมีผู้สื่อข่าว 10 ไมโครกรัมและโครงสร้างนิพจน์ 5 ไมโครกรัม พลาสมิดเวกเตอร์ที่ว่างเปล่า (pCDNA) ถูกนำมาใช้เพื่อทำให้ปริมาณดีเอ็นเอทั้งหมดเป็นปกติ หลังจากการถ่ายเซลล์เซลล์จะเติบโตบนจานเคลือบคอลลาเจน 35 มม. ตามระยะเวลาที่ระบุ

Luciferase ทำการทดสอบ

สองหรือสามวันหลังการเปลี่ยนถ่ายเซลล์จะถูกล้าง 3 ครั้งในน้ำเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟตของ Dulbecco ไลเซด (ใช้ไกลซิลไกลซีน 25 mM, 15 mM MgSO₄, 4 mM EGTA, 1% ไทรทัน X-100, pH 7.8, 1 mM DTT) รวบรวมและล้างผ่านการปั่นแยก 30 μLของ lysate รวมกับ 140 μL luciferase assay buffer (25 mM glycylglycine, 15 mM MgSO₄, 4 mM EGTA, 1 mM DTT, 1 mM ATP, โพแทสเซียม 1 mM ฟอสเฟต, 1 mM โคเอ็นไซม์ A, pH 7.8) กิจกรรมการเรืองแสงถูกวัดโดยใช้เครื่องอ่านฟลูออเรสเซนซ์ microplate FLx-800 หลังจากการฉีดลูซิเฟอร์ซิน 40 μL 1 mM แบบอัตโนมัติ กิจกรรมของ Luciferase นั้นถูกทำให้เป็นปกติกับปริมาณโปรตีนทั้งหมดตามที่กำหนดโดยการทดสอบโปรตีน BioRad

การทดสอบการเคลื่อนย้ายด้วยไฟฟ้า

สารสกัดจากนิวเคลียร์จากชิ้นทวิภาคีของ striatum จากหนู 11A bi-transgenic (ที่เก็บรักษาไว้ในหรือนอก doxycycline สำหรับ 2 หรือ 8 สัปดาห์) (McClung และ Nestler, 2003) ถูกจัดทำขึ้นตาม Huang and Walters (1996). ³²โพลิโอลิโกนิวคลีโอไทด์ที่มีฉลากเป็นเกลียวสองเส้นที่เตรียมไว้โดยใช้โปรโตคอลระบบ Promega Gel Shift Assay (#E3300) และโพรบถูกทำให้บริสุทธิ์โดยใช้คอลัมน์โรช Quick Spin ฉันทามติลำดับ CRE และ AP-1 โพรบมาจาก Promega (#E328A และ E320B ตามลำดับ) และ CCK ลำดับ CRE คือ (ความรู้สึก Cck-CRE: CTAGCGAGCTCTGGACTGCGTCAGCACTGGGTTCA; Antisense Cck-CRE: CCCAGTGCTGACGCGTCGAGGTCGCTAGCTTT)

ปฏิกิริยาการเกาะติดและอิเล็กโทรโฟรีซิสได้ดำเนินการโดยการปรับเปลี่ยนขั้นตอนของระบบ Promega Gel Shift Assay (#E3300) 50,000 CPM ของโพรบที่มีป้ายกำกับรวมกับ 10 μgสารสกัดจากนิวเคลียร์ striatal เพิ่ม DNA หรือแอนติบอดี้คู่แข่งเย็นก่อนที่จะมีการเปิดตัวโพรบ radiolabeled สำหรับการทดลองที่ Superershift ได้ใช้ 2 μgของแอนติบอดี CREB (เทคโนโลยีชีวภาพตอนเหนือ # 06-083) ปฏิกิริยาถูก electrophoresed ในเจลโพลีอะคริลาไมด์ 4% แห้งและสัมผัสกับฟิล์ม (ใช้หน้าจอที่มีความเข้มข้นเป็นเวลา 1 ชั่วโมงถึง 2 วัน)

immunoblotting

สำหรับเซลล์ PC12 แผ่นเซลล์ที่เปลี่ยนถ่าย 35 มม. จะถูกล้างด้วยน้ำเกลือฟอสเฟตบัฟเฟอร์เย็นของ Dulbecco และไลเสตที่เตรียมไว้ใน RIPA lysis buffer เย็น (50 mM Tris pH 7.4, 5 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% deoxycholate, 1 % Triton X-100, โซเดียมโดเดซิลซัลเฟต 0.1%) ที่มีสารยับยั้งโปรตีเอส หลังจากการทดสอบ sonication การล้างและการทดสอบโปรตีนแบรดฟอร์ดไลเซทถูกทำให้แตกตัวเต็มที่และ 50 ไมโครกรัมของแต่ละตัวอย่างถูกอิเล็กโทรโฟรีนบนเจลโพลีอะคริลาไมด์ SDS 10% โปรตีนถูกถ่ายโอนไปยังเยื่อหุ้มเซลล์ PVDF ซึ่งถูกปิดกั้นเป็นเวลา 1 ชั่วโมงในนมแห้งที่ไม่มีไขมัน 3% ในน้ำเกลือ Tris-buffered ที่มี 0.1% Tween-20 (นม TBS-T) และตรวจสอบค้างคืนที่อุณหภูมิ 4 ° C ด้วยแอนติบอดีหลัก (CREB- Upstate Biotechnology # 06-083 ใช้ที่ 1: 1,000; GAPDH- Sigma # G8795 ใช้ที่ 1: 80,000) เจือจางในนม TBS-T หลังจากล้างหลายครั้งใน TBS-T จะมีการตรวจสอบบล็อตเป็นเวลาหนึ่งชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องโดยใช้แอนติบอดี้ทุติยภูมิอัลคาไลน์ฟอสฟาเตส - คอนจูเกต (Sigma) เจือจาง 1: 5,000 ในนม TBS-T หลังจากล้างด้วยน้ำเกลือ Tris หลายครั้งปฏิกิริยาของสีจะดำเนินการตามคำแนะนำของ BioRad (# 170-6432) เมมเบรนถูกทำให้แห้งในชั่วข้ามคืนสแกนบนเครื่องสแกนแบบแท่นและทำการวัดความหนาแน่นโดยใช้ ImageJ (ดูด้านล่าง)

สำหรับสารสกัดจาก striatal มีการตรวจสอบ blot ตะวันตกตามที่เผยแพร่ก่อนหน้านี้ (ความหวังและคณะ, 1994) เนื้อเยื่อถูกลบออกจากหนูหัวที่ถูกวางไว้บนน้ำแข็งและแบ่งส่วนบนเมทริกซ์สมองที่ความหนา 1 mm จากนั้นนำไปเจาะเนื้อเยื่อและแช่แข็งที่ -80 ° C จนกระทั่งนำไปใช้ เนื้อเยื่อถูกทำให้เป็นก้อนบนน้ำแข็งในบัฟเฟอร์ที่ปรับเปลี่ยนตามผงซักฟอกซึ่งประกอบด้วยฟอสฟาเทสและโปรตีเอส (Roche, Sigma) หลังจาก sonication ตัวอย่างถูกแปลงสภาพในน้ำเดือดและหมุนเหวี่ยงที่ 15,000xg เป็นเวลา 15 นาที; ส่วนเหนือสุดถูกรวบรวมและประมวลผลในภายหลัง ปริมาณความเข้มข้นของโปรตีนถูกวัดปริมาณโดยใช้ Bradford assay (Bio-Rad) ตัวอย่างถูกเรียกใช้บนเจล 10% acrylamide / bisacrylamide ที่ถูกถ่ายโอนไปยังเยื่อหุ้มเซลล์ PVDF ที่ถูกบล็อกในนม 5% และบ่มด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิ (Anti-CREB, Upstate, Lake Placid, NY) ในเวลาต่อมาภาพจะถูกมองเห็นโดยใช้ระบบเคมีบำบัด (เพียร์ซ) ตัวอย่างทั้งหมดถูกทำให้เป็นมาตรฐานเป็น GAPDH (Fitzgerald, Concord, MA) เส้นโค้งมาตรฐานถูกเรียกใช้เพื่อให้แน่ใจว่าเราอยู่ในช่วงเชิงเส้นของการทดสอบ

การวิเคราะห์ความหนาแน่น

สำหรับ PC12 immunoblots การวิเคราะห์ความหนาแน่นได้ดำเนินการโดยใช้ ImageJ พร้อมการสอบเทียบแบบบาร์ด สัญญาณพื้นหลังเฉลี่ยถูกลบออกจากการวัดแต่ละครั้งและอัตราส่วนของสัญญาณ CREB ต่อ GAPDH ถูกคำนวณสำหรับแต่ละตัวอย่าง สำหรับการตรวจหาอิมมูโนบล็อตและการวิเคราะห์ EMSA จะใช้ Scion Image 1.62c กับการลบพื้นหลัง

โครมาตินกระตุ้นการตกผลึก (ChIP)

การทดสอบ ChIP ได้ดำเนินการตามวิธีการของ Tsankova และคณะ (2004) และ คูมาร์และคณะ (2005). สั้น ๆ ตัวอย่างทวิภาคีทวิภาคีจากหนู 11A ที่ได้รับการดูแลหรือปิด doxycycline ถูกเชื่อมขวางด้วยฟอร์มาลดีไฮด์ 1% และการเชื่อมขวางถูกดับด้วยไกลซีน (ความเข้มข้นสุดท้าย 0.125 M) ตัวอย่างเหล่านี้มาจากชิ้นส่วนสมองทั้งหมดที่ถ่ายในระดับของนิวเคลียส accumbens โดยเอาเยื่อหุ้มสมองออก โครมาตินถูกตัดเป็นชิ้นส่วนประมาณ 0.2 ถึง 1 กิโลไบต์โดยใช้ sonication ล้างด้วยเม็ดโปรตีน G (Thermo Scientific # 22852) และใส่ตัวอย่างที่แช่แข็งที่อุณหภูมิ -80 ° C มีการใช้โครมาตินระหว่าง 60 ถึง 100 ไมโครกรัมสำหรับการตกตะกอนแต่ละครั้ง ใช้แอนติบอดีหลัก 5-10 ไมโครกรัม (CREB: Upstate Biotechnology # 06-863, ΔFosB: Santa Cruz Biotechnology # SC-48x, acetylated H3: Upstate Biotechnology # 06-599, methylated H3 (LYS9): Cell Signaling Technology, cFos: เทคโนโลยีชีวภาพซานตาครูซ # SC-7202x) แอนติบอดี - โครมาตินคอมเพล็กซ์ได้รับการกระตุ้นภูมิคุ้มกันด้วยเม็ดโปรตีน G plus ตามคำแนะนำของผู้ผลิต (Thermo Scientific # 22852) หลังจากการเชื่อมขวางแบบย้อนกลับของตัวอย่างอินพุตและตัวอย่างที่ตกตะกอนแต่ละตัวอย่างจะต้องผ่าน PCR เชิงปริมาณ (qPCR) การใช้แอนติบอดีเหล่านี้ทั้งหมดสำหรับ ChIP ได้รับการตรวจสอบอย่างครอบคลุม (Tsankova และคณะ, 2004; Kumar et al., 2005; Renthal et al., 2009).

ระดับของการจับโปรตีนในแต่ละโปรโมเตอร์ยีนที่น่าสนใจถูกกำหนดโดยการวัดปริมาณของ DNA ที่เกี่ยวข้องโดย qPCR (Applied Biosystems (ABI) ปริซึม 7700, Foster City, CA) DNA ที่ป้อนเข้าหรือรวม (ไม่เป็นภูมิคุ้มกัน) และ DNA ที่ถูกกระตุ้นภูมิคุ้มกันถูกขยายในการเพิ่มขึ้นสามเท่าเมื่อมี SYBR Green (Applied Biosystems, CA) ได้รับค่า Ct จากแต่ละตัวอย่างโดยใช้ซอฟต์แวร์ Sequence Detector 1.1 การหาปริมาณเชิงปริมาณของแม่แบบดีเอ็นเอได้ดำเนินการโดยใช้วิธีΔΔCt (Tsankova และคณะ, 2004) ไพรเมอร์ที่ใช้: โปรโมเตอร์ BDNF 4: CTTCTGTGTGCGTGAATTTGCT; AGTCCACGAGAGGGCTCCA CDK5 ก่อการ: GCTGAAGCTGTCAGGAGGTC; GTGCCCCGCTCTTGTTATTA โปรโมเตอร์ Cck: CTTGGGCTAGCCTCTCATTCACTG; TTAAATAGCTCCTCCCGGTTCG โปรโมเตอร์ Prodynorphin: GGCTTCCTTGTGCTGAGTCAGAC; GCGCTGTTTGTCACTTTCAA

การวิเคราะห์ทางสถิติ

ข้อมูลทั้งหมดแสดงเป็นค่าเฉลี่ยข้อผิดพลาดมาตรฐานของค่าเฉลี่ย ความแตกต่างทางสถิติถูกกำหนดโดยการทดสอบ t-test สองด้านของนักเรียน (p <0.05) เมื่อทำการเปรียบเทียบหลายครั้งค่า p จะถูกปรับโดยใช้การแก้ไข Bonferroni

ไปที่:

กิตติกรรมประกาศ

เราขอขอบคุณ Will Renthal และ Arvind Kumar สำหรับการสนทนาที่เป็นประโยชน์ เราขอขอบคุณนิด้าที่ให้เงินสนับสนุนการทดลองเหล่านี้

ไปที่:

เชิงอรรถ

ข้อจำกัดความรับผิดชอบของผู้จัดพิมพ์: นี่เป็นไฟล์ PDF ของต้นฉบับที่ไม่มีการแก้ไขซึ่งได้รับการยอมรับให้ตีพิมพ์ เพื่อเป็นการบริการลูกค้าของเราเรากำลังจัดทำต้นฉบับฉบับแรกนี้ ต้นฉบับจะได้รับการคัดลอกเรียงพิมพ์และตรวจสอบหลักฐานที่เป็นผลลัพธ์ก่อนที่จะเผยแพร่ในรูปแบบที่อ้างอิงได้สุดท้าย โปรดทราบว่าในระหว่างกระบวนการผลิตข้อผิดพลาดอาจถูกค้นพบซึ่งอาจส่งผลกระทบต่อเนื้อหาและการปฏิเสธความรับผิดชอบทางกฎหมายทั้งหมดที่ใช้กับวารสารที่เกี่ยวข้อง

เงื่อนไขการจัดหมวดหมู่:

ส่วน: #1 เซลล์และอณูชีววิทยาของระบบประสาท

ไปที่:

อ้างอิง

1. Andersson M, Konradi C, Cenci MA การตอบสนองของ cAMP นั้นเป็นสิ่งที่จำเป็นสำหรับการแสดงออกของยีนที่ต้องพึ่งโดปามีนในสภาพที่สมบูรณ์ แต่ไม่ใช่ striatum ที่ต้องรับสาร dopamine J Neurosci 2001; 21: 9930 43- [PubMed]
2. Barrot M, Olivier JD, Perrotti LI, DiLeone RJ, Berton O, Eisch AJ, Impey S, Storm DR, Neve RL, Yin JC, Zachariou V, Nestler EJ กิจกรรมของ CREB ในนิวเคลียส accumbens เชลล์ควบคุมการ gating ของพฤติกรรมตอบสนองต่อสิ่งเร้าทางอารมณ์ Proc Natl Acad Sci US A. 2002; 99: 11435 – 40 [บทความฟรี PMC] [PubMed]
3. Beinfeld MC, Connolly KJ, Pierce RC การรักษาโคเคนจะเพิ่มการเสริม cholecystokinin extracellular (CCK) ในนิวเคลียส accumbens เปลือกของหนูตื่นตัวเคลื่อนไหวอย่างอิสระหนูผลที่เพิ่มขึ้นในหนูที่มีพฤติกรรมไวต่อโคเคน J Neurochem 2002; 81: 1021 7- [PubMed]
4. Bernard C, Sutter A, Vinson C, Ratineau C, Chayvialle J, Cordier-Bussat M. Peptones กระตุ้นการถอดรหัสยีน cholecystokinin ในลำไส้ผ่านวงจร adenosine monophosphate ที่ตอบสนองต่อองค์ประกอบ การศึกษาเกี่ยวกับต่อมไร้ท่อ 2001; 142: 721 9- [PubMed]
5. Bibb JA, Chen J, Taylor JR, Svenningsson P, Nishi A, Snyder GL, Yan Z, Sagawa ZK, Ouimet CC, Nairn AC, Nestler EJ, Greengard P. ผลกระทบของการสัมผัสโคเคนแบบเรื้อรังกับโปรตีนโคเคน Cdk5 ธรรมชาติ. 2001; 410: 376 80- [PubMed]
6. Cha-Molstad H, Keller DM, Yochum GS, Impey S, Goodman RH การโยงเฉพาะชนิดเซลล์ของปัจจัยการถอดรหัส CREB กับองค์ประกอบการตอบสนองของ cAMP Proc Natl Acad Sci US A. 2004; 101: 13572 – 7 [บทความฟรี PMC] [PubMed]
7. Chen J, Nye HE, Kelz MB, Hiroi N, Nakabeppu Y, Hope BT, Nestler EJ ระเบียบของเดลต้า FosB และโปรตีนที่คล้ายกับ FosB โดยการรักษาด้วยไฟฟ้าและโคเคน Mol Pharmacol 1995; 48: 880 9- [PubMed]
8. เฉิน J, Kelz MB, เซงจี, ซาไกเอ็น, สเตฟเฟนซี, Shockett PE, Picciotto MR, Duman RS, Nestler EJ สัตว์ดัดแปลงพันธุกรรมที่มีการเหนี่ยวนำการแสดงออกของยีนเป้าหมายในสมอง Mol Pharmacol 1998; 54: 495 503- [PubMed]
9. เฉินเจจางจาง Kelz MB, Steffen C, อ่างทอง ES, เซง L, Nestler EJ การเหนี่ยวนำของไคเนส 5 ที่ขึ้นกับไซโคลในฮิบโปโดยวิธีอิเล็กโทรไลต์ชักชักเรื้อรัง: บทบาทของΔFosB J Neurosci 2000; 20: 8965 71- [PubMed]
10. Chinenov Y, Kerppola TK การเผชิญหน้าอย่างใกล้ชิดหลายชนิด: ปฏิสัมพันธ์ Fos-Jun ที่เป็นสื่อกลางในการกำกับดูแลการถอดรหัส มะเร็ง 2001; 20: 2438 52- [PubMed]
11. Cole RL, Konradi C, Douglass J, Hyman SE การปรับตัวของเซลล์ประสาทกับแอมเฟตามีนและโดปามีน: กลไกระดับโมเลกุลของการควบคุมยีน prodynorphin ในหนู striatum เซลล์ประสาท 1995; 14: 813 23- [PubMed]
12. Deavall DG, Raychowdhury R, ​​Dockray GJ, Dimaline R. การควบคุมการถอดรหัสยีน CCK โดย PACAP ในเซลล์ STC-1 Am J Physiol ตับ Gastiolintest Gastiol 2000; 279: G605-12 [PubMed]
13. Ding XZ, Mocchetti I. การควบคุมโดปามินอจิกของเนื้อหา mycNA ของ cholecystokinin ในหนู rat striatum ความต้านทานของสมอง Mol ความต้านทานของสมอง 1992; 12: 77 83- [PubMed]
14. Forrest S, McNamara C. Id ตระกูลของปัจจัยการถอดรหัสและการก่อโรคหลอดเลือด Arterioscler Thromb Vasc Biol 2004; 24: 2014 20- [PubMed]
15. Gevrey JC, Cordier-Bussat M, Némoz-Gaillard E, Chayvialle JA, Abello J. ความต้องการร่วมของแอมป์ไซคลิกวงจรและโปรตีนไคเนสที่ขึ้นกับแคลเซียมสำหรับการกระตุ้นการแสดงออกของยีน cholecystokinin โดยการย่อยโปรตีน J Biol Chem 2002; 277: 22407 13- [PubMed]
16. Green TA, Alibhai IN, Unterberg S, Neve RL, Ghose S, Tamminga CA, Nestler EJ การเหนี่ยวนำของการเปิดใช้งานปัจจัยการถอดความ (ATF) ATF2, ATF3 และ ATF4 ในนิวเคลียส accumbens และการควบคุมพฤติกรรมทางอารมณ์ J Neurosci 2008; 28: 2025 32- [PubMed]
17. แฮมิลตัน ME, Redondo JL, ฟรีแมน AS การหลั่งสารโดปามีนและยาโฮเซซิสตินในน้ำล้นในหนูนิวเคลียสมีอาการตอบสนองต่อการรักษาด้วยยาเฉียบพลัน ไซแนปส์ 2000; 38: 238 42- [PubMed]
18. Hansen TV, Rehfeld JF, Nielsen FC โปรตีนไคเนสที่กระตุ้นด้วยไมโตเจนและโปรตีนไคเนสวิถีการส่งสัญญาณกระตุ้นการถอดความของ cholecystokinin ผ่านการกระตุ้นของไซคลิกอะดีโนซีน 3 ′, 5′-monophosphate response element-binding protein โมลเอนโดครินอล 1999; 13: 466–75 [PubMed]
19. Hansen TV, Nielsen FC กฎระเบียบของการถอดความของยีนเส้นประสาท cholecystokinin Scand J Clin Lab Invest Suppl. 2001; 234: 61 7- [PubMed]
20. ทีวี Hansen การถอดรหัสยีน Cholecystokinin: องค์ประกอบของโปรโมเตอร์ปัจจัยการถอดความและเส้นทางการส่งสัญญาณ เปปไทด์ 2001; 22: 1201 11- [PubMed]
21. ทีวี Hansen, Rehfeld JF, Nielsen FC KCl และ forskolin ประสานการแสดงออกของยีน cholecystokinin ที่ควบคุมการทำงานร่วมกันผ่านการประสานงานการเปิดใช้งานของ CREB และ co-activator CBP J Neurochem 2004; 89: 15 23- [PubMed]
22. Haun RS, Dixon JE ตัวเพิ่มประสิทธิภาพการถอดเสียงที่จำเป็นสำหรับการแสดงออกของยีนหนู cholecystokinin มีลำดับเหมือนกับองค์ประกอบ -296 ของยีนมนุษย์ c-fos J Biol Chem 1990; 265: 15455 63- [PubMed]
23. Hiroi N, Marek GJ, Brown JR, Ye H, Saudou F, Vaidya VA, Duman RS, Greenberg ME, Nestler EJ บทบาทสำคัญของยีน fosB ในการกระทำระดับโมเลกุลเซลล์และพฤติกรรมของการชักด้วยไฟฟ้าแบบเรื้อรัง J Neurosci 1998 1998; 18: 6952 62- [PubMed]
24. Hokfelt T, Rehfeld JF, Skirboll L, Ivemark B, Goldstein M, Markey K. หลักฐานการอยู่ร่วมกันของโดปามีนและ CCK ในเซลล์ประสาท meso-limbic ธรรมชาติ. 1980; 285: 476 8- [PubMed]
25. Hope BT, Kelz MB, Duman RS, Nestler EJ ผลการรักษาด้วยอิเล็กโทรไลต์ซีอีซี (ECS) ในการแสดงออกของคอมเพล็กซ์ AP-1 ที่ยาวนานในสมองที่มีองค์ประกอบและลักษณะที่เปลี่ยนแปลงไป J Neurosci 1994; 14: 4318 28- [PubMed]
26. Hope BT, Nye HE, Kelz MB, DW ตัวเอง, Iadarola MJ, Nakabeppu Y, Duman RS, Nestler EJ การเหนี่ยวนำของคอมเพล็กซ์ AP-1 ที่ยาวนานประกอบด้วยโปรตีน Fos-like ที่เปลี่ยนแปลงในสมองโดยโคเคนเรื้อรังและการรักษาอื่น ๆ เซลล์ประสาท 1994; 13: 1235 44- [PubMed]
27. Huang KX, Walters JR กฎระเบียบโดปามีนของกิจกรรมการถอดรหัสดีเอ็นเอ AP-1 ที่มีผลผูกพันใน striatum ของหนู ประสาท 1996; 75: 757 75- [PubMed]
28. Impey S, McCorkle SR, Cha-Molstad H, Dwyer JM, Yochum GS, Boss JM, McWeeney S, Dunn JJ, Mandel G, Goodman RH การกำหนด CREB regulon: การวิเคราะห์จีโนมทั่วภูมิภาคของภูมิภาค เซลล์ 2004; 119: 1041 54- [PubMed]
29. Johannessen M, Delghandi MP, Moens U. เปิด CREB อะไร? สัญญาณเซลล์ 2004; 16: 1211 27- [PubMed]
30. Josselyn SA, Vaccarino FJ ผลตรงกันข้ามของ CCK (A) และ CCK (B) คู่อริต่อการพัฒนากิจกรรมปรับอากาศในหนู Behav Pharmacol 1996; 7: 505 512- [PubMed]
31. Josselyn SA, De Cristofaro A, Vaccarino FJ หลักฐานการมีส่วนร่วมของตัวรับ CCK (A) ในการได้มาซึ่งกิจกรรมที่ผลิตโดยโคเคนในหนู ความต้านทานของสมอง 1997; 763: 93 102- [PubMed]
32. Kelz MB, Chen J, Carlezon WA, Jr. , Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, DW ตนเอง, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Neve RL, Duman RS, Picciotto MR , Nestler EJ การแสดงออกของปัจจัยการถอดรหัส deltaFosB ในสมองควบคุมความไวต่อโคเคน ธรรมชาติ. 1999; 401: 272 6- [PubMed]
33. Kumar A, Choi KH, Renthal W, Tsankova NM, Theobald DE, Truong HT, Russo SJ, Laplant Q, Sasaki TS, Whistler KN, Neve RL, DW ตัวเอง, Nestler EJ Chromatin remodeling เป็นกลไกสำคัญที่แสดงถึงความเป็นพลาสติกที่เกิดจากโคเคนใน striatum เซลล์ประสาท 2005; 48: 303 14- [PubMed]
34. Mattson BJ, Bossert JM, Simmons DE, Nozaki N, Nagarkar D, Kreuter JD, Hope BT CREB phosphorylation เหนี่ยวนำโคเคนในนิวเคลียส accumbens ของหนูโคเคนไวต่อความรู้สึกถูกเปิดใช้งานโดยการเปิดใช้งานขั้นสูงของไคเนสที่เกี่ยวข้องกับสัญญาณ extracellular แต่ไม่ kinase โปรตีน A. J Neurochem 2005; 95: 1481 94- [PubMed]
35. McClung CA, Nestler EJ ระเบียบการแสดงออกของยีนและรางวัลโคเคนโดย CREB และ DeltaFosB Nat Neurosci 2003; 6: 1208 15- [PubMed]
36. McClung CA, Ulery PG, Perrotti LI, Zachariou V, Berton O, Nestler EJ DeltaFosB: สวิตช์ระดับโมเลกุลสำหรับการปรับตัวในระยะยาวในสมอง ต้านทานสมอง Mol ต้านทานสมอง. 2004; 132: 146 54- [PubMed]
37. Nestler EJ, Kelz MB, Chen JS ΔFosB: ผู้ไกล่เกลี่ยระดับโมเลกุลของพลาสติกและระบบประสาทในระยะยาว ความต้านทานของสมอง 1999; 835: 10 17- [PubMed]
38. Nestler EJ มีทางเดินโมเลกุลที่พบบ่อยสำหรับการติดยาเสพติด? Nat Neurosci 2005; 8: 1445 9- [PubMed]
39. Nestler EJ กลไกการติดยาเสพติด: บทบาทของ DeltaFosB Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 2008; 363: 3245 55- [บทความฟรี PMC] [PubMed]
40. Perrotti LI, ผู้ประกอบ RR, Robison B, Renthal W, Maze I, Yazdani S, Elmore RG, Knapp DJ, Selley DE, Martin BR, Sim-Selley L, Bachtell RK, DW ตนเอง, Nestler EJ รูปแบบที่แตกต่างของการเหนี่ยวนำ DeltaFosB ในสมองโดยยาเสพติด ไซแนปส์ 2008; 62: 358 69- [บทความฟรี PMC] [PubMed]
41. Rando OJ, Chang HY มุมมองกว้างของจีโนมของโครงสร้างโครมาติน Annu Rev Biochem 2009; 78: 245 71- [บทความฟรี PMC] [PubMed]
42. Renthal W, Carle TL, Maze I, Covington HE, 3rd., Truong HT, Alibhai I, Kumar A, Montgomery RL, Olson EN, Nestler EJ Delta FosB ไกล่เกลี่ย desensitization epigenetic ของยีน c-fos หลังจากการสัมผัสยาบ้าเรื้อรัง J Neurosci 2008; 28: 7344 9- [บทความฟรี PMC] [PubMed]
43. Renthal W, Kumar A, Xiao G, Wilkinson M, Covington HE, 3rd, เขาวงกตฉัน, Sikder D, Robison AJ, LaPlant Q, Dietz DM, รุสโซ SJ, Vialou V, Chakravarty S, Kodadek TJ, Nestler EJ การวิเคราะห์โครมาตินอย่างกว้างขวางของโครโมโซมโดยโคเคนเผยให้เห็นบทบาทของ sirtuins เซลล์ประสาท 2009; 62: 335 48- [บทความฟรี PMC] [PubMed]
44. Rotzinger S, Bush DE, Vaccarino FJ การปรับ Cholecystokinin ของฟังก์ชั่นโดปามีน mesolimbic: การควบคุมพฤติกรรมแรงจูงใจ Pharmacol Toxicol 2002; 91: 404 13- [PubMed]
45. Rourke IJ, Hansen TV, Nerlov C, Rehfeld JF, Nielsen FC ความร่วมมือเชิงลบระหว่าง E-box juxtaposed และองค์ประกอบตอบสนอง cAMP / TPA ในโปรโมเตอร์ cholecystokinin FEBS Lett 1999; 448: 15 8- [PubMed]
46. Shaw-Lutchman TZ, Barrot M, Wallace T, Gilden L, Zachariou V, Impey S, Duman RS, Storm D, Nestler EJ การทำแผนที่ภูมิภาคและเซลลูล่าร์ของการถอดความ CRE-mediated ระหว่างการถอนมอร์ฟีนจากนัลโตเซโคโฟน J Neurosci 2002; 22: 3663 3672- [PubMed]
47. Shaw-Lutchman TZ, Impey S, Storm D, Nestler EJ ระเบียบการถอดความ CRE-mediated ในสมองหนูโดยยาบ้า ไซแนปส์ 2003; 48: 10 7- [PubMed]
48. Sheng M, McFadden G, Greenberg ME การสลับขั้วของเมมเบรนและการเหนี่ยวนำให้เกิดการถอดรหัส c-fos ผ่านทางฟอสโฟรีเลชั่นของการถอดรหัสปัจจัย CREB เซลล์ประสาท 1990; 4: 571 82- [PubMed]
49. Tsankova NM, Kumar A, Nestler EJ การปรับเปลี่ยนฮิสโตนที่บริเวณโปรโมเตอร์ยีนในหนูหนูฮิปโปแคมปัสหลังจากเกิดอาการชักด้วยไฟฟ้าเฉียบพลันและเรื้อรัง J Neurosci 2004; 24: 5603 10- [PubMed]
50. Ulery PG, Nestler EJ ระเบียบของกิจกรรมการถอดรหัส DeltaFosB โดย Ser27 phosphorylation Eur J Neurosci 2007; 25: 224 30- [PubMed]
51. Vaccarino FJ นิวเคลียส accumbens ปฏิสัมพันธ์โดพามีน - CCK ในรางวัล psychostimulant และพฤติกรรมที่เกี่ยวข้อง Neurosci Biobehav รายได้ 1992; 18: 207 – 14 [PubMed]
52. Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchmann T, Berton O, Sim-Selley LJ, DiLeone RJ, Kumar A, Nestler EJ ΔFosB: บทบาทที่สำคัญสำหรับΔFosBในนิวเคลียส accumbens ในการกระทำมอร์ฟีน Neurosci ธรรมชาติ 2006; 9: 205 11- [PubMed]