DeltaFosB ไกล่เกลี่ย desensitization epigenetic ของยีน c-fos หลังจากการสัมผัสยาบ้าเรื้อรัง (2008)

เผยแพร่ในแบบฟอร์มการแก้ไขขั้นสุดท้ายเป็น:

PMCID: PMC2610249

NIHMSID: NIHMS66599

นามธรรม

กลไกระดับโมเลกุลที่เปลี่ยนจากการใช้ยาเพื่อการพักผ่อนไปเป็นการเสพติดเรื้อรังยังไม่เป็นที่เข้าใจ หนึ่งโมเลกุลที่เกี่ยวข้องในกระบวนการนี้คือΔFosBซึ่งเป็นปัจจัยการถอดรหัสที่สะสมอยู่ใน striatum หลังจากได้รับยาซ้ำหลายครั้งและเป็นสื่อกลางที่ไวต่อการตอบสนองเชิงพฤติกรรมต่อยารักษาโรคทางจิตและยาอื่น ๆ กลไกการถอดรหัสแบบดาวน์สตรีมที่ΔFosBควบคุมพฤติกรรมที่เกิดจากยานั้นเป็นที่เข้าใจกันอย่างไม่สมบูรณ์ ก่อนหน้านี้เราได้รายงานกลไกการเปลี่ยนแปลงโครมาตินโดยที่ΔFosBกระตุ้นการแสดงออกของยีนบางชนิดอย่างไรก็ตามกลไกที่อยู่ภายใต้การยับยั้งการกดยีน geneFosB ที่อาศัยสื่อกลางยังไม่ทราบ ที่นี่เราระบุ C-เหลวไหลเป็นยีนต้นในทันทีที่เกิดขึ้นอย่างรวดเร็วใน striatum หลังจากได้รับสารกระตุ้นประสาทในฐานะเป้าหมายปลายน้ำแบบใหม่ที่ถูกควบคุมโดย byFosB เราแสดงให้เห็นว่าการสะสมของΔFosBใน striatum หลังจากการรักษาแอมเฟตามีนเรื้อรัง desensitizes C-เหลวไหล การเหนี่ยวนำ mRNA กับปริมาณยาที่ตามมา ΔFosB desensitizes C-เหลวไหล การแสดงออกโดยการสรรหา histone deacetylase 1 (HDAC1) ให้กับ C-เหลวไหล โปรโมเตอร์ของยีนซึ่งจะเปลี่ยนเป็นอะเซทิลีนโดยรอบ histones และลดทอนกิจกรรมของยีน ดังนั้นสิ่งที่น่าพิศวงในท้องถิ่นของ HDAC1 ใน striatum จะยกเลิก desensitization ที่เกิดจากแอมเฟตามีน C-เหลวไหล ยีน. ในคอนเสิร์ตแอมเฟตามีนเรื้อรังเพิ่มฮิสโตน H3 เมธิลใน C-เหลวไหล ก่อการ, การดัดแปลง chromatin ยังเป็นที่รู้จักกันในการปราบปรามกิจกรรมของยีนเช่นเดียวกับระดับการแสดงออกของ H3 ฮิสโตน methyltransferase, KMT1A / SUV39H1 การศึกษาครั้งนี้เผยให้เห็นเส้นทางที่มีความแปลกใหม่ของ epigenetic ซึ่งΔFosBไกล่เกลี่ยโปรแกรมการถอดเสียงที่แตกต่างกัน

คำสำคัญ: การเสพติดยาบ้า, striatum, chromatin, การปรับเปลี่ยนฮิสโตน, การควบคุมยีน

บริษัท

การใช้ psychostimulants ซ้ำ ๆ เช่นยาบ้าและโคเคนบ่อยครั้งส่งผลให้เกิดการเปลี่ยนจากการใช้ยาเพื่อการพักผ่อนไปสู่ภาวะติดยาเรื้อรัง) กลไกหนึ่งที่เกี่ยวข้องในกระบวนการนี้เกี่ยวข้องกับปัจจัยการถอดรหัสΔFosBซึ่งเป็นผลิตภัณฑ์ประกบที่มีความเสถียรสูงของยีนเริ่มต้นทันที fosBซึ่งลดขนาดลงด้วยโปรตีนในตระกูล Jun เพื่อสร้างสารประกอบเชิงซ้อน AP transcriptional AP-1 () ΔFosBสะสมหลายเท่าใน striatum หลังจากได้รับยาเสพติดซ้ำหลายครั้งและการสะสมนี้มีการเชื่อมโยงกับรางวัลโคเคนที่เพิ่มขึ้นการแพ้จากหัวรถจักรและการดูแลตนเอง (; ; ) ซึ่งร่วมกันแนะนำให้มีบทบาทในกลไกประสาทที่เกี่ยวข้องกับการเปลี่ยนระหว่างการพักผ่อนหย่อนใจและการใช้ยาเสพติด ตามสมมติฐานนี้ฟังก์ชันΔFosBในวงตอบรับเชิงบวกโดยการเพิ่มพฤติกรรมการค้นหายาเสพติดซึ่งจะทำให้เกิดΔFosBมากขึ้น คำถามสำคัญที่โดดเด่นอย่างหนึ่งคือΔFosBเป็นสื่อกลางถึงผลกระทบต่อพฤติกรรมที่เกี่ยวข้องกับยาเสพติดอย่างไร การศึกษา microarray ทั่วทั้งจีโนมในหนูที่แสดงออกว่า expressFosB ใน striatum ให้ความเข้าใจอย่างลึกซึ้งเกี่ยวกับเป้าหมายดาวน์สตรีม () การศึกษาครั้งนี้ชี้ให้เห็นว่าΔFosBสามารถทำหน้าที่เป็นตัวเร่งปฏิกิริยาการถอดเสียงหรืออัดโดยขึ้นอยู่กับยีนเป้าหมาย อย่างไรก็ตามการศึกษาตรวจสอบใบรับรองผลการศึกษาในการตั้งค่าการแสดงออกมากเกินไปดังนั้นจึงไม่ชัดเจนซึ่งยีนเหล่านี้เป็นทางตรงเป้าหมายทางสรีรวิทยาΔFosBเป้าหมาย

เราได้ระบุไคเนสที่ขึ้นกับไซโคล 5 (cdk5) ยีนเป็นเป้าหมายโดยตรงสำหรับ ogenFosB ภายนอกซึ่งส่งเสริม Cdk5 การถอดความใน striatum () อย่างไรก็ตามกลไกที่เกี่ยวข้องในการปราบปรามยีนเป้าหมายของΔFosBยังคงเข้าใจยาก หนึ่งในผู้สมัครที่น่าสนใจคือ C-เหลวไหลยีนที่ถูกกระตุ้นอย่างรุนแรงโดย psychostimulants เฉียบพลัน แต่อ่อนแอลงเล็กน้อยหลังจากได้รับสัมผัสซ้ำ ๆ (; ; ) เมื่อระดับของ complexFosB และΔFosBที่มี AP-1 คอมเพล็กซ์สูง (, ) ตั้งแต่ C-เหลวไหล ยีนมีไซต์ที่คล้าย AP-1 ในโปรโมเตอร์ใกล้เคียง () เป็นผู้สมัครที่น่าเชื่อถือสำหรับการกดขี่ΔFosBที่เป็นสื่อกลาง การเหนี่ยวนำของ C-เหลวไหล ถูกมองว่าเป็นเครื่องหมายเริ่มต้นของการกระตุ้นประสาทแบบดั้งเดิมเนื่องจากมันถูกเหนี่ยวนำอย่างรวดเร็วและชั่วคราวเพื่อตอบสนองต่อสิ่งเร้าต่าง ๆ () C-เหลวไหล ยีนก็มีความสำคัญต่อพฤติกรรมตอบสนองต่อโคเคนเช่นเดียวกับหนูที่ขาด C-เหลวไหล ใน dopamine D1 เซลล์ประสาทที่ประกอบด้วยตัวรับชนิดเซลล์ประสาทชนิดที่ΔFosBถูกเหนี่ยวนำโดย psychostimulants () มีการลดความไวต่อพฤติกรรมต่อโคเคน () การค้นพบเหล่านี้ทำให้เราตรวจสอบว่าΔFosBควบคุมหรือไม่ C-เหลวไหล กิจกรรมของยีนหลังจากการเปิดรับยาบ้าเรื้อรัง เราอธิบายกลไก epigenetic แบบใหม่ที่การสะสมΔFosBในการตอบสนองต่อแอมเฟตามีนเรื้อรังดึงกลับไปยัง desensitize C-เหลวไหล การเหนี่ยวนำให้ปริมาณยาที่ตามมา นวนิยายเรื่องนี้มีอิทธิพลซึ่งกันและกันระหว่างΔFosBและเหตุการณ์การเปลี่ยนแปลงของ chromatin บน C-เหลวไหล ผู้ก่อการอาจเป็นกลไกสำคัญในการควบคุมความอ่อนไหวของสัตว์ในการสัมผัสกับยาซ้ำ

วัสดุและวิธีการ

การแยก RNA และการหาปริมาณ

เนื้อเยื่อสมองแช่แข็งถูกละลายใน TriZol (Invitrogen, Carlsbad, CA) และดำเนินการตามระเบียบของผู้ผลิต RNA ถูกทำให้บริสุทธิ์ด้วยคอลัมน์ RNAesy Micro (Qiagen, Valencia, CA) RNA ทั้งหมดถูกถ่ายสำเนาแบบย้อนกลับโดยใช้ Superscript III (Invitrogen) PCR แบบเรียลไทม์ถูกเรียกใช้โดยใช้ SYBR Green (ABI, Foster City, CA) และหาปริมาณโดยใช้วิธีΔΔCt ดู ตารางเสริม สำหรับรายการไพรเมอร์ที่สมบูรณ์

โครมาตินกระตุ้นการตกผลึก (ChIP)

โครมาตินถูกทำให้กระอักกระอ่วนแล้วกระตุ้นภูมิคุ้มกัน (ดู วิธีการเสริม) ใช้ acetylated histone antibodies (มิลลิพอร์, Billerica, MA), anti-HDAC1, หรือ anti-H3K9me2 จาก Abcam (Cambridge, UK), anti-FosB (C-terminus) (), anti-FosB (N-terminus) (เทคโนโลยีชีวภาพซานตาครูซ, ซานตาครูซ, แคลิฟอร์เนีย, รัฐ) หรือการควบคุม IgG กระต่าย (มิลลิพอร์) IP ถูกรวบรวมโดยใช้โปรตีนเม็ดบีจากมิลลิพอร์ หลังจากล้างแล้ว Chromatin จะถูกชะออกจากเม็ดบีดและย้อนกลับ cross-linked ในที่ที่มีโปรตีเอสเคดีเอ็นเอแล้วถูกทำให้บริสุทธิ์และวัดปริมาณโดยใช้ PCR แบบเรียลไทม์

immunoprecipitation

เซลล์ PC12 ได้รับการถ่ายด้วย V5 ที่ติดแท็ก HDAC1 (), FosB หรือΔFosBตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้า () เซลล์ไลซีสถูกแยกและบ่มด้วยแอนติบอดีที่ไม่ใช่ภูมิคุ้มกัน IgG (Sigma) หรือแอนตี้ - ฟอสบีแอนติบอดี (sc-48, ซานตาครูซ) ค้างคืนที่ 4 ° C การให้ภูมิคุ้มกันโดยใช้โปรตีนเม็ด G (Sigma) โปรตีนที่ถูกกระตุ้นให้ทำงานด้วย SDS-PAGE และวิเคราะห์โดย Western blotting โดยใช้ polyclonal anti-FosB (N-terminus) antibody แบบกำหนดเอง) และแอนติบอดีต่อต้าน V5 (Abcam) เพื่อตรวจสอบว่า HDAC1 และΔFosBเป็นพันธมิตรที่มีผลผูกพัน ในร่างกายเราใช้การชักด้วยไฟฟ้าซ้ำ ๆ เพื่อกระตุ้นโปรตีนΔFosBระดับสูง () เนื้อเยื่อเยื่อหุ้มสมองถูกผ่าจากเรื้อรัง (7 ทุกวัน) การจับกุมหรือหนูที่รักษาเสแสร้ง, lysed และ immunoprecipitated ตามที่อธิบายข้างต้นด้วยแอนติบอดีต่อต้าน HDAC1 (Abcam)

การจับเลเซอร์แบบไมโคร

เมื่อใช้การผ่าตัดแบบสเตริโอแทคติค (vente striata) ของหนูติดเชื้อไวรัสที่เกี่ยวข้องกับ adeno (AAV) ซึ่งแสดงถึงยีนที่ระบุหรือ GFP ที่ด้านตรงข้ามของสมอง หลังจากการรักษาแอมเฟตามีนสมองแช่แข็งถูกประมวลผลเป็นส่วนโคโรนา 8 µm หนาและติดตั้งบนแผ่นสไลด์เมมเบรน (Lieca, Wetzlar, Germany) ภูมิภาคที่ติดเชื้อ AAV ถูกเลเซอร์ผ่า (Leica) เพื่อแยกเซลล์ที่ไม่ติดเชื้อและประมวลผลด้วยชุดสกัด PicoPure RNA (MDS, Sunnyvale, CA) RNA ถูกขยายด้วย RiboAmp HS kit (MDS) และถอดเสียงด้านหลังตามที่อธิบายไว้ข้างต้น ดู วิธีการเสริม สำหรับรายละเอียดที่สมบูรณ์

ผลสอบ

ΔFosB desensitizes C-เหลวไหล การเหนี่ยวนำ mRNA ใน striatum หลังจากได้รับแอมเฟตามีนเรื้อรัง

ในการสำรวจว่า desensitization ของ C-เหลวไหล การแสดงออกของ mRNA เป็นการปรับตัวแบบเซลลูลาร์ที่ควบคุมโดยΔFosBเราทำการรักษาหนูด้วยแอมเฟตามีนน้ำเกลือหรือเฉียบพลันหรือเรื้อรัง หนูถูกวิเคราะห์แล้ว 1 ชม. หลังจากปริมาณความท้าทายของน้ำเกลือหรือแอมเฟตามีน ดังที่แสดงไว้ก่อนหน้า (ดู บริษัท), C-เหลวไหล mRNA ถูกเหนี่ยวนำให้เกิด 4-fold ใน striatum โดยการบริหารแอมเฟตามีนแบบเฉียบพลัน ในหนูที่เคยสัมผัสกับแอมเฟตามีนเรื้อรังอย่างไรก็ตามการแสดงออกของ C-เหลวไหล ในการตอบสนองต่อความท้าทายยาเสพติดอย่างมีนัยสำคัญลดทอนถึง 5 วันของการถอนยาเสพติด (รูปที่ 1A) จุดที่ΔFosBยังคงเพิ่มขึ้นในพื้นที่สมองนี้ () นอกจากนี้ในหนูที่ถูกถอนออกจากแอมเฟตามีนเรื้อรังเป็นเวลา 5 วันเราก็พบว่าเบสนั้น C-เหลวไหล การแสดงออกของ mRNA ลดลงต่ำกว่าระดับที่พบในการควบคุมด้วยน้ำเกลือ (รูปที่ 1A) ที่สำคัญขนาดของ C-เหลวไหล การเหนี่ยวนำให้เกิดการท้าทายแอมเฟตามีนนั้นลดลงอย่างมีนัยสำคัญในวันที่ 1 ของการถอนตัวเมื่อเทียบกับสัตว์ที่รักษาด้วยน้ำเกลือ การค้นพบนี้แสดงให้เห็นถึงผลกระทบของแอมเฟตามีนเรื้อรังต่อทั้งพื้นฐานและการชักนำ C-เหลวไหล ระดับ mRNA แม้ว่าจะมีสองเอฟเฟกต์ที่เกิดขึ้นกับหลักสูตรเวลาที่ซับซ้อน

รูป 1  

ΔFosB desensitizes C-เหลวไหล การเหนี่ยวนำ mRNA ใน striatum หลังจากได้รับแอมเฟตามีนเรื้อรัง

เพื่อตรวจสอบว่าการสะสมของΔFosBหลังจากแอมเฟตามีนเรื้อรังมีส่วนช่วยในการลดความเสี่ยง C-เหลวไหล นิพจน์เราดำเนินการ ChIP ครั้งแรกสำหรับΔFosBบน C-เหลวไหล โปรโมเตอร์ยีนใน striatum ตามที่ปรากฏใน รูปที่ 1Bที่ C-เหลวไหล ผู้ก่อการมีΔFosBผูกมัดอย่างมากหลังจากได้รับแอมเฟตามีนเรื้อรังผลที่เห็นเป็นเวลาอย่างน้อย 5 วันของการถอนยา ข้อมูลเหล่านี้มีความสัมพันธ์กับการเข้าพักของΔFosBบน C-เหลวไหล ก่อการกับจลนพลศาสตร์ของการลดลง C-เหลวไหล กิจกรรมของยีน ถัดไปเพื่อทดสอบโดยตรงว่าΔFosBทำให้ลดลงหรือไม่ C-เหลวไหล การเหนี่ยวนำเพื่อตอบสนองต่อความท้าทายแอมเฟตามีนเราใช้เวกเตอร์ AAV เพื่อแสดงออกอย่างมากทั้งΔFosBหรือ GFP เป็นตัวควบคุมใน striatum จากนั้นเราก็ทำการแยก striatum ที่ติดเชื้อโดย laser microdissection (รูป 1C) และดำเนินการ qRT-PCR สำหรับ C-เหลวไหล mRNA เราสังเกตอย่างมีนัยสำคัญน้อยกว่า C-เหลวไหล mRNA เกิดขึ้นหลังจากการให้แอมเฟตามีนในปริมาณมากในเนื้อเยื่อ striatal ที่ติดเชื้อ AAV-ΔFosBเมื่อเทียบกับด้าน contralateral ที่ติดเชื้อ AAV-GFP ในขณะที่ระดับของ β-tubulin mRNA ยังคงไม่เปลี่ยนแปลง (รูปที่ 1D) ข้อมูลเหล่านี้แนะนำว่า C-เหลวไหล desensitization เป็นสื่อกลางโดยการสะสมของΔFosBในโปรโมเตอร์ของมันหลังจากการสัมผัสยาบ้าเรื้อรัง

ΔFosBรับสมัคร HDAC1 อีกครั้งเพื่อ C-เหลวไหล ผู้ก่อการไกล่เกลี่ย C-เหลวไหล การหักห้ามใจของยีน

เพื่อสำรวจกลไกที่ medFosB เป็นสื่อกลาง C-เหลวไหล desensitization เรามุ่งเน้นไปที่จุดเวลาที่ C-เหลวไหล ถูกระงับอย่างมีนัยสำคัญที่สุด: 5 วันของการถอนออกจากแอมเฟตามีนเรื้อรัง กลไกสำคัญที่เกี่ยวข้อง C-เหลวไหล การเปิดใช้งานเพื่อตอบสนองต่อสิ่งเร้าต่าง ๆ รวมถึงโคเคน) คือ acetylation ฮิสโตน เราจึงมีความสนใจที่จะตรวจสอบว่าฮิสโตนอะซิติเลชั่นบน C-เหลวไหล โปรโมเตอร์ของยีนถูกกระตุ้นด้วยแอมเฟตามีนแบบเฉียบพลันและการสัมผัสกับยาซ้ำ ๆ นั้นลดการตอบสนองนี้หรือไม่ แอมเฟตามีนเฉียบพลันเพิ่มฮิสโตน H4 acetylation บน C-เหลวไหล ผู้ก่อการและหลังจากการรักษาแอมเฟตามีนเรื้อรังการเหนี่ยวนำนี้ไม่ถูกสังเกตเห็นอีกต่อไป (รูปที่ 2A) Acetylation ของ H4 นั้นจำเพาะเจาะจงเนื่องจากไม่มีผลกระทบใด ๆ สำหรับ H3 (ไม่แสดง) ข้อมูลเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าการลดฮิสโตนอะซิติเลชั่นเกี่ยวข้องกับโครงสร้างโครมาตินที่กะทัดรัดและไม่ทำงาน () มีส่วนช่วยในการลดความจำเป็นของ C-เหลวไหล ยีนหลังจากการสัมผัสแอมเฟตามีนเรื้อรัง เพื่อทดสอบสมมติฐานนี้โดยตรงเราทำการรักษาหนูด้วยยาบ้าเรื้อรังและหลังจากการถอน 5 วันให้ยา HDAC ยับยั้งโซเดียม butyrate หรือยานพาหนะ เราพบว่าโซเดียม butyrate กลับยับยั้งการปราบปรามของแอมเฟตามีน C-เหลวไหล การแสดงออก (รูปที่ 2B) โดยตรงสนับสนุนความคิดที่ hypoacetylation C-เหลวไหล ก่อการเป็นกลไกสำคัญที่ทำให้เกิดการลดความสำคัญของยีน

รูป 2  

การรับสมัครของ HDAC1 ไกล่เกลี่ยการกระทำ osFosB บน C-เหลวไหล

เพื่อให้เข้าใจว่าΔFosBยับยั้งฮิสโตนอะซิติเลชั่นใน C-เหลวไหล โปรโมเตอร์เราตรวจสอบว่าΔFosBมีปฏิกิริยากับเอนไซม์ที่ลดฮิสโตนอะซิติเลชั่นหรือไม่คือ HDAC ก่อนอื่นเราสำรวจ HDAC1 และ HDAC2 เพราะเอนไซม์เหล่านี้ก่อตัวเป็นสารประกอบเชิงซ้อนที่มีความหลากหลายของปัจจัยการถอดรหัสเพื่อยับยั้งการแสดงออกของยีน () เนื่องจากการศึกษาเบื้องต้นของ ChIP ระบุว่า HDAC1 มีผลผูกพันอย่างมีนัยสำคัญใน C-เหลวไหล ผู้ก่อการ (ดูด้านล่าง) แต่ไม่มี HDAC2 ที่ตรวจพบได้ (ไม่แสดง) เราได้ทำการทดลองแบบ co-immunoprecipitation เพื่อตรวจสอบว่าΔFosBมีปฏิกิริยากับ HDAC1 หรือไม่ อันที่จริงเราพบว่าการกระตุ้นด้วยภูมิคุ้มกันของΔFosBก็ดึง HDAC1 ลงในเซลล์ PC12 (รูปที่ 2D) ที่สำคัญการมีปฏิสัมพันธ์นี้มีความเฉพาะสำหรับΔFosBเนื่องจาก FosB แบบยาวเต็มรูปแบบซึ่งไม่ได้สะสมหลังจากการรักษาด้วยยาจิตเวชเรื้อรัง () ไม่ได้โต้ตอบกับ HDAC1 เราทำการทดลองย้อนกลับ ในร่างกาย ด้วยการชักนำΔFosBจำนวนมากด้วยการชักด้วยไฟฟ้า สอดคล้องกับข้อมูลการเพาะเลี้ยงเซลล์ของเราภูมิคุ้มกันที่มีแอนติบอดีต่อต้าน HDAC1 ดึงลงΔFosBจากเนื้อเยื่อสมอง (รูปที่ 2E).

จากการค้นพบเหล่านี้ที่ΔFosBและ HDAC1 โต้ตอบทางร่างกาย ในหลอดทดลอง และ ในร่างกายเราตั้งสมมติฐานว่าหลังจากแอมเฟตามีนเรื้อรังΔFosBรับสมัคร HDAC1 อีกครั้งเพื่อ C-เหลวไหล โปรโมเตอร์ยีน แท้จริงแล้ว ChIP ของ lisates striatal พบว่ามีระดับ HDAC1 สูงขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ C-เหลวไหล ก่อการหลังจากการสัมผัสยาบ้าเรื้อรัง (รูป 2C) ในขณะที่แอมเฟตามีนไม่ได้เปลี่ยนแปลง HDAC1 ที่เชื่อมโยงกับ β-โปรตีน โปรโมเตอร์ยีน หากต้องการตรวจสอบโดยตรงว่า HDAC1 เพียงพอที่จะลดทอนหรือไม่ C-เหลวไหล เราทำการแปลงเซลล์ HEK293T ด้วย HDAC1 หรือ GFP และกระตุ้นพวกมันด้วย 5% เซรั่ม (ดู วิธีการเสริม) เราพบว่าเกิดเซรั่ม C-เหลวไหล การแสดงออกถูกทื่ออย่างมีนัยสำคัญในเซลล์แสดงผลมากเกินไป HDAC1 (รูปที่ 2F) การศึกษาเหล่านี้ได้ขยายออกไป ในร่างกาย โดยใช้ฟลูป HDAC1 ที่ติดเชื้อ AAV-GFP ที่ด้านหนึ่งของ striatum และ AAV-CreGFP เพื่อกระตุ้นให้เกิดการล้มลง hdac1 ยีนใน contralateral striatum AAV-CreGFP ลดลง Hdac1 การแสดงออกของ mRNA ในเนื้อเยื่อที่ติดเชื้อ (แยกโดยเลเซอร์ microdissection)> 75% เมื่อเทียบกับ AAV-GFP ที่ฉีดควบคุมในขณะที่ Hdac2 การแสดงออกยังคงไม่เปลี่ยนแปลง (รูปที่ 2G) หนูจะได้รับการรักษาด้วยแอมเฟตามีนเรื้อรังตามด้วยการถอนตัวยาเป็นเวลา 5 วัน หนูถูกวิเคราะห์ 30 นาทีหลังจากการยาบ้าและพื้นที่ striatal ที่ติดเชื้อนั้นถูก microdissected เราพบว่าแอมเฟตามีนเหนี่ยวนำให้เกิดขึ้นอย่างมีนัยสำคัญมากขึ้น C-เหลวไหล mRNA ในเนื้อเยื่อ striatal ที่ติดเชื้อ AAV-CreGFP เทียบกับ AAV-GFP (รูปที่ 2G) แสดงให้เห็นว่า HDAC1 เป็นสิ่งจำเป็นสำหรับการปราบปรามยาบ้าที่เกิดจากแอมเฟตามีนเรื้อรัง C-เหลวไหล การแสดงออก ข้อมูลเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าการสะสมของ BFosB ในหนูหลังการรักษาแอมเฟตามีนเรื้อรังส่งผลให้ moreFosB มีผลผูกพันกับ C-เหลวไหล โปรโมเตอร์การสรรหา HDAC1 acetylation ฮิสโตนน้อยและท้ายที่สุดกิจกรรมของยีน

methylation ฮิสโตนจะเพิ่มขึ้นเมื่อ C-เหลวไหล ก่อการหลังจากการสัมผัสยาบ้าเรื้อรัง

การหักห้ามใจของกิจกรรมของยีนมักเกี่ยวข้องกับการดัดแปลง epigenetic หลายอย่างที่เกิดขึ้นแบบขนาน (; ) หนึ่งในการดัดแปลงฮิสโตนที่โดดเด่นที่สุดที่เกี่ยวข้องกับการทำงานของยีนที่ลดลงคือเมทิลเลชันของฮิสโตน H3 ที่ไลซีน 9 (H3K9) การปรับเปลี่ยนฮิสโตนนี้เมื่อพบในพื้นที่โปรโมเตอร์สัมพันธ์กับการกดการถอดเสียงโดยการสรรหา co-repressors เช่น HP1 (heterochromatin protein 1) () เราจึงวิเคราะห์ว่า hypoacetylation ของ C-เหลวไหล ยีนที่เห็นหลังจากการบริหารแอมเฟตามีนเรื้อรังยังเกี่ยวข้องกับการเปลี่ยนแปลงในเมทิลเลชั่น H3K9 สอดคล้องกับสมมติฐานนี้ ChIP ดำเนินการเกี่ยวกับเนื้อเยื่อ striatal จากหนูรับการรักษาด้วยยาบ้าเรื้อรังเปิดเผยว่า di-methylated H3K9 (H3K9me2) เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญใน C-เหลวไหล ผู้ก่อการรูปที่ 3A) ผลกระทบที่ไม่ได้สังเกตเห็นใน β-โปรตีน โปรโมเตอร์ยีน หนึ่งในเอนไซม์หลักที่ไกล่เกลี่ย H3K9 methylation คือ KMT1A / SUV39H1 ซึ่งทำให้เกิดคำถามว่าการแสดงออกของเอนไซม์นี้ถูกควบคุมโดยการสัมผัสยาบ้าเรื้อรังหรือไม่ เราดำเนินการ qRT-PCR บน striatum ของหนูที่ได้รับการรักษาด้วยยาบ้าเรื้อรังและสังเกตเห็นการเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญของ Kmt1a / Suv39h1 mRNA ในขณะที่ chromatin ดัดแปลงเอนไซม์ Hdac5ยังคงได้รับผลกระทบ (รูปที่ 3B) ซึ่งแตกต่างจาก HDAC1 อย่างไรก็ตามการทดลองแบบ co-immunoprecipitation ไม่เปิดเผยการทำงานร่วมกันที่ตรวจพบได้ระหว่างΔFosBและ KMT1A / SUV39H1 และเราไม่สามารถระบุการเสริมสารสำคัญของ methyltransferase บน C-เหลวไหล ผู้สนับสนุนโดย ChIP (ไม่แสดง) การค้นพบเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าการควบคุม KMT1A / SUV39H1 อาจทำให้ H3 hypermethylate ที่ C-เหลวไหล และนำไปสู่การลดกลไก C-เหลวไหล กิจกรรมของยีนหลังจากการเปิดรับยาบ้าเรื้อรัง

รูป 3  

ฮิสโตน methylation หลังจากได้รับยาบ้าเรื้อรัง

การสนทนา

การศึกษาครั้งนี้ระบุว่า C-เหลวไหล เป็นยีนปลายน้ำเป้าหมายใหม่ของΔFosBใน striatum หลังจากการบริหารแอมเฟตามีนเรื้อรัง เราให้หลักฐานโดยตรงที่ว่าภายนอกΔFosBผูกติดกับ C-เหลวไหล โปรโมเตอร์ ในร่างกายโดยที่ΔFosBรับสมัคร HDAC1 ใหม่เพื่อยกเลิกการปิดเสียงฮิสโตสโดยรอบและลดกิจกรรมการถอดเสียงของ C-เหลวไหล ยีน. ทั้งการยับยั้งทางเภสัชวิทยาของ HDACs และสิ่งที่น่าพิศวงของ HDAC1 นั้นไม่เพียงพอที่จะบรรเทา C-เหลวไหล desensitization และยกระดับ C-เหลวไหล การแสดงออกใน striatum ของสัตว์ที่รักษาแอมเฟตามีนเรื้อรัง นอกจากนี้เรายังพบการเพิ่มขึ้นของฮิสโตนเมทิลเลชั่นที่ถูกกดทับพร้อมกันที่ H3K9 บน C-เหลวไหล ก่อการ, การปรับตัวที่เกี่ยวข้องกับ upregulation แอมเฟตามีนที่เกิดขึ้นของฮิสโตน methyltransferase, KMT1A / SUV39H1 การค้นพบเหล่านี้ร่วมกันให้ข้อมูลเชิงลึกใหม่ ๆ เกี่ยวกับกลไกที่ΔFosBยับยั้งกิจกรรมของยีนบางชนิดและแสดงให้เห็นถึงการมีปฏิสัมพันธ์ใหม่ ๆ ระหว่างทางเดินหลักสองเส้นทางที่ควบคุมการตอบสนองเชิงพฤติกรรมต่อจิตเวช: inductionFosB) และการเปลี่ยนแปลง chromatin () การค้นพบของเราแสดงให้เห็นว่าเส้นทางทั้งสองนี้มาบรรจบกันได้อย่างไร C-เหลวไหล ผู้ก่อการหลังจากการสัมผัสยาบ้าเรื้อรังเพื่อเปลี่ยนกิจกรรมของยีน

ครั้งแรกที่เราสังเกตเห็น C-เหลวไหล การแสดงออกของ mRNA หลังจากการรักษาโคเคนเรื้อรังมากกว่า 15 ปีที่ผ่านมา () แต่ไม่มีความเข้าใจกลไกที่มีอยู่ในวิธีการตอบสนองการถอดเสียงที่แตกต่างกันอย่างลึกซึ้งดังกล่าวอาจเกิดขึ้นระหว่างการสัมผัสกับยาเสพติดเฉียบพลันและเรื้อรัง ในความพยายามของเราเพื่อทำความเข้าใจการดำเนินการดาวน์สตรีมของΔFosBเรากลับมาควบคุมอีกครั้ง C-เหลวไหล การแสดงออกเนื่องจากการควบคุมที่แตกต่างกันระหว่างการสัมผัสกับยาจิตเวชเฉียบพลันและเรื้อรัง เนื่องจากΔFosBสูงขึ้นหลายเท่าหลังจากได้รับยาเรื้อรังการเหนี่ยวนำที่แตกต่างกันของ C-เหลวไหล mRNA เช่นเดียวกับไซต์เหมือน AP-1 ใน C-เหลวไหล ผู้ก่อการใกล้เคียงแนะนำบทบาทที่มีศักยภาพในการกำกับดูแลสำหรับΔFosB สิ่งนี้ยังทำให้ C-เหลวไหล ยีนผู้สมัครที่น่าสนใจที่จะศึกษาผลการปราบปรามของΔFosBในการแสดงออกของยีน ().

แอมเฟตามีนเรื้อรังลดทอน C-เหลวไหล การเหนี่ยวนำ mRNA หรือระดับพื้นฐานใน striatum เป็นเวลาประมาณ 5 วันของการถอนตัวยาซึ่งเป็นช่วงเวลาที่สอดคล้องกับความเสถียรของΔFosB () และอัตราการเข้าพักใน C-เหลวไหล โปรโมเตอร์ แม้ว่าΔFosBสามารถตรวจจับได้หลังจากที่ถอนออกมาเป็นเวลานาน แต่ก็ค่อยๆลดลงเมื่อเวลาผ่านไป (; ) และอาจไม่เพียงพอในการรักษาการกดปุ่ม C-เหลวไหล ยีนมากเกินกว่าที่กำหนดเวลาวัน 5 อย่างไรก็ตามช่วงเวลาของ C-เหลวไหล desensitization มีความซับซ้อนด้วยการปราบปรามการเหนี่ยวนำพับโดยแอมเฟตามีนท้าทายสูงสุดที่ 1 วันของการถอน แต่การปราบปรามของระดับฐานของมันสูงสุดที่ 5 วันของการถอน ข้อมูล ChIP ของเราแสดงว่าΔFosBถูกผูกไว้กับ C-เหลวไหล โปรโมเตอร์ที่จุดเวลาทั้งสองชี้ให้เห็นว่ากิจกรรมที่แตกต่างของ C-เหลวไหล ยีนที่สังเกตุระหว่าง 1 และ 5 วันของการถอนอาจเป็นเพราะหน่วยงานด้านการถอดเสียงเพิ่มเติมที่คัดเลือกมาให้กับยีนด้วยหลักสูตรเวลาที่ซับซ้อนมาก จำเป็นต้องมีการศึกษาเพิ่มเติมเพื่อทำความเข้าใจกลไกรายละเอียดที่เกี่ยวข้อง

ความสำคัญด้านพฤติกรรมของΔFosB-mediated C-เหลวไหล desensitization อาจ homeostatic เหมือนหนูที่ขาด C-เหลวไหล ยีนในเซลล์ประสาทที่มีตัวรับ dopamine D1 แสดงพฤติกรรมตอบสนองต่อโคเคนที่ลดลง () นอกจากนี้สารยับยั้ง HDAC ซึ่งปิดกั้นΔFosB-mediated desensitization C-เหลวไหลเพิ่มความไวของสัตว์ต่อผลกระทบด้านพฤติกรรมของโคเคน (; ) การค้นพบเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าในขณะที่ผลกระทบสุทธิΔFosBคือการส่งเสริมการตอบสนองพฤติกรรมไวต่อยาจิตเวช (; ) นอกจากนี้ยังเริ่มต้นโปรแกรมการถอดรหัสใหม่ด้วย C-เหลวไหล desensitization เพื่อ จำกัด ขนาดของพฤติกรรมเดียวกันนี้ ΔFosBจะทำการไตเตรทการตอบสนองเชิงพฤติกรรมต่อ psychostimulants ผ่านชุดการบันทึกเหตุการณ์ปลายน้ำที่ซับซ้อนซึ่งเกี่ยวข้องกับการเหนี่ยวนำหรือการปราบปรามของยีนเป้าหมายจำนวนมาก () ซึ่งนอกเหนือจากการเข้ารหัสยีน c-Fos ดังที่แสดงที่นี่ยังรวมถึง AMPA glutamate receptor subunit GluR2 () ไคเนสซีรีน - ธ รีโอนีน Cdk5 () และ opioid peptide dynorphin (), ท่ามกลางคนอื่น ๆ () ยีนเหล่านี้บางส่วนเปิดใช้งานโดยΔFosB (ที่ΔFosBเรียกใช้ co-activators transcriptional) () ในขณะที่คนอื่นถูกควบคุมโดยΔFosB (โดยที่ΔFosBดังที่แสดงไว้ที่นี่ ความพยายามที่สำคัญของการวิจัยในอนาคตคือการระบุปัจจัยที่กำหนดว่าΔFosBจะกระตุ้นหรือยับยั้งยีนเป้าหมายเมื่อมันจับกับโปรโมเตอร์ยีน

เมื่อนำมารวมกันการค้นพบของเราระบุกลไก epigenetic แบบใหม่ซึ่งΔFosBเป็นสื่อกลางในส่วนของผลการถอดเสียงใน striatum หลังจากได้รับยาบ้าเรื้อรัง การศึกษานี้ยังให้ข้อมูลเชิงลึกใหม่ที่สำคัญในกลไกการถอดรหัสและ epigenetic พื้นฐาน ในร่างกาย มีส่วนร่วมใน desensitization (เช่นความอดทน) ของยีนที่สำคัญสำหรับการตอบสนองพฤติกรรมที่กระตุ้นจิต

 

วัสดุเสริม

กิตติกรรมประกาศ

งานนี้สนับสนุนโดย NIDA

อ้างอิง

  • Bibb JA, Chen J, Taylor JR, Svenningsson P, Nishi A, Snyder GL, Yan Z, Sagawa ZK, Ouimet CC, Nairn AC, Nestler EJ, Greengard P. ผลกระทบของการสัมผัสโคเคนแบบเรื้อรังกับโปรตีนโคเคน Cdk5 ธรรมชาติ. 2001; 410: 376 380- [PubMed]
  • Carle TL, Ohnishi YN, Ohnishi YH, Alibhai IN, Wilkinson MB, Kumar A, Nestler EJ กลไกที่ขึ้นกับโปรตีนและ - อิสระสำหรับการทำให้เสถียร FosB: การระบุโดเมน FosB degron และผลกระทบต่อเสถียรภาพ DeltaFosB Eur J Neurosci 2007; 25: 3009 3019- [PubMed]
  • Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, DW ตัวเอง การแสดงออกเฉพาะของเซลล์มากเกินไปของ DeltaFosB ช่วยเพิ่มแรงจูงใจสำหรับโคเคน J Neurosci 2003; 23: 2488 2493- [PubMed]
  • Grozinger CM, Schreiber SL เอนไซม์ Deacetylase: หน้าที่ทางชีวภาพและการใช้สารยับยั้งโมเลกุลขนาดเล็ก Chem Biol 2002; 9: 3 16- [PubMed]
  • Hope B, Kosofsky B, Hyman SE, Nestler EJ ระเบียบว่าด้วยการแสดงออกของยีนในระยะเริ่มแรกและ AP-1 มีผลผูกพันในนิวเคลียสหนูโดยการโคเคนเรื้อรัง Proc Natl Acad Sci US A. 1992; 89: 5764 – 5768 [บทความฟรี PMC] [PubMed]
  • Hope BT, Nye HE, Kelz MB, DW ตัวเอง, Iadarola MJ, Nakabeppu Y, Duman RS, Nestler EJ การเหนี่ยวนำของคอมเพล็กซ์ AP-1 ที่ยาวนานประกอบด้วยโปรตีน Fos-like ที่เปลี่ยนแปลงในสมองโดยโคเคนเรื้อรังและการรักษาอื่น ๆ เซลล์ประสาท 1994; 13: 1235 1244- [PubMed]
  • Hyman SE, Malenka RC, Nestler EJ กลไกประสาทของการเสพติด: บทบาทของการเรียนรู้ที่เกี่ยวข้องกับการให้รางวัลและความทรงจำ Annu Rev Neurosci 2006; 29: 565 598- [PubMed]
  • Kelz MB, Chen J, Carlezon WA, Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, DW ตนเอง, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Neve RL, Duman RS, Picciotto MR, Nestler EJ การแสดงออกของปัจจัยการถอดรหัส deltaFosB ในสมองควบคุมความไวต่อโคเคน ธรรมชาติ. 1999; 401: 272 276- [PubMed]
  • Kouzarides T. การดัดแปลง Chromatin และฟังก์ชั่นของมัน เซลล์ 2007; 128: 693 705- [PubMed]
  • Kumar A, Choi KH, Renthal W, Tsankova NM, Theobald DE, Truong HT, Russo SJ, Laplant Q, Sasaki TS, Whistler KN, Neve RL, DW ตัวเอง, Nestler EJ Chromatin remodeling เป็นกลไกสำคัญที่แสดงถึงความเป็นพลาสติกที่เกิดจากโคเคนใน striatum เซลล์ประสาท 2005; 48: 303 314- [PubMed]
  • McClung CA, Nestler EJ ระเบียบการแสดงออกของยีนและรางวัลโคเคนโดย CREB และ DeltaFosB Nat Neurosci 2003; 6: 1208 1215- [PubMed]
  • McClung CA, Ulery PG, Perrotti LI, Zachariou V, Berton O, Nestler EJ DeltaFosB: สวิตช์ระดับโมเลกุลสำหรับการปรับตัวในระยะยาวในสมอง ต้านทานสมอง Mol ต้านทานสมอง. 2004; 132: 146 154- [PubMed]
  • Montgomery RL, Davis CA, Potthoff MJ, Haberland M, Fielitz J, Qi X, ฮิลล์ JA, Richardson JA, โอลสัน EN Histone deacetylases 1 และ 2 ควบคุมการเปลี่ยนรูปร่างของหัวใจการเติบโตและการหดตัวซ้ำซ้อน ยีน Dev 2007; 21: 1790 1802- [บทความฟรี PMC] [PubMed]
  • มอร์แกน JI, เคอร์แรนต. กระตุ้นการมีเพศสัมพันธ์ในเซลล์ประสาท: บทบาทของยีนต้นเซลล์ทันที เทรนด์ Neurosci 1989; 12: 459 462- [PubMed]
  • Nye HE, Hope BT, Kelz MB, Iadarola M, Nestler EJ การศึกษาทางเภสัชวิทยาของกฎระเบียบของการเหนี่ยวนำแอนติเจนที่เกี่ยวข้องกับ FOS เรื้อรังโดยโคเคนใน striatum และนิวเคลียส accumbens J Pharmacol Exp Ther. 1995; 275: 1671 1680- [PubMed]
  • Persico AM, Schindler CW, O'Hara BF, Brannock MT, Uhl GR. การแสดงออกของปัจจัยการถอดความของสมอง: ผลของแอมเฟตามีนแบบเฉียบพลันและเรื้อรังและความเครียดจากการฉีดยา สมอง Res Mol Brain Res. 1993; 20: 91–100 [PubMed]
  • Renthal W, Maze I, Krishnan V, Covington HE, 3rd, Xiao G, Kumar A, Russo SJ, Graham A, Tsankova N, Kippin TE, Kerstetter, Neve RL, Haggarty SJ, McKeley TA, Bassel-Duby R, Olson EN, Nestler EJ Histone deacetylase 5 epigenetically ควบคุมการปรับพฤติกรรมเพื่อกระตุ้นอารมณ์เรื้อรัง เซลล์ประสาท 2007; 56: 517 529- [PubMed]
  • Steiner H, Gerfen CR c-fos messenger โคเคนที่เกิดขึ้น RNA เกี่ยวข้องกับการแสดงออกของ dynorphin ใน striatum J Neurosci 1993; 13: 5066 5081- [PubMed]
  • Tsankova N, Renthal W, Kumar A, Nestler EJ การควบคุม epigenetic ในโรคทางจิตเวช Nat Rev Neurosci 2007; 8: 355 367- [PubMed]
  • Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchman T, Berton O, Sim-Selley LJ, Dileone RJ, Kumar A, Nestler EJ มีบทบาทสำคัญสำหรับ DeltaFosB ในนิวเคลียส accumbens ในการกระทำมอร์ฟีน Nat Neurosci 2006; 9: 205 211- [PubMed]
  • Zhang J, Zhang L, Jiao H, Zhang Q, Zhang D, Lou D, Katz JL, Xu M. c-Fos อำนวยความสะดวกในการได้มาและการสูญเสียของการเปลี่ยนแปลงแบบถาวรที่เกิดจากโคเคน J Neurosci 2006; 26: 13287 13296- [PubMed]