ประสบการณ์การใช้ยา epigenetically primes Fosb inducibility ในหนูหนูนิวเคลียส accumbens (2012)

ความคิดเห็น: หลักฐานที่แสดงว่า deltafosb ทิ้งร่องรอยไว้นานหลังจากการฟื้นตัวจากการเสพติด การติดเฉพาะทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลง epigenetic ซึ่งส่งผลให้เกิดการเหนี่ยวนำของ deltafosb ได้เร็วขึ้นมากเมื่อเกิดการกำเริบของโรค สิ่งนี้อธิบายถึงวิธีการกำเริบของโรคแม้หลังจากหลายปีที่ผ่านมาสามารถขยายไปสู่รัฐที่ติดยาเสพติดอย่างเต็มรูปแบบ



J Neurosci ต้นฉบับผู้เขียน; พร้อมใช้งานใน PMC 2013 มกราคม 25

 

นามธรรม

osFosB, Fosb ผลิตภัณฑ์ยีนถูกเหนี่ยวนำให้เกิดในนิวเคลียส accumbens (NAc) และ caudate putamen (CPu) โดยการสัมผัสกับยาเสพติดซ้ำเช่นโคเคน การเหนี่ยวนำนี้ก่อให้เกิดรูปแบบที่ผิดปกติของการแสดงออกของยีนและความผิดปกติของพฤติกรรมที่เห็นด้วยการได้รับยาซ้ำ.

ที่นี่เราประเมินว่าประวัติระยะไกลของการสัมผัสกับยาในหนูอาจเปลี่ยนแปลงความไม่ลงรอยกันของ Fosb ยีนที่นำออกมาโดยการสัมผัสโคเคน เราแสดงให้เห็นว่าการบริหารโคเคนเรื้อรังก่อนตามด้วยการถอนออกไปเป็นเวลานาน Fosb ใน NAc เป็นหลักฐานโดยการเหนี่ยวนำแบบเฉียบพลันมากขึ้นของΔFosB mRNA และการสะสมที่เร็วขึ้นของโปรตีนΔFosBหลังจากการสัมผัสโคเคนซ้ำ ๆ. ไม่มีสีพื้น Fosb การเหนี่ยวนำถูกสังเกตใน CPu อันที่จริงแล้วการเหนี่ยวนำเฉียบพลันของΔFosB mRNA ถูกยับยั้งใน CPu

รูปแบบที่ผิดปกติของ Fosb การแสดงออกที่เกี่ยวข้องกับการดัดแปลงโครมาตินที่ Fosb โปรโมเตอร์ยีน การบริหารโคเคนเรื้อรังก่อนก่อให้เกิดการเพิ่มขึ้นยาวนานใน RNA polymerase II (Pol II) ที่มีผลผูกพัน Fosb ผู้ก่อการใน NAc เท่านั้นแนะนำว่า Pol II "ถ่วงเวลา" ช่วงเวลา Fosb สำหรับการเหนี่ยวนำในภูมิภาคนี้เมื่อสัมผัสกับโคเคนอีกครั้ง. ความท้าทายโคเคนจะกระตุ้นการปลดปล่อย Pol II จากผู้ก่อการยีน Fosb การถอดความ ความท้าทายของโคเคนยังลดการบีบอัดฮิสโตนที่ควบคุมได้ Fosb ผู้ก่อการใน NAc แต่เพิ่มเครื่องหมายปราบปรามและลดการเปิดใช้งานเครื่องหมายใน CPu

ผลลัพธ์เหล่านี้ให้ข้อมูลเชิงลึกใหม่เกี่ยวกับการเปลี่ยนแปลงของโครมาตินที่ Fosb ผู้ก่อการและเผยให้เห็นกลไกใหม่สำหรับรองพื้น Fosb การเหนี่ยวนำใน NAc เมื่อสัมผัสกับโคเคนอีกครั้ง

บริษัท

การติดยาเสพติดเป็นลักษณะของการแสวงหาและการใช้ยาซึ่งต้องกระทำแม้จะมีผลกระทบรุนแรง (Kalivas et al., 2005; Hyman et al., 2006). การได้รับยาเรื้อรังทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงอย่างต่อเนื่องในการแสดงออกของยีนใน ventral striatum (หรือนิวเคลียส accumbens; NAc) และ dorsal striatum (หรือ caudate putamen; CPu), โครงสร้างของทารกในครรภ์ที่เกี่ยวข้องกับการให้รางวัลและการติดยา (ฟรีแมนและคณะ, 2001; โรบินสันและคอล์บ 2004; Shaham และ Hope 2005; เขาวงกตและเนสท์เล่ 2011). ΔFosBโปรตีนที่ถูกตัดทอนและมีความเสถียรซึ่งเข้ารหัสโดยยีนที่อยู่ในช่วงเริ่มต้น Fosbเป็นปัจจัยการถอดรหัสที่โดดเด่นที่เกิดขึ้นใน NAc และ CPu จากการสัมผัสเรื้อรังกับยาเสพติดทุกชนิดที่ใช้ในทางที่ผิดซึ่งจะเป็นสื่อกลางในการตอบสนองพฤติกรรมที่ไวต่อการบริหารยาซ้ำ (Nestler, 2008) อย่างไรก็ตามไม่ว่าก่อนหน้านี้การสัมผัสกับยาเสพติดก่อนหน้านี้จะมีการเปลี่ยนแปลงการเหนี่ยวนำ inductionFosB หรือไม่ก็ตาม

เราได้ตั้งสมมติฐานเมื่อไม่นานมานี้ว่าการดัดแปลงโครมาตินเพื่อตอบสนองต่อการสัมผัสกับยาเสพติดเรื้อรังอาจเปลี่ยนแปลงความไม่แน่นอนของยีนจำเพาะในบริเวณสมองเป้าหมาย (Robison and Nestler, 2011) หลักฐานที่เพิ่มขึ้นแสดงให้เห็นว่ายาที่ใช้ในทางที่ผิดหลังจากที่มีการบริหารเรื้อรังจะปรับเปลี่ยนโครงสร้างและการเข้าถึงโครมาตินแบบถอดเสียงผ่านการดัดแปลงหลายประเภทรวมถึงฟอสโฟรีเลชั่นอะเซทิเลชัน งานล่าสุดในระบบการเพาะเลี้ยงเซลล์ได้มุ่งเน้นไปที่การคัดเลือก RNA polymerase II (Pol II) ให้กับโปรโมเตอร์ของยีน“ inducible” ก่อนที่จะแสดงออกโดย Pol II นั้นถูกผูกไว้กับภูมิภาคโปรโมเตอร์ใกล้เคียงและรอบ ๆ ไซต์การถอดความ (TSS) ) ในสถานะ“ จนตรอก” (Core และ Lis, 2008; Nechaev และ Adelman, 2008) การเปิดใช้งานของ Pol II ที่หยุดชะงักนั้นคิดว่าจะต้องรับผิดชอบในการหลบหนีจากผู้ก่อการและภูมิภาค TSS และการถอดความของยีน "primed" เหล่านี้ (Zeitlinger และคณะ, 2007; Saha et al., 2011; Bataille และคณะ, 2012).

ที่นี่เราแสดงให้เห็นว่าการได้รับโคเคนแบบเรื้อรังมาก่อนและตามด้วยระยะเวลาการถอนตัวที่ยาวนาน Fosb ยีนต่อการบริหารโคเคนต่อมาโดยมี NAc ถูกเตรียมไว้สำหรับการเหนี่ยวนำในขณะที่ CPu ไม่ใช่ จากนั้นเราจะระบุลายเซ็น Chromatin ที่แตกต่างกันที่ Fosb โปรโมเตอร์ยีนใน NAc และ CPu ที่เกี่ยวข้องกับการชักนำให้เกิดความผิดปกติของ Fosb ยีนรวมถึงการรับสมัครของ Pol II ที่จนตรอก Fosb ผู้ก่อการใกล้ชิดใน NAc เท่านั้นเช่นเดียวกับการเปลี่ยนแปลงในการเปิดใช้งานหรือแก้ไขฮิสโตนหลายการเปิดใช้งานในภูมิภาคสมองทั้งสอง ผลลัพธ์เหล่านี้ให้ข้อมูลเชิงลึกเกี่ยวกับการเปลี่ยนแปลงของโครมาตินที่ Fosb โปรโมเตอร์ของยีนและบ่งชี้เป็นครั้งแรกที่กลไกที่ถ่วงเวลาของ Pol II Fosb สำหรับการเปิดใช้งานที่มากขึ้นใน NAc เมื่อได้รับโคเคนอีกครั้ง

วัสดุและวิธีการ

สัตว์

หนู Sprague Dawley หนู (250 – 275 g; Charles River Laboratories) ที่ใช้ในการทดลองทั้งหมดถูกจับคู่ในห้องควบคุมสภาพภูมิอากาศบน 12 ชม. รอบแสง / มืด (ไฟที่ 7 AM) เข้าถึงอาหารและ น้ำ โฆษณาฟรี. สัตว์ทุกชนิดถูกฉีดสองครั้งต่อวันเป็นเวลาสิบวันด้วยโคเคน (15 mg / kg, ip) หรือ saline (ip) ในกรงที่บ้าน การทดลองในสัตว์ได้รับการอนุมัติจากคณะกรรมการการดูแลและใช้สัตว์ประจำสถาบัน (IACUC) ที่ภูเขาซีนาย

การวัดหัวรถจักร

สัตว์ถูกตัวเคยอยู่ในห้องควบคุมการเคลื่อนไหวในวันแรกเป็นเวลา 1 ชม. และจากนั้นตรวจสอบการเคลื่อนไหวของหัวรถจักรหลังจากฉีดน้ำเกลือโดยใช้ Photobeam Activity System (เครื่องมือซานดิเอโก) หลังจาก 1 hr ทำให้เกิดความเคยชินในห้องการเคลื่อนไหวในแต่ละวันโคเคน (15 mg / kg, ip) ได้รับการจัดการทุกวันเป็นเวลา 2 วันและสัตว์ได้รับการตรวจสอบอีกครั้งสำหรับกิจกรรมการเคลื่อนไหวของ 1 ชั่วโมง

immunohistochemistry

สัตว์ถูกทำให้สมบูรณ์ 24 ชม. หลังจากได้รับยาครั้งสุดท้าย immun ตรวจพบ immunoreactivity FosB / FosB ตามที่อธิบายไว้ (Perrotti et al., 2004) blotting ตะวันตกยืนยันว่า immunoreactivity ที่เหมือนΔFosB / FosB ทั้งหมดสังเกต 24 ชั่วโมงหรือนานกว่านั้นหลังจากการฉีดโคเคนสะท้อนให้เห็นΔFosBโดยที่ FosB ตรวจไม่พบ (ไม่แสดง)

การแยก RNA การถอดรหัสแบบย้อนกลับและ PCR

ทวิภาคี 12-gauge punches ของ NAc และ dorsolateral / dorsomedial CPu ได้รับตามที่อธิบายไว้ (Perrotti et al., 2004) แช่แข็งบนน้ำแข็งแห้งและประมวลผลตามโปรโตคอลที่เผยแพร่ (Covington และคณะ, 2011) ΔFosBและ FosB mRNA วัดโดยใช้ PCR เชิงปริมาณ (qPCR) พร้อมไอโซฟอร์มเฉพาะΔFosBและ FosB ไพรเมอร์ (Alibhai และคณะ, 2007) levels ระดับ FOSB และ FosB mRNA ถูกทำให้เป็นมาตรฐานในระดับ GAPDH mRNA ซึ่งไม่ได้รับผลกระทบจากการสัมผัสโคเคน (ไม่แสดง)

ซับแบบตะวันตก

มีการรวบรวมหมัด NAc และ CPu ตามข้างบนและประมวลผลสำหรับการซับแบบตะวันตกตามที่อธิบายไว้ (Covington และคณะ, 2011), ใช้แอนติบอดีต่อ ERK44 / 42 [การควบคุมสัญญาณนอกเซลล์ kinase-44 / 42], และ phosphoERK44 / 42 (PERK), AKT [thymoma viral proto-oncogene] [การตอบสนองขององค์ประกอบโปรตีนที่จับยึดแคมป์] และ pCREB ปริมาณโปรตีนที่ถูกกลืนไปยังเลนแต่ละเลนนั้นถูกทำให้เป็นระดับปกติของแอคตินหรือทูบูลินซึ่งไม่ได้รับผลกระทบจากการสัมผัสโคเคน

โครมาตินกระตุ้นการตกผลึก (ChIP)

หมัด NAc และ CPu ที่ผ่าสดใหม่ถูกเตรียมไว้สำหรับ ChIP ตามที่อธิบายไว้ (Maze et al., 2010) แต่ละเงื่อนไขการทดลองวิเคราะห์เป็นสามเท่าจากกลุ่มอิสระของสัตว์ สำหรับตัวอย่างชิปแต่ละชิ้นหมัด NAc และ CPu ทวิภาคีถูกรวมเข้าด้วยกันจากหนูห้าตัว (หมัด 10) แอนติบอดีที่ใช้สำหรับการดัดแปลงฮิสโตนที่เฉพาะเจาะจงจะเหมือนกับที่เผยแพร่ (Maze et al., 2010); แอนติบอดี้ต่อ Pol II phosphorylated ที่ Ser5 ของขอบเขตการทำซ้ำ carboxyl terminal (CTD) (Pol II-pSer5) ได้จาก abcam 5131 ไพรเมอร์ ChIP สี่ชุดถูกออกแบบมาสำหรับ Fosb (Lazo et al., 1992; Mandelzys และคณะ, 1997): 1F: GTACAGCGGAGGTCTGAAGG, 1R: GAGTGGGATGAGATGCATGCGAGT; 2F: CATCCCACTCGGCCATAG, 2R: CCACCGAAGACAGGGTACTGAG; 3F: GCTGCCTTTAGCCAATCAAC, 3R: CCAGGTCCAAAGAAAAAATCTCCTC; 4F: GGGTGTTTGTGTGTGAGTGG, 4R: AGAGGAGGCTGGACACAACC ระดับของการดัดแปลงโครมาตินจะถูกนำไปเปรียบเทียบกับ DNA อินพุทตามที่อธิบายไว้ (Maze et al., 2010).

การวิเคราะห์ทางสถิติ

ค่าทั้งหมดที่รายงานเป็นค่าเฉลี่ย± sem ข้อมูลสำหรับการทำงานของขมิ้นอ้อยและการนับเซลล์ได้รับการวิเคราะห์โดยความแปรปรวนสองทางโดยมีการรักษาและการฉีดยาเป็นปัจจัย การทดลอง qPCR ได้รับการวิเคราะห์ต่อจุดเวลาโดย ANOVA ทางเดียวโดยมีการรักษาเป็นปัจจัย เมื่อสังเกตเห็นผลกระทบหลักที่สำคัญ (p <0.05) การทดสอบหลังการทดลองของ Bonferroni ได้ดำเนินการเพื่อเปรียบเทียบกับสัตว์ที่ได้รับน้ำเกลือที่ไม่ได้รับยา (^ ในรูป) และสัตว์ที่ได้รับโคเคนที่ปราศจากยา การทดสอบ t-test แบบสองด้านของนักเรียนที่ไม่มีการจับคู่ถูกใช้สำหรับข้อมูล Western blotting และ ChIP โดยมีการแก้ไขสำหรับการเปรียบเทียบหลายรายการ

ผลสอบ

มหานคร Fosb inducibility ใน NAc แต่ไม่ใช่ CPu ของหนูโคเคนที่มีประสบการณ์

เพื่อตรวจสอบอิทธิพลของโคเคนเรื้อรังก่อนหน้านี้ตามด้วยระยะเวลานานในการถอนตัว Fosb ยีนในการตอบสนองต่อความท้าทายโคเคนที่ตามมาหนูที่เคยฉีด ip วันละสองครั้งด้วยน้ำเกลือหรือโคเคน (15 มก. / กก.) เป็นเวลา 10 วันได้รับปริมาณความท้าทายของยาหลังจาก 28 วันของการถอน (รูปที่ 1A) อันดับแรกเราวัดการตอบสนองของหัวรถจักรในสัตว์กลุ่มหนึ่งเพื่อยืนยันการเหนี่ยวนำของอาการแพ้หัวรถจักรโดยการสัมผัสโคเคนก่อนซึ่งเป็นผลสืบเนื่องที่ยั่งยืนของการใช้ยา โคเคนที่มีประสบการณ์และหนูน้อยแสดงให้เห็นว่ามีกิจกรรมการเคลื่อนไหวพื้นฐานเทียบเท่ากับความท้าทายของโคเคนในการใช้สัตว์ไร้เดียงสาในการเพิ่มการเคลื่อนไหว (รูปที่ 1B. มาตรการการวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบสองทางซ้ำ, การรักษา: F1,66 = 30.42, พี <0.0001; ความท้าทายโคเคน: F2,66= 58.39, พี <0.0001; การรักษา x ความท้าทายโคเคน: F2,66= 8.56, p = 0.0005, Bonferroni หลังการทดสอบ ^หน้า <0.001) ความท้าทายของโคเคนนี้ทำให้เกิดการทำงานของขมิ้นอ้อยมากขึ้นอย่างมีนัยสำคัญเช่นการแพ้ในหนูที่พบโคเคน (Bonferroni post-testing * p <0.001)

รูป 1  

ผลกระทบของการได้รับโคเคนเรื้อรังก่อนการเคลื่อนไหวของหัวรถจักรและ Fosb การเหนี่ยวนำใน NAc และ CPu เมื่อได้รับยาอีกครั้ง

ในการประเมินผลของการรักษาด้วยโคเคนก่อนการรักษาด้วยการแสดงออกของΔFosBใน NAc และ CPu เราทำการวัดΔFosBโปรตีนด้วยวิธีการทางอิมมูโนฮิสโตเคมี 24 ชั่วโมงหลังจากโคเคน-nïxและ X-NUMX, 0, 1, 3, 6, 15 การฉีด (XNUMX mg / kg; ดู รูปที่ 1A) ตามที่จัดตั้งขึ้นก่อนหน้านี้ (Nye et al., 1995) การฉีดโคเคน 3 นั้นเพียงพอที่จะกระตุ้นโปรตีนΔFosBใน NAc และ CPu ของสัตว์ที่ติดยาเสพติดและการสะสมของมันยังคงมีความสำคัญหลังจากการฉีดโคเคน 6 วัน (รูปที่ 1C. วัดซ้ำสองทาง ANOVA, NAc core, การรักษา: F1,28= 23.5, พี <0.0001; ความท้าทายโคเคน: F3,28= 49.16, พี <0.0001; การรักษา x ความท้าทายโคเคน: F3,28= 6.83, p = 0.0014; เปลือก NAc การรักษา: F1,28= 18.69, พี <0.0001; ความท้าทายโคเคน: F3,28= 31.52, พี <0.0001; การรักษา x ความท้าทายโคเคน: F3,28= 3.21, พี <0.05; CPu การรักษา: F1,28= 9.47, พี <0.001; ความท้าทายโคเคน: F3,28= 19.74, พี <0.0001; การรักษา x ความท้าทายโคเคน: F3,28= 0.94, p> 0.05 ใน NAc core, shell และ CPu, Bonferroni post-testing ^หน้า <0.05) ในสัตว์ที่มีประสบการณ์โคเคนไม่มีหลักฐานว่ายังคงมีการเหนี่ยวนำΔFosBใน NAc หรือ CPu หลังจากถอนตัวไป 28 วันซึ่งสอดคล้องกับรายงานก่อนหน้านี้ว่าสัญญาณΔFosBกระจายไปอย่างสมบูรณ์ตามจุดเวลานี้ (Nye et al., 1995) เหตุผลที่ใช้จุดนี้ในการศึกษาครั้งนี้ อย่างไรก็ตามหนูโคเคนที่ได้รับ 3 หรือ 6 ได้รับการฉีดโคเคนที่ท้าทายอย่างยอดเยี่ยมแสดงให้เห็นว่าการเหนี่ยวนำโปรตีน FosB ใน NAc มีความชัดเจนมากขึ้นทั้งในแกนกลางและเปลือกย่อย (รูปที่ 1C. Bonferroni หลังการทดสอบ * p <0.05) ในทางตรงกันข้ามไม่พบการเหนี่ยวนำของโปรตีนΔFosBมากขึ้นใน CPu แทนการเหนี่ยวนำΔFosBที่เทียบเท่ากันพบได้ในภูมิภาคนี้หลังจากฉีดโคเคน 3 หรือ 6 วันในหนูที่ไม่มีประสบการณ์และโคเคน (รูปที่ 1C).

เพื่อให้เข้าใจถึงการดัดแปลงการถอดเสียงที่เกิดขึ้นใน NAc และ CPu เพื่อตอบสนองต่อการท้าทายโคเคนเราได้ศึกษาหลักสูตรเวลา (45, 90, และ 180 min) ของการชักนำให้เกิดการถอดรหัส cocFosB และ FosB mRNA เพื่อโคเคน - naïveและ - มีประสบการณ์หนูหลังจากถอนตัว 28 วัน (ดู รูปที่ 1A) สัมพันธ์กับความท้าทายของน้ำเค็มความท้าทายของโคเคนทำให้ระดับ RFosB และ FosB mRNA เพิ่มขึ้นอย่างรวดเร็วในเวลา 3 จุดทั้งใน NAc และ CPu ของสัตว์โคเคน-naïve (รูปที่ 1D. วัดซ้ำทางเดียว ANOVA ต่อจุดเวลา; Bonferroni หลังการทดสอบ ^หน้า <0.05) ใน NAc เราสังเกตเห็นการเหนี่ยวนำΔFosBและ FosB mRNA มากขึ้นในสัตว์ที่มีประสบการณ์โคเคนเมื่อเทียบกับสัตว์ที่ไม่มีโคเคนหลังจากการท้าทายโคเคนผลมีนัยสำคัญที่ 90 นาทีในขณะที่ในทางตรงกันข้ามความไม่สามารถใช้งานของΔFosBและ FosB mRNA ใน CPu ได้อย่างมีนัยสำคัญ ลดลงในสัตว์ที่มีประสบการณ์โคเคน (รูปที่ 1D. Bonferroni หลังการทดสอบ %p = 0.08, * p <0.05)

การจำแนกลักษณะของเส้นทางส่งสัญญาณต้นน้ำใน NAc และ CPu ของหนูโคเคนที่มีประสบการณ์

คำอธิบายหนึ่งที่เป็นไปได้สำหรับการเปลี่ยนแปลงที่ไม่สามารถเปลี่ยนแปลงได้ของ Fosb ยีนใน NAc และ CPu หลังจากที่มีโคเคนเรื้อรังมาก่อนนั่นคือประวัติศาสตร์ที่ห่างไกลจากการสัมผัสโคเคนอาจทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงที่ยั่งยืนในเส้นทางการส่งสัญญาณที่อยู่เหนือ Fosb การชักนำให้เกิดการถ่ายทอดทางพันธุกรรมเช่นความท้าทายโคเคนทำให้ยีนนั้นมีระดับผิดปกติ เพื่อศึกษาสมมติฐานนี้เราได้วิเคราะห์ปัจจัยการถอดความสองอย่างคือ SRF และ CREB ซึ่งเพิ่งได้รับการพิสูจน์แล้วว่าจำเป็นสำหรับการเหนี่ยวนำโคเคนของΔFosBในบริเวณสมองเหล่านี้ (Vialou et al., 2012) พร้อมกับโปรตีนไคเนสต้นน้ำ, ERK และ AKT, มีส่วนเกี่ยวข้องในการกระทำโคเคน (Valjent และคณะ, 2000; Lu et al., 2006; Boudreau และคณะ, 2009) เราล้มเหลวในการตรวจจับการเปลี่ยนแปลงใด ๆ ในระดับทั้งหมดหรือระดับฟอสโฟรีเลตของโปรตีนต่างๆเหล่านี้ซึ่งสามารถอธิบายการเปลี่ยนแปลงที่ไม่แน่นอนของ Fosb สังเกตรวมถึงไม่มีการเปลี่ยนแปลงใน SRF, CREB หรือ AKT (รูปที่ 2B, C) การขาดการเปลี่ยนแปลงใน pSRF และ pCREB ใน NAc เพื่อตอบสนองต่อความท้าทายของโคเคนนั้นสอดคล้องกับรายงานล่าสุดซึ่งพบว่าทั้งสองเกิดจากโคเคนเรื้อรังเท่านั้น (Vialou et al., 2012).

รูป 2  

ผลของการได้รับโคเคนเรื้อรังก่อนต่อการลดหลั่นของโมเลกุลสัญญาณในระดับต้นใน NAc และ CPu

ใน NAc และ CPu ของสัตว์ที่มียาเสพติดนั้น 20 ขั้นต่ำหลังจากได้รับยาครั้งแรก (รูปที่ 2A) การท้าทายโคเคนเพียงครั้งเดียวลดระดับของ pERK42 / 44 (รูปที่ 2B, C. t-test ของนักเรียนสองหาง: * p <0.05) มีรายงานก่อนหน้านี้เกี่ยวกับระดับ pERK ที่เพิ่มขึ้นในภูมิภาคเหล่านี้หลังจากการให้โคเคนเฉียบพลัน (Valjent และคณะ, 2000) นี่เป็นเรื่องยากที่จะเปรียบเทียบกับเอกสารอื่นที่ตรวจสอบ ERK phosphorylation ใน NAc ระหว่างการถอนตัวจากการฉีดโคเคนซ้ำ ๆ (Boudreau และคณะ, 2007; Shen และคณะ, 2009) เช่นเดียวกับในการศึกษาของเรา pERK ถูกวัดปริมาณหลังจากถอนตัว 28 วันและหลังจากการท้าทายโคเคนหรือน้ำเกลือ สัมพันธ์กับยาเสพติดไร้เดียงสาของสัตว์ที่ประสบกับโคเคนเป็นครั้งแรกการสัมผัสโคเคนในหนูโคเคนที่มีประสบการณ์อีกครั้งหลังจากการถอนตัวของ 28 วันทำให้ระดับ PERK42 / 44 เพิ่มขึ้นอย่างมากใน CPu (รูปที่ 2B, C. การทดสอบ t ของนักเรียนสองหาง: * p <0.05)

ภูมิทัศน์ Chromatin ที่ โปรโมเตอร์ยีน Fosb ใน NAc และ CPu ของหนูโคเคนที่มีประสบการณ์

เราตรวจสอบครั้งต่อไปว่ามีการเปลี่ยนแปลงหรือไม่ Fosb การเหนี่ยวนำของยีนเกี่ยวข้องกับการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างโครมาติน ChIP ได้ดำเนินการใน NAc และ CPu โดยใช้แอนติบอดีโดยตรงกับการปรับเปลี่ยนฮีสโตนสามรูปแบบ: ไตรเมทิลเลชั่นของยีน Lys4 ของฮิสโตน H3 (3K4meUMNXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXbbbxbzX เราทำการวิเคราะห์โคเคน-naïveและ -experienced rats หลังจากการถอน 3 วันโดยไม่ต้องมีการฉีดโคเคนที่ท้าทายหรือไม่โดยให้สัตว์ทำการตรวจสอบ 3 ชั่วโมงต่อมา (รูปที่ 3A) ใน NAc เราไม่พบการเปลี่ยนแปลงที่สำคัญในการเชื่อมโยงการแก้ไขฮิสโตนสามรายการใด ๆ ต่อ Fosb ผู้ก่อการยีนในกรณีที่ไม่มีความท้าทายโคเคนแม้ว่าจะมีแนวโน้มลดลงในระดับของ H3K9me2 (รูปที่ 3B-D. t-test นักเรียนสองคน #p = 0.2 เปรียบเทียบกับการควบคุมNaïveยาที่เกี่ยวข้อง) ผลกระทบนี้มีความสำคัญหลังจากการท้าทายโคเคนและเป็นสิ่งเฉพาะสำหรับภูมิภาคก่อการก่อการใกล้เคียงของยีน (รูปที่ 3C. * p <0.05) ในขณะที่ระดับของ H3K9me2 นั้นต่ำมากในยีนบางตัว แต่ Fosb ยีนโปรโมเตอร์แสดงระดับที่มองเห็นได้ของเครื่องหมายนี้ใน NAc ภายใต้เงื่อนไขการควบคุม (Maze et al., 2010ข้อมูลจะไม่แสดง) ในทางตรงกันข้ามใน CPu เราพบว่าการเชื่อมโยง H3K4me3 ลดลงเล็กน้อย แต่มีนัยสำคัญและเพิ่มการผูกมัด H3K27me3 ที่เพิ่มขึ้น Fosb ผู้ก่อการในกรณีที่ไม่มีการท้าทายโคเคนผลที่หายไปหลังจากการท้าทาย (รูปที่ 3D. * p <0.05)

รูป 3  

ผลของการได้รับโคเคนเรื้อรังก่อนการทำ epigenetic ของ Fosb ยีนใน NAc และ CPu

ต่อไปเราตรวจสอบ Pol II ผูกพันกับ Fosb ยีนบนพื้นฐานของการค้นพบล่าสุดในการเพาะเลี้ยงเซลล์ที่ถ่วงของ Pol II ที่ TSS ซึ่งโดดเด่นด้วย phosphorylation ที่ Ser 5 ในพื้นที่ทำซ้ำ CTD มีความสัมพันธ์กับการสร้างยีน (ดูบทนำ) เราจึงวิเคราะห์ Pol II-pSer5 Fosb ที่สี่ภูมิภาคที่แตกต่างของยีน (รูปที่ 3B) การวิเคราะห์นี้แสดงให้เห็นถึงความสำคัญของ Pol II-pSer5 ที่ Fosb ยีนในภูมิภาคก่อการใกล้เคียงและรอบ ๆ TSS ใน NAc ของสัตว์ที่มีประสบการณ์โคเคนหลังจากการถอนตัวเป็นเวลานานในกรณีที่ไม่มีความท้าทายโคเคนเมื่อเทียบกับการควบคุม (รูปที่ 3E. * p <0.05) การเพิ่มคุณค่านี้ไม่ปรากฏที่บริเวณลำตัวยีนสองแห่งของ Fosbสอดคล้องกับการปิดกั้น Pol II ที่อธิบายไว้ในระบบการทดลองที่ง่ายขึ้น น่าสนใจหลังจากการท้าทายโคเคน Pol II-pSer5 ยังคงแสดงอาการของการเพิ่มระดับแม้ว่าจะไม่ได้มีนัยสำคัญอีกต่อไป Fosb ภูมิภาคผู้ก่อการใกล้เคียง (รูปที่ 3E. %p = 0.1) แต่กลับสู่ระดับการควบคุมที่ TSS การค้นพบใน CPu นั้นมีความหลากหลายมากขึ้นโดยที่ไม่มีรูปแบบที่ชัดเจนของการจับยึด Pol II-pSer5

การสนทนา

การศึกษาปัจจุบันให้ข้อมูลเชิงลึกใหม่ในกฎระเบียบที่ยั่งยืนของ Fosb สัปดาห์หลังจากหยุดโคเคนซ้ำแล้วซ้ำอีก เราแสดงให้เห็นว่าการบริหารโคเคนเรื้อรังก่อนทำให้ Fosb ยีนที่เหนี่ยวนำให้เกิดใน NAc มากขึ้นส่งผลให้การสะสมของΔFosBเร็วขึ้นเมื่อได้รับยาอีกครั้ง จากหลักฐานที่พิสูจน์ว่าการเหนี่ยวนำΔFosBใน NAc ไกล่เกลี่ยไวต่อพฤติกรรมตอบสนองต่อโคเคน (Nestler, 2008) การค้นพบของเราเผยให้เห็นกลไกใหม่สำหรับการตอบสนองต่อการตอบสนองที่ไวต่อการกระตุ้นหลังจากการถอนตัวเป็นเวลานาน

เราแสดงให้เห็นว่าการเหนี่ยวนำที่เพิ่มขึ้นของΔFosBใน NAc นั้นสัมพันธ์กับการเปลี่ยนแปลงของโครมาตินที่ Fosb ยีนที่คาดว่าจะสำคัญสำหรับการเหนี่ยวนำมากขึ้น ดังนั้นเราจึงแสดงให้เห็นการเพิ่มขึ้นของ Pol II ที่มีผลผูกพันกับผู้ก่อการใกล้เคียงและภูมิภาค TSS ของยีนที่มีอยู่หลังจาก 4 สัปดาห์ของการถอนตัวจากการบริหารโคเคนเรื้อรังก่อนหน้านี้ การเสริมสมรรถนะ Pol II ที่ TSS จะหายไปอย่างรวดเร็วเมื่อมีการท้าทายโคเคนและ Fosb การเหนี่ยวนำสอดคล้องกับรูปแบบในการเพาะเลี้ยงเซลล์ที่จนแต้ม Pol II ถูกปล่อยออกจาก TSSs เมื่อเปิดใช้งานยีน (ดูบทนำ) ความท้าทายโคเคนยังช่วยลดการผูกพัน H3K9me2 ซึ่งเป็นเครื่องหมายของการปราบปรามของยีนอย่างรวดเร็ว Fosb โปรโมเตอร์ ในทางตรงกันข้ามเราตรวจพบว่าไม่มีการเหนี่ยวนำที่ยั่งยืนของปัจจัยการถอดความหลายอย่างหรือจลนศาสตร์ต้นน้ำของพวกเขาซึ่งเป็นที่รู้กันว่าไกล่เกลี่ย Fosb การเหนี่ยวนำโดยโคเคน ผลลัพธ์เหล่านี้สนับสนุนสมมุติฐานของเราว่าการเหนี่ยวนำที่เพิ่มขึ้นของ osFosB ใน NAc นั้นถูกสื่อผ่านการเตรียม epigenetic ของ Fosb ยีนและไม่ผ่านการควบคุมเหตุการณ์ต้นน้ำ

ได้ผลลัพธ์ที่แตกต่างกันมากสำหรับ CPu ไม่มีหลักฐานใด ๆ สำหรับ Pol II ที่ถ่วงเวลา Fosb ในหนูที่มีประสบการณ์โคเคนก่อนที่จะมีความท้าทายโคเคนแม้ว่าจะมีการปรับเปลี่ยนฮิสโตนขนาดเล็ก แต่มีนัยสำคัญที่สอดคล้องกับการปราบปรามของยีน: เพิ่มขึ้น H3K27me3 ผูกพันและลดลงผูกพัน H3K4me3 นอกจากนี้ยังไม่มีการเปลี่ยนแปลงในปัจจัยการถอดรหัสต้นน้ำหรือไคเนสที่สอดคล้องกับการลดลง Fosb อุปนัย การค้นพบนี้ชี้ให้เห็นว่าหลังจากการบริหารโคเคนเรื้อรัง Fosb การเหนี่ยวนำของยีนใน CPu ตรงกันข้ามกับไพรเมอร์ที่เห็นใน NAc อย่างไรก็ตามในขณะที่ผลกระทบเหล่านี้จะลดการเหนี่ยวนำΔFosB mRNA เมื่อสัมผัสกับโคเคนอีกครั้งไม่มีการสูญเสียการสะสมของโปรตีน proteinFosB กลไกที่เป็นพื้นฐานของความขัดแย้งในตอนนี้จำเป็นต้องมีการสอบสวนเพิ่มเติม

โดยทั่วไปแล้วผลลัพธ์ของเราสนับสนุนแบบจำลองที่การเปลี่ยนแปลงภูมิทัศน์ของโครมาตินที่ยีนจำเพาะเพื่อตอบสนองต่อการบริหารโคเคนเรื้อรังทำหน้าที่นายกหรือทื่อยีนเหล่านั้นเพื่อการเหนี่ยวนำที่ตามมาเมื่อสัมผัสกับยาอีกครั้ง การเปลี่ยนแปลงของโครมาตินเช่นนี้ซึ่งสามารถมองได้ว่าเป็น "epigenetic scars" จะไม่ได้รับการวิเคราะห์ระดับยีน mRNA ในระดับคงที่ ด้วยวิธีนี้การระบุลักษณะของ epigenome ของการติดยาเสพติดสัญญาว่าจะเปิดเผยข้อมูลที่สดใหม่เกี่ยวกับการเกิดโรคระดับโมเลกุลของความผิดปกติซึ่งสามารถขุดเพื่อการพัฒนาวิธีการรักษาใหม่

กิตติกรรมประกาศ

งานนี้ได้รับการสนับสนุนโดยทุนจากสถาบันแห่งชาติว่าด้วยยาเสพติด

อ้างอิง

  • Alibhai IN, Green TA, Potashkin JA, Nestler EJ กฎระเบียบของการแสดงออก fosB และ DeltafosB mRNA: ในการศึกษาในหลอดทดลองและในร่างกาย สมอง Res 2007;1143: 22 33- [บทความฟรี PMC] [PubMed]
  • Bataille AR, Jeronimo C, Jacques PE, Laramee L, Fortin ME, ป่า A, Bergeron M, Hanes SD, โรเบิร์ตเอฟ Universal RNA Polymerase II CTD วัฏจักรถูกควบคุมโดยการประสานซับซ้อนระหว่างเอนไซม์ Kinase, Phosphatase และ Isomerase เอนไซม์ตามยีน Mol Cell 2012;45: 158 170- [PubMed]
  • Boudreau AC, Reimers JM, Milovanovic M, Wolf ME ตัวรับผิว AMPA ในนิวเคลียสหนูเพิ่มขึ้นในระหว่างการถอนโคเคน แต่ภายในหลังจากการท้าทายโคเคนร่วมกับการกระตุ้นการทำงานของไคเนสโปรตีนที่กระตุ้นการทำงานของไมโทเจน J Neurosci 2007;27: 10621 10635- [บทความฟรี PMC] [PubMed]
  • Boudreau AC, Ferrario CR, Glucksman MJ, Wolf ME การส่งสัญญาณการปรับตัวของทางเดินและไคเนสโปรตีนใหม่สารตั้งต้นที่เกี่ยวข้องกับการกระตุ้นอาการแพ้ต่อโคเคน J Neurochem 2009;110: 363 377- [บทความฟรี PMC] [PubMed]
  • Core LJ, Lis JT กฎการถอดความโดยการหยุดชั่วคราวของโปรโมเตอร์ใกล้เคียงกับ RNA polymerase II วิทยาศาสตร์ 2008;319: 1791 1792- [บทความฟรี PMC] [PubMed]
  • Covington HE, 3rd, Maze I, Sun H, Bomze HM, DeMaio KD, Wu EY, Dietz DM, Lobo MK, Ghose S, Mouzon E, Neve RL, Tamminga CA, Nestler EJ บทบาทในการลดฮิสโตนเมทิลเลชั่นในความอ่อนแอที่เกิดจากโคเคนต่อความเครียด เซลล์ประสาท 2011;71: 656 670- [บทความฟรี PMC] [PubMed]
  • ฟรีแมน WM, Nader MA, Nader SH, Robertson DJ, Gioia L, Mitchell SM, Daunais JB, Porrino LJ, Friedman DP, Vrana KE การเปลี่ยนแปลงโคเคนแบบเรื้อรังในนิวเคลียสที่ไม่ใช่มนุษย์เจ้าคณะ accumbens การแสดงออกของยีน J Neurochem 2001;77: 542 549- [PubMed]
  • Hyman SE, Malenka RC, Nestler EJ กลไกประสาทของการเสพติด: บทบาทของการเรียนรู้ที่เกี่ยวข้องกับการให้รางวัลและความทรงจำ Annu Rev Neurosci 2006;29: 565 598- [PubMed]
  • Kalivas PW, Volkow N, Seamans J. แรงจูงใจที่ไม่สามารถจัดการได้ในการเสพติด: พยาธิวิทยาในการส่งผ่านกลูตาเมตล่วงหน้า เซลล์ประสาท 2005;45: 647 650- [PubMed]
  • Lazo PS, Dorfman K, Noguchi T, Mattei MG, Bravo R. โครงสร้างและการแมปของยีน fosB FosB ลดการทำงานของโปรโมเตอร์ fosB กรดนิวคลีอิก 1992;20: 343 350- [บทความฟรี PMC] [PubMed]
  • Lu L, Koya E, Zhai H, Hope BT, Shaham Y. บทบาทของ ERK ในการเสพติดโคเคน Trends Neurosci 2006;29: 695 703- [PubMed]
  • Mandelzys A, Gruda MA, Bravo R, Morgan JI การขาดแอนติเจนที่เกี่ยวข้องกับ 37 kDa fos ที่เพิ่มขึ้นอย่างต่อเนื่องและกิจกรรมที่มีผลผูกพัน DNA เช่น AP-1 ในสมองของหนูที่ได้รับการรักษาด้วยกรด kainic fosB J Neurosci 1997;17: 5407 5415- [PubMed]
  • เขาวงกต I, Nestler EJ ภูมิทัศน์ของการติดยาเสพติด แอนวิทย์นิวยอร์ก Acad 2011;1216: 99 113- [บทความฟรี PMC] [PubMed]
  • เขาวงกตฉัน, Covington HE, 3rd, Dietz DM, LaPlant Q, Renthal W, Russo SJ, ช่าง M, Mouzon E, Neve RL, Haggarty SJ, Ren Y, Sampath SC, Hurd YL, Greengard P, Tarakhovsky A, Schaefer A, Nestler EJ บทบาทสำคัญของฮิสโตนเมทิลtransferase G9a ในพลาสติกที่เกิดจากโคเคน วิทยาศาสตร์ 2010;327: 213 216- [บทความฟรี PMC] [PubMed]
  • Nechaev S, Adelman K. Promoter-proximal Pol II: เมื่อถ่วงเวลาเร่งความเร็ว วัฏจักรของเซลล์ 2008;7: 1539 1544- [PubMed]
  • Nestler EJ ทบทวน กลไกการติดยาเสพติด: บทบาทของ DeltaFosB Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 2008;363: 3245 3255- [บทความฟรี PMC] [PubMed]
  • Nye HE, Hope BT, Kelz MB, Iadarola M, Nestler EJ การศึกษาทางเภสัชวิทยาของกฎระเบียบของการเหนี่ยวนำแอนติเจนที่เกี่ยวข้องกับ FOS เรื้อรังโดยโคเคนใน striatum และนิวเคลียส accumbens J Pharmacol Exp Ther. 1995;275: 1671 1680- [PubMed]
  • Perrotti LI, Hadeishi Y, Ulery PG, Barrot M, Monteggia L, Duman RS, Nestler EJ การเหนี่ยวนำของ deltaFosB ในโครงสร้างสมองที่เกี่ยวข้องกับการให้รางวัลหลังจากความเครียดเรื้อรัง J Neurosci 2004;24: 10594 10602- [PubMed]
  • Robinson TE, Kolb B. โครงสร้างพลาสติกที่เกี่ยวข้องกับการสัมผัสกับยาเสพติด Neuropharmacology 47 Suppl 2004;1: 33 46- [PubMed]
  • Robison AJ, Nestler EJ กลไกการติดยาเสพติดและการถอดรหัส Nat Rev Neurosci 2011;12: 623 637- [บทความฟรี PMC] [PubMed]
  • สห RN, Wissink EM, Bailey ER, Zhao M, Fargo DC, Hwang JY, Daigle KR, Fenn JD, Adelman K, Dudek SM การถอดรหัสที่รวดเร็วที่เกิดจากกิจกรรมของอาร์คและ IEG อื่น ๆ นั้นอาศัย RNA polymerase II ที่ทรงตัว Nat Neurosci 2011;14: 848 856- [บทความฟรี PMC] [PubMed]
  • Shaham Y, BT หวัง บทบาทของ neuroadaptations ในการกำเริบของการแสวงหายาเสพติด Nat Neurosci 2005;8: 1437 1439- [PubMed]
  • Shen HW, Toda S, Moussawi K, Bouknight A, Zahm DS, Kalivas PW เปลี่ยนแปลงความเป็นกระดูกสันหลังของกระดูกสันหลัง dendritic ในหนูโคเคนที่ถูกถอนออก J Neurosci 2009;29: 2876 2884- [บทความฟรี PMC] [PubMed]
  • Valjent E, Corvol JC, หน้า C, Besson MJ, Maldonado R, Caboche J. การมีส่วนร่วมของน้ำตกไคเนสที่ควบคุมสัญญาณนอกเซลล์สำหรับคุณสมบัติโคเคนที่ได้รับรางวัล J Neurosci 2000;20: 8701 8709- [PubMed]
  • Zeitlinger J, Stark A, Kellis M, Hong JW, Nechaev S, Adelman K, Levine M, Young RA RNA polymerase ถ่วงที่ยีนควบคุมพัฒนาการใน Drosophila melanogaster ตัวอ่อน Nat Genet 2007;39: 1512 1516- [บทความฟรี PMC] [PubMed]
  • Vialou VF, Feng J, Robison AJ, เฟอร์กูสัน D, Scobie KN, Mazei-Robison M, Mouzon E, Nestler EJ ปัจจัยการตอบสนองของเซรั่มและโปรตีนที่ตอบสนองต่อองค์ประกอบของแคมป์นั้นจำเป็นสำหรับการเหนี่ยวนำโคเคนของΔFosB J Neurosci 2012 ได้รับการยอมรับ [บทความฟรี PMC] [PubMed]