(HUMAN) พฤติกรรมและโครงสร้างการตอบสนองต่อโคเคนเรื้อรังต้องใช้วงวนที่เกี่ยวข้องกับการป้อน FeedFosB และแคลเซียม / Calmodulin-Dependent Protein Kinase II ในนิวเคลียส Accumbens Shell (2013)

J Neurosci 2013 Mar 6;33(10):4295-4307.

Robison AJ, Vialou V, Mazei-Robison M, เฟิงเจ, Kourrich S, Collins M, วี, Koob G, Turecki G, นีฟอาร์, โทมัสเอ็ม, Nestler EJ.

แหล่ง

Fishberg กรมประสาทและสถาบันสมองฟรีดแมน, โรงเรียนแพทย์ Mount Sinai, นิวยอร์ก, นิวยอร์ก, 10029, ภาควิชาประสาทวิทยาและจิตวิทยา, สถาบันพันธุศาสตร์มนุษย์, มหาวิทยาลัยมินนิโซตา, Minneapolis, Minnesota 55455, คณะกรรมการระบบประสาทผิดปกติ , สถาบันวิจัย Scripps, La Jolla, California 92037 โปรแกรมโรคซึมเศร้า, สถาบันสุขภาพจิตมหาวิทยาลัย Douglas และสถาบัน McGill University, มอนทรีออล, ควิเบก, แคนาดา, H4H 1R3 และภาควิชาสมองและภูมิปัญญาสถาบันเทคโนโลยีแห่งเคมบริดจ์, Massachusetts 02139 .

นามธรรม

ปัจจัยการถอดความΔFosBและการเสริมแคลเซียมในสมอง / เคลโดดูลินขึ้นอยู่กับโปรตีนไคเนสที่สอง (CaMKIIα) ถูกเหนี่ยวนำให้เกิดขึ้นในนิวเคลียส accumbens (NAc) จากการสัมผัสเรื้อรังกับโคเคนหรือยาเสพติดอื่น ๆ . แม้ว่าΔFosBและCaMKIIαทั้งคู่ควบคุมการแสดงออกของตัวรับและหน้าที่ของกลูตาเมต AMPA ใน NAc แต่การก่อตัวของกระดูกสันหลัง dendritic ในเซลล์ประสาทไขสันหลังกลางของ MSN (MSNs) และการกระตุ้นประสาทสัมผัสโคเคนกับโคเคนไม่มีการเชื่อมโยงโดยตรงระหว่างโมเลกุลเหล่านี้ ที่นี่เราแสดงให้เห็นว่าΔFosBนั้นมี phosphorylated โดยCaMKIIαที่ Ser27 ที่ทำให้โปรตีนเสถียรและ CaMKII นั้น จำเป็นสำหรับการสะสมโคเคนที่เป็นสื่อกลางของΔFosBในหนู NAc

ในทางกลับกันเราแสดงให้เห็นว่าΔFosBมีความจำเป็นและเพียงพอสำหรับการเหนี่ยวนำโคเคนของการแสดงออกของยีนCaMKIIαในวิฟซึ่งเป็นเอฟเฟกต์สำหรับ D1-type MSNs ใน NAc subregion เชลล์.

นอกจากนี้การเหนี่ยวนำของ dendritic กระดูกสันหลังบน NAc MSNs และการตอบสนองเชิงพฤติกรรมที่เพิ่มขึ้นต่อโคเคนหลังจาก NAc การแสดงออกของΔFosBเกินเหตุนั้นขึ้นอยู่กับ CaMKII

ที่สำคัญเราแสดงให้เห็นถึงการริเริ่มครั้งแรกของΔFosBและ CaMKII ใน NAc ของ ติดโคเคนของมนุษย์แนะนำเป้าหมายที่เป็นไปได้สำหรับการแทรกแซงการรักษาในอนาคต ข้อมูลเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าΔFosBและ CaMKII มีส่วนร่วมในห่วงโซ่การส่งต่อของเซลล์ในเชิงบวกประเภทเซลล์และสมองเป็นกลไกสำคัญในการควบคุมวงจรรางวัลของสมองในการตอบสนองต่อโคเคนเรื้อรัง

บริษัท

หลักฐานที่เพิ่มขึ้นสนับสนุนมุมมองที่การเปลี่ยนแปลงในการแสดงออกของยีนนำไปสู่กลไกของการติดยาเสพติด (Robison and Nestler, 2011) ผู้ไกล่เกลี่ยที่สำคัญคนหนึ่งของการเปลี่ยนแปลงเหล่านี้คือ ,FosB ซึ่งเป็นปัจจัยการถอดรหัสครอบครัว Fos (Nestler, 2008) การใช้ยาเสพติดอย่างไม่ถูกวิธีก่อให้เกิดการสะสมยาวนานของΔFosBในนิวเคลียส accumbens (NAc) ซึ่งเป็นเขตลิมบิกที่จำเป็นสำหรับพฤติกรรมการให้รางวัล Such การเหนี่ยวนำปรากฏขึ้นเฉพาะกับคลาสของเซลล์ประสาทสปินเอ็นไซโคลกลาง (MSN) ที่แสดงออกถึงตัวรับโดปามีน D1 การแสดงออกอย่างชัดเจนของΔFosBใน NAN MSN ประเภท D1 เหล่านี้ช่วยเพิ่ม locomotor และให้รางวัลการตอบสนองต่อโคเคนและมอร์ฟีน (Kelz และคณะ, 1999; Zachariou และคณะ, 2006) รวมถึงการเพิ่มการจัดการโคเคนด้วยตนเอง (Colby และคณะ 2003). นอกจากนี้การปิดล้อมทางพันธุกรรมหรือไวรัสของกิจกรรม Transcriptional transFosB ลดผลกระทบที่คุ้มค่าของยาเหล่านี้Zachariou และคณะ, 2006) แสดงว่าการเหนี่ยวนำอย่างยั่งยืนของΔFosBเป็นสื่อกลางที่สำคัญของการเปลี่ยนแปลงที่ยั่งยืนที่เกิดขึ้นใน NAc โดยการบริหารยาเรื้อรัง.

ความเสถียรที่ผิดปกติของΔFosB (เทียบกับโปรตีนในตระกูล Fos อื่น ๆ ทั้งหมด) เป็นทั้งคุณสมบัติที่แท้จริงของโมเลกุลเนื่องจากการตัดทอนของโดเมน degron ที่มีอยู่ใน FosB แบบเต็มความยาว (Carle et al., 2007) และกระบวนการที่ได้รับการควบคุม ΔFosBมีฟอสฟอรัส ในหลอดทดลอง และ ในร่างกาย ที่ Ser27 และปฏิกิริยานี้ทำให้เสถียรΔFosB, ~ 10-fold, ในการเพาะเลี้ยงเซลล์และ NAc ในร่างกาย (Ulery-Reynolds และคณะ, 2009) ถึงแม้ว่า Ser27-ΔFosBแสดงให้เห็นว่าเป็นสารตั้งต้นสำหรับ casein kinase-2 ในหลอดทดลอง (Ulery et al., 2006) กลไกของ ในร่างกาย phosphorylation ยังไม่ทราบ

แคลเซียม / เคลโดดูลินขึ้นอยู่กับโปรตีนไคเนสที่ 2 (CaMKII) เป็นไคเนสซีรีน / ทรีโอนีนที่แสดงออกอย่างสูงซึ่งมีαและβ isoforms เป็น dodecameric homo- และ hetero-holoenzymes ในร่างกายและมีความจำเป็นสำหรับรูปแบบต่าง ๆ ของ neuroplasticity (Lisman และคณะ, 2002; Colbran และ Brown, 2004) CaMKIIαถูกชักนำให้เลือกในเปลือก NAc โดยแอมเฟตามีนเรื้อรัง (Loweth และคณะ 2010) และการปิดล้อมทางเภสัชวิทยาของกิจกรรม CaMKII ในเปลือก NAc ช่วยลดอาการแพ้ทางพฤติกรรมต่อแอมเฟตามีน (Loweth และคณะ 2008) และโคเคน (Pierce et al., 1998) ในขณะที่CaMKIIαมีการแสดงออกของไวรัสในอนุภูมิภาค NAc นี้จะช่วยเพิ่มความไวต่อการเคลื่อนไหวของแอมเฟตามีนและการควบคุมตนเองของยาบ้าLoweth และคณะ 2010) CaMKIIαอาจส่งผลกระทบต่อพฤติกรรมการให้รางวัลผ่านการปรับหน่วยย่อยของตัวรับ AMPA กลูตาเมต (Pierce et al., 1998) เนื่องจากกิจกรรมCaMKIIαนั้นเชื่อมโยงกับฟังก์ชั่นตัวรับ AMPA และการกำหนดเป้าหมาย synaptic ในรูปแบบต่าง ๆ ของ neuroplasticity (Malinow และ Malenka, 2002).

วรรณกรรมนี้แสดงให้เห็นถึงความคล้ายคลึงกันหลายอย่างระหว่างΔFosBและ CaMKII: ทั้งสองเป็นสิ่งที่จำเป็นและเพียงพอสำหรับผลกระทบพฤติกรรมหลายอย่างของยาที่ใช้ในทางที่ผิดทั้งสองเงี่ยง dendritic เงี่ยงในเซลล์ประสาทชนิดต่าง ๆ ในร่างกาย (Jourdain et al., 2003; Maze et al., 2010) และทั้งสองออกแรงอย่างน้อยบางส่วนของผลกระทบพฤติกรรมของพวกเขาผ่านการปรับตัวรับ AMPA (Kelz และคณะ, 1999; Malinow และ Malenka, 2002; Vialou et al., 2010) แม้จะมีความคล้ายคลึงกันเหล่านี้ก็ยังไม่มีการเชื่อมโยงการทำงานระหว่างΔFosBและ CaMKII เป็นที่รู้จักกัน ที่นี่เราสร้างกฎระเบียบซึ่งกันและกันระหว่างΔFosBและ CaMKII และแสดงให้เห็นว่าโปรตีนทั้งสองรูปแบบ D1-type MSN-specific feed-forward loop ใน NAc shell ที่เกิดจากโคเคนและควบคุมการตอบสนองของโคเคน ในร่างกาย.

ไปที่:

วัสดุและวิธีการ

การทดลอง 1: การวิเคราะห์โปรตีน iTRAQ ของ NAc Shell และ Core หลังการรักษาโคเคน (รูปที่ 1A)

ผู้ใหญ่ (8 สัปดาห์) หนูเพศผู้ได้รับโคเคน 20 mg / kg หรือ IP ยานพาหนะเกลือวันละครั้งเป็นเวลาเจ็ดวัน 24 ชม. หลังจากการฉีดครั้งสุดท้ายเปลือก NAc และแกนถูกผ่ารูปที่ 1A) และแฟลชแช่แข็ง ทำการวิเคราะห์ iTRAQ ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (Ross และคณะ, 2004; Davalos และคณะ, 2010).

รูป 1

รูป 1

การชักนำให้ CaMKII เฉพาะเชลล์ใน NAc โดยโคเคน

การทดลอง 2: การเปลี่ยนปริมาณโปรตีนใน Rat NAc Core และ Shell หลังการรักษาโคเคน (รูปที่ 1B – D)

ผู้ใหญ่ (8 สัปดาห์) หนูเพศผู้ได้รับโคเคน 10 mg / kg หรือยานพาหนะน้ำเกลือ IP วันละครั้งเป็นเวลาเจ็ดวันในห้องบันทึกการเคลื่อนไหว Locomotor ตอบสนองต่อการฉีดโคเคน (5 mg / kg IP) หนึ่งครั้งในสัตว์ที่ได้รับการรักษาด้วยโคเคนก่อนหน้านี้ (เรียกว่า "เรื้อรัง") และส่วนหนึ่งของผู้ที่ได้รับการบำบัดด้วยน้ำเกลือ (เรียกว่า "เฉียบพลัน") และ locomotor ตอบสนองต่อน้ำเกลือ เพียงอย่างเดียวถูกบันทึกไว้ในสัตว์ที่รักษาด้วยน้ำเกลือเรื้อรังที่เหลืออยู่ (เรียกว่า "น้ำเกลือ") การทดสอบกิจกรรมของหัวรถจักรได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ (Hiroi et al., 1997) สั้น ๆ หนูตัวผู้ตัวโตถูกวางไว้ใน 18” × 24” PAS กล่องบันทึกข้อมูลแบบเปิด (เครื่องมือซานดิเอโก) สำหรับ 30 นาทีถึงทำให้เกิดความเคยชินได้รับการฉีด IP ของน้ำเกลือเดียวและตรวจสอบอีก 30 นาทีและได้รับ การฉีด IP เดียวของโคเคน 5 mg / kg และตรวจสอบ 30 ขั้นต่ำ

24 ชม. หลังจากการฉีดครั้งสุดท้ายหนูถูกประหารชีวิตโดยไม่ต้องดมยาสลบเพื่อหลีกเลี่ยงผลกระทบของยาชาที่มีต่อระดับโปรตีนในเซลล์ประสาทและฟอสโฟ สมองถูกหั่นอย่างต่อเนื่องในเมทริกซ์ 1.2 mm (Braintree Scientific) และเนื้อเยื่อเป้าหมายจะถูกลบออกในน้ำเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟตที่มีโปรตีเอส (Roche) และ phosphatase (Sigma Aldrich) โดยใช้เครื่องวัดหมัด 14 สำหรับแกน NAc และ 12 เกจ เนื้อเยื่อสำหรับเปลือก NAc (ดู รูปที่ 1A) และแช่แข็งทันทีบนน้ำแข็งแห้ง ตัวอย่างถูกทำให้เป็นเนื้อเดียวกันโดย sonication แสงในบัฟเฟอร์ RIPA ที่แก้ไข: 10 mM Tris ฐาน, 150 mM โซเดียมคลอไรด์, 1 mM EDTA, 0.1 mM EDTA, 1% โซเดียม dodecyl ซัลเฟต, 100% Triton X-1% โซเดียม deoxycholate ดังกล่าวข้างต้น หลังจากเพิ่มบัฟเฟอร์ Laemmli แล้วโปรตีนจะถูกแยกออกในเจลไล่สี 7.4 – 4% polyacrylamaide (ระบบมาตรฐาน BioRad) และการซับแบบตะวันตกโดยใช้ระบบ Odyssey (Li-Cor) ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต

การทดลอง 3: การเปลี่ยนปริมาณโปรตีนในหนู NAc Core และ Shell หลังจากถอนโคเคน (รูปที่ 1E)

ผู้ใหญ่ (8 สัปดาห์) หนูเพศผู้ได้รับโคเคน 10 mg / kg หรือ IP ยานพาหนะเกลือวันละครั้งเป็นเวลาเจ็ดวัน 14 วันหลังจากการฉีดครั้งสุดท้ายสัตว์ที่รักษาด้วยน้ำเกลือจะได้รับการฉีดน้ำเกลืออีกครั้ง (เรียกว่า "น้ำเกลือ) และสัตว์ที่รักษาด้วยโคเคนจะได้รับการฉีดน้ำเกลืออีกครั้ง (เรียกว่าการถอน 14 วันหรือ" 14d WD ") หรือการฉีดโคเคนครั้งเดียว เรียกว่า“ 14d WD Chal” สำหรับความท้าทาย) หนึ่งชั่วโมงหลังจากการฉีดครั้งสุดท้ายสัตว์ได้รับการตัดหัวและทำการซับแบบตะวันตก 2 ทดลอง.

การทดลอง 4: การเปลี่ยนปริมาณโปรตีนในหนู NAc Core และ Shell หลังจากการบริหารตนเองของโคเคน (รูปที่ 2A – C)

หนูได้รับการฝึกฝนให้จัดการโคเคน 0.5 mg / kg / infusion ด้วยตนเองในช่วงเวลาหนึ่งชั่วโมงภายใต้ตาราง 1 อัตราส่วนคงที่เป็นเวลาเก้าวัน หลังจากเก้ารอบพื้นฐานหนูถูกแบ่งออกเป็นสองกลุ่มที่สมดุลโดยปริมาณโคเคนในสองช่วงสุดท้าย หนูกลุ่มหนึ่งได้รับอนุญาตให้จัดการโคเคนด้วยตนเอง (0.5 mg / kg / infusion) ในช่วงเวลาหนึ่งชั่วโมง (การเข้าถึงสั้น SHA) ในขณะที่อีกกลุ่มหนูโคเคนที่จัดการด้วยตนเองในช่วงหกชั่วโมง (การเข้าถึงระยะยาว LgA ) เป็นเวลาสิบวันเพิ่มเติม (เซสชันการเพิ่ม)

ส่วนสมองถูกประมวลผลสำหรับอิมมูโนวิทยาตามที่อธิบายไว้ (Perrotti et al., 2004) สมองถูกทำให้สมบูรณ์แบบ 18 – 24 ชม. หลังจากการสัมผัสกับยาครั้งสุดท้ายส่งผลให้การสลายตัวของโปรตีน FosB ที่มีความยาวเต็มรูปแบบใด ๆ ที่ตกค้างเช่นปฏิกิริยาภูมิคุ้มกันที่เหลือทั้งหมดจะสะท้อนΔFosB การสลายตัวนี้ได้รับการยืนยันจาก Western blotting ซึ่งไม่พบการย้อมสีอย่างมีนัยสำคัญด้วยแอนติบอดีที่ตรงข้ามกับ C ปลายทางของ FosB ที่มีความยาวเต็มรูปแบบซึ่งไม่รู้จักΔFosB (ไม่แสดงข้อมูล) หลังจากหั่นเป็นส่วน 35 µm จำนวนของเซลล์ภูมิคุ้มกันΔFosBนั้นถูกวัดปริมาณโดยผู้สังเกตตาบอดในสองส่วนผ่าน NAc ของหนูแต่ละตัวและค่าเฉลี่ยต่อเขต 40 ×ถูกคำนวณโดยภูมิภาคสำหรับสัตว์แต่ละตัว สัตว์แต่ละตัวได้รับการพิจารณาเป็นรายบุคคลสำหรับการวิเคราะห์ทางสถิติ มีการระบุภูมิภาคที่น่าสนใจโดยใช้ Paxinos และ Watson (Paxinos และ Watson, 2007).

ปริมาณของCaMKIIα immunoreactivity ดำเนินการโดยใช้ระบบใบอนุญาตตามที่อธิบายไว้ (Covington และคณะ, 2009) ความหนาแน่นของ CaMKII และ GAPDH ถูกรวมเข้าด้วยซอฟต์แวร์ Odyssey ผลลัพธ์จะแสดงเป็นค่าความเข้มรวมต่อมม2 และถูกนำเสนอเป็นหมายถึง± sem (n = 4 – 10 ต่อกลุ่ม) ใช้ค่า GAPDH เพื่ออ้างอิงความเข้ม CaMKII ปกติสำหรับความหนาและเงื่อนไข

รูป 2

รูป 2

การชักนำให้เกิด CaMKII ในเปลือก NAc ของหนูที่ควบคุมตนเองและผู้เสพโคเคน

การทดลอง 5: การหาปริมาณโปรตีนในปริมาณโคเคนที่ขึ้นกับมนุษย์ (รูปที่ 2D)

การรักษาอื่นๆ

เนื้อเยื่อสมองของมนุษย์ภายหลังการตายได้มาจากสมองควิเบกฆ่าตัวตาย (สถาบันสุขภาพจิตมหาวิทยาลัย Douglas, Montreal, Quebec, Canada) การเก็บรักษาเนื้อเยื่อดำเนินการเป็นหลักตามที่อธิบายไว้ (Quirion และคณะ, 1987) สมองจะถูกวางลงบนน้ำแข็งเปียกในกล่องโฟมและรีบไปยังธนาคารสมองควิเบกฆ่าตัวตาย ซีกจะถูกแยกออกทันทีโดยการผ่าทัยตรงกลางของสมองก้านสมองและซีเบลลัม หลอดเลือด, ต่อมไพเนียล, choroid plexus, ครึ่ง cerebellum, และก้านสมองครึ่งหนึ่งถูกผ่าโดยปกติจากซีกซ้ายด้านซ้ายซึ่งจะถูกตัด coronally เป็นชิ้นหนา 1 ซม. ก่อนแช่แข็ง ซีรีเบลลัมครึ่งหลังถูกตัดแบบ sagittally เป็นชิ้นหนา 1cm ก่อนแช่แข็ง เนื้อเยื่อถูกแช่แข็งแฟลชใน 2-methylbutane ที่ −40 ° C เป็นเวลา ~ 60 วินาที เนื้อเยื่อแช่แข็งทั้งหมดจะถูกเก็บแยกในถุงพลาสติกที่ −80 ° C สำหรับการจัดเก็บระยะยาว บริเวณสมองที่เฉพาะเจาะจงถูกผ่าออกจากชิ้นเนื้อแช่แข็งที่แช่แข็งบนแผ่นสแตนเลสที่มีน้ำแข็งแห้งอยู่ทั่วเพื่อควบคุมอุณหภูมิของสภาพแวดล้อม การซับแบบตะวันตกดำเนินการตามที่อธิบายไว้ใน 2 ทดลอง.

หมู่คน

กลุ่มนี้ประกอบด้วยอาสาสมัครชาย 37 และหญิง 3 ซึ่งมีอายุอยู่ระหว่าง 15 – 66 ปี อาสาสมัครทุกคนเสียชีวิตอย่างกะทันหันโดยไม่มีรัฐเป็นเวลานานหรือเจ็บป่วยทางการแพทย์ยืดเยื้อ. ในแต่ละกรณีสาเหตุของการเสียชีวิตถูกตรวจสอบโดยสำนักงานชันสูตรศพของควิเบกและมีการตรวจสารพิษด้วยตัวอย่างเนื้อเยื่อเพื่อรับข้อมูลเกี่ยวกับยาและการใช้สารผิดกฎหมายในช่วงเวลาที่เสียชีวิต กลุ่มวิชาประกอบด้วยบุคคล 20 ที่ตรงตามเกณฑ์ SCID-I สำหรับการพึ่งพาโคเคน กลุ่มควบคุมประกอบด้วยกลุ่ม 20 ที่ไม่มีประวัติการพึ่งพายาเสพติดโคเคนและไม่มีการวินิจฉัยทางจิตเวชที่สำคัญ ทุกวิชาเสียชีวิตอย่างกะทันหันจากสาเหตุที่ไม่มีผลกระทบโดยตรงต่อเนื้อเยื่อสมอง กลุ่มถูกจับคู่สำหรับอายุของกลุ่มเป้าหมายค่าหน่วงเวลาการแช่แข็งและค่า pH สำหรับทุกวิชามีการชันสูตรทางจิตวิทยาตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (Dumais และคณะ, 2005) ทำให้เราสามารถเข้าถึงข้อมูลรายละเอียดเกี่ยวกับประวัติทางจิตเวชและการแพทย์รวมถึงข้อมูลทางคลินิกและข้อมูลทางสังคมอื่น ๆ ที่เกี่ยวข้อง โดยสังเขปผู้สัมภาษณ์ที่ผ่านการฝึกอบรมได้ทำการ สัมภาษณ์ทางคลินิกที่มีโครงสร้างสำหรับ DSM-IV ความผิดปกติทางจิตเวช (SCID-I) กับผู้ให้ข้อมูลหนึ่งรายหรือมากกว่าของผู้เสียชีวิต คณะแพทย์ตรวจสอบการประเมิน SCID-I รายงานผู้ป่วยบันทึกชันสูตรศพและบันทึกทางการแพทย์เพื่อรับการวินิจฉัยทางจิตเวชฉันทามติ

การทดลอง 6: การเสริมภูมิคุ้มกันของ Chromatin สำหรับหนู NAc (รูปที่ 3A – C)

ผู้ใหญ่ (8 สัปดาห์) หนูเพศผู้ได้รับโคเคน 10 mg / kg หรือ IP ยานพาหนะเกลือวันละครั้งเป็นเวลาเจ็ดวัน 24 ชม. หลังจากการฉีดครั้งสุดท้ายเปลือก NAc และแกนถูกผ่า Chromatin immunoprecipitation (ChIP) ทำการรวมหมัด NAc ทวิภาคีของเปลือกหรือแกนจากเจ็ดหนูต่อกลุ่มในกลุ่มรวม 14 (รวมสัตว์สัตว์ 98, สระโคเคน 7, สระน้ำเกลือ 7) เนื้อเยื่อถูกเชื่อมโยงข้ามล้างและเก็บไว้ที่ −80 ° C จนกระทั่งโครมาตินตัดโดย sonication โครมาตินแบบ Sheared ถูกบ่มในชั่วข้ามคืนด้วยแอนติบอดีที่ผูกไว้กับลูกปัดแม่เหล็กก่อนหน้านี้ (Dynabeads M-280, Invitrogen) IgG ที่ไม่มีภูมิคุ้มกันถูกใช้เป็นตัวควบคุม หลังจากการเชื่อมโยงข้ามย้อนกลับและการทำให้บริสุทธิ์ DNA นั้นใช้ qPCR เพื่อวัดระดับดีเอ็นเอCaMKIIαก่อการ ไพรเมอร์ได้รับการออกแบบมาเพื่อขยายภูมิภาคที่มีลำดับฉันทามติ AP-1 อยู่ ~ 450 bp ก่อนไซต์เริ่มการถอดรหัส (ส่งต่อ: ACTGACTCAGGAAGAGGGGATA; ย้อนกลับ: TGTGCTCCTCAGAATCCACAA)

รูป 3

รูป 3

ชนิดของเซลล์และพื้นที่เฉพาะΔFosBการเหนี่ยวนำของCaMKIIα ในร่างกาย

การทดลอง 7: การวัดการแสดงออกของยีน CaMKII และการแสดงออกของโปรตีนด้วยการระบุเฉพาะเซลล์ชนิดΔFosBรูปที่ 3D)

หนู bitransgenic ตัวผู้มาจาก NSE-TTA (บรรทัด A) × TetOp-ΔfosB (บรรทัด 11) และ NSE-TTA (บรรทัด B) × TetOp-FLAG-ΔfosB (บรรทัด 11) เมาส์ (เฉินและคณะ, 1998; Kelz และคณะ, 1999; Werme et al., 2002; Zachariou และคณะ, 2006) ตั้งครรภ์และเลี้ยงบน doxycycline ของ 100 µg / ml เพื่อยับยั้งการแสดงออกของΔFosBในระหว่างการพัฒนา Littermates แบ่งออกเป็นหย่านม: ครึ่งหนึ่งยังคงอยู่ใน doxycycline และครึ่งหนึ่งถูกเปลี่ยนเป็นน้ำและสัตว์ถูกใช้ 8 เป็น 11 สัปดาห์ต่อมาเมื่อผลการถอดรหัสของ transFosB เป็นค่าสูงสุด (Kelz และคณะ, 1999; McClung และ Nestler, 2003) สำหรับการวิเคราะห์การถอดเสียงหนูถูกประหารชีวิตอย่างรวดเร็วและสมองถูกกำจัดและวางบนน้ำแข็ง การผ่าของ NAc นั้นใช้เข็มเจาะแบบ 14 และแช่แข็งอย่างรวดเร็วบนน้ำแข็งแห้งจนกระทั่งถูกดึง RNA การแยก RNA, qPCR และการวิเคราะห์ข้อมูลได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (LaPlant และคณะ 2009) คร่าว ๆ RNA นั้นถูกแยกด้วย TriZol reagent (Invitrogen) ซึ่งจะทำให้บริสุทธิ์ด้วย RNAeasy micro kit จาก Qiagen และตรวจสอบคุณภาพด้วย Bioanalyzer ของ Agilent การถอดรหัสแบบย้อนกลับดำเนินการโดยใช้ iScript (BioRad) qPCR ถูกดำเนินการด้วย Applied Biosystems ระบบ 7900HT RT PCR พร้อมพารามิเตอร์รอบต่อไปนี้: 10 min ที่ 95 ° C; รอบ 40 ของ 95 ° C สำหรับ 1 ขั้นต่ำ, 60 ° C สำหรับ 30 วินาที, 72 ° C สำหรับ 30 วินาที; การให้ความร้อนอย่างช้าๆกับ 95 ° C เพื่อสร้างเส้นโค้งการแยกส่วนเพื่อยืนยันผลิตภัณฑ์ PCR เดี่ยว การวิเคราะห์อิมมูโนฮิสโตเคมีของการแสดงออกของโปรตีนΔFosBและCaMKIIαนั้นได้อธิบายไว้ใน 4 ทดลอง.

การทดลอง 8: ผลของ Intra-NAc D1 และ D2 Dopamine Receptor Antagonists ที่มีต่อการเปลี่ยนแปลงโปรตีนที่ทำจากโคเคน (รูปที่ 3H)

ผู้ใหญ่ (8 สัปดาห์) หนูเพศผู้ได้รับโคเคน 10 mg / kg หรือยานพาหนะเกลือ (กลุ่มยานพาหนะ) IP วันละครั้งเป็นเวลาเจ็ดวัน 30 ขั้นต่ำก่อนการฉีดโคเคนหนูได้รับยา IP ทั้งกลุ่มที่ได้รับ D1 antagonist SCH 23390 (0.5 mg / kg, กลุ่ม "D1 Ant") หรือ D2 receptor antagonist eticlopride (0.5 mg / kg หรือการฉีดควบคุมน้ำเกลือ (กลุ่ม“ โคเคน”) 2 ชม. หลังจากการฉีดครั้งสุดท้ายสัตว์ถูกประหารชีวิตและปริมาณโปรตีนโดยการซับแบบตะวันตกตาม 2 ทดลอง.

การทดลอง 9: ผลของ AAV-Mediated expressFosB การแสดงออกมากเกินไปต่อการแสดงออกของโปรตีน (รูปที่ 4 A – C)

ทำการผ่าตัด Stereotaxic กับหนูตัวผู้ผู้ใหญ่ (สัปดาห์ 8) เพื่อฉีด AAV-GFP (โปรตีนเรืองแสงสีเขียว) หรือ AAV-GFP-ΔFosB (Maze et al., 2010) เข็มมาตรวัด 33 (แฮมิลตัน) ถูกนำมาใช้ในการผ่าตัดทั้งหมดในระหว่างที่ 0.5 µl ของไวรัส high-titer ที่บริสุทธิ์บริสุทธิ์ถูกฉีดเข้าทางผิวหนังในระยะเวลา 5 นาทีตามด้วยการพักฟื้นหลังการฉีด 5 ขั้นต่ำ ระยะทั้งหมดจะถูกวัดเทียบกับ Bregma: มุม 10 °, AP = + 1.7 mm, Lat = 2.5 mm, DV = −6.7 mm 14 วันหลังการผ่าตัดสัตว์ได้รับการฉีด IP โคเคน 10 mg / kg หนึ่งครั้งในห้องเฝ้าระวังการเคลื่อนไหวของหัวรถจักรเพื่อประเมินผลพฤติกรรมของการแสดงออกของΔFosB 24 ชม. หลังจากการฉีดครั้งสุดท้ายหนูถูกประหารชีวิตตาม 2 ทดลองและเนื้อเยื่อ microdissection ได้ดำเนินการภายใต้คำแนะนำด้วยกล้องจุลทรรศน์เรืองแสงเพื่อให้ได้ NAP เนื้อเยื่อบวก GFP การซับแบบตะวันตกนั้นได้ดำเนินการตาม ทดลอง 2

รูป 4

รูป 4

ΔFosBมีทั้งที่จำเป็นและเพียงพอสำหรับการชักนำด้วยCaMKIIαที่ขึ้นกับตัวรับโคเคนในโคเคน NAc เชลล์

การทดลอง 10: ผลของ AAV-Mediated express มิถุนายนการแสดงออกที่มากเกินไปต่อการแสดงออกโปรตีนโคเคน - ขึ้นอยู่กับ (รูปที่ 4 D – F)

การฉีด stereotaxic ของ AAV-GFP หรือ AAV-GFP-Δมิถุนายนได้ดำเนินการตาม ทดลอง 8 14 วันหลังการผ่าตัดสัตว์ได้รับยาโคเคน 10 mg / kg หรือ IP ยานพาหนะน้ำเกลือวันละครั้งเป็นเวลาเจ็ดวันในห้องบันทึกการเคลื่อนไหว Locomotor ตอบสนองต่อการฉีดโคเคน (5 mg / kg IP) เพียงครั้งเดียวหรือบันทึกน้ำเกลือ 24 ชม. หลังจากการฉีดครั้งสุดท้ายหนูถูก decapitated เก็บเกี่ยวเนื้อเยื่อและ blots ตะวันตกดำเนินการใน ทดลอง 9

ทดลอง 11: ในหลอดทดลอง การวิเคราะห์โปรตีน Kinase (รูปที่ 5A – D)

Recombinant CaMKIIαและΔFosBถูกทำให้บริสุทธิ์จากเซลล์แมลง (Brickey และคณะ, 1990; Jorissen et al., 2007) และทำการตรวจโปรตีนคิเนส (Colbran, 1993) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้า สั้น ๆ CaMKII ถูก preincubated บนน้ำแข็งด้วย 2.5 µM ​​(หรือความเข้มข้นที่ระบุ) ของΔFosB, 1 mM Ca2+, 40 mM Mg2+, 15 µM ​​ยาลดความอยากอาหารและ 200 mM HEPES pH 7.5 Phosphorylation ถูกริเริ่มโดยการเพิ่ม 200 µM ​​ATP โดยมีหรือไม่มี [γ-32P] ATP และอนุญาตให้ดำเนินการ 10 ขั้นต่ำที่อุณหภูมิห้อง (รูป 5A & B) หรือ 2 ขั้นต่ำบนน้ำแข็ง (รูปที่ 5C & D) ผลิตภัณฑ์ได้รับการแก้ไขโดย Western blotting (รูป 5A & B) หรือด้วยการนับอัตโนมัติและการนับประกาย (รูปที่ B – D)

รูป 5

รูป 5

ΔFosBเป็นสารตั้งต้นที่มีศักยภาพสำหรับCaMKIIα

การทดลอง 12: การระบุ Ser27 Δฟอสโฟฟอสเฟต (รูปที่ 5E)

ในหลอดทดลอง kinase assays ได้ดำเนินการตาม 11 ทดลองโปรตีนถูกแยกออกจาก SDS-PAGE และวงดนตรีที่สอดคล้องกับΔFosBถูกตัดออกและถูกตรวจจับด้วยวิธีสเปคตรัมมวล การกำหนด m / z ของชิ้นส่วนไอออนที่สอดคล้องกันในแผงควบคุมทั้งหมดจะมีป้ายกำกับอยู่ด้านบนสุดของยอดไอออน อิออนบางส่วนเท่านั้นที่ติดฉลากเนื่องจากข้อ จำกัด ด้านพื้นที่ โดยทั่วไปข้อความสำหรับฉลากไอออนของชิ้นส่วนนั้นจะมีสีดำยกเว้นเมื่อมีการยืนยันหรือเพิ่มหลักฐานโดยตรงต่อการปรากฏตัวของแหล่งฟอสฟอรัสที่เป็นที่สนใจซึ่งในกรณีนั้นจะมีการทำเครื่องหมายสีแดง หลักฐานสำหรับผลิตภัณฑ์การกระจายตัวของกระดูกสันหลังจะถูกนำเสนอในการอ่านลำดับของฟอสโฟเปปไทด์พร้อมกับไซต์ที่ตรวจพบของฟอสโฟรีเลชั่นตกค้างที่ระบุด้วยสีแดงด้วยการกำหนดตัวอักษรกรดอะมิโนเดี่ยว คำอธิบายเชิงตัวเลขของชิ้นส่วนไอออนที่สังเกตได้จะถูกทำเครื่องหมายในลำดับเปปไทด์เป็น b และ y ไอออน ปัจจัยการซูมสำหรับส่วนของแกน m / z เพื่อแสดงไอออนแฟรกเมนต์ความเข้มต่ำกว่าจะถูกทำเครื่องหมายที่ด้านบนของสเปกตรัมมวลชิ้นส่วนแต่ละชิ้น อิออนแฟรกเมนต์ที่แสดงในแผง H ยืนยันการมีอยู่ของไอโซโทป Ser27 phosphorylated อย่างไรก็ตามภายในส่วนผสมของไอโซโทป phosphorylated อื่น ๆ ที่ไซต์ Ser28, Ser31, Ser34 และ Thr37 การมีอยู่ของ pa5, pa5-P, pb5, และ pb5-P ไอออนยืนยันการตกค้างของฟอสโฟรีเลชันของ Ser27 ที่ไม่ซ้ำกันโดยเฉพาะ

การทดลอง 13: การวัดปริมาณฟอสโฟรีเลชันของ Ser27 (รูปที่ 5F)

เปปไทด์มาตรฐานได้รับการออกแบบเลียนแบบ Ser27 ΔFosBในรูปของฟอสโฟและไม่ใช่ฟอสโฟ หลังจากการสังเคราะห์และการทำให้บริสุทธิ์เปปไทด์ที่“ หนัก” แต่ละตัวจะถูกละลายในบัฟเฟอร์ 50 / 50 acetonitrile / น้ำและส่งไปยังการวิเคราะห์กรดอะมิโนเพื่อกำหนดความเข้มข้นสัมบูรณ์ในสารละลายสต็อกเปปไทด์สังเคราะห์ เปปไทด์“ หนัก” แต่ละตัวจะถูกฉีดเข้าสู่ 4000 QTRAP mass spectrometer (MS) โดยตรงเพื่อกำหนดพลังงานการชนที่ดีที่สุดสำหรับการกระจายตัวของ MS / MS และการเปลี่ยน MRM สองถึงสี่ ถัดไปเปปไทด์“ หนัก” ที่เรียบร้อยได้รับการขึ้นอยู่กับ LCMS บน 4000 QTRAP เพื่อให้แน่ใจว่ามีการแยกเปปไทด์ เครื่องมือนี้ทำงานในโหมดสามส่วนสี่เท่าโดยมีการตั้งค่า Q1 บนค่า precursor เฉพาะ m / z (Q1 ไม่สแกน) และ Q3 ตั้งค่าเป็นค่า m / z เฉพาะที่สอดคล้องกับเศษเฉพาะของเปปไทด์นั้น ในโหมด MRM ชุดของปฏิกิริยาเดี่ยว (precursor / fragment ion transitions ที่ปรับพลังงานการชนเพื่อปรับความเข้มของไอออนของชิ้นส่วนที่น่าสนใจ) ถูกวัดตามลำดับและวงจร (โดยทั่วไปคือ 1 – 2 sec) ตลอดเวลาของการแยก HPLC การเปลี่ยน MRM ถูกกำหนดจาก MS / MS spectra ของเปปไทด์ที่มีอยู่ จากนั้นจะเลือกการเปลี่ยนสองครั้งต่อเปปไทด์ซึ่งสอดคล้องกับชิ้นส่วนความเข้มสูงและพลังงานการชนจะปรับให้เหมาะสมเพื่อเพิ่มความแรงของสัญญาณของการเปลี่ยน MRM โดยใช้ซอฟต์แวร์อัตโนมัติ Peaks ที่เกิดจากเปปไทด์มาตรฐานและตัวอย่างΔFosBที่สัมผัสกับ CaMKII หรือการควบคุมถูกนำมาเปรียบเทียบเพื่อกำหนดความสมบูรณ์แบบของเปปไทด์แต่ละรูปแบบในปฏิกิริยา การวิเคราะห์ข้อมูลเกี่ยวกับข้อมูล LC-MRM ดำเนินการโดยใช้ซอฟต์แวร์ AB Multiquant 1.1

การทดลอง 14: การเหนี่ยวนำของΔFosBใน CaMKII หนูที่แสดงออกมากเกินไป (รูป 5G & H.)

หนูดัดแปลงพันธุกรรม overexpressing T286D CaMKII (Mayford และคณะ, 1996; Kourrich et al., 2012) และผู้เลี้ยงสัตว์ป่าประเภทนี้ถูกเลี้ยงขึ้นมาโดยไม่มี doxycycline เพื่อให้สามารถแสดงออกทางยีน หนูผู้ใหญ่ได้รับโคเคน 20 mg / kg หรือ saline IP วันละครั้งเป็นเวลา 14 วัน 24 ชม. หลังจากการฉีดครั้งสุดท้ายสัตว์ถูกประหารชีวิตและอิมมูโนวิทยาและปริมาณของนิพจน์ ofFosB ดำเนินการใน 4 ทดลอง.

การทดลอง 15: ผลของการใช้ HSV-Mediated expressFosB Overexpression และการยับยั้ง CaMKII ที่มีต่อกระดูกสันหลัง Dendritic ของ NAc (รูปที่ 6A – E)

หนูตัวผู้ตัวเต็มวัย (สัปดาห์ 8) ถูกฉีดใน NAc ด้วย HSV-GFP, HSV-GFP-ΔFosB (Olausson และคณะ, 2006) HSV-GFPAC3I หรือ HSV-GFPAC3I-ΔFosB ในโครงสร้างเหล่านี้ AC3I ซึ่งเป็นตัวยับยั้งการทำงานของเปปไทด์ของกิจกรรม CaMKII จะถูกหลอมรวมเข้ากับ C-terminus ของ GFP GFPAC3I ถูกโคลนโดย PCR โดยใช้ pMM400- เวกเตอร์ที่มี GFPAC3I เป็นแม่แบบที่มีไพรเมอร์ดังต่อไปนี้: GFP-AC3I-F: 5 'CC GCTAGC GCCGCCACCGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGAGGGGGGGGGAGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGAGGGGGGGGGGGGGGGGGGGAGGGGGGGGGGAGGGGGGAGGGGGGGAGGGGGAGGGGGAGGGGAGGGGGGGGGGGGGAGGGGGGGGGGAGGGGGGGGGGAGGGTAG GFP-AC3I-R: 3 'CC TCCGGA TTACAGGCAGTCCACGGCCT 5' (แคลมป์ BspEIstop) ผลิตภัณฑ์ PCR ที่เป็นผลลัพธ์ถูกแทรกลงในเวกเตอร์ p3 + และ p1005 +-vectors FosB โดยใช้ไซต์ NheI และ BspEI สิ่งก่อสร้างถูกตรวจสอบความถูกต้องโดยการหาลำดับ พิกัด stereotaxic คือ: มุม 1005 °, AP = + 10 mm, Lat = + 1.6 mm, DV = −1.5 mm (Barrot et al., 4.4) การแบ่งส่วนของเลือดและสมอง 4 ทดลอง.

ทำการวิเคราะห์กระดูกสันหลังตามที่อธิบายไว้ (Christoffel และคณะ, 2011) สั้น ๆ dendritic เซ็กเมนต์ 50 – 150 µm อยู่ห่างจาก Soma ถูกสุ่มเลือกจากเซลล์ที่ติดเชื้อ HSV ซึ่งแสดง GFP ภาพได้มาจาก confocal LSM 710 (Carl Zeiss) สำหรับการวิเคราะห์ทางสัณฐานวิทยาโดยใช้ NeuronStudio พร้อมอัลกอริทึมเรย์เบิร์สต์ NeuronStudio จัดประเภทกระดูกสันหลังเป็นบาง, เห็ด, หรือตอไม้ตามค่าต่อไปนี้: (1) อัตราส่วน, (2) อัตราส่วนหัวต่อคอและ (3) เส้นผ่าศูนย์กลางหัว เงี่ยงที่มีคอสามารถจัดได้ว่าเป็นแบบบางหรือแบบเห็ดและประเภทที่ไม่มีคอที่สำคัญก็จัดว่าเป็นตอ เงี่ยงที่มีลำคอมีป้ายกำกับว่าบางหรือเห็ดขึ้นอยู่กับเส้นผ่าศูนย์กลางหัว

รูป 6

รูป 6

การปิดล้อมของกิจกรรม CaMKII ช่วยป้องกันผลกระทบทางสัณฐานวิทยาและพฤติกรรมของΔFosBใน NAc

การทดลอง 16: ผลของการใช้ HSV-Mediated Overexpression และการยับยั้ง CaMKII ต่อการตอบสนองโคเคน (รูปที่ 6F)

หนูตัวผู้ที่เป็นผู้ใหญ่ถูกฉีดด้วยไวรัสตาม 15 ทดลองและ locomotor ตอบสนองต่อการฉีดโคเคน 5 mg / kg เดียวตาม ทดลอง 9 ข้อมูลหัวรถจักรจะแสดงเมื่อลำแสงทั้งหมดแตกเกิน 30 นาทีหลังจากฉีดโคเคน

ข้อมูลเพิ่มเติม

ที่อยู่อาศัยของสัตว์

หนู Sprague Dawley (250 – 275 g; Charles River Laboratories) เป็นคู่ หนูตัวผู้ C57BL / 6J อายุแปดสัปดาห์ (The Jackson Laboratory) ได้รับการเลี้ยงดูด้วยสัตว์จำนวนสูงสุดห้าตัวต่อกรง สัตว์ทุกตัวเคยอยู่ในสถานที่เลี้ยงสัตว์เป็นเวลา≥1สัปดาห์ก่อนทำการทดลองและตั้งอยู่ในห้องควบคุมสภาพภูมิอากาศ (23 – 25 ° C) บน 12 ชม. รอบแสง / ความมืด (ไฟที่ 7: 00 AM) พร้อมการเข้าถึงอาหาร และน้ำ โฆษณาฟรี. การทดลองได้ดำเนินการตามแนวทางของสมาคมประสาทวิทยาศาสตร์และคณะกรรมการการดูแลและการใช้สัตว์ในสถาบัน (IACUC) ที่ Mount Sinai

ยาเสพติด

ยาถูกควบคุม IP และละลายในน้ำเกลือที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้วรวมถึงโคเคน (5 – 20 mg / kg ต่อ 10 µl สำหรับหนู, ต่อ 1 ml สำหรับหนู, NIDA) และ SCH 23390 หรือ eticlopride ไฮโดรคลอไรด์ (0.5 mg / kg ต่อ 1 mg T กิโลกรัม) . สำหรับการผ่าตัด stereotaxic หนูได้รับยาสลบด้วย "ค็อกเทล" ของคีตามีน (100 mg / kg) และไซลาซีน (10 mg / kg) (เฮนรี Schein) ในน้ำเกลือปลอดเชื้อ

แอนติบอดี

CaMKIIα (ทั้งหมด): ตอนเหนือของรัฐ 05 – 532, 1: 5,000

CaMKII phospho-Thr286: Promega V111A, 1: 1,000

ΔFosB (ทั้งหมด): การส่งสัญญาณเซลล์ 5G4, 1: 250

ΔFosB phospho-Ser27: ฟอสฟอรัส, 1: 500

GluA1 (ทั้งหมด): Abcam, Ab31232, 1: 1,000

GluA1 phospho-Ser831: มิลลิพอร์ N453, 1: 1,000

GluA1 phospho-Ser845: Chemicon Ab5849, 1: 2,000

GluA2: มิลลิพอร์ 07 – 598, 1: 2,000

NR2A: Sigma HPA004692, 1: 2,500

NR2B: Millipore Ab1557P, 1: 1,000

การวิเคราะห์ทางสถิติ

การวิเคราะห์ทางสถิติทั้งหมดดำเนินการโดยใช้แพ็คเกจซอฟต์แวร์ Prism 6 (GraphPad) ใช้การทดสอบ t ของนักเรียนสำหรับการเปรียบเทียบแบบจับคู่ทั้งหมด (ระบุในผลลัพธ์ที่ให้ค่า t) และใช้การวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบทางเดียวสำหรับการเปรียบเทียบหลายรายการทั้งหมด (ระบุในส่วนผลลัพธ์ที่ให้ค่า F)

ไปที่:

ผลสอบ

โคเคนเรื้อรังชักนำ CaMKII ใน NAc Shell

มีงานวิจัยหลายชิ้นระบุว่า MSN ในเปลือก NAc และแกนกลางมีการตอบสนองทางชีวเคมีและสรีรวิทยาที่แตกต่างกันต่อการได้รับสารเสพติดอย่างเรื้อรัง (Kourrich และ Thomas, 2009; Loweth และคณะ 2010) และอนุภูมิภาคทั้งสองควบคุมพฤติกรรมการแสวงหายาเสพติดต่างกัน (Ito et al., 2004) เพื่อตรวจสอบผลกระทบที่แตกต่างของโคเคนในองค์ประกอบโปรตีนของเปลือก NAc เมื่อเทียบกับ แกนหลักเราใช้ Multiplexed Isobaric Tagging (iTRAQ) และตีคู่สเปกโตรสโคปี (MS / MS) หนูเพศผู้ตัวเต็มวัยถูกฉีด IP ด้วยโคเคน (20 mg / kg) หรือน้ำเกลือทุกวันเป็นเวลา 7 วัน; 24 ชม. หลังจากการฉีดครั้งสุดท้ายเปลือก NAc และแกนถูกผ่ารูปที่ 1A) และแฟลชแช่แข็ง จากนั้นโปรตีนในตัวอย่างเหล่านี้จะถูกวัดปริมาณโดยใช้ iTRAQ isoforms CaMKII ทั้งสี่แสดงการแสดงออกที่เพิ่มขึ้นอย่างมากหลังจากการรักษาโคเคนที่เฉพาะกับเปลือก NAc เมื่อเทียบกับแกน phosphatases โปรตีนหลายชนิดรวมถึงตัวเร่งปฏิกิริยา PP1 และหน่วยย่อยด้านกฎระเบียบและ PP2A ซึ่งก่อนหน้านี้เกี่ยวข้องกับสารตั้งต้น CaMKII ต่างๆในระบบอื่น (Colbran, 2004) ตามรูปแบบที่คล้ายกัน การค้นพบเหล่านี้ให้หลักฐานที่แปลกใหม่และเป็นกลางว่าเส้นทางการส่งสัญญาณ CaMKII นั้นถูกควบคุมอย่างชัดเจนโดยโคเคนใน NAc ในลักษณะเฉพาะของเปลือกหอย

ในการตรวจสอบการค้นพบปริมาณมากกว่านี้เราได้ทำการรักษาหนูด้วยโคเคน (ตามขนาดที่ต่างกัน) หรือน้ำเกลือและ locomotor ที่ตอบสนองต่อโคเคน (5 mg / kg) หรือปริมาณความท้าทายของเกลือ การสัมผัสโคเคน 10 mg / kg ซ้ำ ๆ ส่งผลให้เกิดอาการแพ้แบบ locomotor (รูปที่ 1B) การศึกษาเพิ่มเติมเกี่ยวกับการใช้ยานี้เปิดเผยโดยการใช้ Western blotting ที่โคเคนซ้ำกระตุ้นCaMKIIαคัดเลือกใน NAc เชลล์ 24 ชม. หลังจากการฉีดโคเคนครั้งสุดท้าย (รูปที่ 1C และ D; p = 0.0019; F = 7.943; DF = 29) นอกจากนี้ฟอสโฟรีเลชั่นของสารตั้งต้น CaMKII Ser831 ที่เป็นที่ยอมรับของหน่วยย่อย GluA1 ของออปชั่น AMPA นั้นมีการเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในเชลล์ NAc และไม่ใช่แกนหลัก (p = 0.0261; d = 4.208) ในขณะที่CaMKIIα Thr28 แนวโน้มที่สำคัญต่อการเหนี่ยวนำในเปลือกเท่านั้น (รูปที่ 1D) ตัวรับกลูตาเมตอื่น ๆ อีกหลายตัวไม่ได้รับผลกระทบ ตรงกันข้ามกับมาตรการเหล่านี้ของ CaMKII ตัวอย่างเนื้อเยื่อเดียวกันแสดงการเหนี่ยวนำของΔFosBในทั้งสองเชลล์ (p = 0.0260; F = 4.189; df = 29) และแกน (p = 0.0350; f = 3.807; df = 29) ของ NAc (รูปที่ 1C และ D) สอดคล้องกับสิ่งที่ค้นพบก่อนหน้านี้ (Perrotti et al., 2008).

เนื่องจากการศึกษาก่อนหน้านี้เกี่ยวกับการควบคุมโคเคนของตัวรับ AMPA วิเคราะห์สัตว์หลังจาก ~ 14 วันของการถอนตัวจากโคเคนเรื้อรัง (ดูการสนทนา) เราจึงทำการวิเคราะห์ทางชีวเคมีเหล่านี้ซ้ำในเวลานี้ เราพบว่า 14 วันหลังจากการฉีดโคเคนครั้งสุดท้ายΔFosBยังคงเพิ่มขึ้นใน NAc (p = 0.0288; F = 4.258; df = 22) ในขณะที่ CaMKII และ phosphorylation ของ GluA1 Ser831 ยังคงเพิ่มขึ้น (รูปที่ 1E) อย่างไรก็ตาม 1 ชม. หลังจาก 10 mg / kg หนึ่งครั้งท้าทายปริมาณโคเคน, ระดับ CaMKII รวม (p = 0.0330; F = 3.947; df = 26) และ GluA1 Ser831 (p = 0.0213; F = 4.509; d = 27; d = XNUMX; ระดับฟอสโฟรีเลชั่นจะเพิ่มขึ้นในระดับเดียวกับที่พบหลังจากการสัมผัสโคเคนเรื้อรังในระยะเริ่มต้นรูปที่ 1E) ข้อมูลเหล่านี้บ่งชี้ว่าเซลล์ประสาทเชลล์ NAc นั้นได้รับการเตรียมไว้สำหรับการเหนี่ยวนำ CaMKII ในช่วงที่งดเว้นการยืดระยะเวลาหรืออาจจะผ่านการลงยาโดยตรงของโปรโมเตอร์ยีน CaMKII (ดูการสนทนา) ยิ่งกว่านั้นข้อเท็จจริงที่ว่าการเหนี่ยวนำ BFosB นั้นยาวนานกว่าการเหนี่ยวนำ CaMKII แสดงให้เห็นถึงการมีอยู่ของกลไกเพิ่มเติมไม่ว่าจะเป็นโครมาตินหรือไม่ก็ตามที่ใช้ "เบรก" ในกฎของ CaMKII ดังที่กล่าวไว้ในการอภิปราย

เพื่อเสริมความแข็งแกร่งให้กับข้อสังเกตเหล่านี้เราได้สำรวจรูปแบบของการจัดการด้วยตนเองของโคเคนซึ่งเกี่ยวข้องกับการใช้ยาตามความต้องการ หนูตัวผู้ที่โตเต็มวัยจะได้รับโคเคนสั้นหรือยาว อย่างที่คาดไว้ (Ahmed และ Koob, 1998) มีเพียงเงื่อนไขการเข้าถึงที่ยาวนานซึ่งนำไปสู่การเพิ่มการบริหารตนเองของยาเสพติด (รูปที่ 2A) ΔFosBถูกเหนี่ยวนำให้มีขนาดใหญ่ขึ้นโดยยาว เมื่อเทียบกับ การเข้าถึงโคเคนสั้น ๆ ในทั้งสอง NAc shell (p = 0.0011; F = 11.12; df = 17) และ core (p = 0.0004; F = 13.86; df = 17) ในทางตรงกันข้ามCaMKIIαถูกเหนี่ยวนำในเปลือก NAc โดยการเข้าถึงโคเคนเป็นเวลานานเท่านั้นรูปที่ 2B และ C; p = 0.0236; F = 4.957; DF = 16) เป็นที่น่าสนใจที่จะเปรียบเทียบปริมาณโคเคนเฉลี่ยต่อวันสำหรับสัตว์ที่มีการเข้าถึงสั้น (~ 12 mg / kg IV), สัตว์ที่มีการเข้าถึงยาว (~ 70 mg / kg IV) และสัตว์ที่ได้รับการดูแล (10 mg / kg) และ ถามว่าเหตุใดระบบ elicits อันหลังของการเหนี่ยวนำที่แข็งแกร่งของΔFosBและ CaMKII ในขณะที่การเข้าถึงระยะสั้นไม่ ความคลาดเคลื่อนนี้น่าจะเกิดจากความแตกต่างของระดับโคเคนสูงสุด (โคเคนทดลองให้เป็นยาลูกกลอนเดี่ยว IP ในขณะที่โคเคนที่ได้รับการจัดการด้วยตนเองจะถูกส่งผ่านยา IV หลายครั้ง) หรือโดยความแตกต่างของระยะเวลาในการสัมผัสกับยา การจัดการ, 7 วันสำหรับการจัดการตนเอง)

แม้จะมีวรรณกรรมขนาดใหญ่เกี่ยวกับΔFosBและ CaMKII ในการกระทำโคเคน แต่ก็ยังไม่มีการศึกษาโปรตีนเหล่านี้ในผู้ใช้โคเคนของมนุษย์ ที่นี่เรานำเสนอหลักฐานแรกว่าระดับของΔFosB (p = 0.0316; t = 1.921; df = 34) และ CaMKII (p = 0.0444; t = 1.755; df = 32) จะเพิ่มขึ้นใน NAc ของมนุษย์ที่พึ่งพาโคเคนรูปที่ 2D, 1 ตาราง) ข้อมูลเหล่านี้บ่งชี้ว่าการตรวจสอบการชักนำΔFosBและ CaMKII ของเราโดยโคเคนในหนูหนู NAc นั้นเกี่ยวข้องกับการติดยาเสพติดโคเคนของมนุษย์ทางคลินิก

1 ตาราง

1 ตาราง

การศึกษาลักษณะของตัวอย่างจากผู้ติดโคเคนของมนุษย์และกลุ่มควบคุม

ΔFosBควบคุมการถอดความ CaMKII คัดเลือกใน D1-Type MSNs ของ NAc Shell

การค้นพบว่าทั้ง CaMKII และΔFosBถูกควบคุมโดยโคเคนในหนูหนู NAc ทำให้เราตัดสินว่า determineFosB อาจควบคุมการถอดรหัสยีน CaMKII หรือไม่ ก่อนหน้านี้เราได้รายงานCaMKIIαว่าเป็นเป้าหมายที่เป็นไปได้สำหรับΔFosBในการวิเคราะห์ microarray แบบไม่ลำเอียงของ NAc (McClung และ Nestler, 2003) แต่การค้นพบนี้ไม่ได้รับการตรวจสอบเพิ่มเติมในการศึกษาครั้งนั้น เราใช้ ChIP เชิงปริมาณเป็นครั้งแรก (qChIP — ChIP ตามด้วย PCR เชิงปริมาณ) เพื่อตรวจสอบว่าΔFosBเชื่อมโยงกับโปรโมเตอร์ยีนCaMKIIαใน NAc ของหนูตัวผู้ที่เป็นผู้ใหญ่แล้วและพบอย่างเด่นชัดว่าความผูกพันนี้เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ p = 0.0133; t = 2.901; df = 12) แต่ไม่ใช่แกนกลาง, subregion (รูปที่ 3A) เพื่อทำความเข้าใจเพิ่มเติมเกี่ยวกับกลไกที่เกี่ยวข้องกับความแตกต่างเฉพาะของอนุภูมิภาคในΔFosBที่เชื่อมโยงกับโปรโมเตอร์CaMKIIαเราใช้ qChIP เพื่อจำแนกลักษณะของการดัดแปลงฮิสโตนในภูมิภาคจีโนมนี้ การศึกษาก่อนหน้าแสดงให้เห็นถึงการเหนี่ยวนำโคเคนของ H3 acetylation ที่CaMKIIαก่อการในหนูทั้งหมด NAc (วังและคณะ, 2010) ในทางตรงกันข้ามเราพบว่าโคเคนลด acetylation H3 ที่ผู้ก่อการCaMKIIαคัดเลือกในแกน NAc (รูปที่ 3B; p = 0.0213; t = 2.726; df = 10) โดยไม่มีการเปลี่ยนแปลงที่ชัดเจนในเชลล์สอดคล้องกับการดัดแปลงโครมาตินเฉพาะภูมิภาคย่อยเกิน beyondFosB qChIP สำหรับเครื่องหมายการปราบปราม, dimethylated H3 ไลซีน 9 (H3K9me2), เปิดเผยแนวโน้มสำหรับการลดลงทั้งใน subregions ของเชลล์และ core (รูปที่ 3C).

เพื่อตรวจสอบว่าΔFosBควบคุมการถอดความCaMKIIα ในร่างกายเราใช้เมาส์สองบรรทัดที่เป็นบิตเอ็กซ์เรนจีเนียที่สามารถอธิบายได้อย่างชัดเจนว่าΔFosBโดยเฉพาะใน D1 เมื่อเทียบกับ MSN ในประเภท D2 ในลักษณะที่ควบคุมโดยการบริหาร doxycycline ในน้ำดื่ม (เฉินและคณะ, 1998; Kelz และคณะ, 1999; Werme et al., 2002) หนูเพศผู้ที่โตมากเกินไป expressFosB แต่เพียงผู้เดียวใน D1-type MSNs มีระดับCaMKIIα mRNA เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญใน NAc (p = 0.0337; t = 1.996; df = 13) ซึ่งไม่เห็นในหนูที่แสดงออกมากเกินไป significantlyFosBรูปที่ 3D) การเพิ่มขึ้นของCaMKIIα mRNA เกิดจากการแสดงออกของΔFosBใน MSN ชนิด D1 พร้อมกับการเพิ่มขึ้นของโปรตีนCaMKIIαในเปลือกทั้งสอง NAc (p = 0.0030; d = 3.578; d = 14) และแกน (p = 0.0392; = 2.275; df = 14; มะเดื่อ 3E และ F) ข้อมูลเหล่านี้แสดงให้เห็นว่าΔFosBมีความสามารถในการผลักดันการแสดงออกของยีนCaMKIIαใน MSN ประเภท D1 ในทั้งสองภูมิภาค รูปที่ 3B แสดงให้เห็นว่าการเปลี่ยนโครมาตินแบบโคเคนที่มีโคเคนในโปรโมเตอร์CaMKIIα (เช่น acetylation ที่ลดลง) ป้องกันΔFosBจากการควบคุม CaMKII ในอนุภูมิภาคหลักหลังจากโคเคน

เนื่องจากข้อมูลเมาส์แปลงพันธุกรรมของเราระบุว่าการเหนี่ยวนำΔFosBของการแสดงออกของยีน CaMKII มีความเฉพาะเจาะจงกับ MSN ชนิด D1 ใน NAc ต่อไปเราจึงพยายามพิจารณาว่าการควบคุม CaMKII ขึ้นอยู่กับโคเคนนั้นจำเป็นต้องมีการกระตุ้นตัวรับ D1 dopamine หรือไม่ หนูตัวผู้ที่โตเต็มวัยจะได้รับโคเคนเรื้อรังหรือน้ำเกลือเหมือนเดิม แต่ 30 นาทีก่อนการฉีดแต่ละครั้งหนูในกลุ่มโคเคนจะได้รับการฉีดน้ำเกลือทาง IP, D1 antagonist SCH 23390 (0.5 มก. / กก.) หรือเอติคลอปไรด์ตัวรับ D2 receptor (0.5 มก. / กก.) วิเคราะห์สัตว์ 24 ชม. หลังการฉีดโคเคนครั้งสุดท้าย Western blotting เปิดเผยว่า D1 แต่ไม่ใช่ D2 ผู้ต่อต้านได้ปิดกั้นการเพิ่มขึ้นของโคเคนใน medFosB (p <0.0001; F = 18.96; df = 18) ตามที่รายงานก่อนหน้านี้ (Nye et al., 1995) เช่นเดียวกับใน CaMKII (p = 0.0005; F = 10.99; df = 18; รูปที่ 3G และ H) ข้อมูลเหล่านี้สนับสนุนสมมติฐานที่ว่าโคเคนมีการเพิ่มขึ้นของΔFosB-mediated ในการแสดงออกของยีน CaMKII โดยเฉพาะใน MSNN ประเภท D1 ชนิดของ NAc เชลล์ มันจะมีความสำคัญในการศึกษาในอนาคตเพื่อแสดงให้เห็นถึงผลกระทบเฉพาะประเภทเซลล์ของโคเคนต่อการแสดงออกของ CaMKII ในบริเวณสมองนี้

ΔFosBเป็นทั้งที่จำเป็นและเพียงพอสำหรับการเหนี่ยวนำโคเคนของ CaMKII ใน NAc Shell

เพื่อเสริมการใช้งานของ bitransgenic หนูต่อไปเราศึกษาบทบาทของΔFosBในการเป็นสื่อกลางในการเหนี่ยวนำโคเคนของCaMKIIαโดยการใช้การถ่ายโอนยีนของไวรัสในหนู เราฉีดอนุภาคไวรัส (AAV) ที่เกี่ยวข้องกับ adeno ลงในเปลือก NAc ของหนูตัวผู้ตัวเต็มวัย (ซึ่งสามารถเลือกเปลือกเป้าหมายได้) ไปที่ overexpress expressFosB บวก GFP หรือ GFP เพียงอย่างเดียว จากนั้นสัตว์จะได้รับโคเคน 10 mg / kg แบบ IP ครั้งเดียว สัตว์ที่แสดงออกมากเกินไปΔFosB / GFP แสดงการตอบสนองของหัวรถจักรที่เพิ่มขึ้นเมื่อเปรียบเทียบกับสัตว์ที่แสดงออกมากเกินไป GFP เพียงอย่างเดียว (รูปที่ 4A) 24 ชม. หลังจากการฉีดโคเคนครั้งเดียวเนื้อเยื่อ NAC GFP-positive ถูกตัดออกจากสัตว์เหล่านี้โดยการผ่าภายใต้แหล่งกำเนิดแสงฟลูออเรสเซนต์ ซับกระดาษทิชชูแบบตะวันตก (รูปที่ 4B และ C) เปิดเผย expressFosB ที่รุนแรงเกินไปรวมถึงการเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญของโปรตีนCaMKIIαทั้งหมดเมื่อเปรียบเทียบกับสัตว์ GFP (p = 0.0070; t = 2.894; df = 30) ซึ่งคล้ายกับการเหนี่ยวนำที่พบในการบริหารโคเคนเรื้อรัง นอกจากนี้CaMKIIα autophosphorylation ที่ Thr286 (บ่งบอกถึงการเปิดใช้งานเอนไซม์) เพิ่มขึ้นโดยΔFosB overexpression (p = 0.0330; t = 2.243; df = 28) เช่นเดียวกับ phosphorylation ของพื้นผิว CaMKII, Ser831 of thAXX 1; df = 0.0540) เป็นการเลียนแบบการกระทำของโคเคนเรื้อรังอีกครั้ง (รูปที่ 1C และ D) Tข้อมูลเหล่านี้แสดงหลักฐานเพิ่มเติมว่าการแสดงออกของΔFosBใน NAc shell นั้นเพียงพอสำหรับการกระตุ้นให้เกิดการเคลื่อนไหวของโคเคนต่อโคเคนและการเหนี่ยวนำและการกระตุ้น CaMKII ในอนุภูมิภาคนี้

เราใช้วิธีการที่คล้ายกันในการพิจารณาว่าΔFosBนั้นจำเป็นต่อการเหนี่ยวนำด้วยโคเคนจากCaMKIIαในเปลือก NAc หรือไม่ AAV ถูกใช้เพื่อแสดงออกถึงโปรตีน JunD ที่ถูกตัดทอนเรียกว่าΔJunDซึ่งเป็นตัวควบคุมเชิงลบของ activationFosB transcriptional activation (Winstanley และคณะ, 2007) บวก GFP หรือ GFP เพียงอย่างเดียว สองสัปดาห์ต่อมาเมื่อการแสดงออกของยีนมากที่สุดสัตว์จะได้รับโคเคน (10 mg / kg) หรือ saline ทุกวันเป็นเวลา 7 วันและทดสอบเพื่อตอบสนองต่อการเคลื่อนที่ของโคเคน (5 mg / kg) 24 ชั่วโมงหลังจากการฉีดเรื้อรังครั้งสุดท้าย (รูปที่ 4D) un มิถุนายนการแสดงออกที่มากเกินไปช่วยป้องกันไม่ให้เกิดอาการแพ้กับโคเคนและยังป้องกันการเหนี่ยวนำและการกระตุ้นของCaMKIIαในเปลือก NAc (รูปที่ 4E และ F; p = 0.0437; F = 2.997; Total df = 38) ซึ่งระบุว่ากิจกรรมการถอดเสียง criptFosB เป็นสิ่งจำเป็นสำหรับการเหนี่ยวนำโดยใช้โคเคนซึ่งเป็นสื่อกลางของCaMKIIαในภูมิภาคนี้ ที่น่าสนใจเราพบว่าΔJDDลดระดับของΔFosBภายใต้เงื่อนไขทั้งที่ใช้น้ำเกลือและโคเคน (p = 0.0004; F = 8.110; df = 35) เพิ่มความเป็นไปได้ใหม่ที่ novelFosB ขึ้นอยู่กับกิจกรรมของ AP-1

CaMKII Phosphorylates ΔFosBที่ Ser27

การใช้ ในหลอดทดลอง การตรวจสอบโปรตีนไคเนสเราพิจารณาแล้วว่าบริสุทธิ์ΔFosBเป็นสารตั้งต้นที่แข็งแกร่งสำหรับCaMKIIα ฟักไข่ของเขา6-ΔFosBพร้อมCaMKIIαและ ATP ทำให้เกิดการเลื่อนขึ้นในการเคลื่อนที่แบบอิเล็กโทรฟอเรติกของΔFosB (รูปที่ 5A); หลายวงที่เกิดขึ้นได้แนะนำไซต์หลายแห่งของฟอสโฟ คล้ายคลึงกัน ในหลอดทดลอง kinase assays ใช้ [γ-32P] ATP แสดงการรวมตัวกันของ radiolabeled phosphate ในแถบΔFosBที่เลื่อน (รูปที่ 5B) แสดงให้เห็นถึง phosphorylation โดยตรงของโปรตีน เราได้สร้างแอนติบอดี้ฟอสโฟเฉพาะสำหรับ Ser27 ที่มีเอกลักษณ์ก่อนหน้านี้ของΔFosB (Ulery et al., 2006) แม้ว่าแอนติบอดีนี้จะไม่สร้างสัญญาณต่อต้านสารสกัดจากสมองที่มี Ser27-phosphorylated ΔFosB (ไม่แสดงข้อมูล) เราก็สามารถตรวจจับ Ser27 phosphorylation ใน ในหลอดทดลอง kinase assay ใช้ CaMKII (รูปที่ 5B) การวิเคราะห์จลน์ของ CaMKII phosphorylation ของΔFosBบ่งชี้ว่ามันเป็นสารตั้งต้นที่มีศักยภาพสำหรับไคเนส (รูปที่ 5C) พร้อมด้วย KM ของ 5.7 ± 2.0µM และ Kแมว ของ 2.3 ± 0.3 นาที-1. ผลลัพธ์เหล่านี้เปรียบได้กับหลายลักษณะ ในร่างกาย พื้นผิวของ CaMKII (Colbran และ Brown, 2004) นอกจากนี้เราพิจารณาแล้วว่า CaMKII phosphorylates ΔFosBที่มีปริมาณสารสัมพันธ์ของ 2.27 ± 0.07 mol / mol (รูปที่ 5D) แสดงให้เห็นว่ามีอย่างน้อยสามเว็บไซต์ของ CaMKII phosphorylation ภายในของเขา6-ΔFosBโปรตีนสอดคล้องกับ รูปที่ 5A.

ในการตรวจสอบแต่ละพื้นที่ของฟอสโฟรีเลชั่นเราใช้การวิเคราะห์ MS ของตัวอย่างจากเรา ในหลอดทดลอง ไคเนสตรวจสอบ รูปที่ 5E แสดงให้เห็นถึงΔFosB phosphorylation ที่ Ser27 ที่โดดเด่นก่อนหน้านี้และที่ไซต์เพิ่มเติมหลายแห่ง (ไม่ได้แสดงข้อมูล) เมื่อพิจารณาถึงลักษณะการทำงานก่อนหน้าของ Ser27 เรามุ่งเน้นไปที่ไซต์นี้โดยการสร้างเปปไทด์สังเคราะห์ที่มีข้อความซึ่งเลียนแบบฟอสโฟและไม่ติดไฟของ Ser27 จากนั้นใช้ปริมาณเปปไทด์ที่ทราบเป็นมาตรฐานในการวิเคราะห์ MRM ของΔFosB ในหลอดทดลอง phosphorylation โดย CaMKII ปริมาณที่ตามมา (รูปที่ 5F) ยืนยันว่า Ser27 เป็นวัสดุพิมพ์ที่มีศักยภาพสำหรับ CaMKII ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่าในบรรดาสารตกค้างที่มีฟอสโฟรีเลชั่นจำนวนมากภายในΔFosB Ser27 เป็นสารตั้งต้นที่มีประสิทธิภาพโดยเฉพาะสำหรับ CaMKII

CaMKII เป็นสื่อกลางในการสะสมโคเคนของΔFosBใน NAc Shell

เนื่องจาก CaMKII สามารถ phosphorylate ΔFosB ในหลอดทดลอง ที่ไซต์ที่ช่วยเพิ่มความเสถียรอย่างมาก ในหลอดทดลอง และ ในร่างกาย (Ulery et al., 2006; Ulery-Reynolds และคณะ, 2009) เราได้พิจารณาว่ากิจกรรม CaMKII ควบคุมระดับ levelsFosB ใน NAc หรือไม่ ในร่างกาย. เพื่อตอบคำถามนี้เราใช้เมาส์เป็นคำสั่งแทนที่CaMKIIα (T286D) กลายพันธุ์ที่ไม่ขึ้นอยู่กับแคลเซียมในพื้นที่สมองหลายแห่งรวมถึง NAc (Mayford และคณะ, 1996; Kourrich et al., 2012) เราฉีดโคเคน 20 mg / kg หรือ saline วันละครั้งสำหรับ 14 วันแล้วทำการวิเคราะห์สัตว์หนึ่งวันหลังจากการฉีดครั้งสุดท้าย เราพบว่าระดับพื้นฐานของΔFosBเพิ่มขึ้นในสัตว์กลายพันธุ์ในเปลือก NAc (p = 0.0001; F = 9.207; df = 37) แต่ไม่ใช่แกนกลาง (รูปที่ 5G และ H) น่าแปลกใจที่การเหนี่ยวนำโคเคนของΔFosBนั้นถูกบล็อกในสัตว์ที่กลายพันธุ์ในทั้งเปลือกและแกนบอกว่าถึงแม้ว่า CaMKII อาจควบคุมโดยตรงΔFosBในเปลือกหอยมันอาจจะอยู่เหนือของΔFosBในเส้นทางโคเคน .

จำเป็นต้องมีกิจกรรม CaMKII สำหรับ Structural โครงสร้างแบบสื่อผสม Bos และโครงสร้างพลาสติก

การเหนี่ยวนำโคเคนของกระดูกสันหลัง dendritic บน NAc MSNs เป็นหนึ่งในการดัดแปลงยากระตุ้นที่ดีที่สุดในภูมิภาคสมองนี้และการเหนี่ยวนำกระดูกสันหลังดังกล่าวมีความสัมพันธ์กับการตอบสนองพฤติกรรมไวยาเสพติด (โรบินสันและคอล์บ 2004; รุสโซและคณะ, 2010) และรายงานว่าเป็นตัวเลือกสำหรับ MSN ประเภท D1Lee และคณะ, 2006) เราได้แสดงให้เห็นเมื่อเร็ว ๆ นี้ว่าการเหนี่ยวนำโคเคนของกระดูกสันหลัง dendritic ใน NAc นั้นขึ้นอยู่กับΔFosBและโปรแกรมการถอดเสียงปลายน้ำ (Maze et al., 2010) แม้ว่าจะมีวรรณกรรมมากมายที่เกี่ยวข้องกับการมีส่วนร่วมของ CaMKII ในลักษณะทางสัณฐานวิทยาของกระดูกสันหลัง dendritic และการเหนี่ยวนำในพื้นที่สมองอื่น ๆ และระบบการทดลอง (Jourdain et al., 2003; Penzes et al., 2008; Okamoto และคณะ, 2009) บทบาทของมันในการก่อตัวของกระดูกสันหลัง NAc MSN ยังไม่ได้รับการศึกษา ดังนั้นเราจึงตัดสินว่ากิจกรรม CaMKII นั้นจำเป็นสำหรับการชักนำ osFosB-mediated ของ MSN dendritic spines โดยใช้ HSV-mediated overexpression ของ CaMKII ยับยั้งเปปไทด์ AC3I หลอมรวมกับ GFP ซึ่งเป็นโครงสร้างที่แสดงก่อนหน้านี้เพื่อยับยั้งกิจกรรม CaMKII ในร่างกาย (จางและคณะ, 2005; Klug et al., 2012). การแสดงออกที่มากเกินไปของไวรัสของΔFosBในเปลือก NAc ของหนูที่โตเต็มวัยทำให้ความหนาแน่นของกระดูกสันหลัง MSN เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ (p <0.0001; F = 8.558; df = 59; รูปที่ 6A และ B) ตามที่รายงานไว้ก่อนหน้า (Maze et al., 2010) และการเพิ่มขึ้นนี้ได้รับแรงหนุนหลักจากบาง (p = 0.0027; F = 5.319; df = 59) และตอไม้ (p = 0.0378; F = 2.988; d = 59) ประเภทกระดูกสันหลัง (ทั้งคู่คิดว่าเป็นเงี่ยงที่ยังไม่บรรลุนิติภาวะ)รูปที่ 6C – E) ไม่มีผลกระทบต่อกระดูกสันหลังที่โตเต็มที่และเป็นรูปเห็ด อย่างไรก็ตามเมื่อ GFP-AC3I ถูก coexpressed การเหนี่ยวนำ osFosB ของกระดูกสันหลังถูกยกเลิกอย่างสมบูรณ์ (รูปที่ 6A – E) ระบุว่ากิจกรรม CaMKII นั้นจำเป็นสำหรับการเหนี่ยวนำΔFosBของเงี่ยง dendritic ใน NAc เชลล์

ต่อไปเราใช้เครื่องมือที่เหมือนกันของไวรัสเพื่อตรวจสอบว่าจำเป็นต้องมีกิจกรรมของ CaMKII หรือไม่สำหรับผลกระทบของΔFosBต่อความไวของพฤติกรรมต่อโคเคน 72 ชม. หลังจากฉีดไวรัสเข้าไปในเปลือก NAc สัตว์ได้รับโคเคน 5 mg / kg หนึ่งครั้งและบันทึกการเคลื่อนไหวของหัวรถจักร ดังที่แสดงไว้ก่อนหน้านี้พร้อมกับ AAV ที่ขยายเพิ่มเติมมากขึ้นของΔFosB (รูปที่ 4A) การแสดงออกที่เกิน HSV ของ ofFosB เพิ่มความไวของหัวรถจักรต่อโคเคน (p = 0.0002; F = 8.823; df = 37; รูปที่ 6F) เช่นเดียวกับการเหนี่ยวนำของกระดูกสันหลัง dendritic การยับยั้งกิจกรรม CaMKII โดยการแสดงออกของ GFP-AC3I บล็อกการเพิ่มโคเคนไวโคเคนΔFosB-mediated อย่างสมบูรณ์แสดงให้เห็นว่ากิจกรรม CaMKII นั้นจำเป็นสำหรับการเปลี่ยนแปลงที่เกิดขึ้นในโคเคน

ไปที่:

การสนทนา

การศึกษาครั้งนี้อธิบายถึงกลไกการส่งต่อใหม่ที่โคเคนเจือจางΔFosBใน NAc ซึ่งทำให้การถอดความของยีนCaMKIIαคัดเลือกในเปลือก NAc. CaMKIIα phosphorylates ในเวลาต่อมาและทำให้เสถียร osFosB นำไปสู่การสะสมΔFosBที่มากขึ้นและเพื่อเหนี่ยวนำCaMKIIαเพิ่มเติม (รูปที่ 6G) ระดับที่เพิ่มขึ้นของโปรตีนทั้งสองระหว่างการสัมผัสโคเคนเรื้อรังจากนั้นมีส่วนร่วมในวิธีการสำคัญในการตอบสนองพฤติกรรมไวต่อยาเสพติด นี่เป็นสมมติฐานที่น่าดึงดูดเป็นพิเศษเนื่องจากทั้งΔFosBและ CaMKII ได้รับการพิสูจน์มาก่อนหน้าแล้วว่าจำเป็นสำหรับการตอบสนองเชิงพฤติกรรมที่เพิ่มขึ้นของโคเคน (Pierce et al., 1998; Peakman และคณะ 2003) และเราทำซ้ำการค้นพบนี้สำหรับΔFosBใน NAc เชลล์โดยเฉพาะโดยใช้วิธีการของไวรัส (มะเดื่อ 4 และ and66).

แม้ว่า transgenic ΔFosBที่แสดงออกใน D1-type MSNs สามารถกระตุ้นการเหนี่ยวนำ CaMKII ในเปลือก NAc และแกนของสัตว์โคเคน - naïveในบริบทของโคเคน, การสะสมของภายนอกΔFosBซึ่งเกิดขึ้นในอนุภูมิภาคทั้งสอง . ความแตกต่างนี้อาจเกี่ยวข้องกับระดับที่สูงขึ้นของ higherFosB ที่เกิดขึ้นในแบบจำลอง bitransgenic ของเราอย่างไรก็ตามมันอาจสะท้อนความสามารถของโคเคนในการเปลี่ยนCaMKIIαก่อการในเปลือก เมื่อเทียบกับ MSN หลักในการส่งเสริมΔFosBผูกพันในอดีตหรือไม่รวมใน subregion หลัง ในความเป็นจริงข้อมูล ChIP ของเราซึ่งเผยให้เห็นการกำจัด deacetylation ของโคเคนที่ฮิสโตนที่โปรโมตยีนCaMKIIαในแกน NAc เท่านั้นสนับสนุนการมีส่วนร่วมที่เป็นไปได้ของกลไกโครมาติน เพื่อให้สอดคล้องกับสมมติฐานนี้ΔFosBที่แสดงออกมาใน D1-type MSNs สามารถกระตุ้นการเหนี่ยวนำCaMKIIαในแกน NAc ในกรณีที่ไม่มีโคเคน (รูปที่ 3F) แนะนำว่ามีการแก้ไขCaMKIIαก่อการที่ป้องกันการเหนี่ยวนำนี้ในระหว่างการสัมผัสโคเคนเรื้อรัง กฎระเบียบของภูมิทัศน์โครมาตินที่โปรโมเตอร์ CaMKII อาจอธิบายได้ว่าทำไม CaMKII ถูกเหนี่ยวนำโดยปริมาณโคเคนที่ท้าทายในเปลือก NAc ของหนูที่ถอนโคเคนเรื้อรัง (รูปที่ 1E) แต่ไม่ใช่ของสัตว์ยาเสพติดไร้เดียงสา (รูปที่ 1D) สิ่งนี้สามารถเป็นตัวแทนของ epigenetic "ยีนรองพื้น" ผลของΔFosB (Robison and Nestler, 2011) และอาจเป็นหนึ่งในกลไกระดับโมเลกุลของการบ่มโคเคนความอยาก (Pickens และคณะ, 2011) อย่างไรก็ตามสำหรับการเปลี่ยนโครมาตินนี้จะเชื่อมโยงกับการบ่มของความอยากเชิงสาเหตุมันจะต้องเพิ่มขึ้นเมื่อเวลาผ่านไป มันจะน่าสนใจที่จะตรวจสอบว่าเป็นกรณีนี้หรือไม่และเพื่อศึกษาว่ายีนอื่น ๆ แสดง regulationFosB-dependent, อนุภูมิภาคเฉพาะโดยโคเคนหรือไม่ นอกจากนี้ยังเป็นสิ่งสำคัญที่จะต้องทราบว่าการวนลูปไปข้างหน้าฟีดที่เราอธิบายไม่ได้นำไปสู่การสะสม CaMKII หรือΔFosBไม่สิ้นสุดรูปที่ 1E); การเปิดเผย“ เบรก” ในระดับโมเลกุลที่รับผิดชอบในเรื่องนี้เป็นเป้าหมายสำคัญของการศึกษาในอนาคต

ฟังก์ชั่นที่เป็นที่รู้จักของΔFosBและ CaMKII ในหลายระบบการทดลองและบริเวณสมองรวมกันในหลายระดับ (รูปที่ 6F) โมเลกุลทั้งสองนั้นเชื่อมโยงอย่างใกล้ชิดกับการเจริญเติบโตของกระดูกสันหลัง dendritic: CaMKII มีปฏิสัมพันธ์กับโครงร่างของเซลล์แอกตินOkamoto และคณะ, 2009) ควบคุมขนาดหัวกระดูกสันหลัง (Matsuzaki และคณะ, 2004) และเป็นทั้งที่จำเป็นและเพียงพอสำหรับการเพิ่มขึ้นของพลาสติกใน filopodia และจำนวน synapse ในวัฒนธรรม slice ของ hippocampal organotypic (Jourdain et al., 2003), while ΔFosBมีทั้งที่จำเป็นและเพียงพอสำหรับการสร้างกระดูกสันหลัง dendritic โคเคนใน NAc MSNs (Maze et al., 2010) นอกจากนี้โมเลกุลทั้งสองยังสัมพันธ์กับระเบียบของ AMPA glutamate receptors CaMKII ไม่ควบคุมระดับทั้งหมดของหน่วยย่อยตัวรับ AMPA แต่ผลักดันการแทรกตัวรับ AMPA ลงใน synapses และเพิ่มความนำของช่องสัญญาณ AMPA โดย phosphorylating GluA1 ที่ Ser831 ในเซลล์เสี้ยมแบบ hippocampal ในร่างกาย (ตรวจสอบใน (Malinow และ Malenka, 2002; Colbran และ Brown, 2004)) การค้า GluA1 ที่เพิ่มขึ้นดังกล่าวไปยังไซแนปส์ได้มีส่วนเกี่ยวข้องในการกระทำโคเคนเรื้อรังเช่นกัน (Boudreau และ Wolf, 2005) ยิ่งกว่านั้นการตอบสนองเชิงพฤติกรรมต่อการเปิดใช้งานตัวรับ AMPA ใน NAc นั้นได้รับการปรับปรุงโดยCaMKIIαแสดงออกมากเกินไปในลักษณะที่ต้องพึ่งพาตัวรับ dopamine ของ D1 (นักร้องและคณะ, 2010) การแสดงออกที่เฉพาะเจาะจงในระยะยาวของ D1 ของΔFosBได้รับการแสดงเพื่อกระตุ้นการถอดความ GluA2 ใน NAc (Kelz และคณะ, 1999) ซึ่งรองรับการตอบสนองของ AMPA ผ่านทาง GluA1 ในขณะที่เราแสดงให้เห็นว่าคำว่า "FosB overexpression" ในระยะสั้นเช่นเดียวกับการสัมผัสโคเคนในระยะสั้น - ไม่มีผลต่อหน่วยย่อยนี้ (1 รูป) อย่างไรก็ตามเราได้พบเมื่อเร็ว ๆ นี้ว่าΔFosBการแสดงออกมากเกินไปในระยะสั้นยังช่วยลดการตอบสนอง AMPA ใน MSNN ประเภท D1 ใน NAc (Grueter et al., 2013) ข้อมูลเหล่านี้ชี้ให้เห็นถึงกลไกที่แตกต่างชั่วคราวซึ่งอาจเป็นชุดของโคเคนที่ขึ้นกับเวลาในการใช้โคเคนซึ่งเป็นพื้นฐานของการดำเนินการติดยาเสพติดที่ยังไม่เป็นที่เข้าใจ ในระดับพฤติกรรมนั้นจำเป็นต้องใช้ทั้ง CaMKII และ osFosB สำหรับการกระตุ้นให้เกิดอาการแพ้โคเคนต่อโคเคน (ดูด้านบน) และทั้งสองอย่างจำเป็นสำหรับการจัดการโคเคนด้วยตนเองอย่างยั่งยืนในสัตว์ฟันแทะColby และคณะ 2003; วังและคณะ, 2010) ชี้ให้เห็นว่าโปรตีนทั้งสองมีความสำคัญต่อการปรับพฤติกรรมทั้งระยะสั้นและระยะยาวต่อการสัมผัสกับยาแม้ว่าจะผ่านกลไกพื้นฐานบางส่วน สันนิษฐานว่าΔFosBและ CaMKII ควบคุมการปรับเปลี่ยนพฤติกรรมที่ซับซ้อนเช่นนี้ผ่านการเปลี่ยนแปลงในฟังก์ชัน NAc synaptic แม้ว่าจำเป็นต้องมีการทำงานเพิ่มเติมเพื่อเชื่อมโยงปรากฏการณ์ซินแท็กซ์กับการเปลี่ยนแปลงพฤติกรรมโดยตรง

CaMKII holoenzyme ทำปฏิกิริยากับโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับไซแนปส์พร้อม ๆ กัน (Robison et al., 2005) ซึ่งคิดว่าจะควบคุมการกำหนดเป้าหมายไปที่ความหนาแน่น postsynaptic (PSD) ซึ่งเป็นปรากฏการณ์ที่แนะนำให้มีความสำคัญสำหรับพลาสติกซินแนปติก โดยเฉพาะอย่างยิ่งการทำงานร่วมกันของ CaMKII กับหน่วยย่อย GluN2B ของตัวรับกลูตาเมตชนิด NMDA ได้แสดงให้เห็นเมื่อเร็ว ๆ นี้เพื่อควบคุมทั้งพลาสติกซินแนปติกและการเรียนรู้ (หยุดและ 2012) ในขณะที่ AC3I เปปไทด์เลียนแบบโดเมน autoinhibitory ของ CaMKII และยับยั้งการเร่งปฏิกิริยาของเอนไซม์มันยังบล็อกการทำงานร่วมกันของโปรตีน - โปรตีน (Strack และคณะ, 2000; Robison et al., 2005) ดังนั้นพฤติกรรมและลักษณะทางสัณฐานวิทยาของ HSV-GFP-AC3I รายงานที่นี่อาจเกิดขึ้นได้จากการลดฟอสฟอรัสของโปรตีนเป้าหมาย CaMKII การเปลี่ยนแปลงในการกำหนดเป้าหมาย CaMKII หรือการเปลี่ยนแปลงบทบาทโครงสร้างที่เสนอของ CaMKII ที่ซินก์Lisman และคณะ, 2002).

ข้อ จำกัด ของวงΔFosB-CaMKII ที่เสนอไปยังเชลล์ NAc นั้นเป็นข้อความพิเศษเนื่องจากงานล่าสุดได้แสดงให้เห็นถึงความแตกต่างทางสรีรวิทยาหลายประการระหว่างเชลล์ NAc และแกนกลางในการตอบสนองต่อการบริหารโคเคนความเชื่อที่ยืนยันโดย iTRAQ (ตาราง S1) . MSNs ใน NAc shell แสดงภาวะซึมเศร้าในความสามารถในการเผาหลังจากโคเคนเรื้อรังที่ถูกเก็บรักษาไว้เป็นเวลาหลายสัปดาห์ในขณะที่ MSNs หลักจากสัตว์เดียวกันแสดงความสามารถในการยิงชั่วคราว (1 – 3 วัน) เพิ่มขึ้นในความสามารถในการยิงKourrich และ Thomas, 2009) นอกจากนี้โปรตีนซินแนปส์หลายชนิดยังถูกควบคุมในเปลือกหอย NAc เมื่อเทียบกับ แกนกลางของสัตว์ที่สัมผัสกับโคเคนเรื้อรังรวมถึง GluA2 (Knackstedt และคณะ, 2010) ในฐานะที่เป็นแอมเฟตามีนเรื้อรังก่อให้เกิดCaMKIIαเฉพาะในเปลือก NAc (Loweth และคณะ 2010) ไม่น่าแปลกใจที่เราพบว่ามีผลคล้ายกับโคเคน อย่างไรก็ตามเนื่องจากΔFosBถูกเหนี่ยวนำให้เกิดขึ้นทั้งในเปลือก NAc และแกนโดยโคเคนเรื้อรัง (Perrotti et al., 2008) และเนื่องจากเราแสดงให้เห็นว่าการเหนี่ยวนำCaMKIIαในเปลือกเป็นΔFosBขึ้นอยู่กับการค้นพบของเราให้หลักฐานใหม่สำหรับกลไกการถอดรหัสที่แตกต่างกันที่ก่อการก่อการCaMKIIαระหว่างสองภูมิภาคย่อยนี้ซึ่งมีความรับผิดชอบในการคัดเลือกที่เลือกของCaMKIIαในเปลือก

การทำงานล่าสุดจำนวนมากได้มุ่งเน้นไปที่การวิเคราะห์ความแตกต่างระหว่าง D1- และ D2 ประเภท NAc MSNs แม้ว่าตัวรับ D1 และ D2 จะเกี่ยวข้องกับผลของโคเคน (ตนเอง 2010), งานล่าสุดแสดงให้เห็นว่าการเปิดใช้งาน optogenetic ของ MSN-D1 ชนิดเพิ่มการตอบสนองพฤติกรรมโคเคนในขณะที่การเปิดใช้งาน MSN D2- ประเภทมีผลตรงกันข้าม (Lobo และคณะ, 2010) สอดคล้องกับสิ่งที่ค้นพบเหล่านี้หนูที่น่าพิศวงของ D1 มีข้อบกพร่องในการได้รับโคเคนด้วยตนเอง (เคนและคณะ 2007) ในขณะที่ knockouts D2 ไม่ใช่ (เคนและคณะ 2002) การบริหารแบบเอกเทศของ D1 โดยตรงใน NAc ทำให้เกิดพฤติกรรมการแสวงหาโคเคนในกระบวนทัศน์เรียกคืนสถานะ (ตนเอง 2010) น่าสนใจเอฟเฟกต์นี้ต้องการการเพิ่มขึ้นของตัวรับ D1 ที่ขึ้นกับกิจกรรม CaMKII ในเชลล์ NAc แต่ไม่ใช่แกน (Anderson และคณะ, 2008) ผลลัพธ์ที่ประกบกันเป็นอย่างดีกับ D1- และเชลล์เฉพาะΔFosB-CaMKII ที่นำเสนอที่นี่

ก่อนหน้านี้เรารายงานว่า Ser27 ในΔFosBสามารถ phosphorylated โดย casein kinase-2 (Ulery et al., 2006) อย่างไรก็ตามเราสร้างที่นี่ว่า CaMKII phosphorylates ΔFosBที่ไซต์นี้และไซต์อื่น ๆ ที่มีจลนศาสตร์และปริมาณสารสัมพันธ์มากขึ้นและสามารถทำซ้ำ M ที่ชัดเจนยิ่งขึ้นr สังเกตได้สำหรับΔFosB (รูปที่ 5A) ด้วยการสัมผัสโคเคน ในร่างกาย (Nestler, 2008) เรารู้อยู่แล้วว่า Ser27 phosphorylation เพิ่มความเสถียร osFosB และกิจกรรมการถอดเสียง (Ulery et al., 2006; Ulery และ Nestler, 2007; Ulery-Reynolds และคณะ, 2009) การทำงานในอนาคตจะมุ่งเน้นไปที่การระบุตัวตนและผลที่ตามมาจากการทำงานของไซต์ใหม่ของฟอสฟอรัส BFosB ที่ระบุโดยการศึกษาปัจจุบัน

ห่วงฟีดไปข้างหน้าที่อธิบายไว้ที่นี่ให้กลไกใหม่ที่เป็นไปได้ซึ่งการบริหารโคเคนซ้ำ ๆ ทำให้เกิดความผิดปกติที่ก้าวหน้าใน NAc ดังนั้นเส้นทางชีวเคมีนี้อาจเป็นเป้าหมายสำคัญสำหรับการแทรกแซงการบำบัดรักษาในอนาคตในโรคติดสารเสพติด เนื่องจาก CaMKII นั้นเป็นที่แพร่หลายและจำเป็นสำหรับฟังก์ชั่นพื้นฐานของเซลล์ประสาทและพฤติกรรมหลายอย่างการใช้ CaMKII inhibitors โดยตรงจึงหลีกเลี่ยงไม่ให้เป็นการรักษาแบบติดยาเสพติด ข้อมูลของเราชี้ให้เห็นว่าการกำหนดเป้าหมายที่ละเอียดยิ่งขึ้นของกลไกของการเหนี่ยวนำ CaMKII ซึ่งเฉพาะสำหรับเซลล์แต่ละชนิดและอนุภูมิภาคของวงจรการให้รางวัลของสมองสามารถให้เป้าหมายการรักษาที่จะหลีกเลี่ยงภาวะแทรกซ้อนของการยับยั้ง CaMKII ในระบบ

ไปที่:

กิตติกรรมประกาศ

งานนี้ได้รับการสนับสนุนโดยทุนจากสถาบันแห่งชาติว่าด้วยการใช้ยาในทางที่ผิด (EJN), NIDA-Yale Proteomics Center DA018343 (AJR และ EJN) และ Hartwell Foundation (AJR) ผู้เขียนขอขอบคุณ Gabby Rundenko สำหรับของขวัญที่มีความบริสุทธิ์ΔFosBและ Roger Colbran สำหรับของขวัญที่มีคุณค่าของCaMKIIαที่บริสุทธิ์

ไปที่:

อ้างอิง

  1. Ahmed SH, Koob GF การเปลี่ยนจากระดับปานกลางไปสู่การรับประทานยามากเกินไป: เปลี่ยนจุด hedonic set วิทยาศาสตร์. 1998; 282: 298 300- [PubMed]
  2. Anderson SM, KR ที่มีชื่อเสียง, Sadri-Vakili G, Kumaresan V, Schmidt HD, เบส CE, Terwilliger EF, Cha JH, Pierce RC CaMKII: สะพานชีวเคมีเชื่อมโยงระบบโดปามีนและกลูตาเมต accumbens ในการแสวงหาโคเคน Nat Neurosci 2008; 11: 344 353- [PubMed]
  3. Boudreau AC, Wolf ME การไวต่อพฤติกรรมของโคเคนมีความสัมพันธ์กับการแสดงออกของ AMPA receptor ผิวที่เพิ่มขึ้นในนิวเคลียส accumbens J Neurosci 2005; 25: 9144 9151- [PubMed]
  4. Brickey DA, Colbran RJ, Fong YL, Soderling TR การแสดงออกและลักษณะของอัลฟา - หน่วยย่อยของ Ca2 + / โปรตีนแคลโลดูลินขึ้นอยู่กับไคเนส II โดยใช้ระบบการแสดงออกของไวรัสบาซิลลัส ชุมชน Biochem Biophys Res 1990; 173: 578 584- [PubMed]
  5. เคน SB, Negus SS, Mello NK, Patel S, Bristow L, Kulagowski J, Vallone D, Saiardi A, Borrelli E. บทบาทของตัวรับสาร dopamine D2 ในโคเคนการจัดการตนเอง: ศึกษากับตัวรับ DMNUMX ตัวกลายพันธุ์ คู่อริ J Neurosci 2; 2: 2002 22- [PubMed]
  6. เคน SB, Thomsen M, Gabriel KI, Berkowitz JS, ทอง LH, Koob GF, Tonegawa S, Zhang J, Xu M. ขาดการดูแลตนเองของโคเคนในโดปามีน D1 ตัวรับหนูที่ถูกกระแทก J Neurosci 2007; 27: 13140 13150- [บทความฟรี PMC] [PubMed]
  7. Carle TL, Ohnishi YN, Ohnishi YH, Alibhai IN, Wilkinson MB, Kumar A, Nestler EJ กลไกที่ขึ้นกับโปรตีนและ - อิสระสำหรับการทำให้เสถียร FosB: การระบุโดเมน FosB degron และผลกระทบต่อเสถียรภาพ DeltaFosB Eur J Neurosci 2007; 25: 3009 3019- [PubMed]
  8. เฉิน J, Kelz MB, เซงจี, ซาไกเอ็น, สเตฟเฟนซี, Shockett PE, Picciotto MR, Duman RS, Nestler EJ สัตว์ดัดแปลงพันธุกรรมที่มีการเหนี่ยวนำการแสดงออกของยีนเป้าหมายในสมอง Mol Pharmacol 1998; 54: 495 503- [PubMed]
  9. Christoffel DJ, Golden SA, Dumitriu D, Robison AJ, Janssen WG, Ahn HF, Krishnan V, Reyes CM, Han MH, Ables JL, Eisch AJ, Dietz DM, เฟอร์กูสัน D, Neve RL, Greengard P, Kim Y, Morrison JH , รุสโซ SJ IkappaB kinase ควบคุมความพ่ายแพ้ทางสังคมที่เกิดจากความเครียด synaptic และปั้นพลาสติกพฤติกรรม J Neurosci 2011; 31: 314 321- [บทความฟรี PMC] [PubMed]
  10. Colbran RJ การหยุดการทำงานของ Ca2 + / ไคเนสโปรตีนที่ขึ้นอยู่กับความสงบของเอนไซม์ไคเนสที่ 2 โดย basal autophosphorylation J Biol Chem 1993; 268: 7163 7170- [PubMed]
  11. Colbran RJ โปรตีนฟอสฟาเตสและแคลเซียม / ไคเนสโดลินขึ้นอยู่กับโปรตีนไคเนสพลาสติกซินแนปปี II J Neurosci 2004; 24: 8404 8409- [PubMed]
  12. Colbran RJ, Brown AM แคลเซียม / ไคเนสโปรตีนที่ขึ้นกับความสงบของเอนไซม์ไคเนสที่สองและพลาสติกซินแนปติก Curr Minnes Neurobiol 2004; 14: 318 327- [PubMed]
  13. Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, DW ตัวเอง การแสดงออกเฉพาะของเซลล์มากเกินไปของ DeltaFosB ช่วยเพิ่มแรงจูงใจสำหรับโคเคน J Neurosci 2003; 23: 2488 2493- [PubMed]
  14. Covington HE, 3rd, Maze I, LaPlant QC, Vialou VF, Ohnishi YN, Berton O, Fass DM, Renthal W, Rush AJ, 3rd, Wu EY, Ghose S, Krishnan V, รุสโซ SJ, Tamo C EJ การกระทำของยากล่อมประสาทในการยับยั้งฮิสโตนดีเซส J Neurosci 2009; 29: 11451 11460- [บทความฟรี PMC] [PubMed]
  15. Davalos A, Fernandez-Hernando C, Sowa G, Derakhshan B, Lin MI, Lee JY, Zhao H, Luo R, Colangelo C, Sessa WC โปรตีโอมิกเชิงปริมาณของโปรตีนที่ควบคุมโดย caveolin-1: การศึกษาคุณสมบัติของพอลิเมอเรสที่ 1 และปัจจัยการปลดปล่อยยีน / CAVIN-1 ในเซลล์บุผนังหลอดเลือด Mol Cell Proteomics 2010; 9: 2109 2124- [บทความฟรี PMC] [PubMed]
  16. Dumais A, Lesage AD, Alda M, Rouleau G, Dumont M, Chawky N, Roy M, แมนน์เจเจ, Benkelfat C, Turecki G. ปัจจัยเสี่ยงต่อการฆ่าตัวตายในภาวะซึมเศร้าครั้งใหญ่: กรณีศึกษาการควบคุมพฤติกรรมหุนหันพลันแล่นและก้าวร้าวใน ผู้ชาย ฉันคือจิตเวชศาสตร์ 2005; 162: 2116 2124- [PubMed]
  17. Grueter BA, Robison AJ, Neve RL, Nestler EJ, Malenka RC ΔFosBปรับแต่งนิวเคลียส accumbens ฟังก์ชั่นทางเดินทั้งทางตรงและทางอ้อม Proc Natl Acad Sci สหรัฐอเมริกา 2013 ในการกด [บทความฟรี PMC] [PubMed]
  18. Halt AR, Dallap Piazza RF, Zhou Y, Stein IS, Qian H, Juntti S, Wojcik S, Brose N, Silva AJ, Hell JW CaMKII เชื่อมโยงกับ GluN2B เป็นสิ่งสำคัญในระหว่างการรวมหน่วยความจำ EMBO J. 2012; 31: 1203 – 1216 [บทความฟรี PMC] [PubMed]
  19. Hiroi N, Brown JR, Haile CN, Ye H, Greenberg ME, Nestler EJ หนูที่กลายพันธุ์ FosB: การสูญเสียการเหนี่ยวนำโคเคนเรื้อรังของโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับ Fos และเพิ่มความไวต่อจิตของโคเคนและผลที่คุ้มค่า Proc Natl Acad Sci US A. 1997; 94: 10397–10402 [บทความฟรี PMC] [PubMed]
  20. Ito R, Robbins TW, Everitt BJ การควบคุมความแตกต่างของพฤติกรรมการค้นหาโคเคนโดยนิวเคลียส accumbens แกนกลางและเปลือก Nat Neurosci 2004; 7: 389 397- [PubMed]
  21. Jorissen HJ, Ulery PG, Henry L, Gourneni S, Nestler EJ, Rudenko G. การทำให้มีขนาดเล็กลงและคุณสมบัติที่มีผลต่อ DNA ของการถอดรหัส DeltaFosB ชีวเคมี. 2007; 46: 8360 8372- [PubMed]
  22. Jourdain P, Fukunaga K, มุลเลอร์ดี. แคลเซียม / ไคเนสโปรตีนที่ขึ้นกับยากล่อมประสาทเย็น II มีส่วนช่วยในการเจริญเติบโตของพืชที่ขึ้นอยู่กับกิจกรรมและการก่อตัวของกระดูกสันหลัง J Neurosci 2003; 23: 10645 10649- [PubMed]
  23. Kelz MB, Chen J, Carlezon WA, Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, DW ตนเอง, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Neve RL, Duman RS, Picciotto MR, Nestler EJ การแสดงออกของปัจจัยการถอดรหัส deltaFosB ในสมองควบคุมความไวต่อโคเคน ธรรมชาติ. 1999; 401: 272 276- [PubMed]
  24. Klug JR, Mathur BN, Kash TL, Wang HD, Matthews RT, Robison AJ, Anderson ME, Deutch AY, Lovinger DM, Colbran RJ, Winder DG การยับยั้งทางพันธุกรรมของ CaMKII ในเซลล์ประสาทส่วนปลายกระดูกสันหลังส่วนปลายของกระดูกสันหลังส่วนปลายช่วยลดการทำงานของอวัยวะที่กระตุ้นการทำงานและเพิ่มความตื่นเต้นง่ายภายในร่างกาย กรุณาหนึ่ง 2012; 7: e45323 [บทความฟรี PMC] [PubMed]
  25. Knackstedt LA, Moussawi K, Lalumiere R, Schwendt M, Klugmann M, Kalivas PW การฝึกอบรมการสูญพันธุ์หลังจากการจัดการโคเคนด้วยตนเองก่อให้เกิดกลูตามาเทกติกพลาสติกเพื่อยับยั้งการแสวงหาโคเคน J Neurosci 2010; 30: 7984 7992- [บทความฟรี PMC] [PubMed]
  26. Kourrich S, Thomas MJ เซลล์ประสาทที่คล้ายกันการปรับตัวตรงข้าม: ประสบการณ์ psychostimulant แตกต่างกันไปเปลี่ยนคุณสมบัติการยิงใน accumbens แกนกับเปลือก J Neurosci 2009; 29: 12275 12283- [บทความฟรี PMC] [PubMed]
  27. Kourrich S, Klug JR, Mayford M, Thomas MJ ผลที่ไม่ขึ้นกับ AMPAR อิสระของ alphaCaMKII ส่งเสริมการแพ้ของรางวัลโคเคน J Neurosci 2012; 32: 6578 6586- [บทความฟรี PMC] [PubMed]
  28. LaPlant Q, Chakravarty S, Vialou V, Mukherjee S, คูเจดับบลิว, Kalahasti G, แบรดเบอรี่ KR, เทย์เลอร์ SV, เขาวงกต I, Kumar A, เกรแฮม A, Birnbaum SG, Krishnan V, Truong HT, เนวี RL, Nestso SJ . บทบาทของ kappaB ปัจจัยนิวเคลียร์ต่อการแพ้ฮอร์โมนความเครียดจากรังไข่ในหนูตัวเมีย จิตเวช Biol 2009; 65: 874 880- [บทความฟรี PMC] [PubMed]
  29. Lee KW, Kim Y, Kim AM, Helmin K, Nairn AC, Greengard P. การก่อตัวของ dendritic กระดูกสันหลังโคเคนที่เกิดจากโคเคนใน D1 และ D2 ตัวรับโดปามีนที่มีโดพามีนขนาดกลางในนิวเคลียส accumbens Proc Natl Acad Sci US A. 2006; 103: 3399 – 3404 [บทความฟรี PMC] [PubMed]
  30. Lisman J, Schulman H, Cline H. พื้นฐานระดับโมเลกุลของฟังก์ชัน CaMKII ในหน่วยความจำ synaptic และพฤติกรรม Nat Rev Neurosci 2002; 3: 175 190- [PubMed]
  31. Lobo MK, Covington HE, 3rd, Chaudhury D, Friedman AK, Sun H, Damez-Werno D, Dietz DM, Zaman S, Koo JW, เคนเนดี้ PJ, Mouzon E, Mogri M, Neve RL, Deisseroth K, Han MH, Nestler EJ การสูญเสียเฉพาะประเภทเซลล์ของ BDNF การส่งสัญญาณเลียนแบบการควบคุม optogenetic ของรางวัลโคเคน วิทยาศาสตร์. 2010; 330: 385 390- [บทความฟรี PMC] [PubMed]
  32. Loweth JA, Baker LK, Guptaa T, Guillory AM, Vezina P. การยับยั้ง CaMKII ในนิวเคลียส accumbens shell ลดการบริโภคยาบ้าในหนูที่ไวต่อการรับสัมผัส Neurosci Lett 2008; 444: 157 160- [บทความฟรี PMC] [PubMed]
  33. JA Loweth, นักร้อง BF, Baker LK, Wilke G, Inamine H, Bubula N, อเล็กซานเดอร์ JK, Carlezon WA, จูเนียร์, Neve RL, Vezina P. การแสดงออกอย่างรวดเร็วของ alpha-Ca2 + / โปรตีนสงบที่ขึ้นอยู่กับโปรตีน kinase II ปรับปรุงพฤติกรรมการตอบสนองต่อแอมเฟตามีน J Neurosci 2010; 30: 939 949- [บทความฟรี PMC] [PubMed]
  34. Malinow R, Malenka RC การค้ามนุษย์ของ AMPA และพลาสติกซินแนปติก Annu Rev Neurosci 2002; 25: 103 126- [PubMed]
  35. Matsuzaki M, Honkura N, Ellis-Davies GC, Kasai H. พื้นฐานโครงสร้างของความสามารถในระยะยาวในเงี่ยงเดียว dendritic ธรรมชาติ. 2004; 429: 761 766- [PubMed]
  36. Mayford M, Bach ME, Huang YY, Wang L, Hawkins RD, Kandel ER การควบคุมการก่อตัวของหน่วยความจำผ่านการแสดงออกที่ควบคุมของยีน CaMKII วิทยาศาสตร์. 1996; 274: 1678 1683- [PubMed]
  37. เขาวงกตฉัน, Covington HE, 3rd, Dietz DM, LaPlant Q, Renthal W, Russo SJ, ช่าง M, Mouzon E, Neve RL, Haggarty SJ, Ren Y, Sampath SC, Hurd YL, Greengard P, Tarakhovsky A, Schaefer A, Nestler EJ บทบาทที่สำคัญของฮิสโตนเมทิลtransferase G9a ในพลาสติกที่เกิดจากโคเคน วิทยาศาสตร์. 2010; 327: 213 216- [บทความฟรี PMC] [PubMed]
  38. McClung CA, Nestler EJ ระเบียบการแสดงออกของยีนและรางวัลโคเคนโดย CREB และ DeltaFosB Nat Neurosci 2003; 6: 1208 1215- [PubMed]
  39. Nestler EJ ทบทวน กลไกการติดยาเสพติด: บทบาทของ DeltaFosB Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 2008; 363: 3245 3255- [บทความฟรี PMC] [PubMed]
  40. Nye HE, Hope BT, Kelz MB, Iadarola M, Nestler EJ การศึกษาทางเภสัชวิทยาของกฎระเบียบของการเหนี่ยวนำแอนติเจนที่เกี่ยวข้องกับ FOS เรื้อรังโดยโคเคนใน striatum และนิวเคลียส accumbens J Pharmacol Exp Ther. 1995; 275: 1671 1680- [PubMed]
  41. Okamoto K, Bosch M, Hayashi Y. บทบาทของ CaMKII และ F-actin ในพลาสติกที่มีโครงสร้างของกระดูกสันหลัง dendritic: โมเลกุลที่มีศักยภาพของแท็ก synaptic หรือไม่? สรีรวิทยา (Bethesda) 2009; 24: 357 – 366 [PubMed]
  42. Olausson P, Jentsch JD, Tronson N, Neve RL, Nestler EJ, Taylor JR DeltaFosB ในนิวเคลียส accumbens ควบคุมพฤติกรรมเครื่องมือเสริมแรงจูงใจและแรงจูงใจ J Neurosci 2006; 26: 9196 9204- [PubMed]
  43. Paxinos G, Watson C. สมองหนูในพิกัด stereotaxic 6th Edition อัมสเตอร์ดัม; บอสตัน: Academic Press / Elsevier; 2007
  44. MC Peakman, Colby C, Perrotti LI, Tekumalla P, Carle T, Ulery P, Chao J, Duman C, Steffen C, Monteggia L, อัลเลน MR, หุ้น JL, Duman RS, McNeish JD, Barrot M, ตัวเอง DW, Nestler EJ , Schaeffer E. Inducible, การแสดงออกเฉพาะภูมิภาคของสมองของการกลายพันธุ์เชิงลบที่โดดเด่นของ c-Jun ในหนูดัดแปลงพันธุกรรมลดความไวต่อโคเคน ความต้านทานของสมอง 2003; 970: 73 86- [PubMed]
  45. Penzes P, Cahill ME, Jones KA, Srivastava DP สัญญาณ CaMK และ RacGEF แบบรวมกันจะควบคุมโครงสร้างและฟังก์ชันของ dendritic เทรนด์เซลล์ Biol 2008; 18: 405 413- [PubMed]
  46. Perrotti LI, Hadeishi Y, Ulery PG, Barrot M, Monteggia L, Duman RS, Nestler EJ การเหนี่ยวนำของ deltaFosB ในโครงสร้างสมองที่เกี่ยวข้องกับการให้รางวัลหลังจากความเครียดเรื้อรัง J Neurosci 2004; 24: 10594 10602- [PubMed]
  47. Perrotti LI, ผู้ประกอบ RR, Robison B, Renthal W, Maze I, Yazdani S, Elmore RG, Knapp DJ, Selley DE, Martin BR, Sim-Selley L, Bachtell RK, DW ตนเอง, Nestler EJ รูปแบบที่แตกต่างของการเหนี่ยวนำ DeltaFosB ในสมองโดยยาเสพติด ไซแนปส์ 2008; 62: 358 369- [บทความฟรี PMC] [PubMed]
  48. Pickens CL, Airavaara M, Theberge F, Fanous S, Hope BT, Shaham Y. ชีววิทยาของการฟักตัวของความอยากยา เทรนด์ Neurosci 2011; 34: 411 420- [บทความฟรี PMC] [PubMed]
  49. Pierce RC, EA ด่วน, Reeder DC, Morgan ZR, Kalivas PW ผู้สื่อสารที่มีแคลเซียมเป็นสื่อกลางช่วยปรับการแสดงออกของความไวต่อพฤติกรรมต่อโคเคน J Pharmacol Exp Ther. 1998; 286: 1171 1176- [PubMed]
  50. Quirion R, Robitaille Y, Martial J, Chabot JG, Lemoine P, Pilapil C, Dalpe M. Autoradiography ตัวรับสมองของมนุษย์โดยใช้ส่วนทั้งหมดของซีกโลก: วิธีการทั่วไปที่ช่วยลดสิ่งประดิษฐ์ของเนื้อเยื่อ ไซแนปส์ 1987; 1: 446 454- [PubMed]
  51. Robinson TE, Kolb B. โครงสร้างพลาสติกที่เกี่ยวข้องกับการสัมผัสกับยาเสพติด Neuropharmacology 2004; 47 (Suppl 1): 33 – 46 [PubMed]
  52. Robison AJ, Nestler EJ กลไกการติดยาเสพติดและการถอดรหัส Nat Rev Neurosci 2011; 12: 623 637- [บทความฟรี PMC] [PubMed]
  53. Robison AJ, Bass MA, Jiao Y, MacMillan LB, Carmody LC, Bartlett RK, Colbran RJ การทำงานร่วมกันหลายครั้งของไคเนสโปรตีนที่ขึ้นกับความสงบ / เคลโดดูลินกับโปรตีนความหนาแน่นหลังการสังเคราะห์ NR2B, densin-180, และ alpha-actinin-2 J Biol Chem 2005; 280: 35329 35336- [PubMed]
  54. Ross PL, Huang YN, Marchese JN, Williamson B, Parker K, Hattan S, Khainovski N, Pillai S, Dey S, Daniels S, Purkayastha S, Juhasz P, Martin S, Bartlet-Jones M, เขา F, Jacobson A, Pappin DJ การหาปริมาณโปรตีนแบบมัลติเพล็กซ์ใน Saccharomyces cerevisiae โดยใช้รีเอเจนต์ isobaric แท็กรีเอมีน Mol Cell Proteomics 2004; 3: 1154 1169- [PubMed]
  55. Russo SJ, Dietz DM, Dumitriu D, Morrison JH, Malenka RC, Nestler EJ สิ่งเสพติดแบบซินแนปส์: กลไกของซินแนปติกและความเป็นพลาสติกเชิงโครงสร้างในนิวเคลียส เทรนด์ Neurosci 2010; 33: 267 276- [บทความฟรี PMC] [PubMed]
  56. DW ตนเอง ใน: ตัวรับ Dopamine Neve KA บรรณาธิการ นิวยอร์ก: Humana Press; 2010 pp. 479 – 524
  57. นักร้อง BF, Loweth JA, Neve RL, Vezina P. การแสดงออกของการแสดงออกของโปรตีนเกินขนาดอัลฟาแคลเซียม / ยากล่อมประสาทที่ขึ้นกับโปรตีนไคเนส II ในนิวเคลียส accumbens เปลือกนำไปสู่การ upregulation การทำงานที่ยาวนานของ alpha-amino-3 -methyl-5-isoxazole-propionate receptors: ตัวรับ dopamine type-4 และไคเนสโปรตีน Eur J Neurosci 1; 2010: 31 1243- [บทความฟรี PMC] [PubMed]
  58. Strack S, McNeill RB, Colbran RJ กลไกและการควบคุมของโปรตีนไคเนส / โปรตีนที่ขึ้นกับความสงบของคาโดเนดูลิน II กำหนดเป้าหมายไปยังยูนิตย่อย NR2B ของตัวรับ N-methyl-D-aspartate J Biol Chem 2000; 275: 23798 23806- [PubMed]
  59. Ulery-Reynolds PG, Castillo MA, Vialou V, Russo SJ, Nestler EJ phosphorylation ของ DeltaFosB ไกล่เกลี่ยความมั่นคงในร่างกาย ประสาท 2009; 158: 369 372- [บทความฟรี PMC] [PubMed]
  60. Ulery PG, Nestler EJ ระเบียบของกิจกรรมการถอดรหัส DeltaFosB โดย Ser27 phosphorylation Eur J Neurosci 2007; 25: 224 230- [PubMed]
  61. Ulery PG, Rudenko G, Nestler EJ ระเบียบความมั่นคง DeltaFosB โดย phosphorylation J Neurosci 2006; 26: 5131 5142- [PubMed]
  62. Vialou V และอื่น ๆ DeltaFosB ในวงจรรางวัลสมองไกล่เกลี่ยความยืดหยุ่นต่อความเครียดและการตอบสนองต่อยากล่อมประสาท Nat Neurosci 2010; 13: 745 752- [บทความฟรี PMC] [PubMed]
  63. วัง L, Lv Z, Hu Z, Sheng J, Hui B, Sun J, Ma L. acetylation โคเคนที่เกิดจากโคเคนเรื้อรังและการกระตุ้นการแสดงออกของ CaMKIIalpha ใน accumbens นิวเคลียสมีความสำคัญต่อแรงจูงใจในการเสริมแรงยา Neuropsychopharmacology 3; 2010: 35 913- [บทความฟรี PMC] [PubMed]
  64. Werme M, Messer C, Olson L, Gilden L, Thoren P, Nestler EJ, Brene S. Delta FosB ควบคุมการวิ่งของล้อ J Neurosci 2002; 22: 8133 8138- [PubMed]
  65. Winstanley CA, LaPlant Q, Theobald DE, กรีนทา, Bachtell RK, Perrotti LI, DiLeone RJ, รุสโซ SJ, Garth WJ, DW ส่วนตัว, Nestler EJ DeltaFosB เหนี่ยวนำใน orbitofrontal cortex ไกล่เกลี่ยความอดทนต่อความผิดปกติของความรู้ความเข้าใจโคเคนที่เกิดขึ้น J Neurosci 2007; 27: 10497 10507- [PubMed]
  66. Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchman T, Berton O, Sim-Selley LJ, Dileone RJ, Kumar A, Nestler EJ มีบทบาทสำคัญสำหรับ DeltaFosB ในนิวเคลียส accumbens ในการกระทำมอร์ฟีน Nat Neurosci 2006; 9: 205 211- [PubMed]
  67. Zhang R, Khoo MS, Wu Y, Yang Y, Grueter CE, Ni G, ราคา EE, ​​จูเนียร์, Thiel W, Guatimosim S, เพลง LS, Madu EC, Shah, Vishnivetskaya TA, แอตกินสัน JB, Gurevich VV, Salama G, Lederer WJ, Colbran RJ, Anderson ME Calmodulin kinase II ยับยั้งป้องกันโรคหัวใจโครงสร้าง ชัยนาทเมธา 2005; 11: 409 417- [PubMed]