Proc Natl Acad Sci สหรัฐ A. 2005 กุมภาพันธ์ 1; 102(5):-1737 1742
นามธรรม
โคเคนยาเสพติดเพิ่มระดับ dopamine synaptic ใน striatum โดยการปิดกั้น reuptake ต้องใจที่ขั้วซอน ไคเนสพึ่งพา Cyclin 5 (Cdk5) และ p35 ของ activator ซึ่งเป็นโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับฟอสโฟรีเลชั่นของสารตั้งต้นในเซลล์ประสาทหลังการติดเชื้อพบว่ามีการควบคุมขึ้นหลังจากการสัมผัสโคเคนเรื้อรัง ในการตรวจสอบผลกระทบของการเหนี่ยวนำ Cdk5 และ p35 เพิ่มเติมเกี่ยวกับการส่งสัญญาณโดปามีน striatal เราได้สร้างสายเมาส์ transgenic mouse สองสายที่ Cdk5 หรือ p35 ถูกแสดงออกมาโดยเฉพาะในเซลล์ประสาท เรารายงานที่นี่ซึ่งเพิ่มกิจกรรม Cdk5 ซึ่งเป็นผลมาจาก p35 แต่ไม่ใช่การแสดงออกมากเกินไปของ Cdk5 นำไปสู่การลดทอนสัญญาณ dopamine ที่มีโคเคนเป็นสื่อกลาง การเพิ่มฟอสโฟรีเลชั่นที่เป็นสื่อกลางของ Cdk5 ที่เพิ่มขึ้นของโดปามีนและฟอสโฟโปรตีนที่ควบคุมด้วย cAMP, มวลโมเลกุล 32 kDa (DARPP-32) ที่ Thr-75, มาพร้อมกับการลดลงของฟอสโฟ เพิ่ม phosphorylation ที่เป็นสื่อกลาง Cdk32 ที่เพิ่มขึ้นของ kinase kinase 34 ที่ควบคุมสัญญาณนอกเซลล์ที่ Thr-5 นั้นมาพร้อมกับการกระตุ้นการทำงานของ kinase ที่ควบคุมสัญญาณ kinase 1 / 286 ที่ลดลง ผลกระทบเหล่านี้มีส่วนทำให้การลดลงของการเกิดฟอสโฟรีเลชั่นของโคเคนที่เกิดจากโปรตีนที่จับกับองค์ประกอบการตอบสนองของแคมป์รวมถึงการเหนี่ยวนำ c-fos ใน striatum ที่น้อยลง ผลลัพธ์เหล่านี้สนับสนุนแนวคิดที่ว่ากิจกรรม Cdk1 มีส่วนร่วมในการแสดงออกของยีนที่เปลี่ยนแปลงหลังจากการสัมผัสโคเคนเรื้อรังและดังนั้นจึงส่งผลต่อการเปลี่ยนแปลงที่ยาวนานในการทำงานของเซลล์ประสาทที่เกี่ยวข้องกับการติดโคเคน
โคเคนเพิ่มระดับโดปามีน synaptic ในการแสดงออกของยีน striatum และเปลี่ยนแปลงในเซลล์ประสาท dopaminoceptive โดยการเปิดใช้งานเซลล์ทางเดินของเซลล์ที่เผยแพร่สัญญาณเริ่มต้นจาก dopamine D1 รับไปยังนิวเคลียส (1) การได้รับโคเคนแบบเรื้อรังจะควบคุมปัจจัยการถอดความหลายประการส่งผลให้เกิดการเปลี่ยนแปลงในการแสดงออกของยีนในระยะยาวซึ่งคาดว่าจะมีผลต่อการปรับตัวของเซลล์ประสาทในการติดโคเคน (2) ΔFosBระบุว่าเป็นปัจจัยการถอดความ (3) ได้รับการแสดงเพื่อเพิ่มการตอบสนองเชิงพฤติกรรมของสัตว์สู่โคเคน (4, 5) ดังนั้นการระบุยีนเป้าหมายที่ควบคุมโดยการเหนี่ยวนำΔFosBคาดว่าจะช่วยให้มีความเข้าใจมากขึ้นเกี่ยวกับกลไกระดับโมเลกุลเกี่ยวกับการติดโคเคนโคเคน เมื่อเร็ว ๆ นี้การรักษาสัตว์ที่มีโคเคนอย่างต่อเนื่องแสดงให้เห็นถึงการควบคุมการแสดงออกของไคเนส 5 (Cdk5) และ c35 ที่กระตุ้นการทำงานของไซโคลที่ขึ้นกับไซโคล6, 7).
Cdk5 เป็นสมาชิกของตระกูล Cdk ของ kinases serine / threonine แตกต่างจาก Cdks อื่น ๆ ที่เป็นผู้ควบคุมหลักของความก้าวหน้าของวัฏจักรของเซลล์ Cdk5 ส่วนใหญ่เกี่ยวข้องกับฟอสโฟรีเลชั่นของสารตั้งต้นในเซลล์ประสาทที่อ่อนตัว (8) ความจำเพาะของเซลล์ประสาทของกิจกรรม Cdk5 เกิดขึ้นได้จากการเชื่อมโยงกับ activators ไม่ว่าจะเป็น p35 หรือ p39 ซึ่งแสดงออกมาเป็นส่วนใหญ่ในเซลล์ประสาท postmitotic (8) นอกจากบทบาทสำคัญของ Cdk5 ในการพัฒนาสมอง (9, 10), ผมt ยังมีส่วนเกี่ยวข้องในการส่งผ่านสาร dopaminergic ในสมองหลังคลอด11, 12) การยับยั้งกิจกรรม Cdk5 ส่งผลให้มีการเพิ่มโดปามีนใน striatum ซึ่งบ่งชี้ว่าการทำงานแบบ presynaptic ของ Cdk5 เป็นตัวควบคุมเชิงลบของการปลดปล่อยโดปามีน (11) นอกจากนี้ Cdk5 ยังปรับประสิทธิภาพของการส่งสัญญาณโดปามีนโพสต์แน็ปทิฟิกโดยฟอสโฟรีเลชั่นโดปามีน - และฟอสโฟ - โปรตีนในการยับยั้งการเปลี่ยนแปลงของแคมป์ (Thrarp-32) (12).
ข้อสังเกตเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า Cdk5 และ p35 เป็นสารควบคุมขั้นปลายของการกระตุ้นการส่งสัญญาณโดปามีนต่อเนื่องเป็นระยะเวลานานหลังจากได้รับโคเคนเรื้อรังและจากการติดโคเคน ในการพูดถึงบทบาทของ Cdk5 เพิ่มเติมเกี่ยวกับการส่งสัญญาณ dopamine แบบ striatal เราได้สร้างสายเมาส์ transgenic สองสายโดยที่ Cdk5 หรือ p35 นั้นถูกแสดงออกมาเป็นพิเศษในเซลล์ประสาทภายใต้การควบคุมของโปรโมเตอร์ p35 ผลการวิจัยของเราระบุว่ากิจกรรม Cdk5 นั้นได้รับการควบคุมด้วยโปรตีน p35 ในระดับที่เพิ่มขึ้น แต่ไม่ใช่โปรตีน Cdk5 บ่งบอกว่าระดับของโปรตีน p35 นั้น จำกัด อัตราสำหรับกิจกรรม Cdk5 เราให้บริการที่นี่ ในร่างกาย หลักฐานที่เพิ่มกิจกรรม Cdk5 ซึ่งเป็นผลมาจากการแสดงออกของ p35 ที่มากเกินไปนำไปสู่การลดทอนของ dopamine ที่มีโคเคนเป็นสื่อกลางส่งสัญญาณไปยังนิวเคลียสผ่านการยับยั้งของ PKA และลดระดับสัญญาณ kinase (ERK)
วัสดุและวิธีการ
แอนติบอดี โพลีโคลนอลแอนติบอดีต่อ Cdk5 (C-8) และ p35 (C-19) ถูกซื้อจากซานตาครูซเทคโนโลยีชีวภาพ แอนติบอดีที่พึ่งพาฟอสโฟรีเลชั่นและ - อิสระต่อ ERK kinase (MEK) 1 / 2, ERK1 / 2 และโปรตีนจับยึดองค์ประกอบการตอบสนองที่แคมป์ (CREB) ได้มาจากเทคโนโลยีการส่งสัญญาณของเซลล์ (Beverly, MA) แอนติบอดี้ต่อ phospho-Thr-34 DARPP 32 (13), phospho-Thr-75 DARPP-32 (12), ทั้งหมด DARPP-32 (12) และ c-fos (14) ถูกนำมาใช้ตามที่อธิบายไว้ แอนติบอดีต่อแอคตินนั้นซื้อมาจากซิกมา
สัตว์ทดลอง ก่อนหน้านี้เราโคลนยีน p35 ของเมาส์ Cdk5r1ซึ่งเข้ารหัสโปรตีน p35 และกำหนดโครงสร้างจีโนม (15) ในการสร้างเมาส์ดัดแปรพันธุกรรมด้วยการแสดงออกของเส้นประสาทส่วนเกินของ p35 (Tgp35) 6-kb EcoRI-Ecoแฟรกเมนต์ RI ที่มีส่วนโปรโมชัน 1.2-kb ถูก subcloned ลงในพลาสมิด pGEM9Z (-) และแท็ก 45-bp ที่ได้จาก SV40 ถูกแทรกลงใน Kpnฉันลงเว็บไซต์ของโพลี (A+) สัญญาณ (มะเดื่อ. 1A) แท็กที่มี Speฉันหาแหล่งพันธุกรรมของสัตว์ ชิ้นส่วน 6-kb ถูกตัดออกจากพลาสมิดและทำให้บริสุทธิ์แล้วตามด้วยการฉีดนิวเคลียร์ของยีนเพื่อสร้างหนูพันธุ์ เพื่อตรวจสอบโปรไฟล์การแสดงออกของยีนที่อยู่ภายใต้การควบคุมของ 1.2-kb p35 ก่อการ ในร่างกาย, เมาส์แปลงพันธุกรรมคู่ (Tgp35; p35 - / -) ถูกสร้างขึ้นโดยใช้กลยุทธ์การผสมพันธุ์สองขั้นตอนซึ่งเมาส์ Tgp35 ถูกสร้างใหม่ในพื้นหลัง p35-null แบบภายนอก แบบจำลองเมาส์อื่น ๆ ที่ใช้ในการศึกษานี้รวมถึง p35 +/–, p35 - / -, Cdk5 +/– และเมาส์ดัดแปรพันธุกรรมที่มีการแสดงออกของเส้นประสาทของ Cdk5 (TgCdk5) (9, 16, 17) จีโนไทป์ของหนูเหล่านี้ถูกกำหนดโดยทำการวิเคราะห์ทั้งแบบ Southern blot analysis หรือ PCR บน DNA จีโนมที่แยกได้จากการตัดชิ้นเนื้อหาง หนูถูกวางไว้ใต้แสง 12-h / 12-h วงจรมืด การดูแลทั้งหมดได้รับตามแนวทางของสถาบันสุขภาพแห่งชาติเกี่ยวกับการดูแลและการใช้ห้องปฏิบัติการและสัตว์ทดลอง
การวิเคราะห์บล็อตภาคใต้ จีโนมดีเอ็นเอสกัดจากการตัดชิ้นเนื้อหางถูกย่อยด้วย EcoRI และ Speฉันอิเลคโตรเรสบนเจลอะกาโรส 0.9% และถ่ายโอนไปยังเมมเบรนไนล่อน เมมเบรนถูกผสมกับแบบสุ่มเตรียมไว้ 32โพรบ P-label ที่ 42 ° C ในชั่วข้ามคืน สอบสวน 485-bp สำหรับ genotyping ของ p35 ที่น่าพิศวง (p35 - / -) และ Tgp35 หนูถูกสร้างขึ้นโดยวิธี PCR โดยใช้ไพรเมอร์ต่อไปนี้: 5'-ACATCCTGCTGCCACGGTGAC-3 และ 5'-CCACTGTAAAAGCAACAAGA-3 ' เมมเบรนที่ถูกไฮบริดถูกล้างสองครั้งใน 2 × SSC / 0.1% SDS ที่ 42 ° C สำหรับ 10 นาทีและสองครั้งใน 0.1 × SSC / 0.1% SDS ที่ 65 ° C สำหรับ 20 นาทีและสัมผัสกับฟิล์ม x-ray
ยารักษาโรค โคเคน (ซิกมา) ถูกละลายในน้ำเกลือที่ปราศจากเชื้อ สัตว์ถูกฉีดยาด้วยโคเคน (15 mg / kg) หรือปริมาณน้ำเกลือที่เท่ากันเมื่ออายุ 3 เดือนและถูกฆ่าโดยการตัดหัวที่จุดเวลาต่าง ๆ (15, 30, 60, และ 120 นาที) หลังจากการฉีด สมองถูกกำจัดอย่างรวดเร็วและถูกแช่แข็งใน PBS ที่เย็นจัด จากนั้นสไตรค์ก็ถูกผ่าออกและถูกวิเคราะห์โดย blot เหนือหรือตะวันตก สำหรับการวิเคราะห์ทางอิมมูโนวิทยาทางเคมีพบว่าส่วนที่เกิดจากส่วนที่ได้จากหนู 2 ชั่วโมงหลังฉีด
การวิเคราะห์ภาคเหนือ Total RNA ถูกสกัดจาก striata ด้วย TRIzol reagent (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) และอยู่ภายใต้การวิเคราะห์ blot ภาคเหนือตามที่อธิบายไว้ (18) สำหรับการตรวจจับ c-fos mRNA ใช้ชิ้นส่วน 189-bp ของเมาส์ c-fos cDNA ถูกใช้เป็นโพรบตามที่อธิบายไว้ (19) ระดับของ c-fos mRNA นั้นถูกวัดปริมาณโดยการวัดความหนาแน่นเชิงแสงของย่านความถี่ที่เฉพาะเจาะจงโดยใช้ระบบการวิเคราะห์ภาพด้วยซอฟต์แวร์ภาพ nih รุ่น 1.62
การวิเคราะห์ Western Blot กระดาษทิชชู่ striatal ถูก sonicated ใน 1% SDS และต้มเป็นเวลา 10 นาที ความเข้มข้นของโปรตีนในแต่ละตัวอย่างถูกกำหนดโดย BCA protein assay (Pierce) ปริมาณโปรตีนที่เท่ากันถูกแยกด้วย SDS / PAGE ก่อนที่จะถูกถ่ายโอนไปยังเยื่อหุ้มไนโตรเซลลูโลส เยื่อหุ้มถูกบล็อกใน 1 × PBS ที่มี 5% นมพร่องมันเนยและ 0.05% Tween 20 และบ่มด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิค้างคืนที่ 4 ° C การบ่มด้วยแอนติบอดี peroxidase-conjugated anti-mouse หรือ rabbit IgG (Sigma) ได้ดำเนินการที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 60 นาที สัญญาณถูกตรวจพบโดย chemiluminescence ที่ปรับปรุงแล้ว (เพียร์ซ) และความหนาแน่นเชิงแสงของแถบถูกวัดปริมาณตามที่อธิบายไว้ข้างต้น
Cdk5 Kinase Assay lysates striatal ถูกเตรียมด้วย lysis buffer ซึ่งประกอบด้วย 50 mM Tris · HCl, pH 7.4 / 50 mMaNN / 5 mM EDTA / 1MMTTT / 100MMTTX ml leupeptin / phosphatase inhibitors (สารยับยั้ง phosphatase I และ II, ซิกมา) ไลซีนถูกกระตุ้นด้วยแอนติบอดีต่อต้าน Cdk1 (C-1) หรือแอนติบอดี p1 (C-1) Cdk5 immunoprecipitates ถูกเตรียมโดยการฟักตัวของ 8 μlของ lysate (ตรงกับ 35 μgของโปรตีนใน AN) กับแอนติบอดีต่อต้าน Cdk19 (5 μg) ในเวลากลางคืนที่ 300 ° C สารละลายในบัฟเฟอร์ lysis; Santa Cruz เทคโนโลยีชีวภาพ) สำหรับ 300 h ที่ 5 ° C สำหรับการเตรียม p3 immunoprecipitates นั้น 4 μlของ lysate (ตรงกับ 25 mg ของโปรตีน) ถูกบ่มด้วยแอนติบอดีต่อต้าน p50 (3 μg) ตามที่อธิบายไว้ข้างต้น immunoprecipitates ถูกล้างสองครั้งด้วยบัฟเฟอร์ lysis และสองครั้งด้วย kinase buffer ประกอบด้วย 4 mM Tris · HCl, pH 35 / 500 mM MgCl2/ 1 mM EDTA / 1 mM EGTA / 1 mM DTT ซึ่งถูกระงับอีกครั้งใน 60 μlของบัฟเฟอร์ kinase กิจกรรม Kinase วัดโดยใช้ฮิสโตน H1 เป็นสารตั้งต้น (18).
immunohistochemistry หนูถูกดมยาสลบโดยการฉีด ip ของ avertin (250 mg / kg, Fluka) และ perfused transcardially ด้วย 0.1 M โซเดียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ pH 7.4 ตามด้วย Streck Laboratories Fixative (Streck Laboratories, La Vista, NE) สมองที่ชำแหละได้รับการแก้ไขเพิ่มเติมในตรึงเดิมค้างคืนที่ 37 ° C จากนั้นสมองจะถูกฝังในพาราฟินตัดเป็นส่วนที่มีความหนา 5-μm-coronal และอยู่ภายใต้ immunohistochemistry โดยใช้เทคนิคที่ซับซ้อน avidin-biotin-peroxidase (Vector Laboratories) ด้วย diaminobenzidine เป็นสารตั้งต้น ส่วนที่ถูกบ่มด้วยโพลีโคลนอลแอนติบอดีบริสุทธิ์ต่อต้าน c-fos ค้างคืนที่ 4 ° C ประเมินความจำเพาะของการย้อมสีโดยการละเว้นแอนติบอดีปฐมภูมิ
ผลสอบ
การสร้างหนูดัดแปลงพันธุกรรมที่มีการแสดงออกของเส้นประสาทส่วนเกินของ p35 ยีนที่ใช้เพื่อให้เกิดการแสดงออกของเซลล์ประสาทที่เพิ่มขึ้นของ p35 ประกอบด้วยส่วน 6-kb ของยีนเมาส์ p35 โคลนที่ประกอบด้วย 1.2-kb ก่อการและลำดับการเข้ารหัสทั้งหมดของ p35 (มะเดื่อ. 1 A) จีโนไทป์ของหนูถูกกำหนดโดยการวิเคราะห์บล็อตใต้โดยใช้โพรบที่ออกแบบมาเพื่อแยกแยะความแตกต่างของ p35 - / - และ Tgp35 ของหนูจากหนูป่า (มะเดื่อ. 1 A และ B). ในการตรวจสอบการแสดงออกของยีนภายใต้การควบคุมของโปรโมเตอร์ 1.2-kb p35 เราได้สร้างหนูดัดแปรพันธุกรรมสองครั้ง (Tgp35; p35 - / -) ซึ่งการแสดงออกของ p35 ถูกผลักดันจากยีนเท่านั้น การแสดงออกของ p35 ใน Tgp35; p35 - / - หนูถูกพบในสมองเท่านั้น (มะเดื่อ. 1C) ซึ่งรูปแบบการแสดงออกของพื้นที่มีความคล้ายคลึงกับของหนูป่าชนิด (มะเดื่อ. 1D) การขาด p35 นั้นแสดงให้เห็นว่ามีโครงสร้างชั้นที่ผิดปกติในเปลือกสมองและฮิบโปแคมตัสของหนู (10) อย่างไรก็ตาม Tgp35; p35 - / - หนูแสดงการช่วยเหลือที่สมบูรณ์ของ p35 - / - ฟีโนไทป์ของสมอง (มะเดื่อ. 1E) ข้อมูลเหล่านี้แสดงให้เห็นว่า 1.2-kb p35 ก่อการก่อการควบคุมการแสดงออกของยีนที่มีโปรไฟล์การแสดงออกที่คล้ายกันกับที่ของ p35 จากยีน p35 ภายนอก
ระดับโปรตีน p35 เป็นการ จำกัด อัตราสำหรับการควบคุมกิจกรรม Cdk5 ที่สูงขึ้น เราตรวจสอบผลกระทบปริมาณยีนของยีนที่เข้ารหัส p35 และ Cdk5 ต่อการแสดงออกของโปรตีนในสารสกัดจากต้นกำเนิดในช่วงอายุ p35 - / -, p35 +/–, ชนิดป่า, Tgp35, Cdk5 +/–, และ TgCdk5 เดือน ระดับของโปรตีน p3 และ Cdk35 มีความสัมพันธ์กับปริมาณยีนตามลำดับ (มะเดื่อ. 2 A และ B) หนู Tgp35 แสดงให้เห็นว่าระดับโปรตีน p1.6 เพิ่มขึ้น X35 เท่าเมื่อเทียบกับหนูป่าชนิดในขณะที่ระดับโปรตีน Cdk5 ไม่ได้รับผลกระทบจากโปรตีน p35 ระดับต่างๆ หนู TgCdk5 แสดงให้เห็นว่าระดับโปรตีน Cdk1.9 เพิ่มขึ้น≈5เท่าเมื่อเปรียบเทียบกับหนูป่าชนิดในขณะที่ระดับโปรตีน P35 ไม่ได้รับผลกระทบจากระดับ Cdk5 โปรตีนที่แตกต่างกัน เพื่อตรวจสอบผลกระทบของโปรตีน p35 ในปริมาณที่แตกต่างกันต่อกิจกรรม Cdk5, Cdk5 นั้นได้รับการกระตุ้นด้วยภูมิคุ้มกันจากสารสกัดจากต้นกำเนิดด้วยแอนติบอดีต่อต้าน Cdk5 และไคเนส ในการตรวจสอบผลกระทบของปริมาณ Cdk5 โปรตีนที่แตกต่างกันต่อกิจกรรมไคเนส p35 ได้รับการกระตุ้นด้วยภูมิคุ้มกันจากสารสกัดจากต้นกำเนิดที่มีแอนติบอดีต่อต้าน p35 และวัดกิจกรรมไคเนส กิจกรรม Cdk5 มีความสัมพันธ์ที่ดีกับระดับของโปรตีน p35 แต่ไม่ใช่กับระดับของโปรตีน Cdk5 (มะเดื่อ. 2 C และ D) ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่าปริมาณของโปรตีน p35 เป็นปัจจัย จำกัด อัตราสำหรับกิจกรรม Cdk5 ดังนั้นเราจึงใช้หนู Tgp35 เพื่อตรวจสอบผลกระทบของกิจกรรม Cdk5 ที่เพิ่มขึ้นต่อการส่งสัญญาณโดปามีน striatal
Phosphorylation ที่เกิดจากโคเคนของ DARPP-32 ที่ Thr-34 ถูกลดทอนลงในหนู Tgp35 ฟังก์ชั่นของ DARPP-32 ขึ้นอยู่กับสถานะฟอสโฟรีเลชั่นในหลาย ๆ ไซต์ (20) PKA phosphorylates DARPP-32 ที่ Thr-34 ในขณะที่ Cdk5 phosphorylates DARPP-32 ที่ Thr-75 ดังนั้นเราจึงตรวจสอบสถานะฟอสโฟรีเลชั่นของ DARPP-32 ในสารสกัดจาก striatal จาก wild-type และหนู Tgp35 ระดับของ phospho-Thr-75 DARPP-32 นั้นสูงกว่าในหนู Tgp35 (มะเดื่อ. 3A; 1.6 ± 0.2- พับเหนือค่าของเมาส์ชนิดไวด์สกรีน) ต่อไปเราจะประเมินผลของกิจกรรม Cdk5 ที่เพิ่มขึ้นต่อการส่งสัญญาณโดปามีนแบบ striatal เราตรวจสอบการกระตุ้นการกระตุ้นด้วยโคเคนที่เกิดจากโคเคนในหนู Tgp35 โดยการวิเคราะห์สถานะฟอสโฟรีเลชั่นของ DARPP-32 ที่ Thr-34 ระดับของ phospho-Thr-34 DARPP-32 เพิ่มขึ้นในหนูป่าชนิด 15 ขั้นต่ำหลังจากการฉีดโคเคน (มะเดื่อ. 3B; 1.8 ± 0.2- พับเหนือระดับฐาน) อย่างไรก็ตามผลกระทบของโคเคนต่อ Thr-34 phosphorylation ของ DARPP-32 นั้นถูกลดทอนลงในหนู Tgp35 (1.2 ± 0.3-fold เหนือระดับฐาน) ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าการเพิ่มขึ้นของกิจกรรม Cdk5 ลดการกระตุ้นการกระตุ้นด้วยโคเคนที่เกิดจากโคเคนซึ่งอาจเกิดจากการใช้ฟอสฟอรัส DARPP-32 ที่ Thr-75 (6, 12) นอกจากนี้ยังเป็นไปได้ว่าการเพิ่มขึ้นของกิจกรรม presynaptic Cdk5 นำไปสู่การลดลงของการปลดปล่อยโดปามีนและสิ่งนี้มีส่วนช่วยลดผลกระทบของโคเคน โดยเฉพาะการฉีดโคเคนเพียงครั้งเดียวไม่ส่งผลต่อระดับของโปรตีน p35 และ Cdk5 รวมถึงกิจกรรมไคเนส (มะเดื่อ. 3 C และ D) นี่คือตรงกันข้ามกับการศึกษาก่อนหน้านี้ที่แสดงให้เห็นถึงการสัมผัสโคเคนเรื้อรังเพื่อควบคุมการแสดงออกของ p35 และ Cdk5 (6).
การควบคุมกิจกรรม Cdk5 ลดการเปิดใช้งานการกระตุ้นโคเคนจาก ERK1 / 2 หลักฐานล่าสุดบ่งชี้ว่าการเปิดใช้งานตัวรับโดปามีนใน striatum นั้นยังเปิดใช้งานการส่งสัญญาณอื่น ๆ รวมถึงทางเดิน ERK (21, 22) ซึ่งมีบทบาทสำคัญในการตอบสนองเชิงพฤติกรรมต่อโคเคน (23) ดังนั้นเราจึงตรวจสอบว่ากิจกรรม Cdk5 อาจส่งผลต่อการเปิดใช้งานเส้นทางโคเคนที่เกิดจากโคเคนหรือไม่ การกระตุ้นการทำงานของทางเดิน ERK เกิดขึ้นหลังจากการฉีดโคเคนในสารสกัดจาก striatal จากหนูป่าซึ่งเห็นได้จากการเพิ่ม phosphorylation ของ MEK1 / 2 ที่ Ser-217 และ Ser-221 (1.5 ± 0.2-fold เหนือระดับฐาน) และ ERK1 / 2 ที่ Thr-202 และ Tyr-204 (ฟอสฟอรัส ERK2: 1.5 ± 0.2- พับเหนือระดับฐาน) (มะเดื่อ. 4 A และ B) อย่างไรก็ตามการกระตุ้นโคเคนของ MEK1 / 2 (1.2 ± 0.2-fold เหนือระดับ basal) และ ERK1 / 2 (ERK2 phosphorylation: 1.2 ± 0.2-fold เหนือระดับฐาน)มะเดื่อ. 4 A และ B) นอกจากนี้ระดับพื้นฐานของ phospho-ERK1 / 2 นั้นต่ำกว่าในหนู Tgp35 (0.8 ± 0.2- พับต่ำกว่าค่าของหนูป่าชนิด) ในขณะที่แนวโน้มนี้ไม่มีนัยสำคัญทางสถิติ ผลลัพธ์หลังนี้อาจเกิดจากการขึ้นรูปฟอสโฟรีเลชั่นของ Cdk5 ที่ MEK1 ที่ Thr-286 ซึ่งส่งผลให้กิจกรรมของตัวเร่งปฏิกิริยาลดลง (24) เพื่อประเมินความเป็นไปได้นี้เราได้ทำการตรวจสอบสถานะ phosphorylation ของ MEK1 ที่ Thr-286 และพบว่าระดับที่สูงขึ้นของ phospho-Thr-286 MEK1 นั้นมีอยู่ในสารสกัดจากต้นกำเนิดจากหนู Tgp35 (มะเดื่อ. 4C; 1.3 ± 0.1- พับเหนือค่าของเมาส์ชนิดไวด์สกรีน) นอกจากนี้สถานะฟอสโฟรีเลชั่นของ MEK1 ที่ Thr-286 ไม่ได้ถูกเปลี่ยนแปลงโดยการฉีดโคเคนเพียงครั้งเดียวซึ่งสอดคล้องกับการค้นพบว่ากิจกรรม Cdk5 ไม่ได้รับผลกระทบจากการรักษา (มะเดื่อ. 3D).
การแพร่กระจายของโดปามีนส่งสัญญาณไปยังนิวเคลียสถูกลดทอนโดยกิจกรรม Cdk5 ที่เพิ่มขึ้น การกระตุ้นด้วยโคเคนของการส่งสัญญาณลดหลั่นหลาย ๆ อันที่เกี่ยวข้องกับ PKA และ ERK นำไปสู่การกระตุ้นการถอดรหัสปัจจัย CREB ในนิวเคลียสผ่านฟอสโฟรีเลชั่นที่ Ser-13322, 25) ในการตรวจสอบว่าผลการยับยั้ง Cdk5-mediated ในการกระตุ้นรังไข่ของ PKA และ ERK อาจรวมตัวกันใน CREB phosphorylation ในนิวเคลียสหรือไม่เราตรวจสอบสถานะ phosphorylation ของ CREB ที่ Ser-133 ในสารสกัดจากสัตว์ป่าชนิดและ Tgp35 ระดับพื้นฐานของ phospho-CREB นั้นต่ำกว่าในหนู Tgp35 (0.7 ± 0.1 เท่าของค่าของหนูป่าชนิด) (มะเดื่อ. 5) ในการตอบสนองต่อการฉีดโคเคนระดับของ phospho-CREB จะเพิ่มขึ้นใน striatum ของหนูป่าชนิด (1.5 ± 0.1-fold เหนือระดับฐาน) แต่การตอบสนองต่อโคเคนนี้ลดลงในหนู Tgp35 (1.2 ± 0.1 ± XNUMX- XNUMX- พับเหนือระดับฐาน) (มะเดื่อ. 5).
การสร้างฟอสฟอรัสของ CREB ที่ Ser-133 ช่วยเพิ่มกิจกรรมการถอดรหัสผ่านองค์ประกอบการตอบสนองค่ายในพื้นที่ก่อการของยีนบางชนิดรวมถึงยีน c-fos (26) ดังนั้นเราจึงตรวจสอบการเหนี่ยวนำของ c-fos ใน striatum ของหนูป่าและหนู Tgp35 หลังฉีดโคเคน ในหนูป่าชนิดระดับของ c-fos mRNA เพิ่มขึ้นเป็นค่าสูงสุด (1.8 ± 0.2- พับเหนือระดับฐาน) 30 นาทีหลังจากการฉีดโคเคนแล้วกลับสู่ระดับพื้นฐานโดย 120 นาทีหลังจากการฉีด (มะเดื่อ. 6 A และ B) อย่างไรก็ตามระดับของ c-fos mRNA นั้นต่ำกว่า T30% ในหนู Tgp35 มากกว่าหนูที่อยู่ในป่าจนถึง 30 นาทีหลังจากฉีด (มะเดื่อ. 6 A และ B) การเหนี่ยวนำที่น้อยลงของ c-fos ในหนู Tgp35 นั้นได้รับการยืนยันเพิ่มเติมโดย immunohistochemistry (มะเดื่อ. 6 C-F) การบริหารโคเคนเพิ่ม c-fos immunoreactivity อย่างมากในส่วน dorsomedial – dorsocentral ของ striatum และอ่อนแอในส่วนด้านข้างทั้งในหนูที่เป็น wild-type และ Tgp35 อย่างไรก็ตามการเพิ่มขึ้นของโคเคนที่เกิดขึ้นในจำนวนของเซลล์ c-fos-immunopositive ถูกลดทอนอย่างเห็นได้ชัดใน striatum ของหนู Tgp35 (มะเดื่อ. 6G) ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าการเสริมโคปาเฟนของโดปามีนที่ส่งสัญญาณไปยังนิวเคลียสนั้นถูกยับยั้งในหนู Tgp35 ซึ่งเป็นผลจากกิจกรรม Cdk5 ที่เพิ่มขึ้น
การสนทนา
Cdk5 และ p35 ของ activator ถูกระบุว่าเป็นยีนเป้าหมายที่ถูกควบคุมโดยการสัมผัสโคเคนเรื้อรัง (6). เรารายงานหลักฐานที่แสดงให้เห็นว่าการเพิ่มกิจกรรม Cdk5 ซึ่งเป็นผลมาจากการควบคุม p35 มากกว่าการควบคุมแบบ Cdk5 นำไปสู่การลดทอนสัญญาณ dopamine ที่มีโคเคนเป็นโคเคนในเซลล์ประสาทส่วนบน เพื่อตรวจสอบผลที่ตามมาของการแสดงออกที่ควบคุมอย่างเข้มงวดของ Cdk5 หรือ p35 เกี่ยวกับการส่งสัญญาณโดปามีน striatal, เมาส์สองสายพันธุ์ดัดแปรพันธุกรรม, หนู TgCdk5 และ Tgp35 เราพบว่ากิจกรรม Cdk5 ได้รับการควบคุมในสัดส่วนที่เพิ่มขึ้นของระดับโปรตีน p35 แต่ไม่ได้รับผลกระทบจากระดับโปรตีน Cdk5 ที่เพิ่มขึ้น รายงานก่อนหน้านี้ของเรายังแสดงให้เห็นว่ากิจกรรม Cdk5 ในสมองเมาส์ TgCdk5 นั้นต่ำกว่าสมองเมาส์ชนิดป่าเมื่อกิจกรรมถูกวัดโดยใช้ Cdk5 immunoprecipitates (17) แนะนำว่า Cdk5 การแสดงออกมากเกินไปทำให้ระดับของ monomeric Cdk5 เพิ่มขึ้นหากระดับ p35 ไม่เพิ่มขึ้น ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่าระดับของโปรตีน p35 เป็นปัจจัย จำกัด อัตราสำหรับกิจกรรม Cdk5
หนู Tgp35 แสดงการเหนี่ยวนำน้อยลงของทั้ง CREB phosphorylation และ c-fos ใน striatum หลังจากการฉีดโคเคนแบบเฉียบพลันแสดงให้เห็นว่าการตอบสนองแบบโคตรของโคเคนถูกยับยั้งโดยกิจกรรม Cdk5 ที่เพิ่มขึ้น การลดทอนของสัญญาณโดปามีนที่ใช้โคเคนเป็นสื่อกลางในหนู Tgp35 นั้นสามารถทำได้โดยการยับยั้ง Cdk5 ที่เป็นสื่อกลางของการส่งสัญญาณลดหลั่นหลายอันซึ่งเกี่ยวข้องกับ DARPP-32, PKA และ ERK การบริหารโคเคนเพิ่มขึ้นการตกตะกอน PKA ของ DARPP-32 ที่ Thr-34 ในหนูป่าชนิดในขณะที่การตอบสนองนี้ถูกลดทอนในหนู Tgp35 PKA phosphorylation ของ DARPP-32 ที่ Thr-34 ได้ถูกแสดงเพื่อยับยั้งการทำงานของโปรตีนฟอสฟาเทส 1 (PP1), เอนไซม์ที่รับผิดชอบการตกตะกอนของ Ser-133 ของ CREB (27) ดังนั้นกิจกรรม PP1 จะไม่ถูกทำให้เป็นศัตรูกันผ่านทางเดิน DARPP-32 / PP1 ในหนู Tgp35
การกระตุ้นโคเคนของ ERK1 / 2 นั้นได้รับการลดทอนลงในหนู Tgp35 มีกลไกที่แตกต่างกันหลายประการซึ่ง Cdk5 สามารถยับยั้งการกระตุ้นโคเคนที่เกิดจาก ERK1 / 2 ขั้นแรกการใช้ phosphorylation ที่ขึ้นกับ Cdk5 ของ DARPP-32 ที่ Thr-75 สามารถยับยั้ง PKA ซึ่งนำไปสู่การยับยั้งการเปิดใช้งาน MEK1 / 2 ที่ตามมาของ PKA การศึกษาเมื่อเร็ว ๆ นี้พบว่า phosphorylation ของ DARPP-1 ที่ Thr-2 นั้นเป็นสิ่งจำเป็นสำหรับการกระตุ้นโคเคนซึ่งเป็นสื่อกลางของ ERK32 / 34 โดยวิถีหลายทางที่เกี่ยวข้องกับการควบคุมโดยอ้อมของ MEK activation รวมถึงกฎระเบียบของ phosphatase phosphatase ที่ทำหน้าที่โดยตรงกับ ERK1 / 2 (28) การสนับสนุนสำหรับความเป็นไปได้นี้ได้รับการแนะนำโดยการค้นพบว่า phosphorylation ที่เกิดจากโคเคนของ MEK1 / 2 ที่ Ser-217 และ Ser-221 ถูกยกเลิกในหนู Tgp35 เส้นทางที่เป็นไปได้อีกอย่างหนึ่งคือผ่าน phosphorylation ที่ขึ้นกับ Cdk5 ของ MEK1 ที่ Thr-286 ซึ่งจะส่งผลให้กิจกรรมของตัวเร่งปฏิกิริยาลดลงและนำไปสู่การยับยั้งกิจกรรม ERK1 / 2 (24).
การยับยั้งการทำงานของ Cdk5 ใน striatum นั้นแสดงให้เห็นถึงผลกระทบเชิงพฤติกรรมที่มีอิทธิพลต่อการรักษาโคเคนเรื้อรังในสัตว์ (6) สอดคล้องกับสมมติฐานที่ว่าการควบคุมกิจกรรม Cdk5 ที่เพิ่มขึ้นอาจนำไปสู่การปรับตัวของเส้นประสาทเพื่อต่อต้านผลกระทบของการบริหารโคเคนซ้ำ ๆ (6) เราพบว่าฟอสโฟลเลสเตอรอลแบบพึ่งพิง Cdk5 ของ DARPP-32 และ MEK1 มีส่วนช่วยในการลดทอนการกระตุ้นด้วยโคเคนจาก ERK1 / 2 ซึ่งส่งผลให้การเหนี่ยวนำของ CREB phosphorylation และ c-fos ใน striatum น้อยลง การค้นพบของเราสนับสนุนแนวคิดที่เพิ่มกิจกรรม Cdk5 ซึ่งเป็นผลมาจากการควบคุม p35 ที่เพิ่มขึ้นอาจเปลี่ยนการแสดงออกของยีนใน striatum หลังจากได้รับโคเคนเรื้อรัง สิ่งนี้อาจเกิดขึ้นจากการเปลี่ยนแปลงในกิจกรรมของปัจจัยการถอดความเช่น CREB และ c-fos ดังนั้น Cdk5 activator p35 โดยอาศัยการ จำกัด อัตราผลกระทบต่อกิจกรรม Cdk5 อาจนำไปสู่การเปลี่ยนแปลงที่ยาวนานในการทำงานของเซลล์ประสาทที่ติดอยู่กับโคเคน.
กิตติกรรมประกาศ
เราขอบคุณดร. Mary Jo Danton, Philip Grant และ Sashi Kesavapany สำหรับการอ่านบทวิจารณ์ที่สำคัญของต้นฉบับ งานนี้ได้รับการสนับสนุนโดยสถาบันสุขภาพแห่งชาติ Grant Z01DE00664-05 (เพื่อ ABK), US DA10044 ให้บริการด้านการสาธารณสุขแก่สหรัฐอเมริกาและได้รับทุนจากมูลนิธิ Simons มูลนิธิ Peter J. Sharp และ Picower Foundation (ถึง PG)
หมายเหตุ / รายละเอียดเพิ่มเติม
ตัวย่อ: Cdk5 ไคเนสที่ขึ้นกับไซโคล 5 ERK, ไคเนสที่ควบคุมสัญญาณนอกเซลล์; DARPP-32, โดปามีนและฟอสโฟโปรตีนที่ควบคุมด้วย cAMP, มวลโมเลกุล 32 kDa; PKA, ไคเนสที่ขึ้นกับแคมป์; MEK, ERK ไคเนส; CREB โปรตีนที่ตอบสนองต่อองค์ประกอบที่ค่ายจับยึด
อ้างอิง
;
