PSMC5, 19S Proteasomal ATPase, ควบคุมการกระทำของโคเคนในนิวเคลียส Accumbens (2015)

PLoS One 2015 พฤษภาคม 11; 10 (5): e0126710 doi: 10.1371 / journal.pone.0126710 eCollection 2015

Ohnishi YH1, Ohnishi YN2, นาคามูระ3, Ohno M4, เคนเนดี PJ5, Yasuyuki O6, นิชิเอ7, นีฟอาร์8, Tsuzuki T4, Nestler EJ5.

นามธรรม

ΔFosBเป็นปัจจัยการถอดความที่เสถียรซึ่งสะสมอยู่ในนิวเคลียส accumbens (NAc) ซึ่งเป็นส่วนสำคัญของวงจรการให้รางวัลของสมองเพื่อตอบสนองต่อการได้รับโคเคนหรือยาเสพติดอื่น ๆ ในทางที่ผิด ในขณะที่ osFosB เป็นที่ทราบกันดีว่าสร้างความแตกต่างระหว่างสมาชิกในครอบครัว Jun เพื่อสร้างปัจจัยการถอดรหัสที่ใช้งานอยู่ แต่ก็ยังไม่มีการสำรวจแบบปลายเปิดของพันธมิตรที่มีผลผูกพันอื่น ๆ ที่เป็นไปได้สำหรับΔFosBในสมอง ที่นี่โดยการใช้การทดสอบสองไฮบริดของยีสต์เราระบุ PSMC5 หรือที่เรียกว่า SUG1 ซึ่งเป็นหน่วยย่อยที่ประกอบด้วย ATPase ของ 19S proteasomal complex ซึ่งเป็นโปรตีนที่มีปฏิสัมพันธ์ใหม่กับΔFosB เราตรวจสอบปฏิสัมพันธ์ดังกล่าวระหว่างΔFosBและ PSMC5 ภายนอกใน NAc และแสดงให้เห็นว่าโปรตีนทั้งสองยังรวมตัวกันเป็นเชิงซ้อนกับโปรตีนควบคุมโครเมียมอื่น ๆ ที่เกี่ยวข้องกับการกระตุ้นของยีน เราแสดงให้เห็นว่าโคเคนเรื้อรังเพิ่มนิวเคลียร์ แต่ไม่ใช่ไซโตพลาสซึมระดับ PSMC5 ใน NAc และการแสดงออกของ PSMC5 มากเกินไปในบริเวณสมองนี้ส่งเสริมการตอบสนองของขมิ้นอ้อยต่อโคเคน เมื่อรวมกันแล้วการค้นพบเหล่านี้อธิบายถึงกลไกใหม่ที่ก่อให้เกิดการกระทำของΔFosBและเป็นครั้งแรกที่มีความหมายถึง PSMC5 ในความเป็นโมเลกุลและพฤติกรรมที่เกิดจากโคเคน

อ้างอิง: Ohnishi YH, Ohnishi YN, Nakamura T, Ohno M, Kennedy PJ, Yasuyuki O, และคณะ (2015) PSMC5, 19S Proteasomal ATPase, ควบคุมการกระทำของโคเคนในนิวเคลียสแอคชั่น โปรดหนึ่ง 10 (5): e0126710 ดอย: 10.1371 / journal.pone.0126710

บรรณาธิการวิชาการ: James Edgar McCutcheon, University of Leicester, สหราชอาณาจักร

ที่ได้รับ: ธันวาคม 10, 2014; ได้รับการยืนยัน: เมษายน 7, 2015; ที่เผยแพร่: May 11, 2015

ลิขสิทธิ์: © 2015 Ohnishi และคณะ นี่เป็นบทความการเข้าถึงแบบเปิดที่เผยแพร่ภายใต้ข้อกำหนดของ ใบอนุญาตแสดงที่มาของครีเอทีฟคอมมอนส์ซึ่งอนุญาตให้ใช้การแจกจ่ายและการทำซ้ำแบบไม่ จำกัด ในสื่อใดก็ตามหากมีการให้เครดิตผู้เขียนต้นฉบับและแหล่งที่มา

ความพร้อมใช้งานของข้อมูล: ข้อมูลที่เกี่ยวข้องทั้งหมดอยู่ในเอกสาร

เงินทุน: งานนี้ได้รับการสนับสนุนโดยทุนจากสถาบันสุขภาพแห่งชาติ, สถาบันยาเสพติดแห่งชาติ, และโดยมูลนิธิ Ishibashi และสมาคมเพื่อการส่งเสริมวิทยาศาสตร์แห่งประเทศญี่ปุ่น (หมายเลข KAKENHI: 24591735, 26290064, 25116010) ผู้เลี้ยงไม่มีบทบาทในการออกแบบการศึกษาการรวบรวมและวิเคราะห์ข้อมูลการตัดสินใจที่จะเผยแพร่หรือการจัดทำต้นฉบับ

การแข่งขันความสนใจ: ผู้เขียนได้ประกาศว่าไม่มีความสนใจในการแข่งขันอยู่

บริษัท

ΔFosBผลิตภัณฑ์ที่ถูกตัดทอนจาก FosB ยีนเป็นของตระกูล Fos ของปัจจัยการถอดรหัสซึ่งรวมถึง c-Fos, FosB แบบเต็มความยาว, Fra-1 และ Fra-2 ΔFosBเช่นเดียวกับโปรตีน Fos อื่น ๆ heterodimerizes กับโปรตีนในตระกูล Jun - c-Jun, JunB หรือ JunD— เพื่อสร้าง AP-1 (activator protein-1) ซึ่งเป็นตัวกระตุ้นการแสดงออกของยีนเป้าหมายเฉพาะ [1,2].

ΔFosBแสดงบทบาทสำคัญในการติดยาเสพติด [2] โดยเฉพาะในหมู่โปรตีน Fos ในครอบครัวมันสะสมในนิวเคลียส accumbens (NAc) และบริเวณที่เกี่ยวข้องกับผลตอบแทนอื่น ๆ ของสมองหลังจากให้ยาซ้ำหลายครั้งเนื่องจากความเสถียรในระดับสูง [3,4] ซึ่งเป็นสื่อกลางโดยขาดโดเมน C-terminal degron และโดย phosphorylation โดยโปรตีนไคเนสหลายชนิด5-7] การเหนี่ยวนำของΔFosBในสื่อกลางของ NAc เพิ่มการตอบสนองเชิงพฤติกรรมต่อยาเสพติดในทางที่ผิด ดังนั้นการแสดงออกอย่างมากของΔFosBในบริเวณสมองของสัตว์ที่โตเต็มวัยไม่ว่าจะโดยการใช้เวกเตอร์ไวรัสหรือหนู bitransgenic ที่เหนี่ยวนำให้เกิดการเพิ่มความไวของสัตว์ต่อการเคลื่อนไหวและการให้รางวัลของโคเคนและ opiates โคเคน7-11] ตรงกันข้ามการแสดงออกของปฏิปักษ์เชิงลบที่เด่นชัดของΔFosBทำให้ฟีโนไทป์ของพฤติกรรมตรงกันข้าม10-12].

เราและคนอื่น ๆ ได้ยืนยันก่อนหน้านี้โดยใช้การทดสอบเจลกะว่า JunD และโปรตีนในตระกูล Jun อื่นอาจเป็นคู่หูที่สำคัญของΔFosBในสมองในร่างกาย [13-15] อย่างไรก็ตามจนถึงปัจจุบันยังไม่ได้มีการประเมินผลแบบเปิดกว้างและไม่มีอคติต่อหุ้นส่วนที่มีผลผูกพันของΔFosBในสมอง ที่นี่เราพยายามที่จะระบุพันธมิตรที่มีผลผูกพันนวนิยายสำหรับΔFosBโดยใช้การทดสอบแบบผสมสองยีสต์16,17] ข้อมูลของเราเปิดเผยว่า PSMC5 ซึ่งเป็นที่รู้จักกันในนาม SUG1 เป็นพันธมิตรที่แข็งแกร่งของΔFosBทั้งในหลอดทดลองและใน NAc ในร่างกายที่เข้าร่วมΔFosBซึ่งเป็นส่วนหนึ่งของโปรตีนกระตุ้นการสร้างโคเคนซึ่งประกอบด้วย CBP (CREB) ) และ p300 - ทั้งฮิสโตนอะเซทิลทรานสเฟอเรส (HATs) - รวมถึง BRG1 (โปรตีนการเปลี่ยนแปลงโครมาติน) เราแสดงให้เห็นว่าการได้รับโคเคนแบบเรื้อรังนั้นได้เปลี่ยนแปลงระดับนิวเคลียร์ของ PSMC5 ซึ่งเป็นหน่วยย่อยที่ประกอบด้วย ATPase ของ 19S proteasomal complex ใน NAc และ PSMC5 นั้นควบคุมการตอบสนองเชิงพฤติกรรมต่อโคเคน

วัสดุและวิธีการ

การตรวจคัดกรองยีสต์สองลูกผสม

เซลล์ยีสต์ MaV203 (Invitrogen Life Technologies) ถูก co-transfected ร่วมกับ pDBLeu ขับชิ้นส่วนต่าง ๆ ของโปรตีน differentFosB และห้องสมุดสมองของเมาส์ถูก subcloned ใน pPC86 (Invitrogen Life Technologies) เซลล์ที่ถูกเปลี่ยนรูปนั้นถูกปลูกขึ้นบน SC-Medium ที่ขาด leucine, tryptophan และ histidine และมี 10 mM ของ 3-aminotriazole การเชื่อมโยงระหว่าง FosB แฟรกเมนต์และพันธมิตรผู้สมัครทำให้เกิดนักข่าวนักข่าวสามคน (His3, Ura3และ lacZ) และการเหนี่ยวนำทำให้หม้อแปลงสามารถอยู่รอดได้ภายใต้เงื่อนไขการเพาะเลี้ยงที่ใช้ โคลนที่เป็นบวกถูกทดสอบซ้ำด้วยชิ้นส่วน pDBLeu-ΔFosBที่สดใหม่โดยตรวจสอบการเปลี่ยนรูปใหม่ในเซลล์ MaV203

เส้นเซลล์

Mouse Neuro 2A neuroblastoma cells (ATCC) ได้รับการบำรุงรักษาในตัวกลางที่จำเป็นขั้นต่ำ (EMEM) (ATCC) ของ Eagle เสริมด้วยซีรั่มวัวทารกในครรภ์ 10% (FBS) ที่ 37 ° C และ 5% CO2. เซลล์ Rat 1A เป็นของขวัญจาก Yusaku Nakabeppu (ฟุกุโอกะญี่ปุ่น)18] และปรับปรุงใน MEM (DMEM) (Life Technologies) ของ Dulbecco ซึ่งเสริมด้วย 10% FBS ที่ 37 ° C และ 5% CO2. การถ่ายเซลล์ที่มีพลาสมิดดีเอ็นเอสามารถทำได้โดยใช้ Effectene (Qiagen) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต

สร้าง PSMC5 และΔFosB

PSMC5 กลายพันธุ์หลายรูปแบบซึ่งแต่ละ FLAG-tagged ที่ N-terminus ของพวกเขาถูกสร้างขึ้นเพื่อใช้ในการทดสอบภูมิคุ้มกันหรือการถ่ายโอนยีนผ่านสื่อไวรัส สิ่งเหล่านี้รวมถึง: PSMC5-K196M, PSMC5-iledcoiled-domain domain (PSMC5-K27-ΔCC, ขาดกรดอะมิโน 68 – 5), PSMC1-NT -CT (ประกอบด้วยชิ้นส่วน C-terminal ของโปรตีน, กรดอะมิโน 151) (ดู 1 รูป) นอกจากนี้เรายังใช้ N-terminal MYC ที่ติดแท็กรูปแบบของ wildtype ΔFosBและΔFosBที่มีการกลายพันธุ์ในโดเมน leucine-zip (การกลายพันธุ์ของกรดอะมิโน 182 ถึง 205 ซึ่งเป็นที่รู้จักกันในการกำจัด heterodimerization กับโปรตีนในครอบครัว6].

ภาพขนาดย่อ
รูปที่ 1 ΔFosBผูกติดกับ PSMC5 ในหลอดทดลอง

 

A. แผนผังของΔFosB, ΔFosB-LZM ซึ่งเป็นโดเมนซิปของ leucine จะกลายพันธุ์เพื่อกำจัด heFosB heterodimerization กับโปรตีนมิถุนายนและΔ2ΔFosBซึ่งขาดกรดอะมิโน 78 ตัวแรกของΔFosB N-terminus B. แผนผังของ PSMC5, PSMC5-NT ซึ่งประกอบด้วยกรดอะมิโน 151 แรกของ PSMC5, XMC5-CT ซึ่งขาดกรดอะมิโน 235 แรกของ PSMC5-MCCC . โดเมน AAA นั้นสอดคล้องกับมาตรฐาน ATPases ที่เชื่อมโยงกับกิจกรรมโทรศัพท์มือถือที่หลากหลายซึ่งมีอยู่ใน ATPases จำนวนมาก C. 5 μgของ pcDNA28-ΔFosB (เลน 68 – 2.4) หรือΔFosB-LZM (เลน 3.1) ติดแท็กร่วมกับ 1 μgของแท็ก PSAG4 หรือการลบแบบต่างๆในเซลล์ NeuroX สองวันหลังจากการถ่ายเซลล์ถูก lysed และภายใต้ immunoprecipitation ด้วยแอนติบอดี anti-FLAG และ Western blotted กับแอนตี้ - antiFosB หรือแอนติบอดี anti-FLAG โปรดทราบว่าΔFosB แต่ไม่ใช่ΔFosB-LZM จะรวมกับ PSMC5 หรือ PSMC2.4-NT อย่างแน่นหนา แต่ไม่ใช่ PSMC5-CT หรือ PSMC2-ΔCC ข้อมูลที่แสดงในรูปถูกทำซ้ำในการเพิ่มขึ้นสามเท่าในการทดลองที่แยกกันสามครั้ง

ดอย: 10.1371 / journal.pone.0126710.g001

สัตว์

ทดลองใช้หนูทดลองเพศเมีย C11BL / 57J อายุเก้าถึง 6J (The Jackson Laboratory) สำหรับการทดลองทั้งหมด สัตว์ตั้งอยู่ในวงจร 12-h แสง - มืดพร้อมการเข้าถึงอาหารและน้ำ โฆษณาฟรี และเคยตัว 1 สัปดาห์ก่อนการทดลอง ใช้สูตรการรักษาโคเคนสองแบบ เพื่อศึกษาผลกระทบทางชีวเคมีของโคเคนสัตว์ได้รับโคเคนปริมาณ 7 รายวัน (20 มก. / กก.) หรือน้ำเกลือและถูกฆ่าโดยการสลายหัว 24 ชม. หลังจากการฉีดครั้งสุดท้าย นี่เป็นโปรโตคอลมาตรฐานซึ่งแสดงให้เห็นว่ามีการตอบสนองระดับโมเลกุลและระดับเซลล์ต่อยา [7] เพื่อศึกษาอิทธิพลของ PSMC5 ในนิวเคลียส accumbens ต่อการตอบสนองต่อพฤติกรรมของโคเคนเราใช้ปริมาณที่น้อยกว่าของยาเสพติด (7.5 mg / kg; ดูการทำให้ไวต่อยา Locomotor ด้านล่าง) ตามสมมติฐานที่ว่า PSMC5 จะเพิ่มความไวของสัตว์ โคเคน8] การทดลองสัตว์ทั้งหมดได้รับการอนุมัติจากคณะกรรมการดูแลและใช้สัตว์ประจำสถาบันที่ Mount Sinai

การไม่ตอบสนองต่อการตกตะกอนและการบวมแบบตะวันตก

เซลล์ Neuro 2A ได้รับการเปลี่ยนถ่ายด้วย PSY5 ในรูปแบบ wildtype หรือ mutant สองวันหลังจากการถ่ายเซลล์ถูกล้างใน PBS, lysed ในบัฟเฟอร์ RIPA (50 mM Tris pH 7.4, โซเดียม 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, โซเดียม Deoxycholate, 0.25 mM โซเดียมเมทริกเตรท, . ไลซีนถูกแยกและบ่มด้วยแอนติบอดีที่ไม่มีภูมิต้านทาน IgG (Sigma) หรือแอนติบอดีต่อต้าน FLAG (Sigma) สำหรับ 10 ชม. ที่ 3 ° C การให้ภูมิคุ้มกันโดยใช้โปรตีนเม็ด G (Invitrogen) ตามที่อธิบายไว้ [19] โดยสรุปโปรตีนที่ได้รับการกระตุ้นภายใต้ SDS-PAGE และวิเคราะห์โดย Western blotting โดยใช้ anti-FosB / ΔFosB antibody (Cell Signaling Technology) ตามโปรโตคอลที่ตีพิมพ์ [7] สำหรับการตรวจจับโปรตีนในวิฟเราใช้เศษส่วนนิวเคลียร์ที่บริสุทธิ์จาก NAc ที่ผ่านการชกด้วยหมัดหลังจากการรักษาโคเคนเรื้อรัง (20 mg / kg IP ทุกวันเป็นเวลา 7 วันโดยที่หนูใช้ 24 ชั่วโมงหลังจากการฉีดครั้งสุดท้าย) การลดภาวะ Co-immunoprecipion จากเศษส่วนนิวเคลียร์โดยใช้ Nuclear Complex Co-IP kit (Active Motif) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต แอนติบอดีต่อไปนี้ถูกนำมาใช้: MYC หรือß-actin, เทคโนโลยีการส่งสัญญาณของเซลล์ (Danvers, MA), PSMC5 และ histone H3, Abcam (Cambridge, MA), CBP, p300 และ BRG1, Santa Cruz เทคโนโลยีชีวภาพ (Santa Cruz, CA) และ FLAG M2, ซิกมา

immunohistochemistry

อิมมูโนวิทยาได้ดำเนินการตามขั้นตอนที่ตีพิมพ์ [20] หนูได้รับการดมยาสลบและกระจายไปในทางหลอดเลือดดำด้วย 4% paraformaldehyde ใน PBS สมองถูกแช่แข็งด้วยซูโครส 30% แล้วแช่แข็งและเก็บไว้ที่ -80 ° C จนกระทั่งใช้ ส่วนชเวียน (40 μm) ถูกตัดบน cryostat และประมวลผลสำหรับอิมมูโนฮิสโตเคมี ส่วนที่ลอยตัวฟรีถูกเติมไว้ล่วงหน้าในบัฟเฟอร์การบล็อกที่มี 0.3% Triton และ 3% ซีรัมลาปกติ ตรวจพบΔFosBโดยใช้แอนติบอดีจากแพะ polyclonal ที่ยกขึ้นกับส่วน N-terminal ของโปรตีน (1 / 1000 เทคโนโลยี Santa Cruz) ตรวจพบ PSMC5 โดยใช้แอนติบอดี polyclonal กระต่าย (1 / 100 Abcam, Cambridge, MA) ภาพถูกถ่ายด้วยกล้องจุลทรรศน์ confocal (กำลังขยาย 60x; Zeiss)

การทำให้แพ้จากหัวรถจักร

หนูทุกคนได้รับการฉีด IP ของน้ำเกลือทุกวันเป็นเวลา 3 วันเพื่อทำให้พวกเขาคุ้นเคยกับความเครียดของการฉีดยา ในวันถัดไปหนูถูกฉีดยา IP ด้วยน้ำเกลือหรือโคเคนปริมาณที่กำหนด (7.5 mg / kg; ดูใต้สัตว์เหนือ) และวางลงในกล่องเคลื่อนที่ได้ทันที กิจกรรมของหัวรถจักรของหนูถูกบันทึกโดยใช้ระบบ photobeam เนื่องจากลำแสง ambulatory แตกเป็นระยะเวลา 30 นาที การรักษาเหล่านี้ถูกทำซ้ำทุกวันเป็นเวลา 3 วัน

การถ่ายโอนยีนที่อาศัยไวรัส

เราใช้วิธีการเผยแพร่อย่างกว้างขวางสำหรับการถ่ายโอนยีนที่มีสื่อไวรัส [7,8,11,19] โดยย่อพลาสมิดนิพจน์สำหรับ PSMC5 หรือหลายสายพันธุ์ของมัน (ดู PSMC5 และΔFosBที่สร้างขึ้นด้านบน) ถูก subcloned ลงใน bicistronic p1005 (+) HSV พลาสมิดแสดงพลาสมิดภายใต้การควบคุมของ CMV ก่อการและ PSMC5 โปรโมเตอร์ IE4 / 5 ภายใต้คีตามีน (100 มก. / กก.) / ไซลาซีน (10 มก. / กก.) การวางยาสลบหนูอยู่ในตำแหน่งที่เป็นเครื่องมือฆ่าสัตว์ขนาดเล็กและพื้นผิวกะโหลกถูกสัมผัส เข็มฉีดยามาตรวัดสามสิบสามเข็มถูกนำมาใช้เพื่อใส่ 0.5 μlของเวกเตอร์ HSV ทั้งสองข้างลงใน NAc ที่มุม 10 ° (AP + 1.6; ML + 1.5; DV -4.4) ที่อัตรา 0.1 μl / นาที สัตว์ที่ได้รับการฉีด HSV ได้รับอนุญาตให้ฟื้นตัวเป็นเวลา 2 วันหลังการผ่าตัดก่อนการทดลอง

สถิติ

ANOVA และการทดสอบ t ของนักเรียนถูกนำมาใช้แก้ไขสำหรับการเปรียบเทียบหลายครั้งโดยมีนัยสำคัญที่ p <0.05

ผลสอบ

PSMC5: พันธมิตรที่มีผลผูกพันนวนิยายของΔFosB

เราทำการทดลองเบื้องต้นเพื่อระบุชิ้นส่วนที่เหมาะสมของΔFosBที่ทำหน้าที่เป็นเหยื่อในการทดสอบยีสต์สองลูกผสมโดยไม่ต้องเปิดระบบอัตโนมัติ Holo-ΔFosBชักนำให้เกิดกิจกรรมของนักข่าวด้วยตนเองเช่นเดียวกับ N-terminal 1 – 78 ส่วนของกรดอะมิโนของโปรตีน อย่างไรก็ตาม N-terminal ที่ถูกตัดทอน uncFosB (รูปที่ 1A) เรียกว่าΔ2ΔFosBซึ่งขาดกรดอะมิโน 78 แรกของโปรตีนไม่ได้มีผลกระทบนี้ ดังนั้นเราจึงใช้Δ2ΔFosBเป็นโปรตีนของเหยื่อ

ในการกลั่นกรองพันธมิตรที่มีผลผูกพันเราใช้ห้องสมุดสมองของเมาส์ย่อยใน pPC86 เราระบุผู้สมัคร 11 สำหรับพันธมิตรที่มีผลผูกพัน ถึงแม้ว่าโปรตีนเหล่านี้จะรวมถึงพันธมิตร heterodimerization ของΔFosB, c-Jun และ JunD (1 ตาราง) ผู้สมัครที่แพร่หลายมากที่สุดคือ PSMC5 ในขณะที่น่าแปลกใจนี่คือการค้นพบที่น่าสนใจเนื่องจาก PSMC5 ถูกแสดงในรายงานเดียวเมื่อหลายปีก่อนเพื่อผูกกับ c-Fos ในหลอดทดลอง [21] อย่างไรก็ตามไม่มีรายงานก่อนหน้าของการมีส่วนร่วมของ PSMC5 ในการกระทำโคเคน อย่างไรก็ตามเนื่องจากความแข็งแรงของสัญญาณ PSMC5 ในการทดสอบยีสต์สองลูกผสมเราจึงได้ศึกษาเพิ่มเติมเพื่อให้เกิดการปฏิสัมพันธ์ที่เป็นไปได้ΔFosB-PSMC5

ภาพขนาดย่อ
ตาราง 1 ผลลัพธ์ของการคัดกรองยีสต์สองลูกผสมด้วยΔ2ΔFosB

ดอย: 10.1371 / journal.pone.0126710.t001

ก่อนอื่นเพื่อยืนยันการมีปฏิสัมพันธ์ทางกายภาพระหว่างΔFosBและ PSMC5 เราได้ทำการทดลองในภาวะภูมิคุ้มกันบกพร่องแบบ co-immunoprecipitation เราพบว่าการติดแท็ก FLMC PSMC5 (รูปที่ 1B), ถ่ายเข้าไปในเซลล์ Neuro 2A, ดึงลงได้อย่างมีประสิทธิภาพΔFosB (รูปที่ 1C) ประการที่สองเพื่อระบุภูมิภาคใน PSMC5 ที่รับผิดชอบในการเชื่อมโยงกับΔFosBเราได้สร้างการกลายพันธุ์ของ PSMC5 ที่ติดแท็ก FLAG หลายรายการ (รูปที่ 1B) และทำซ้ำการทดสอบการตกตะกอนของภูมิคุ้มกันร่วม ΔFosBถูกดึงลงได้อย่างมีประสิทธิภาพด้วยกรดอะมิโน 151 5 ของ PSMC5 (PSMC172-NT) แต่ไม่ได้มีส่วนของกรดอะมิโน C-terminal 5 ของโปรตีน (PSMCXNUMX-CT) (รูปที่ 1C) PSMC5 ที่ไม่มีโดเมนขดคอยล์ (PSMC5-ΔCC) ก็ไม่มีประสิทธิภาพเช่นกันในการตกตะกอนΔFosB การค้นพบเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า PSMC5 ผูกΔFosBผ่านโดเมนขดคอยล์ (กรดอะมิโน 27 – 68) ยิ่งไปกว่านั้น PSMC5 ที่ติดแท็ก FLAG ไม่ได้ตกตะกอนรูปแบบของΔFosBที่กลายพันธุ์ด้วยโดเมนซิป leucine ที่กลายพันธุ์ (ΔFosB-LZM) (รูปที่ 1C) ซึ่งบ่งชี้ว่าΔFosBอาจผูก PSMC5 ผ่านโดเมนนี้หรือเป็นไปได้ว่า heFosB heterodimerization จำเป็นสำหรับการรวม PSMC5

PSMC5-ΔFosBผูกพันใน NAc หลังจากการบริหารโคเคนเรื้อรัง

จากการค้นพบเหล่านี้ในหลอดทดลองเราศึกษาว่าระดับ PSMC5 ใน NAc มีการเปลี่ยนแปลงเพื่อตอบสนองต่อการบริหารโคเคนเรื้อรังหรือไม่ เราพบว่าการแบ่ง subcellular และ Western blotting ว่าโคเคนเรื้อรังเพิ่มระดับนิวเคลียร์ของ PSMC5 ในพื้นที่สมองนี้โดยไม่มีการเปลี่ยนแปลงในระดับไซโตพลาสซึมรูปที่ 2A) ผลกระทบนี้ไม่สามารถมองเห็นได้หลังจากโคเคนขนาดเดียว (ไม่แสดงข้อมูล) ต่อไปเราตรวจสอบการแปลของ PSMC5 และΔFosBใน NAc โดยใช้กล้องจุลทรรศน์ confocal immunofluorescence เราวิเคราะห์หนู 24 ชม. หลังจากปริมาณโคเคนที่ทำซ้ำครั้งล่าสุดเป็นจุดเวลาที่ΔFosBเป็นสิ่งเดียวที่ตรวจพบได้ FosB ผลิตภัณฑ์ยีน (ดู Nestler 2008) เราพบปฏิกิริยาภูมิคุ้มกันที่แข็งแกร่งใน PSMC5 ใน NAc รวมถึงสัญญาณนิวเคลียร์ที่แข็งแกร่ง ~ 85% ของΔFosB + นิวเคลียสร่วมสำหรับ PSMC5 (รูปที่ 2B) นอกจากนี้เราได้ทำการทดลองการกระตุ้นด้วยภูมิคุ้มกันร่วมกับสารสกัด NAc และพบว่าหลังจากการรักษาโคเคนเรื้อรังแล้วΔFosBก็ถูกดึงลงอย่างมีประสิทธิภาพโดยแอนติบอดีต่อต้าน PSMC5 (รูปที่ 2C) ในทางตรงกันข้ามการวิเคราะห์ของยาเสพติด - ไร้เดียงสา NAc (หลังจากฉีดน้ำเกลือซ้ำ ๆ ) พบว่าไม่มีการตรวจจับΔFosBดึงลง (ไม่แสดงข้อมูล) ข้อมูลเหล่านี้สอดคล้องกับสิ่งที่เราค้นพบในการเพาะเลี้ยงเซลล์และยืนยันว่าΔFosBและ PSMC5 โต้ตอบใน NAc ในร่างกาย

ภาพขนาดย่อ
รูปที่ 2 PSMC5 ระเบียบในเมาส์ NAc

 

ก. การย่อยสลายเศษส่วนนิวเคลียร์และไซโตโซลิกของหนูที่ได้รับการรักษาทุกวันด้วยน้ำเกลือหรือโคเคน (20 มก. / กก.) เป็นเวลา 7 วันโดยวิเคราะห์สัตว์ 24 ชม. หลังการฉีดครั้งสุดท้าย โคเคนเพิ่มระดับนิวเคลียร์ แต่ไม่ใช่ระดับไซโตโซลิกของ PSMC5 Histone H3 และß-actin ซึ่งไม่ได้รับผลกระทบจากโคเคนถูกใช้เป็นตัวควบคุมการโหลด ข้อมูลคือค่าเฉลี่ย± SEM (n = 8–10 / กลุ่ม, * p <0.05) B. การระบุร่วมกันของ PSMC5 ภายนอก (สีเขียว) และΔFosB (สีน้ำเงิน) ใน NAc ของหนูที่ได้รับการรักษาด้วยโคเคนแบบเรื้อรังเช่นเดียวกับใน AC Nuclear lysates ของหนู NAc หลังการรักษาด้วยโคเคนเรื้อรังต้องได้รับการกระตุ้นภูมิคุ้มกันด้วยแอนติบอดีต่อต้าน PSMC5 หรือ IgG ของหนูเป็นตัวควบคุม จากนั้นตะวันตกก็ถูกทำลายด้วยแอนติบอดีต่อต้าน FosB / ΔFosB รูปนี้แสดงให้เห็นถึงปฏิสัมพันธ์ของ PSMC5-ΔFosBใน NAc ในร่างกาย ข้อมูลใน B และ C ถูกจำลองแบบเป็นสามเท่าในการทดลองแยกกันสามครั้ง

ดอย: 10.1371 / journal.pone.0126710.g002

PSMC5 ปรับปรุงการแสดงออกของ osFosB ในหลอดทดลอง

เนื่องจาก PSMC5 เป็นสมาชิกที่รู้จักกันของโปรตีโอโซมคอมเพล็กซ์เราจึงทดสอบว่าควบคุมระดับΔFosBโดยใช้เซลล์ Rat 1A หรือไม่ PSMC5 การแสดงออกมากเกินไปไม่มีผลต่อระดับพื้นฐานของΔFosB แต่ทำให้การเพิ่มประสิทธิภาพของการเหนี่ยวนำΔFosBเล็ก ๆ น้อย ๆ แต่มีนัยสำคัญต่อการกระตุ้นซีรัมของเซลล์ (รูปที่ 3A) มีแนวโน้มที่คล้ายกันสำหรับ FosB แบบเต็มความยาว แต่ผลลัพธ์ไม่ได้มีนัยสำคัญทางสถิติ ในทางกลับกันการยับยั้งการแสดงออกภายนอกของ PSMC5 ในเซลล์ Rat 1A ซึ่งทำได้โดยการใช้ siRNAs ที่เป้าหมาย PSMC5 นั้นไม่ส่งผลต่อระดับΔFosBพื้นฐาน แต่ยับยั้งการเหนี่ยวนำΔFosBในระดับสูงอย่างรุนแรง (รูปที่ 3B) เอฟเฟ็กต์ที่คล้ายกันถูกพบสำหรับ FosB แบบยาว ข้อมูลเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า PSMC5 ไม่ส่งเสริมการย่อยสลายของ proteasomal ของΔFosBตามที่คาดว่าจะเป็นหน่วยย่อยหลักของ proteasome แต่จำเป็นต้องมีการสะสมสูงสุดของ FosB ผลิตภัณฑ์ยีนในหลอดทดลองอาจทำให้โปรตีนคงตัว

ภาพขนาดย่อ
รูปที่ 3 ระเบียบ PSMC5 ของการแสดงออก FosB / ΔFosBในเซลล์ Rat 1A

 

A. เซลล์หนู 1A ถูกถ่ายด้วย PSMC4 5 ไมโครกรัมหรือดีเอ็นเอควบคุม การแสดงออกมากเกินไปของ PSMC5 ไม่มีผลต่อระดับการแสดงออกพื้นฐานของโปรตีน FosB หรือΔFosBตามที่กำหนดโดยการซับแบบตะวันตก แต่ทำให้การเหนี่ยวนำΔFosBเพิ่มขึ้นเล็กน้อย แต่มีนัยสำคัญโดยการกระตุ้นทางซีรัม (F (2,21) = 9.75, p = 0.001) B. หนู Rat 1A ได้รับการถ่ายเซลล์ด้วย 5 pmol ของสอง siRNAs หรือ RNA ที่มีสัญญาณรบกวน (ตัวควบคุม) siRNA ทั้งสองลดระดับโปรตีน PSMC5 ได้อย่างมีประสิทธิภาพเมื่อเทียบกับสภาวะควบคุม (siRNA # 1, 23 ± 5% ของการควบคุม; siRNA # 2, 18 ± 6%; p <0.05; n = 4) การล้มลง PSMC5 ไม่มีผลต่อระดับพื้นฐานของ FosB หรือΔFosB แต่ลดทอนการเหนี่ยวนำของทั้ง FosB และΔFosBโดยการกระตุ้นทางซีรั่ม (FosB: F (2,6) = 20.99, p = 0.002; ΔFosB: F (2,6) = 22.83 , p = 0.002)

ดอย: 10.1371 / journal.pone.0126710.g003

ΔFosBและ PSMC5 ประกอบไปด้วยคอมเพล็กซ์ CBP, p300 และ BRG1 ใน NAc

เพื่อให้เข้าใจกลไกการถอดรหัสได้ดีขึ้นซึ่ง PSMC5 อาจมีผลต่อฟังก์ชั่นΔFosBเราได้ตรวจสอบคู่หูที่มีความผูกพันเพิ่มเติมสำหรับโปรตีนสองชนิดใน NAc ภายใต้เงื่อนไขที่ได้รับโคเคนเรื้อรัง มีรายงานฉบับหนึ่งที่ PSMC5 เชื่อมโยงกับ CBP — a HAT และเพิ่ม histone H3 acetylation ที่ MHC-II proximal ก่อการในเซลล์ HeLa [22] ยิ่งกว่านั้นหนูที่มีข้อบกพร่องในการแสดง CBP จะลดความไวต่อพฤติกรรมของโคเคนและฮิสโตนอะเซทิเลชั่นที่ลดลง FosB ผู้ก่อการ [23] เราจึงทดสอบว่า PSMC5 อาจเชื่อมโยงกับΔFosBเป็นส่วนหนึ่งของคอมเพล็กซ์ที่มี CBP และอาจเปิดใช้งาน transcriptional อื่น ๆ

เราแสดงให้เห็นเป็นครั้งแรกว่าΔFosBสามารถดึงทั้ง CBP และ p300 ซึ่งเป็น HAT ที่เกี่ยวข้องในเซลล์ Neuro2A ได้อย่างมีประสิทธิภาพ (รูปที่ 4A) ในทางตรงข้ามรูปแบบซิป leucine ของΔFosBตามที่คาดไว้ไม่ได้แสดงกิจกรรมนี้ ในทำนองเดียวกัน PSMC5 ดึง CBP และ p300 ได้อย่างมีประสิทธิภาพ (รูปที่ 4B) สิ่งที่น่าสนใจก็คือ PSMC5-ΔCCซึ่งไม่ได้ดึงลงΔFosBซึ่งแสดงให้เห็นว่า PSMC5 นั้นมีปฏิสัมพันธ์กับ CBP และ p300 ผ่านโดเมนอื่น ๆ ของโปรตีนและไม่เกี่ยวข้องกับΔFosB

ภาพขนาดย่อ
รูปที่ 4 ΔFosBและ PSMC5 โต้ตอบกับ CBP, p300 และ BRG1 ในหลอดทดลองและในร่างกาย

 

A. เซลล์ Neuro2A ได้รับการถ่ายด้วย 2.4 μgของแท็ก MYC ที่ติดแท็ก BFosB หรือติดแท็ก MYC ΔFosB-LZM สารสกัดจากเซลล์ถูกกระตุ้นด้วยแอนติบอดีต่อต้าน -bcp หรือแอนตี้ - p300 และ precipitates เป็นตะวันตกด่างกับแอนติบอดีเดียวกันหรือแอนติบอดีต่อต้าน - myc ทั้ง CBP และ p300 โต้ตอบกับΔFosBและการโต้ตอบดังกล่าวจำเป็นต้องมีซิป leucine ที่ไม่บุบสลาย B. เซลล์ Neuro2A ได้รับการถ่ายด้วย 2.4 μgของ PSMC5 ที่ติดแท็กด้วย FLAG หรือ PSMC5-ΔCCที่ติดแท็กด้วย FLAG สารสกัดจากเซลล์ถูกกระตุ้นด้วยแอนติบอดีต่อต้าน CBP หรือแอนตี้ - p300 และ precipitates ถูก Western blotted กับแอนติบอดีเดียวกันหรือแอนติบอดีต่อต้าน FLAG ทั้ง CBP และ p300 โต้ตอบกับ PSMC5 และการโต้ตอบดังกล่าวไม่จำเป็นต้องมีโดเมน CC C. นิวเคลียร์ lysates ของเมาส์ NAc หลังจากการรักษาโคเคนเรื้อรังถูกต้องภายใต้ภูมิคุ้มกันที่มีแอนติบอดีต่อต้าน CBP หรือแอนติบอดีต่อต้าน p300 การตกตะกอนแบบตะวันตกในครั้งต่อมาของการตกตะกอนด้วยแอนติบอดีต่อต้าน FosB / ΔFosBแสดงให้เห็นปฏิกิริยาภายนอกระหว่างΔFosBและ CBP / p300 D. Aliquots ของ lysates นิวเคลียร์แบบเดียวกันนั้นต้องได้รับ immunoprecipitation ด้วยแอนติบอดีต่อต้าน BRG1 หรือแอนติบอดีต่อต้าน PSMC5 ตามด้วยการตกตะกอนตะวันตกของ precipitates ด้วยแอนติบอดีต่อต้าน FosB / ΔFosBหรือ anti-BRG1 ผลลัพธ์แสดงปฏิสัมพันธ์ภายนอกระหว่างΔFosBและ BRG1 และ BRG1 และ PSMC5 E. ภาพแผนผังของคอมเพล็กซ์การเปิดใช้งานการถอดเสียงประกอบด้วย heFosB: heterodimers JunD ที่โต้ตอบกับ CBP / p300, BRG1 และ PSMC5

ดอย: 10.1371 / journal.pone.0126710.g004

เพื่อยืนยันว่าปฏิกิริยาเหล่านี้เกิดขึ้นในร่างกายเราได้ทำการควบคุมโคเคนอย่างต่อเนื่องเพื่อกระตุ้นΔFosBและระดับ PSMC5 นิวเคลียร์จากนั้นสารสกัดโปรตีน NAc ที่ต่อต้านด้วยแอนติบอดีต่อต้าน CBP หรือต่อต้าน p300 สอดคล้องกับข้อมูลการเพาะเลี้ยงเซลล์ของเราการกระตุ้นภูมิคุ้มกันของ CBP หรือ p300 อย่างมีประสิทธิภาพดึงลง downFosB (รูปที่ 4C) เราทดสอบว่า BRG1 ซึ่งเป็นหน่วยย่อยหลักของการเปลี่ยนแปลงโครมาติน SWI-SNF ที่ซับซ้อนหรือไม่ก็อาจจะจับกับโคเคนΔFosBและ PSMC5 ตามการค้นพบก่อนหน้านี้ของเราว่า BRG1 นั้นถูกคัดเลือกมาจากยีนเป้าหมาย certainFosB ในคอนเสิร์ต24] เราพบว่าการกระตุ้นภูมิคุ้มกันของ BRG1 นั้นลดลงΔFosBในสารสกัด NAc และการลดการสร้างภูมิคุ้มกันของ PSMC5 ก็เหมือนกันกับ Copogen ที่ภายนอก BRG1 (รูปที่ 4D) เมื่อนำมารวมกันผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า formFosB-PSMC5 เป็นสารประกอบเชิงซ้อนใน NAc ซึ่งรวมถึง CBP / p300 และ BRG1 (รูปที่ 4E).

PSMC5 การแสดงออกมากเกินไปเพิ่มการตอบสนองของหัวรถจักรต่อโคเคน

ความผูกพันที่โดดเด่นของ PSMC5 กับΔFosBใน NAc ทำให้เราตรวจสอบว่าการเพิ่มระดับ PSMC5 ในบริเวณสมองนี้จะควบคุมการตอบสนองต่อพฤติกรรมของโคเคนหรือไม่ เราสร้างเวกเตอร์ Herpes Simplex Virus (HSV) ที่แสดงออกอย่างใดอย่างหนึ่งอย่างรวดเร็ว PSMC5 Wildtype หรือหนึ่งในสายพันธุ์กลายและตรวจสอบเวกเตอร์ใน NAc ในร่างกาย (รูปที่ 5A) การแสดงออกทางไวรัสของ PSMC5 ครอบงำในนิวเคลียสของเซลล์ (รูปที่ 5B) หนูที่แสดงออกมากเกินไป PSMC5 แบบไวด์ป่าไม่ได้แสดงการตอบสนองต่อปริมาณโคเคนเริ่มต้นที่เปลี่ยนแปลง แต่แสดงการกระตุ้นการเคลื่อนไหวของหัวรถจักรในการตอบสนองต่อปริมาณโคเคนซ้ำ ๆ เมื่อเปรียบเทียบกับหนูควบคุม GFP ในทางตรงกันข้ามหนูเปลี่ยนรูปแบบของ PSMC5 ที่กลายพันธุ์จนเกินไปซึ่งไม่มีโดเมนคอยล์คอยล์ (PSMC5-ΔCC) ไม่ได้แสดงผลนี้ (รูปที่ 5B) ที่น่าสนใจคือการแสดงออกของ PSMC5-K196M มากเกินไปซึ่งขาดกิจกรรม ATPase ของโปรตีน wildtype รวมถึงการตอบสนองของหัวรถจักรโคเคนที่มีศักยภาพ

ภาพขนาดย่อ
รูปที่ 5 PSMC5 การแสดงออกมากเกินไปใน NAc เพิ่มการตอบสนองของหัวรถจักรต่อโคเคน

 

A. ตัวแทนนิพจน์ทรานยีนที่เป็นสื่อกลาง HSV ใน NAc ที่อยู่ตรงกลาง AC, commissure ด้านหน้า ภูมิภาคย่อยของ NAc และเชลล์จะระบุไว้ในรูป B. เป็นตัวแทนของการขยายตัวที่สูงขึ้น (60x) ของการย้อมสีด้วยภูมิคุ้มกันวิทยาของ PSMC5 ในเซลล์ประสาท NAc หลังการฉีด HSV-PSMC5 ซึ่งแสดงให้เห็นว่าโปรตีนส่วนใหญ่เป็นนิวเคลียร์ตามการย้อมสี DAPI C. หนูได้รับการฉีด HSV ทวิภาคีใน NAc ตามด้วยการฉีดโคเคนในปริมาณที่กำหนดรายวัน (7.5 มก. / กก.) การตอบสนองของ Locomotor จะแสดงโดยตอบสนองต่อครั้งแรกและครั้งสุดท้ายของ 3 ครั้งต่อวันของยา การแสดงออกมากเกินไปของ PSMC5 หรือ PSMC5-K196M จะเพิ่มการตอบสนองของขมิ้นอ้อยต่อโคเคนซ้ำซึ่งไม่เห็นผลกับ PSMC5-ΔCC ไม่มีผลอย่างมีนัยสำคัญของการเปลี่ยนยีนต่อการตอบสนองของขมิ้นอ้อยต่อปริมาณโคเคนเริ่มต้น ANOVA F (3,125) = 4.163, * p <0.05 โดยการทดสอบ posthoc ของ Dunnett

ดอย: 10.1371 / journal.pone.0126710.g005

การสนทนา

ผลการศึกษาครั้งนี้เผยให้เห็นกลไกใหม่ที่ whichFosB เป็นสื่อกลางในการกระทบต่อสมองและกลไกใหม่ที่เกี่ยวข้องกับการกระทำโคเคน จากการใช้วิธีการที่ไม่ฝักใฝ่ฝ่ายใดการทดสอบยีสต์สองลูกผสมเราระบุว่า PSMC5 เป็นพันธมิตรที่มีผลผูกพันนวนิยายสำหรับΔFosB เราตรวจสอบการค้นพบนี้ทั้งในเซลล์เพาะเลี้ยงในหลอดทดลองและใน NAc ในร่างกายโดยแสดงให้เห็นถึงการเชื่อมโยงที่แข็งแกร่งของ PSMC5-ΔFosB ที่สำคัญระดับนิวเคลียร์ของ PSMC5 ถูกเหนี่ยวนำให้เกิดใน NAc โดยการบริหารโคเคนเรื้อรัง เราแสดงให้เห็นเพิ่มเติมว่าการผูก PSMC5-ΔFosBเกิดขึ้นพร้อมกับโปรตีน transcriptional activator อื่น ๆ อีกหลายอย่างคือ CBP และ p300 (HAT สองแห่ง) และ BRG1 (องค์ประกอบสำคัญของ SWI-SNF การเปลี่ยนแปลงเชิงซ้อน) การค้นพบของเราสนับสนุนสมมติฐานที่ว่า PSMC5 เป็นส่วนหนึ่งของการเปิดใช้งาน transcriptional ที่ได้รับการคัดเลือกอย่างน้อย certain ยีนที่เหนี่ยวนำให้เกิด FOSB ในระหว่างการบริหารโคเคนเรื้อรัง (รูปที่ 4E) สอดคล้องกับสมมติฐานนี้คือการค้นพบเพิ่มเติมว่าการแสดงออกมากเกินไปของ PSMC5 ใน NAc เช่น overexpression ของΔFosBนั้นส่งเสริมการตอบสนองเชิงพฤติกรรมต่อโคเคน มันจะน่าสนใจในการศึกษาในอนาคตเพื่อติดตามสิ่งเหล่านี้ในการสังเกตร่างกายด้วยลักษณะของ PSMC5-ΔFosB-HAT-BRG1 การมีปฏิสัมพันธ์โดยใช้การตรวจวิเคราะห์ในหลอดทดลอง

การมีส่วนร่วมของ PSMC5 ในการกระทำโคเคนเป็นเรื่องใหม่อย่างสมบูรณ์ ระบุครั้งแรกในฐานะสมาชิกคนหนึ่งของครอบครัวใหญ่ของ ATPases ที่ประกอบด้วย proteasome, PSMC5 ได้รับการแสดงในช่วงหลายปีที่ผ่านมาเพื่อโต้ตอบกับปัจจัยการถอดรหัสหลายอย่างรวมทั้ง c-Fos, p53, ตัวรับฮอร์โมนนิวเคลียร์และองค์ประกอบของการถอดรหัสฐาน25] อย่างไรก็ตามมีการศึกษาการใช้งานเพียงเล็กน้อยในช่วงหลายปีที่ผ่านมา26] การดำเนินการที่ดีที่สุดคือการส่งเสริมกิจกรรมของปัจจัยการถอดความ MYC ในเซลล์เพาะเลี้ยง [27] ความหมายของ PSMC5 ในกลไกการถอดความได้ชี้ให้เห็นถึงบทบาทที่มีศักยภาพสำหรับกิจกรรม ubiquitination-proteasomal ในการควบคุมการถอดความของยีน แต่การมีส่วนร่วมของ PSMC5 ในกฎระเบียบดังกล่าวยังคงไม่ได้ทดสอบจริงจนถึงปัจจุบัน [28,29].

มีคนรู้น้อยมากเกี่ยวกับฟังก์ชั่น PSMC5 ในสมอง การศึกษาก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นถึงการแสดงออกอย่างกว้างขวางของ PSMC5 mRNA ทั่วสมอง [30] แต่กิจกรรมการทำงานของมันยังคงไม่ผ่านการทดสอบ ขณะนี้การค้นพบของเรากระตุ้นให้มีการตรวจสอบโปรตีนที่น่าสนใจต่อไปเพื่อทำความเข้าใจบทบาทของมันในการควบคุมการถอดรหัสของยีนและความสัมพันธ์กับการทำงานของ ubiquitination-proteasomal ในสมอง การเชื่อมโยงของ PSMC5 กับΔFosBนั้นถูกสื่อกลางโดยโดเมนคอยล์ของ PSMC5 ยิ่งไปกว่านั้นความสามารถของ PSMC5 ในการส่งเสริมการตอบสนองของโคเคนในขณะที่ต้องการขดลวดขดไม่จำเป็นต้องมีกิจกรรม ATPase ที่อยู่ภายในโปรตีน ผลลัพธ์เหล่านี้เพิ่มความเป็นไปได้ที่อย่างน้อยที่สุดในระบบของเรากิจกรรมหลักของ PSMC5 อาจถูกสื่อผ่านการเชื่อมโยงกับΔFosBและโปรตีนควบคุมการถอดรหัสอื่น ๆ และไม่ผ่านกิจกรรมที่เกี่ยวข้องกับ proteasomal จำเป็นต้องทำงานเพิ่มเติมเพื่อทดสอบความเป็นไปได้โดยตรงและทางเลือกอื่น สมมติฐานที่แสดงให้เห็นว่าการแสดงออกของ PSMC5 ที่เกินขอบเขตของไวรัสเพิ่มการตอบสนองต่อโคเคนของโคเคนผ่านการโต้ตอบกับΔFosBเป็นไปได้แม้ว่าจะมีการใช้ยารักษาโคเคนในวันที่ 3 เพราะเป็นที่รู้กันว่าระดับของ apprecFosB สะสมในสมอง3].

การค้นพบในปัจจุบันช่วยยืนยันการใช้ประโยชน์จากการใช้วิธีการทดลองแบบปลายเปิดในการศึกษาพื้นฐานระดับโมเลกุลของการควบคุมสมอง ความสนใจเริ่มแรกของเราที่มีต่อ PSMC5 นั้นขึ้นอยู่กับการผูกพันที่โดดเด่นกับΔFosBในการทดสอบยีสต์สองลูกผสม แต่ดูเหมือนว่าจะเป็นองค์ประกอบที่สำคัญของการเปลี่ยนแปลงการถอดรหัสที่ได้รับการคัดเลือกใน NAc โดยการบริหารโคเคนซ้ำ ความเข้าใจที่ดีขึ้นของกลไกรายละเอียดที่ระดับนิวเคลียร์ของ PSMC5 ถูกเหนี่ยวนำโดยโคเคนและในทางกลับกันซึ่ง PSMC5 นั้นมีส่วนช่วยในการเปิดใช้งานเชิงซ้อนโคเคนที่เกิดจากโคเคนเป็นจุดสนใจของการสืบสวนในปัจจุบัน ในขณะเดียวกันการทดสอบยีสต์สองลูกผสมของเราเปิดเผยพันธมิตรที่มีผลผูกพันเพิ่มเติมหลายตัวของ ofFosB (1 ตาราง) ซึ่งตอนนี้ยังรับประกันการตรวจสอบโดยตรงในรูปแบบโคเคน งานนี้ก่อให้เกิดความเข้าใจที่เพิ่มขึ้นเกี่ยวกับกลไกโมเลกุลที่ซับซ้อนซึ่งโคเคนเปลี่ยนแปลงการทำงานของ NAc

กิตติกรรมประกาศ

งานนี้ได้รับการสนับสนุนโดยทุนจากสถาบันยาเสพติดแห่งชาติและโดยมูลนิธิ Ishibashi และสมาคมเพื่อการส่งเสริมวิทยาศาสตร์แห่งประเทศญี่ปุ่น (หมายเลข KAKENHI: 24591735, 26290064, 25116010)

ผลงานของผู้เขียน

รู้สึกและออกแบบการทดลอง: YHO YNO EJN ดำเนินการทดลอง: YHO YNO PJK RN วิเคราะห์ข้อมูล: YHO YNO EJN รีเอเจนต์ที่สนับสนุน / วัสดุ / เครื่องมือวิเคราะห์: TN MO OY AN RN TT เขียนบทความ: YHO EJN

อ้างอิง

  1. 1 มอร์แกน JI, เคอร์แรน T (1995) ยีนในระยะเริ่มแรก: สิบปีต่อไป เทรนด์ Neurosci 18: 66 – 67 pmid: 7537412 ดอย: 10.1016 / 0166-2236 (95) 80022-t
  2. 2 Nestler EJ (2008) กลไกการถอดรหัสของการเสพติด: บทบาทของ deltaFosB Philos Trans R Soc ลอนดอน B Biol Sci 363: 3245 – 3255 doi: 10.1098 / rstb.2008.0067 PMID: 18640924
  3. ดูบทความ
  4. PubMed / NCBI
  5. Google Scholar
  6. ดูบทความ
  7. PubMed / NCBI
  8. Google Scholar
  9. ดูบทความ
  10. PubMed / NCBI
  11. Google Scholar
  12. ดูบทความ
  13. PubMed / NCBI
  14. Google Scholar
  15. ดูบทความ
  16. PubMed / NCBI
  17. Google Scholar
  18. ดูบทความ
  19. PubMed / NCBI
  20. Google Scholar
  21. ดูบทความ
  22. PubMed / NCBI
  23. Google Scholar
  24. ดูบทความ
  25. PubMed / NCBI
  26. Google Scholar
  27. ดูบทความ
  28. PubMed / NCBI
  29. Google Scholar
  30. ดูบทความ
  31. PubMed / NCBI
  32. Google Scholar
  33. ดูบทความ
  34. PubMed / NCBI
  35. Google Scholar
  36. ดูบทความ
  37. PubMed / NCBI
  38. Google Scholar
  39. ดูบทความ
  40. PubMed / NCBI
  41. Google Scholar
  42. ดูบทความ
  43. PubMed / NCBI
  44. Google Scholar
  45. ดูบทความ
  46. PubMed / NCBI
  47. Google Scholar
  48. ดูบทความ
  49. PubMed / NCBI
  50. Google Scholar
  51. ดูบทความ
  52. PubMed / NCBI
  53. Google Scholar
  54. ดูบทความ
  55. PubMed / NCBI
  56. Google Scholar
  57. ดูบทความ
  58. PubMed / NCBI
  59. Google Scholar
  60. ดูบทความ
  61. PubMed / NCBI
  62. Google Scholar
  63. ดูบทความ
  64. PubMed / NCBI
  65. Google Scholar
  66. ดูบทความ
  67. PubMed / NCBI
  68. Google Scholar
  69. ดูบทความ
  70. PubMed / NCBI
  71. Google Scholar
  72. ดูบทความ
  73. PubMed / NCBI
  74. Google Scholar
  75. ดูบทความ
  76. PubMed / NCBI
  77. Google Scholar
  78. ดูบทความ
  79. PubMed / NCBI
  80. Google Scholar
  81. ดูบทความ
  82. PubMed / NCBI
  83. Google Scholar
  84. ดูบทความ
  85. PubMed / NCBI
  86. Google Scholar
  87. ดูบทความ
  88. PubMed / NCBI
  89. Google Scholar
  90. 3 Hope BT, Nye HE, Kelz MB, DW ตัวเอง, Iadarola MJ, Nakabeppu Y, และคณะ (1994) การเหนี่ยวนำของคอมเพล็กซ์ AP-1 ที่ยาวนานประกอบด้วยโปรตีน Fos-like ที่เปลี่ยนแปลงในสมองโดยโคเคนเรื้อรังและการรักษาอื่น ๆ เซลล์ประสาท 13: 1235 – 1244 pmid: 7946359 ดอย: 10.1016 / 0896-6273 (94) 90061-2
  91. 4. Hiroi N, Brown J, Haile C, Ye H, Greenberg ME, Nestler EJ (1997) หนูกลายพันธุ์ FosB: การสูญเสียการเหนี่ยวนำโคเคนเรื้อรังของโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับ Fos และความไวที่เพิ่มขึ้นต่อจิตของโคเคนและผลตอบแทนที่คุ้มค่า Proc Natl Acad Sci USA 94: 10397–10402 pmid: 9294222 ดอย: 10.1073 / pnas.94.19.10397
  92. 5 Ulery PG, Rudenko G, Nestler EJ (2006) ระเบียบของΔFosBเสถียรภาพโดย phosphorylation J Neurosci 26: 5131 – 5142 pmid: 16687504 ดอย: 10.1523 / jneurosci.4970-05.2006
  93. 6 Carle TL, Ohnishi YN, Ohnishi YH, Alibhai IN, Wilkinson MB, Kumar A, et al. (2007) การไม่มีโดเมน degron C-terminal ที่อนุรักษ์ไว้มีส่วนทำให้เสถียรภาพที่เป็นเอกลักษณ์ของΔFosB Eur J Neurosci 25: 3009 – 3019 PMID: 17561814
  94. 7 Robison AJ, Vialou V, Mazei-Robison M, Feng J, Kourrich S, Collins M, และคณะ (2013) การตอบสนองเชิงพฤติกรรมและโครงสร้างของโคเคนเรื้อรังต้องใช้ห่วงการส่งต่อที่เกี่ยวข้องกับΔFosBและ CaMKII ในนิวเคลียสเปลือก accumbens J Neurosci 33: 4295 – 4307 ดอย: 10.1523 / JNEUROSCI.5192-12.2013 PMID: 23467346
  95. 8 Kelz MB, Chen J, Carlezon WA Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, และคณะ (1999) การแสดงออกของปัจจัยการถอดรหัสΔFosBในสมองควบคุมความไวต่อโคเคน ธรรมชาติ 401: 272 – 276 PMID: 10499584
  96. 9 Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, Self DW (2003) ΔFosBช่วยเพิ่มแรงจูงใจสำหรับโคเคน J Neurosci 23: 2488 – 2493 PMID: 12657709
  97. 10 McClung CA, Nestler EJ (2003) กฎระเบียบของการแสดงออกของยีนและรางวัลโคเคนโดย CREB และ DFosB Nat Neurosci 11: 1208 – 1215 pmid: 14566342 ดอย: 10.1038 / nn1143
  98. 11 Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, และคณะ (2006) ΔFosB: บทบาทสำคัญสำหรับΔFosBในนิวเคลียส accumbens ในการกระทำมอร์ฟีน ธรรมชาติ Neurosci 9: 205 – 211 pmid: 16415864 ดอย: 10.1038 / nn1636
  99. 12 MC Peakman, Colby C, Perrotti LI, Tekumalla P, Carle T, Ulery P, และคณะ (2003) เหนี่ยวนำให้เกิดการแสดงออกเฉพาะภูมิภาคของสมองของการกลายพันธุ์เชิงลบที่โดดเด่นของ c-Jun ในหนูดัดแปลงพันธุกรรมลดความไวต่อโคเคน ความต้านทานของสมอง 970: 73 – 86 pmid: 12706249 ดอย: 10.1016 / s0006-8993 (03) 02230-3
  100. 13 Chen J, Nye HE, Kelz MB, Hiroi N, Nakabeppu Y, และคณะ (1995) กฎระเบียบของโปรตีนเดลต้า FosB และ FosB เหมือนกันโดยการรักษาด้วยไฟฟ้ายึดและโคเคน Mol Pharmacol 48: 880 – 889 PMID: 7476919
  101. 14 Hiroi N, Marek GJ, Brown J, Ye H, Saudou F, Vaidya VA, และคณะ (1998) บทบาทที่สำคัญของยีน fosB ในการกระทำระดับโมเลกุลเซลล์และพฤติกรรมของการชักด้วยไฟฟ้า J Neurosci 18: 6952 – 6962 PMID: 9712664
  102. 15 Perez-Otano I, Mandelzys A, มอร์แกน JI (1998) MPTP พาร์กินสันนิยมมาพร้อมกับการแสดงออกอย่างต่อเนื่องของโปรตีนที่คล้าย D-FosB ในเส้นทางโดปามีน Mol Brain Res 53: 41 – 52 pmid: 9473580 ดอย: 10.1016 / s0169-328x (97) 00269-6
  103. 16 Ma J, Ptashne M (1988) การแปลงสารยับยั้งยูคาริโอทให้เป็นยากระตุ้น เซลล์ 55: 443 – 446 pmid: 3180218 ดอย: 10.1016 / 0092-8674 (88) 90030-x
  104. 17 Chien CT, Bartel PL, Sternglanz R, Fields S (1991) ระบบสองลูกผสม: วิธีการระบุและโคลนยีนของโปรตีนที่มีปฏิสัมพันธ์กับโปรตีนที่น่าสนใจ Proc Natl Acad Sci สหรัฐอเมริกา 88: 9578 – 9582 pmid: 1946372 ดอย: 10.1073 / pnas.88.21.9578
  105. 18 Nakabeppu Y 1, Oda S, Sekiguchi M (1993) กระตุ้นการทำงานของเซลล์ Rat-1A ที่สงบนิ่งโดย delta FosB Mol Cell Biol 13: 4157 – 4166 PMID: 8321220
  106. 19 Scobie KN, Damez-Werno D, Sun H, Shao N, Gancarz A, Panganiban CH, et al. (2014) บทบาทสำคัญของโพลี (ADP-ribosyl) ในการกระทำโคเคน Proc Natl Acad Sci สหรัฐอเมริกา 111: 2005 – 2010 doi: 10.1073 / pnas.1319703111 PMID: 24449909
  107. 20 Perrotti LI, ผู้ประกอบ RR, Robison B, Renthal W, เขาวงกต I, Yazdani S, และคณะ (2008) รูปแบบที่แตกต่างของการเหนี่ยวนำΔFosBในสมองโดยยาเสพติด ไซแนปส์ 62: 358 – 369 doi: 10.1002 / syn.20500 PMID: 18293355
  108. 21 วัง WL, Chevray PM, Nathans D (1996) Mammalian Sug1 และ c-Fos ใน proteasome 26S นิวเคลียร์ Proc Natl Acad Sci สหรัฐอเมริกา 93: 8236 – 8240 pmid: 8710853 ดอย: 10.1073 / pnas.93.16.8236
  109. 22 Koues OI 1, ดัดลีย์ RK, Truax AD, Gerhardt D, Bhat KP, McNeal S, และคณะ (2008) ระเบียบ acetylation ที่สำคัญ histocompatibility คลาส II โปรโมเตอร์ใกล้เคียงที่ซับซ้อนโดย 19S proteasomal ATPase Sug1 Mol Cell Biol 28: 5837 – 5850 doi: 10.1128 / MCB.00535-08 PMID: 18662994
  110. 23 Levine AA, Guan Z, Barco A, Xu S, Kandel ER, Schwartz JH (2005) CREB-binding โปรตีนควบคุมการตอบสนองต่อโคเคนโดย acetylating histones ที่ fosB ก่อการในเมาส์ striatum Proc Natl Acad Sci สหรัฐอเมริกา 102: 19186 – 19191 pmid: 16380431 ดอย: 10.1073 / pnas.0509735102
  111. 24 Kumar A, Choi KH, Renthal W, Tsankova NM, Theobald DEH, Truong HT, และคณะ (2005) การปรับปรุงโครมาตินเป็นกลไกสำคัญที่เกี่ยวข้องกับความเป็นพลาสติกที่เกิดจากโคเคนใน striatum เซลล์ประสาท 48: 303 – 314 pmid: 16242410 ดอย: 10.1016 / j.neuron.2005.09.023
  112. 25. St-Arnaud R (1999) ฟังก์ชั่นคู่สำหรับหน่วยงานกำกับดูแลการถอดเสียง: ตำนานหรือความจริง J Cell Biochem Suppl 32/33: 32–40 ดอย: 10.1002 / (sici) 1097-4644 (1999) 75: 32+ <32 :: aid-jcb5> 3.0.co; 2-x
  113. 26 Ferrell K, Wilkinson CRM, Dubiel W, Gordon C (2000) ปฏิสัมพันธ์ระหว่างหน่วยย่อยของ 26S proteasome ซึ่งเป็นปัญหาที่ซับซ้อน เทรนด์ Biochem Sci 25: 83 – 88 pmid: 10664589 ดอย: 10.1016 / s0968-0004 (99) 01529-7
  114. 27 von der Lehr N, Johansson S, Larson LG (2003) ความหมายของระบบ ubiquitin / proteasome ในการถอดความที่ควบคุมโดย myc รอบเซลล์ 2 – 5: 403 – 407 doi: 10.4161 / cc.2.5.484
  115. 28 Geng FQ, Wenzel S, Tansey WP (2012) Ubiquitin และโปรตีโอโซมในการถอดรหัส Annu Rev Biochem 81: 177 – 201 ดอย: 10.1146 / annurev-biochem-052110-120012 PMID: 22404630
  116. 29 Collins GA, Tansey WP (2006) proteasome: เครื่องมือยูทิลิตี้สำหรับการถอดความ? Curr Op Genet Dev 16: 197 – 202 PMID: 16503126
  117. 30. Sun DH, Swaffield JC, Johnston SA, Milligan CE, Zoeller RT, Schwartz LM (1997) การระบุสมาชิกในตระกูล Sug1 CAD ที่ได้รับการอนุรักษ์ทาง phylogenetically ซึ่งแสดงออกอย่างแตกต่างกันในระบบประสาทของเมาส์ Dev Neurobiol 33: 877–890 ดอย: 10.1002 / (sici) 1097-4695 (199712) 33: 7 <877 :: aid-neu2> 3.0.co; 2-5