Proc Natl Acad Sci US A. Apr 29, 2014; 111 (17): 6455 – 6460
เผยแพร่ออนไลน์ เม.ย. 15, 2014 ดอย: 10.1073 / pnas.1404323111
PMCID: PMC4036004
Neuroscience
Teruko Danjo,a เคนจิโยชิมิ,b คาซึโอะฟุนาบิกิ,a Satoshi Yawata,a และ Shigetada Nakanishia,1
บทความนี้ได้รับ อ้างถึงโดย บทความอื่น ๆ ใน PMC
อย่างมีนัยสำคัญ
เซลล์โดปามีน (DA) ในพื้นที่หน้าท้อง (VTA) ตอบสนองต่อสิ่งเร้า aversive ส่วนใหญ่จากการทำให้เงียบลงชั่วคราว มันยังไม่ชัดเจนว่าปฏิกิริยานี้ก่อให้เกิดปฏิกิริยาตอบสนองโดยตรงในเมาส์พฤติกรรม เราตรวจสอบคำถามนี้โดยการควบคุมทัศนะของเซลล์ประสาท DA ใน VTA และพบว่าการหยุดการทำงานของเซลล์ประสาท DA นั้นส่งผลให้เกิดการตอบสนองและการเรียนรู้อย่างรวดเร็ว นิวเคลียส accumbens (NAc) นิวเคลียสเอาท์พุทที่สำคัญของเซลล์ประสาท VTA DA ได้รับการพิจารณาให้รับผิดชอบต่อการตอบสนองนี้ดังนั้นเราจึงตรวจสอบว่าเส้นทางพื้นฐานใน NAc ใดที่มีความสำคัญต่อพฤติกรรมนี้โดยใช้ตัวรับสัญญาณ D1 หรือ D2 และพบว่าเส้นทางเฉพาะตัวรับ D2 นั้นมีความสำคัญสำหรับพฤติกรรมนี้
นามธรรม
การส่ง Dopamine (DA) จาก ventral tegmental area (VTA) เป็นสิ่งสำคัญสำหรับการควบคุมพฤติกรรมที่ให้ผลตอบแทนและการหลีกเลี่ยง การระงับเสียงชั่วคราวของเซลล์ประสาท DA เป็นหนึ่งในการตอบสนองต่อสิ่งเร้า aversive แต่ผลที่ตามมาและกลไกประสาทที่เกี่ยวข้องกับการตอบสนอง aversive และการเรียนรู้ยังคงเข้าใจยาก. ที่นี่ เรารายงานว่าการปิดใช้งาน optogenetic ของเซลล์ประสาท VTA DA ทันทีควบคุมระดับ DA ลงและเหนี่ยวนำให้เกิดการควบคุมกิจกรรมประสาทในนิวเคลียส accumbens (NAc)) ตามที่ประเมินโดยนิพจน์ Fos Tการปราบปราม optogenetic ของเขาของเซลล์ประสาท DA ยิงทันทีปรากฏการตอบสนอง aversive ไปที่ห้องมืดที่ต้องการก่อนหน้านี้และนำไปสู่การเรียนรู้ aversive ไปยังสถานที่ปรับอากาศ optogenetically ที่สำคัญสถานที่แห่งนี้ถูกยกเลิกเนื่องจากความล้มเหลวของตัวรับ dopamine D2 แต่ไม่ใช่โดยตัวรับ D1 ใน NAc. การระงับเซลล์ประสาท DA ใน VTA จึงเป็นสิ่งที่ขาดไม่ได้ในการกระตุ้นการตอบสนองและเรียนรู้ผ่านตัวรับ dopamine D2 ใน NAc
ระบบ dopaminergic mesolimbic ไม่เพียง แต่มีบทบาทสำคัญในช่วงกว้างของแรงจูงใจและการเรียนรู้ (1-3) แต่ความผิดปกติของมันก็มีส่วนเกี่ยวข้องในความผิดปกติ neuropsychiatric อย่างรุนแรงเป็นแบบสุดขั้วในโรคพาร์กินสัน, โรคจิตเภทและติดยาเสพติด เซลล์โดปามีน (DA) ในพื้นที่หน้าท้อง (TTA) (VTA) ตอบสนองต่อการให้รางวัลสิ่งเร้าโดยการยิงแบบเฟสซิสและหน้าที่หลักของการยิงแบบนี้คือทฤษฎีการเข้ารหัส "ข้อผิดพลาดในการทำนายรางวัล" ความแตกต่างระหว่างค่าที่คาดการณ์ รางวัลจริง (4). ตรงกันข้ามกับการตอบสนองต่อสิ่งเร้าที่ให้รางวัลปฏิกิริยาของพวกเขาต่อสิ่งเร้า aversive อยู่ไกลจากการคล้ายคลึงกัน; กล่าวคือเซลล์ประสาท DA บางตัวทำงานในการตอบสนองต่อสิ่งเร้า aversive ในขณะที่คนอื่น ๆ ส่วนใหญ่มีปฏิกิริยาตอบสนองโดยการยับยั้งการไล่ออก (5-9) ในความเป็นจริงการศึกษาเมื่อเร็ว ๆ นี้พบว่าการกระตุ้นด้วยแสงของเซลล์ประสาท GABAergic และการยับยั้งการทำงานของเซลล์ประสาท DA ลดการบริโภคของรางวัลและกระตุ้นการตอบสนองแบบ aversive (10, 11) อย่างไรก็ตามมันยังคงเข้าใจยากเป็นส่วนใหญ่ว่ากลไกใดในวงจรประสาทมีความจำเป็นสำหรับการได้มาซึ่งการเรียนรู้แบบ aversive หลังจากการใช้งานของเซลล์ประสาท DA ใน VTA และการควบคุมพฤติกรรมตอบสนองต่อการปราบปรามการบริโภคแบบรางวัลและพฤติกรรมการ aversive
หลักฐานสะสมได้เปิดเผยว่าการเรียนรู้ที่สร้างแรงบันดาลใจและความรู้ความเข้าใจในการตอบสนองต่อสิ่งเร้าบวกและลบส่วนใหญ่จะถูกควบคุมโดยวงจรประสาทรวมทั้งปมประสาทฐาน (12) ซึ่งได้รับการฉายโดปามีนจำนวนมากจากสมองส่วนกลาง ใน striatum วงจรประสาทขั้นพื้นฐานสองวงจรประกอบด้วยเซลล์ประสาทหนามขนาดกลางที่ระบุ (MSNs) ที่ระบุแต่ละตัวแสดงประเภทของตัวรับ DA ที่ชัดเจน (13).
- วงจรหนึ่งคือทางเดินตรงซึ่งประกอบด้วย MSNs ที่ฉายโดยตรงไปยังนิวเคลียสเอาท์พุทของฐานปมประสาท substantia nigra pars reticulata (SNr) และส่วนใหญ่แสดง dopamine D1Rs ตัวรับ (D1Rs).
- อีกทางคือทางอ้อมซึ่งประกอบด้วย MSN ที่ฉายทางอ้อมผ่านลูกโลกทองคำไปยัง SNr และแสดงตัวรับ dopamine D2 ตัวรับ (D2Rs) เป็นหลัก
สัญญาณ DA จาก midbrain ปรับเปลี่ยนเส้นทางขนานทั้งสองแบบไดนามิกในลักษณะตรงกันข้ามผ่าน D1Rs และ D2Rs และการปรับนี้ควรจะช่วยให้เกิดการเรียนรู้ที่สร้างแรงบันดาลใจ (3, 14).
- สำหรับสิ่งเร้าที่ให้รางวัลระดับ DA ที่ควบคุมได้โดยการให้สัญญาณถือว่าเป็นตัวกระตุ้น D1R และช่วยอำนวยความสะดวกให้กับทางเดินตรงในนิวเคลียส accumbens (NAc).
- ในทางตรงกันข้ามการปราบปรามของเซลล์ประสาท DA ไล่ออกในการตอบสนองต่อสิ่งเร้า aversive ลดระดับ DA ใน NAc; และปฏิกิริยานี้ควรส่งเสริมการส่งสัญญาณโดยเฉพาะในทางเดินอ้อมผ่านการเปิดใช้งาน D2R.
แม้ว่าการศึกษาโดยใช้กลยุทธ์ทางเภสัชวิทยาและวิธีการปิดกั้นสารสื่อประสาทแบบพลิกกลับได้ (RNB) ได้สนับสนุนกลไกการควบคุมนี้ใน NAc (15, 16) มันยังไม่ทราบว่าการปราบปรามการยิงของเซลล์ประสาท DA นั้นเพียงพอแล้วหรือไม่ที่จะส่งเสริมกิจกรรมของทางเดินอ้อมและก่อให้เกิดพฤติกรรมหลีกเลี่ยง ในการศึกษานี้เราได้กล่าวถึงปัญหานี้โดยการยับยั้งการทำงานของเซลล์ประสาท DA ใน VTA โดยการเลือกใช้โปรตีนอาร์คแบบเมมเบรน17) และแสดงให้เห็นอย่างชัดเจนว่าการปราบปรามของเซลล์ประสาท DA ใน VTA นั้นลดลงในระดับ DA ใน NAc และเหนี่ยวนำให้เกิดปฏิกิริยา aversive และการเรียนรู้ นอกจากนี้เราตรวจสอบกลไกของการควบคุมปฏิกิริยานี้และเปิดเผยว่าปฏิกิริยา aversive นี้ถูกควบคุมโดย D2Rs เฉพาะใน NAc
ผลสอบ
การยับยั้ง Optogenetic ของ DA เซลล์ประสาทบล็อกการตั้งค่าห้องมืด
ในการหยุดการเลือกใช้เซลล์ประสาท DA โดยการฉีดเราจะสร้างโครงสร้างที่เกี่ยวข้องกับการสร้างไวรัสที่เกี่ยวข้องกับ adeno ที่เกี่ยวข้องกับการสร้างรหัส Arch-eGFP [AAV-double-floxed inverted open reading frame (DIO) -Arch] (17) เข้าสู่ VTA ของไทโรซีนไฮดรอกซีเลสสำหรับผู้ใหญ่ (TH) - สร้างหนู (18) และ wild-type (WT) littermates และวางเส้นใยแก้วนำแสงเหนือ VTA (รูปที่ S1 A และ C) สองสัปดาห์หลังการผ่าตัด Arch-eGFP ถูกตรวจพบอย่าง จำกัด ใน VTA (รูปที่ S1B) เราทดสอบผลกระทบ hyperpolarizing ของโปรตีน Arch โดยการบันทึกด้วยไฟฟ้าและวัดผลของการกระตุ้นด้วยแสงของ VTA ของหนู TH-Cre ที่ฉีดด้วย AAV-DIO-Arch ในการบันทึก electrophysiological vivo จาก VTA ของหนูที่ถูกยาสลบ TH-Cre เปิดเผยว่าการกระตุ้นด้วยแสงของเซลล์ประสาท DA สมมุติในการยับยั้งการไล่ออกของพวกเขา (รูปที่ S2) แสดงให้เห็นว่าการกระตุ้นด้วยแสงนั้นมีศักยภาพสูงมากพอที่จะสร้างเมมเบรนของเซลล์อาร์คแสดงถึงการหักห้ามใจและยับยั้งการเผาที่เกิดขึ้นเอง
ด้วยการใช้เมาส์เหล่านี้เราจะตรวจสอบว่าการยับยั้งแสงของเซลล์ประสาท DA ใน VTA สามารถทำหน้าที่เป็นสัญญาณเตือนสำหรับการเรียนรู้พฤติกรรมได้หรือไม่ หนูมีแนวโน้มโดยธรรมชาติที่จะชอบสภาพแวดล้อมที่มืด (19) เราได้ออกแบบเครื่องมือด้านพฤติกรรมซึ่งหนูสามารถสำรวจห้องมืดและพื้นที่เปิดโล่งได้อย่างอิสระ (มะเดื่อ. 1A) หลังจากคุ้นเคยแล้วหนู WT จะอยู่ในห้องมืดมากกว่าโดยมีหรือไม่มีการกระตุ้นด้วยแสงในห้องมืด (รูปที่ S1D) ตรวจสอบให้แน่ใจว่าการกระตุ้นด้วยแสงเองไม่มีอิทธิพลต่อพฤติกรรมที่มืดมิด - เลือกได้ เรากำหนดเวลาการทดลองเชิงพฤติกรรมของสัตว์เพื่อทดสอบผลของการยับยั้งการมองเห็นของเซลล์ประสาท DA ต่อพฤติกรรมของพวกเขา (รูปที่ S1E) หลังจากทำให้เกิดความเคยชินและการทดลองหนูถูกควบคุมโดยการกระตุ้นเซลล์ประสาท DA ในทัศนวิสัยแบบ VTA เมื่อพวกเขาอยู่ในห้องมืด แม้ในช่วง 5 ขั้นต่ำของการปรับอากาศหนู TH-Cre ยังคงอยู่ในห้องมืดที่ต้องการก่อนหน้านี้และหลีกเลี่ยงห้องมืดอย่างต่อเนื่องตลอดการปรับอากาศ (มะเดื่อ. 1B) หนู TH-Cre ไม่ได้หลีกเลี่ยงการกลับไปที่ห้องมืดแม้ว่าพวกเขาจะไม่ได้รับการกระตุ้นสายตาในช่วงหลังการทดลอง (มะเดื่อ. 1C) ข้อมูลเหล่านี้บ่งชี้ว่า hyperpolarization ของ DA neurons ไม่เพียง แต่เหนี่ยวนำให้เกิดพฤติกรรม aversive ชั่วคราว แต่ยังทำหน้าที่เป็นสัญญาณสำหรับการเรียนรู้ aversive กับห้องมืดและยังแสดงให้เห็นว่าการใช้งานของ neurons DA มีบทบาทเชิงสาเหตุในพฤติกรรม aversive ชั่วคราวและ
Optogenetic Down-Regulation ของระดับ DA ใน NAc
เราทำการตรวจสอบครั้งต่อไปว่าการหยุดทำงานของเซลล์ประสาท DA ใน VTA นั้นได้แก้ไขความเข้มข้นของ DA ในพื้นที่เป้าหมายหลักหรือไม่นั่นคือ NAc หรือไม่ เราทำการวัดระดับ DA ใน NAc ด้วยการสแกนแบบ volcametry (FSCV) อย่างรวดเร็วในหนูที่ถูกดมยาสลบ TH-Cre ที่ถูกฉีดด้วย AAV-DIO-Arch เข้าสู่ VTA ระดับ DA ใน NAc ถูกยกระดับทันทีโดยการกระตุ้นด้วยไฟฟ้าของ VTA และการปลดปล่อย DA ที่ถูกเรียกคืนนั้นลดลงอย่างมีนัยสำคัญจากการกระตุ้นด้วยแสงแบบเห็นภาพพร้อมกันของ VTA (รูปที่ S3) จากนั้นเราทดสอบว่าการกระตุ้นด้วยแสงของ VTA สามารถลดระดับโทนิคใน NAc ได้หรือไม่ ในการตั้งค่าการทดลองเดียวกันเราสังเกตว่าระดับ DA ใน NAc ลดลงชั่วคราวโดย 20 s ของการกระตุ้นด้วยแสงของ VTA (มะเดื่อ. 2) ซึ่งสอดคล้องกับปฏิกิริยา FSCV รายงานกับสิ่งเร้า aversive (20) ข้อมูลเหล่านี้แสดงให้เห็นว่าการกระตุ้นด้วยแสงของ VTA นั้นมีประสิทธิภาพเพียงพอที่จะหยุดการทำงานของเซลล์ประสาท VTA DA และลดระดับ DA ใน NAc ในระหว่างการทดลองเชิงพฤติกรรม
การควบคุมการแสดงออกของยีน Fos โดยการยับยั้งการทำงานของเซลล์ประสาท DA ใน VTA
การเปลี่ยนแปลงพฤติกรรมที่เกิดจากการหยุดการทำงานของเซลล์ประสาท DA ใน VTA มีเงื่อนไขว่าการกระตุ้นด้วยแสงเป็นการเปลี่ยนแปลงกิจกรรมของระบบประสาทโดยตรงและส่งผลให้ประสิทธิภาพของพฤติกรรมเปลี่ยนไป ดังนั้นเราจึงตรวจสอบภูมิภาคต่อไปที่กิจกรรมของระบบประสาทถูกยกระดับโดยการยับยั้งการทำงานของเซลล์ประสาท DA โดยการตรวจสอบการแสดงออกของ Fos ซึ่งเป็นยีนเริ่มต้นทันที ไม่นานหลังจากการปรับสภาพในการทดสอบในห้องมืดหนูถูกประมวลผลอย่างรวดเร็วเพื่อตรวจสอบปริมาณการแสดงออกของ Fos โดยการวิเคราะห์เชิงปริมาณในการวิเคราะห์ลูกผสมแหล่งกำเนิด (มะเดื่อ. 3 และ รูปที่ S4) The NAc ซึ่งเป็นภูมิภาคที่ได้รับสาร dopaminergic จาก VTA จำนวนมากแสดงให้เห็นถึงการแสดงออกของ Fos ที่เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในหนู TH-Cre (มะเดื่อ. 3) การควบคุมนี้ยังตรวจพบในด้าน contralateral ของการกระตุ้นด้วยแสงซึ่งเกิดจากการติดเชื้อไวรัสจำนวนเล็กน้อยในด้านนั้น อย่างไรก็ตามการเพิ่มขึ้นของกฎระเบียบนั้นสูงกว่าที่ด้าน ipsilateral มากกว่าด้าน contralateral ของการกระตุ้นด้วยแสงแสดงให้เห็นว่าการยับยั้งการมองเห็นของเซลล์ประสาท DA นั้นควบคุมกิจกรรมทางประสาทของ NAc โดยตรง การแสดงออกของ Fos ที่เพิ่มขึ้นนั้นพบได้ในบริเวณสมองอื่น ๆ รวมถึงกะบัง, พื้นที่ periventricular ของ striatum, amygdala basolateral (BLA) และมลรัฐด้านข้าง แต่ไม่อยู่ใน habenula ด้านข้างหรือ medial prefrontal cortex (mPFC; รูปที่ S4) ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่าภูมิภาคที่เปิดใช้งานโดยการปิดใช้งานออปติคัลของเซลล์ประสาท DA ไม่ได้ จำกัด อยู่ที่พื้นที่เป้าหมายโดยตรงของเซลล์ประสาท VTA DA แต่รวมถึงภูมิภาคที่สามารถเปิดใช้งานทางอ้อมในลักษณะที่ขึ้นกับวงจรประสาท การสังเกตนี้แสดงให้เห็นว่าการปิดใช้งานออปติคัลของเซลล์ประสาท DA ปรับกิจกรรมของเซลล์ประสาททั้งวงจรและไม่เพียง แต่ทำให้เกิดปฏิกิริยา aversive แต่ยังกระตุ้นการทำงานของสมองอื่น ๆ อีกมากมายเช่นความวิตกกังวลความกลัวและการตอบสนองความเครียด21).
การส่งสัญญาณ DA ผ่าน D2R เป็นสิ่งสำคัญสำหรับการหลีกเลี่ยงสถานที่ที่ถูกกระตุ้นด้วยแสง
สัญญาณโดปามีนส่วนใหญ่จาก VTA จะถูกส่งไปยัง MSNs ใน NAc ผ่านตัวรับ DA, D1R และ D2R D1R แสดงออกเกือบเฉพาะในสาร P (เขียนโดยยีน Tac1) - แสดง MSNs และ D2R แสดงออกอย่างเด่นชัดใน enkephalin (เขียนโดยยีน Penk) - ส่ง MSNs; MSNs แต่ละประเภทประกอบด้วยเส้นทางตรงและทางอ้อมตามลำดับใน NAc (3) เนื่องจากความสัมพันธ์ของ DA สูงกว่าสำหรับ D2R (ลำดับ nM) มากกว่าสำหรับ D1R (ลำดับ µM) (22, 23) การลดลงของระดับ DA นั้นคาดว่าจะส่งผลในการหยุดการทำงานของ Gi- D2R สองตัว แต่ไม่มีผลกระทบที่เห็นได้ชัดใน D1R (3, 24) ดังนั้นจึงควบคุมกิจกรรมของระบบประสาทโดยเฉพาะในทางเดินอ้อม ยิ่งไปกว่านั้นการเปิดใช้งาน Fos ถูกสังเกตเห็นได้อย่างชัดเจนใน Penk- หรือ Drd2 (D2R) - แสดงเซลล์มากกว่าใน Tac1- หรือ Drd1a (D1R) - แสดงเซลล์ (รูปที่ S5) จากการสังเกตเหล่านี้เราตั้งสมมติฐานว่าการส่งสัญญาณ DA ผ่าน D2R สามารถมีบทบาทสำคัญในการปรับสภาพ aversive ที่สังเกตได้
เพื่อทดสอบสมมติฐานนี้เราได้ทำการทดสอบแบบสามห้อง (APA)รูปที่ S6) เราได้จัดเตรียมเครื่องมือด้านพฤติกรรมที่มีห้องสองห้องที่มีสถานการณ์ที่เหมือนจริงและทางเดินเล็ก ๆ แห่งหนึ่ง สภาพแวดล้อมที่ไม่เอนเอียงนี้ในการทดสอบ CPA ทำให้เราสามารถตรวจสอบเพิ่มเติมได้ว่าการปิดใช้งานของเซลล์ประสาท VTA DA นั้นสามารถกระตุ้นปฏิกิริยา aversive และการเรียนรู้ได้นอกเหนือจากการปิดกั้นการตั้งค่าห้องมืด เมื่อสัตว์ได้รับอนุญาตให้เคลื่อนที่อย่างอิสระรอบ ๆ อุปกรณ์ทั้งหมดพวกเขาส่วนใหญ่อยู่ในห้องสองห้องโดยไม่มีความแตกต่างด้านพฤติกรรมโดยทั่วไปก่อนการทดลอง การปรับสภาพด้วยแสงนั้นดำเนินการโดยจับคู่การกระตุ้นด้วยแสงกับหนึ่งห้องคงที่ แม้เมื่อใช้ห้องใดห้องหนึ่งสำหรับการปรับสภาพ แต่หนู TH-Cre ยังคงอยู่และหลีกเลี่ยงการอยู่ในห้องที่มีการปรับสภาพสายตาอย่างมีนัยสำคัญในระหว่างการปรับสภาพและหลังการทดสอบ (รูปที่ S6 B-E) การวิเคราะห์ทางสถิติยืนยันว่าการลดเวลาพักของหนู TH-Cre อย่างมีนัยสำคัญในห้องปรับสภาพสายตาหลังการทดลองเมื่อเปรียบเทียบกับเวลาพักสำหรับหนู WT (รูปที่ S6F).
จากนั้นเราพยายามที่จะระบุชนิดย่อยตัวรับ DA ที่เกี่ยวข้องกับพฤติกรรม aversive นี้โดยการระงับเฉพาะตัวรับ DA แต่ละตัวใน NAc โดยเฉพาะ (มะเดื่อ. 4 และ รูปที่ S7) เราออกแบบและตรวจสอบเวกเตอร์ lentiviral ที่มี hairpin สั้น RNA (shRNA) เฉพาะสำหรับตัวรับ DA แต่ละตัวที่มีการแสดงออกของ mCherry สามสัปดาห์หลังจากฉีด lentivirus ลงใน NAc การแสดงออกที่แข็งแกร่งของ mCherry ได้รับการแปลใน NAc (มะเดื่อ. 4B) การล้มลงอย่างมีประสิทธิภาพของการแสดงออก mRNA ของผู้รับแต่ละตัวนั้นได้รับการยืนยันโดยการวิเคราะห์เชิงปริมาณแบบเรียลไทม์ PCR (รูปที่ S7A) การวัดระดับโปรตีนผ่าน Western blotting ยังเผยให้เห็นว่าการฉีด lentiviruses แต่ละรายการจะลดปริมาณโปรตีนเป้าหมายโดยไม่ส่งผลกระทบต่อการแสดงออกของชนิดย่อยอื่น ๆ ของ DA receptor (มะเดื่อ. 4C และ รูปที่ S7 B-G) lentiviruses shD1R- และ shD2R- ลดระดับโปรตีนเป้าหมายของพวกเขาเป็น 46.2 ± 1.1% และ 38.4 ± 4.9% ตามลำดับเมื่อเทียบกับระดับของไวรัสควบคุม (มะเดื่อ. 4C) ผลลัพธ์เหล่านี้ตรวจสอบว่าเวกเตอร์ lentiviral แสดง shRNA ที่เฉพาะเจาะจงสำหรับ D1R และ D2R คัดเลือกและยับยั้ง RNA เป้าหมายของพวกเขาอย่างเพียงพอและเพียงพอและควบคุมปริมาณของผลิตภัณฑ์โปรตีนที่เกี่ยวข้อง นอกจากนี้เรายังยืนยันว่าไม่พบการแสดงออกของไวรัส mCherry ใน VTA ไม่รวมถึงความเป็นไปได้ที่ shRNA ที่ใช้สื่อกลาง lentivirus ส่งผลโดยตรงต่อ VTA
การใช้ lentiviruses เหล่านี้ที่มี shRNA เราได้ทดสอบชนิดของตัวรับ DA ซึ่งรับผิดชอบต่อพฤติกรรม aversive ที่เกิดจากการปิดใช้งาน optogenetic ของเซลล์ประสาท DA เราฉีด lentivirus ที่ประกอบด้วย shRNA หรือควบคุม lentivirus ลงใน NAC ระดับทวิภาคีร่วมกับ AAV-DIO-Arch เข้าสู่ VTA ด้านซ้ายของหนู TH-Cre ใยแก้วนำแสงก็ถูกแทรกไว้เหนือ VTA (มะเดื่อ. 4A) เมื่อการทดสอบ CPA สามห้องได้ดำเนินการในสามสัปดาห์หลังการผ่าตัดหนู TH-Cre ที่ฉีดด้วย lenti: shD1R-mCherry ยังคงแสดง CPA ชัดเจนกับห้องจับคู่การกระตุ้นด้วยแสงที่เทียบได้กับหนู TH-Cre ที่ฉีดด้วย ควบคุม lentivirus (lenti: mCherry) ในทางตรงกันข้ามหนู TH-Cre ที่ฉีดด้วย lenti: shD2R-mCherry ล้มเหลวในการแสดง CPA ที่เห็นได้ชัดในระหว่างการปรับสภาพ (มะเดื่อ. 4D) การขาดดุลพิเศษในการเรียนรู้ของหนู TH-Cre ที่ฉีดด้วย lenti: shD2R-mCherry ได้รับการพิสูจน์เพิ่มเติมโดยการวิเคราะห์การเรียนรู้ aversive ที่หลังการทดสอบ (มะเดื่อ. 4E) ผลลัพธ์เหล่านี้แสดงให้เห็นว่าพฤติกรรม aversive ไปยังสถานที่ปรับอากาศโดยการใช้งานเซลล์ประสาท DA ถูกแสดงออกมาโดยเฉพาะผ่าน D2R และไม่ผ่าน D1R ใน NAc
การสนทนา
ใน striatum การศึกษาพบว่าการกระตุ้นของ Gs- D1R สองตัวช่วยอำนวยความสะดวกในการยิงขณะเปิดใช้งาน GiD2R สองตัวส่งผลให้ประสิทธิภาพการยิงถูกระงับ (25). Acตามความจำเพาะของการแสดงออกของ DA receptor การแสดงออกของ phasic firings ของ DA neurons ส่วนใหญ่เปิดใช้งานทางเดินตรงผ่าน D1R ในขณะที่การลดลงชั่วคราวใน DA neuron firings ส่งเสริมความสามารถทางอ้อมทางอ้อมผ่าน D2R (3, 26). จากกลไกการควบคุมนี้ได้มีการเสนอว่าการระงับเซลล์ประสาทของ DA ในการตอบสนองต่อสิ่งเร้า aversive ส่วนใหญ่จะถูกประมวลผลผ่านทางเดินอ้อมและผลลัพธ์ในพฤติกรรม aversive (3) การศึกษาล่าสุดได้แสดงให้เห็นว่าการปิดล้อมของการส่ง synaptic ของทางเดินทางอ้อมบั่นทอนการได้มาของพฤติกรรม aversive นำโดยไฟฟ้าช็อต (15) และการด้อยค่านี้เกิดจากการยับยั้งการส่งสัญญาณแบบ D2R (16) ผมn นอกจากนี้ optogenetic up-regulated ของ D2R- แสดง MSNs ในทางอ้อมทำให้เกิดการหลีกเลี่ยงพฤติกรรม (27) อย่างไรก็ตามเนื่องจากเซลล์ประสาท DA แสดงการไล่ออกทั้งที่ได้รับการเสริมและระงับเพื่อตอบสนองต่อสิ่งเร้า aversive และเนื่องจากข้อมูลทางประสาทสัมผัสที่เกี่ยวข้องกับการกระตุ้นอื่น ๆ ถูกประมวลผลพร้อมกันในสมองจึงยังคงเป็นที่ชัดเจนว่าการเงียบของเซลล์ประสาท DA สามารถกระตุ้นปฏิกิริยา aversive และปฏิกิริยานี้ได้รับการควบคุมผ่าน D2R ที่แสดง MSNs ในเส้นทางเดินทางอ้อมหรือไม่
ในการศึกษานี้เราใช้การควบคุมแบบออโทเจเนติกของการเกิดฟิวชั่นของเซลล์ประสาท DA ในการทดสอบพฤติกรรมสองแบบ: การทดสอบการตั้งค่าห้องมืดและการทดสอบ CPA สามห้อง การจัดการด้านออพโตจีเนติคของเราแสดงให้เห็นถึงการปราบปรามอย่างมีประสิทธิภาพของเซลล์ประสาท DA ใน VTA และการควบคุมระดับ DA ใน NAc. การปิดใช้งานออพโตเจเนติกที่แม่นยำของเซลล์ประสาท DA ในช่วงเวลาที่สัตว์อยู่ในห้องปรับอากาศทำให้เกิดปฏิกิริยา aversive และการเรียนรู้อย่างชัดเจนแสดงให้เห็นว่าการเงียบ DA ชั่วคราวทำให้เกิดพฤติกรรมการหลีกเลี่ยงแบบพาสซีฟโดยตรง นอกจากนี้การตรวจสอบนี้ได้ชี้แจงว่าการประมวลผลสัญญาณที่ใช้สื่อกลางของ D2R เป็นปัจจัยสำคัญสำหรับการเหนี่ยวนำปฏิกิริยา aversive และการเรียนรู้นี้
แม้ว่าข้อมูลของเราจะแสดงให้เห็นว่า D1R ไม่มีผลในการทดลองเชิงพฤติกรรมเพื่อทำให้เกิด CPA แต่มีงานวิจัยหลายชิ้นที่ได้บันทึกไว้ว่าการยิง phasic ของเซลล์ประสาท DA นั้นจำเป็นสำหรับการตอบสนองต่อความกลัว28, 29) ความแตกต่างนี้เกิดจากการตั้งค่าการทดลอง นั่นคือวิธีการ optogenic ของเราไม่รวมถึงความเป็นไปได้ของการส่งสัญญาณผ่านเซลล์ประสาท DA ที่กระตุ้นการทำงานเพื่อทำให้เกิดพฤติกรรม aversive แสดงให้เห็นว่าการหยุดการทำงานของเซลล์ประสาท DA นั้นเพียงพอที่จะทำให้เกิดพฤติกรรม aversive และการเรียนรู้ ฟังก์ชั่นและการประมวลผลสัญญาณของการยิง DA แบบแอคทีฟที่ปรากฏโดยสิ่งเร้า aversive จะมีส่วนร่วมที่แตกต่างกับพฤติกรรม aversive จากสิ่งที่ศึกษาที่นี่และจำเป็นต้องชี้แจงในอนาคต
DA neurons ยังฉายไปยังภูมิภาคอื่น ๆ อีกมากมายรวมถึง mPFC, amygdala และ hippocampus ผลการศึกษาล่าสุดระบุว่า การเปิดใช้งาน optogenetic ของเซลล์ประสาท habenula ด้านข้างที่ฉายไปยังเซลล์ประสาท DA ใน VTA มีความสามารถในการกระตุ้นพฤติกรรม aversive และเซลล์ประสาท DA เหล่านี้ส่วนใหญ่และเฉพาะเป้าหมายไปที่ mPFC (30) แม้ว่าการปรับสภาพแสงเชิงสายตาของพวกเขาจะแตกต่างจากการศึกษาปัจจุบันของเรา เนื่องจากมีรายงานว่า dopaminergic input ไปยัง mPFC ไม่เพียง แต่ถูกกระตุ้นด้วย aversive แต่ยังเกิดจากความเครียดเรื้อรังด้วย31, 32) เป็นไปได้ว่าการเปิดใช้งานเซลล์ประสาท DA ของ mPFC ที่ฉายอย่างต่อเนื่องจะถูกมองว่าเป็นสัญญาณจากสภาพแวดล้อมที่มีความเครียดสูง และเป็นผลมาจากการสะสมของความเครียดปรับอากาศสัตว์จะแสดงพฤติกรรม aversive ไปที่ห้องปรับอากาศ ในทางตรงกันข้ามเรายับยั้งการยิงของเซลล์ประสาท DA เท่านั้นในขณะที่สัตว์อยู่ในห้องปรับอากาศ ผลจากการทดลองพฤติกรรมของเราโดยใช้การจับคู่ตามกำหนดเวลาบ่งชี้ว่าการปราบปรามสัญญาณ DA อย่างฉับพลันนั้นจะถูกมองว่าเป็นอินพุต aversive ที่ฉับพลันซึ่งส่งผลให้เกิดการตอบสนองอย่างรวดเร็ว
เซลล์ประสาท DA ยังคาดการณ์ถึง amygdala ซึ่งเป็นภูมิภาคที่มีส่วนช่วยในการตอบสนองต่อความกลัว แท้จริงแล้วการส่งสัญญาณ DA สู่ amygdala นั้นมีส่วนเกี่ยวข้องในการตอบสนองความกลัวและการได้มาซึ่งความทรงจำความกลัว (33, 34) ในการศึกษาของเราการติดฉลาก DA neurons ใน VTA ระบุชุดของ DA neurons ที่ฉายไปยัง BLA แต่ขอบเขตของการคาดการณ์เหล่านี้ต่ำกว่าการคาดการณ์ของ NAc มาก แม้ว่าเราไม่สามารถแยกผลกระทบเล็กน้อยจากการส่งสัญญาณ DA ของ amygdala ที่คาดการณ์ไว้ในพฤติกรรม aversive ที่เราสังเกตเห็น, ผลกระทบหลักของการยับยั้ง optogenetic ของเซลล์ประสาท DA ควรอยู่ใน NAc, เนื่องจากการทดลองของเรากับ D2R ลดลงอย่างมาก พฤติกรรม aversive การสืบสวนในอนาคตเกี่ยวกับการส่งสัญญาณ DA เฉพาะเป้าหมายนั้นจำเป็นต้องมีการอธิบายถึงผลกระทบของการดัดแปลงเซลล์ประสาท DA ทั่วทั้งวงจรที่มีต่อสิ่งเร้าที่น่าตื่นเต้นและการปรับสภาพความกลัว
วัสดุและวิธีการ
อาสาสมัคร
ไทโรซีนไฮดรอกซีเลส :: IRES-Cre (TH-Cre) หนูน็อคหนู (EM: 00254) (18) ได้รับมาจากคลังข้อมูลการกลายพันธุ์ของเมาส์ในยุโรป สัตว์ทดลองทุกตัวได้รับการผสมพันธุ์กับสายพันธุ์ C57BL / 6J มากกว่ารุ่น 10 หนูถูกผสมพันธุ์กับหนู C57BL / 6J WT และได้รับการตกแต่งด้วย 12-h light / 12-h วงจรมืดมาตรฐานและให้อาหารและน้ำ Cre+ และ Cre- ใช้หนูจากสัตว์ทดลองเดียวกัน (อายุ 3 – 6 mo) สำหรับการทดลอง การทดลองสัตว์ทั้งหมดได้รับการอนุมัติจากคณะกรรมการสัตว์ของสถาบันวิทยาศาสตร์ชีวภาพโอซาก้าภายใต้แนวทางการทดลองสัตว์
แบบทดสอบพฤติกรรม
ในระหว่างการทดสอบพฤติกรรมหนูถูกเชื่อมต่อกับใยแก้วนำแสงและอนุญาตให้ย้ายไปรอบ ๆ อุปกรณ์ทั้งหมด การเคลื่อนไหวของหนูถูกตรวจสอบเพื่อให้พวกเขาสามารถเคลื่อนที่ไปรอบ ๆ โดยไม่มีสิ่งกีดขวางใด ๆ แม้ว่าพวกเขาจะเชื่อมต่อกับใยแก้วนำแสงบนหัวของพวกเขา ตำแหน่งของเมาส์ถูกตรวจพบโดยกล้องวิดีโอที่แขวนอยู่เหนือเครื่องมือพฤติกรรมและวิเคราะห์โดยโปรแกรมที่ทำขึ้นเองโดยใช้ซอฟต์แวร์ Labview
การทดสอบการตั้งค่าห้องมืด
เครื่องมือปรับแต่งพฤติกรรมที่ใช้ในการทดสอบประกอบด้วยห้องมืด (15 × 9.5 cm) และพื้นที่เปิดโล่ง (15 × 11 cm) ห้องมืดมีผนังพื้นและหลังคาซึ่งทั้งหมดเป็นสีดำและมีทางเข้า (ยาว 4.5 ซม.) ไปยังพื้นที่เปิดโล่ง พื้นที่เปิดโล่งมีรูปร่างเหมือนวงรีและมีพื้นตะแกรงโลหะและผนังที่ไม่มีหลังคา ก่อนการทดสอบหนูทุกตัวเคยใช้งาน 10 นาทีในเครื่องมือ การทดสอบประกอบด้วยสามเซสชัน: ในช่วงครึ่งแรกของวัน 1 (ทดสอบก่อน: 5 ขั้นต่ำ) หนูได้รับอนุญาตให้สำรวจอุปกรณ์ทั้งหมด ตั้งแต่ครึ่งหลังของวัน 1 ถึงวัน 4 (การปรับอากาศ: รวม 35 ขั้นต่ำ) หนูได้รับการกระตุ้นทางสายตาเมื่อพวกเขาอยู่ในห้องมืด ในวันที่ 5 การตั้งค่าห้องมืดถูกทดสอบโดยไม่มีการกระตุ้นด้วยแสง (ทดสอบหลัง: 5 ขั้นต่ำ; รูปที่ S1E).
การทดสอบ CPA สามห้อง
การกำหนดลักษณะสถานที่ปรับอากาศแบบสามห้องที่กำหนดเอง / เครื่องมือ CPA ที่ใช้ในการทดสอบประกอบด้วยสองห้อง (10 × 17 ซม.) และทางเดินเชื่อมต่อ การทดสอบประกอบด้วยสามช่วง วัน 1 (ทดสอบก่อน: 15 ขั้นต่ำ): อนุญาตให้หนูสำรวจอุปกรณ์ทั้งหมดได้อย่างอิสระ หนูที่อยู่ 1.5 นานกว่าในห้องหนึ่งจะถูกแยกออกจากการทดสอบ วัน 2 และ 3 (การปรับสภาพ: 15 ขั้นต่ำแต่ละครั้ง): หนูได้รับการกระตุ้นทางแสงเมื่อพวกมันอยู่ในห้องจับคู่แสง การเลือกห้องที่มีแสงสว่างคู่นั้นเป็นรถยก วันที่ 4 (หลังการทดสอบ: 15 ขั้นต่ำ): การทดสอบดำเนินการภายใต้เงื่อนไขเดียวกับในการทดสอบก่อนหน้า (รูปที่ S6A).
ในช่วงการปรับสภาพการกระตุ้นด้วยแสงจะหยุดสำหรับ 30 s เมื่อหนูอยู่เหนือ 30 s อย่างต่อเนื่องในห้องมืดหรือห้องแสงคู่เพื่อหลีกเลี่ยงความร้อนสูงเกินไป กำลังแสงเลเซอร์ถูกควบคุมให้อยู่ที่ประมาณ 5 mW ที่ปลายไฟเบอร์ออปติกในการทดสอบพฤติกรรมทั้งหมด
ใน Vivo Fast-Scan Cyclic Voltammetry
การทดลอง FSCV ดำเนินการโดยใช้วิธีที่อธิบายไว้ในการศึกษาก่อนหน้า (35-37) หนูได้รับยาสลบด้วยส่วนผสมของคีตามีน / ไซลาซีนตามที่อธิบายไว้ใน วัสดุและวิธีการ SI และวางไว้ในกรอบ stereotaxic ใยแก้วนำแสงที่ใช้ในการกระตุ้นการแสดงออกของเซลล์ประสาท DA แสดงอยู่ใกล้กับขั้วไฟฟ้ากระตุ้น Optrode ที่กระตุ้นนั้นถูกวางไว้ใน VTA (จาก bregma: anterior – posterior, −3.2 mm, ด้านข้าง, 0.5 mm และ dorsal – ventral, 3.5 mm) และลดลงที่ช่วง 0.25-mm microelectrode คาร์บอนไฟเบอร์ (ความยาว 300 µm) สำหรับการบันทึกแบบ voltammetric ลดลงใน NAc (จาก bregma: ด้านหน้า - ด้านหลัง, 1.0 mm, ด้านข้าง, 1.0 mm และด้านหลัง - ventral, 3.5 mm) การวัดปริมาตรถูกทำขึ้นทุก ๆ 100 ms โดยใช้รูปคลื่นรูปสามเหลี่ยม (−0.4 V ถึง + 1.3 V ถึง −0.4 V เทียบกับ Ag / AgCl ที่ 400 V / s) กับ microelectrode คาร์บอนไฟเบอร์ โพเทนชิโอมิเตอร์ที่ปรับแต่งเองนั้นใช้สำหรับการแยกรูปคลื่นและการขยายปัจจุบัน การปลดปล่อย DA นั้นเกิดจากการกระตุ้นด้วยไฟฟ้าของเซลล์ประสาท DA โดยใช้การกระตุ้นด้วยชีพจร 24 (100 µA, ระยะเวลา 5 ms, 30 Hz) การกระตุ้นด้วยแสงของเซลล์ประสาท DA (532 nm, พลังงาน ∼5 mW ที่ปลายไฟเบอร์) ถูกนำไปใช้สำหรับ 10 ที่เริ่มต้น 5 s ก่อนเริ่มการกระตุ้นด้วยไฟฟ้า ไมโครอิเล็กทรอนิกส์คาร์บอนไฟเบอร์ได้รับการสอบเทียบในสารละลายที่มีความเข้มข้นที่เป็นที่รู้จักของ DA (0.2 µM, 0.5 µM และ 1.0 )M) ข้อมูล voltammetry ทั้งหมดถูกวิเคราะห์โดยโปรแกรมที่กำหนดเองโดยใช้ซอฟต์แวร์ Labview และ Matlab การลดระดับ DA โดยการกระตุ้นด้วยแสงได้รับการแก้ไขด้วยการวิเคราะห์องค์ประกอบหลักโดยใช้แม่แบบรูปคลื่น DA ที่ได้จากการกระตุ้นด้วยไฟฟ้า VTA เพื่อแยกสัญญาณโดปามีน (35, 36).
การวิเคราะห์ทางสถิติ.
การวิเคราะห์ทางสถิติดำเนินการโดยใช้ GraphPad PRISM 5.0 (ซอฟต์แวร์ GraphPad) วิเคราะห์ข้อมูลโดยการวัดซ้ำ ANOVA (มะเดื่อ 1B, , 4D,4Dและ รูปที่ S6 D และ E) หรือ ANOVA แบบทางเดียว (มะเดื่อ 1C, , 3D,3D, 4 C และ Eและ มะเดื่อ S4 K-M, S6Fและ S7A) และทำการวิเคราะห์ภายหลังโดยใช้การทดสอบ Bonferroni เครื่องหมาย / คอลัมน์และแถบทั้งหมดแสดงค่าเฉลี่ยและ± SEM ตามลำดับ
ขั้นตอนการทดลองอื่น ๆ รวมถึงการเตรียมไวรัสและการฉีดการบันทึกด้วยไฟฟ้าและการวิเคราะห์อิมมูโนฮิสโตเคมีและ mRNA นั้นมีรายละเอียดใน วัสดุและวิธีการ SI.
กิตติกรรมประกาศ
เราขอขอบคุณ E. Boyden สำหรับโครงสร้าง Arch, R. Matsui สำหรับคำแนะนำด้านเทคนิคในการผลิตและทำให้บริสุทธิ์ lentivirus และ Y. Hayashi สำหรับคำแนะนำด้านเทคนิคในการเขียนโปรแกรมการวิเคราะห์ข้อมูล งานนี้ได้รับการสนับสนุนโดย Research Grants-in-Aid 22220005 (ถึง SN), 23120011 (ถึง SY และ SN), 24700339 (ถึง TD) และ 25871080 (เป็น SY) จากกระทรวงศึกษาธิการ, วัฒนธรรม, วิทยาศาสตร์, วิทยาศาสตร์และ เทคโนโลยีของญี่ปุ่นและทุนจากมูลนิธิวิทยาศาสตร์ทาเคดะ (ถึง SN)
เชิงอรรถ
ผู้เขียนรายงานว่าไม่มีความขัดแย้งทางผลประโยชน์
บทความนี้มีข้อมูลสนับสนุนออนไลน์ที่ www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1404323111/-/DCSupplemental.
อ้างอิง
;