Cdk5 Phosphorylates Dopamine D2 ตัวรับและลดการส่งสัญญาณดาวน์สตรีม (2013)

อ้างอิง: Jeong J, Park YU, Kim DK, Lee S, Kwak Y, และคณะ (2013) Cdk5 ตัวรับฟอสฟอรัสโดพามีน D2 ตัวรับและลดการส่งสัญญาณดาวน์สตรีม โปรดหนึ่ง 8 (12): e84482 ดอย: 10.1371 / journal.pone.0084482

Editor: James Porter มหาวิทยาลัยนอร์ทดาโคตาสหรัฐอเมริกา

ที่ได้รับ: อาจ 20, 2013; ได้รับการยืนยัน: พฤศจิกายน 14, 2013; ที่เผยแพร่: December 31, 2013

ลิขสิทธิ์: © 2013 Jeong และคณะ นี่เป็นบทความแบบเปิดที่เผยแพร่ภายใต้เงื่อนไขของ ใบอนุญาตแสดงที่มาของครีเอทีฟคอมมอนส์ซึ่งอนุญาตให้ใช้การแจกจ่ายและการทำซ้ำแบบไม่ จำกัด ในสื่อใดก็ตามหากมีการให้เครดิตผู้เขียนต้นฉบับและแหล่งที่มา

เงินทุน: งานนี้ได้รับการสนับสนุนจากทุน (NRF-2012R1A2A2A01012923 และ NRF-2012R1A4A1028200) จากรัฐบาลเกาหลี (MSIP) และยังได้รับการสนับสนุนภายใต้กรอบของโครงการความร่วมมือระหว่างประเทศจัดการโดย NRF ของเกาหลี (2012K2A1A2033117) และเกาหลีสมองสถาบันวิจัย (KBRI) โครงการวิจัยพื้นฐานของ MSIP (2031-415) SKP เป็นผู้รับรางวัล 2004 และ 2006 National Alliance เพื่อการวิจัยเกี่ยวกับโรคจิตเภทและโรคซึมเศร้า (NARSAD) Young Investigator Awards ผู้เลี้ยงไม่มีบทบาทในการออกแบบการศึกษาการรวบรวมและวิเคราะห์ข้อมูลการตัดสินใจที่จะเผยแพร่หรือการจัดทำต้นฉบับ

การแข่งขันความสนใจ: ผู้เขียนได้ประกาศว่าไม่มีความสนใจในการแข่งขันอยู่

บทนำ

การส่งสัญญาณโดปามีนนั้นเกี่ยวข้องกับการทำงานของสมองต่าง ๆ รวมถึงการประสานงานของมอเตอร์การควบคุมอารมณ์ [1]. ส่วนประกอบหลักของการส่งสัญญาณโดปามีนในสัตว์มีกระดูกสันหลังนั้นกระทำโดยเซลล์ประสาทสปินกลาง (MSN) ที่เลือกแสดงส่วนย่อยของตัวรับโดปามีนและรับอินพุตโดปามีเซอร์จากพื้นที่หน้าท้องส่วนปลาย (VTA) และ substantia nigra (SN)) [2]. ตัวรับโดปามีนคือตัวรับโปรตีนคู่ G (GPCR) ที่มีโดเมนเซมเมมเบรนเจ็ดโดเมนและประกอบด้วยชนิดย่อยสองชนิด D1-like และ receptors เหมือน D2 ซึ่งเป็นสื่อกลางในการดำเนินการซึ่งกันและกันในการส่งสัญญาณโดปามีน [1]. ยกตัวอย่างเช่นตัวรับโดปามีน D1 (D1, D5) เปิดใช้งาน adenylyl cyclase ผ่าน G_αs และเพิ่มระดับ intracellular ของแคมป์ แต่ตัวรับ dopamine D2 ที่คล้ายกัน (D2, D3, D4) ยับยั้ง adenylyl cyclase adenylyl ผ่าน_αi และลดระดับเซลล์ภายในแคมป์ [1], [3].

ในบรรดาตัวรับโดปามีนตัวรับ D2 (DRD2) มีส่วนเกี่ยวข้องในพยาธิสรีรวิทยาของโรคทางจิตเวชที่สำคัญหลายโรครวมถึงโรคจิตเภทและการติดยา [4]เช่นยารักษาโรคจิตหลายตัวที่เป็นเป้าหมายอย่างน้อย DRD2 เป็นที่ทราบกันว่ากิจกรรม DRD2 มีความสัมพันธ์ที่ดีกับผลกระทบเชิงพฤติกรรมของยาเสพติดในรูปแบบสัตว์ [5]. ประสิทธิภาพของยาแก้ซึมเศร้าและอารมณ์โคลงยังเชื่อมโยงกับการเปลี่ยนแปลงในการแสดงออกของเซลล์ผิวของ DRD2 หรือการส่งสัญญาณภายในเซลล์ดาวน์สตรีมสื่อกลางโดย PKA, ERK และ GSK3 [1], [4], [6]. แม้จะมีบทบาทที่สำคัญเหล่านี้สำหรับ DRD2 ในสมองกลไกการควบคุมอย่างละเอียดที่มอบความหลากหลายและความซับซ้อนให้กับคุณสมบัติ DRD2 นั้นยังไม่เข้าใจอย่างสมบูรณ์

การรวมกันของหลักฐานชี้ให้เห็นว่าการดัดแปลง posttranslational หลายรายการนั้นเกี่ยวข้องกับการปรับกิจกรรม DRD2 glycosylation ที่กว้างขวางของ DRD2 ถูกเปิดเผยในการศึกษาการติดฉลากภาพความสัมพันธ์ในช่วงต้น [7]และการสร้างพันธะซัลไฟด์ภายใน DRD2 ก็ถูกระบุว่าเป็นการเปลี่ยนแปลงที่สำคัญสำหรับการจับยึดลิแกนด์ [8]. นอกจากนี้ยังระบุตำแหน่งของฟอสโฟรีเลชั่นของ DRD2 ด้วย ในหลอดทดลอง ทดสอบกับไอโซโทปรังสีให้เส้นทางสำหรับเส้นทางการกำกับดูแลต่างๆที่ไกล่เกลี่ยโดยไคเนสต่างๆ [9]. อันที่จริงโปรตีนไคเนส C (PKC) ควบคุมการเคลื่อนที่ของแคลเซียมในเซลล์ DRD2 และปรับการทำงานร่วมกันของ DRD2 กับโปรตีนในเซลล์ cytoskeletal [10]. ฟอสโฟรีเลชั่นโดย GPCR kinase 2 (GRK2) ควบคุมรูปแบบ resensitization agonist-induced ของ DRD2 [11].

ไคเนสที่ขึ้นกับ Cyclin 5 (Cdk5) เป็นไคเนสที่มี proline-direct serine / threonine ที่มีกิจกรรมพิเศษเนื่องจากการแสดงออกทางสมองที่เฉพาะเจาะจงของตัวกระตุ้นสำคัญ p35 และ p39 [12]. Cdk5 มีส่วนร่วมในกระบวนการต่าง ๆ ของเซลล์ประสาทรวมถึงการย้ายถิ่นของเซลล์ประสาทและคำแนะนำเกี่ยวกับซอนและ Cdk5 และ p35 หนูที่เป็นโมฆะแสดงข้อบกพร่องในชั้นเปลือกนอก [13]. เมื่อเร็ว ๆ นี้ก็แสดงให้เห็นว่า phosphorylation ของ WAVE1 และ ephexin โดย Cdk5 ควบคุม morphogenesis กระดูกสันหลัง dendritic [14]. นอกจากนี้ Cdk5 ยังควบคุมระดับการแสดงออกของพื้นผิวของตัวรับ NMDA, NR2B และ NMDA ที่เป็นสื่อกลางด้วย NR2A [15], [16]. เป็นที่น่าสังเกตว่าหลักฐานหลายชิ้นบ่งบอกถึงความสัมพันธ์ที่ใกล้ชิดระหว่าง Cdk5 และระบบโดปามีน Cdk5 phosphorylates ไทโรซีนไฮดรอกซีเลส (TH), ควบคุมความมั่นคงของมันและทำให้การรักษาสมดุล dopaminergic [17]. ในเซลล์ประสาท postsynaptic เมื่อ T75 ตกค้างของโดปามีนและไซโคล - แอมป์ควบคุมฟอสโฟโปรตีน - 32kD mediated - 32kD (DARPP-5) เป็น phosphorylated โดย Cdk1 มันสามารถยับยั้งกิจกรรม PKA [18]. ที่น่าสนใจเมื่อโคเคนซึ่งเป็นตัวเอกทางอ้อมของตัวรับโดปามีนจะได้รับการดูแลแบบเรื้อรังในหนู, mRNA และระดับโปรตีนของ Cdk5 ที่เพิ่มขึ้นในเซลล์ประสาทหนามกลาง [19]. โดยรวมแล้ว Cdk5 ดูเหมือนจะมีส่วนร่วมในการปรับตัวที่เกิดจากยา synaptic ในการศึกษานี้เราแสดงการทำงานร่วมกันของ DRD2 และ Cdk5 ซึ่งจะขยายบทบาทของ Cdk5 เพิ่มเติมในการส่งสัญญาณโดปามีน

วัสดุและวิธีการ

แอนติบอดี

เซรั่มต่อต้านกระต่ายถูกยกขึ้นจากเปปไทด์ที่มีฟอสโฟ - เซรีน 321 (pS321) ของวงในเซลล์ที่สามของ DRD2 (D2i3) ใช้ฟอสโฟเปปไทด์ CNPDpSPAKPEK (PEPTRON) เพื่อสร้างคอลัมน์เปปไทด์คอนจูเกตสำหรับการทำให้บริสุทธิ์สัมพันธ์ (20401, PIERCE) แอนติบอดีต่อต้าน pS321 ได้รับการเสริมด้วยระบบการทำให้บริสุทธิ์ที่เกี่ยวข้องตามคำแนะนำของผู้ผลิต เก็บฟอสโฟแอนติบอดีบริสุทธิ์ใน PBS ด้วย 0.1% sodium azide และ 0.1% เจลาติน Anti-mouse anti-Cdk5 antibody (sc-249) และ anti-Rabbit anti-p35 antibody (sc-820) ถูกนำมาใช้ในการ blotting ตะวันตกและ immunocytochemistry ของ Cdk5 / p35 แอนตี้ - แอนตี้ - แอนตี้ - GFP แอนติบอดี (sc-9996) ถูกนำมาใช้เพื่อกระตุ้นภูมิคุ้มกันและตะวันตก blotting DRD2-GFP แอนตี้ - กระต่ายแอนตี้ - ธงแอนติบอดี (sc- xnumx), แอนตี้ - กระต่ายแอนตี้แอนตี้ - ฮ่าแอนติบอดี (sc- xnumx), แอนตี้ - แอนตี้ - แอนติบอดีแอนตี้ - gst แอนติบอดี (sc- xnumx), แอนตี้ - แอนตี้ - gapdh แอนติบอดีและแอนติบอดี 807) ถูกซื้อจากเทคโนโลยีชีวภาพของ Santa Cruz

สัตว์

หนูที่น่าพิศวง p35 เป็นของขวัญที่ดีจากดร. Katsuhiko Mikoshiba ที่สถาบันวิทยาศาสตร์สมอง RIKEN ในประเทศญี่ปุ่นและใช้สำหรับวัฒนธรรมเซลล์ประสาทปฐมภูมิ ชุดไพรเมอร์สำหรับการสร้างจีโนไทป์คือ 5′- GGTCTCCTCTTCTGTCAAGAAG, 5′-GCTCTGCTAGACACACATACTGTAC และ 5′- TCCATCT GCACGAGACTAGT ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้า [20]. หนู ICR และหนู Dawley Sprague ถูกนำมาใช้ในการเตรียมสมอง lysate ขั้นตอนสัตว์ทั้งหมดได้รับการอนุมัติจากคณะวิทยาศาสตร์การดูแลและการใช้สัตว์ของมหาวิทยาลัย Pohang

โครงสร้างพลาสมิด

isoform DRD2 ยาวของมนุษย์ในเวกเตอร์พลาสมิด EGFP-N1 และห่วงภายในเซลล์ที่สามของเวกเตอร์ DRD2 (212 – 373 อะมิโนตกค้างรวมถึงกรดอะมิโน 29 เพิ่มเติมที่เหลือเฉพาะกับ DRD2 ยาว isoform) Human Cdk2 ถูกแทรกใน pCMV-HA พลาสมิดเวกเตอร์และ Human p5 ถูกแทรกในเวกเตอร์ pcDNA 35 พลาสมิด Human Cdk3.1 ถูกแทรกอยู่ภายใต้โปรโมเตอร์ cytomegalovirus (CMV) พร้อมกับ p5 มนุษย์ในเวกเตอร์ pcDNA 35 เพื่อสร้างโครงสร้างนิพจน์คู่ (Cdk3.1 / p5) สำหรับการสร้างภูมิคุ้มกันภายในเซลล์³⁵S] -GTP_γS assay assay, radioligand assay assay และ cAMP enzyme immunoassay

ในหลอดทดลอง Kinase Assay

IP ที่เชื่อมโยง ในหลอดทดลอง kinase assay ได้ดำเนินการดังนี้ สมองของหนูทั้งตัวถูกนำมารวมกันใน 3 mL erythrocytes lysis buffer (ELB) (50 mM ทริสเรทติ้ง (pH 8.0), 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% NP-40) . ไลซีนถูกบ่มบนน้ำแข็งเป็นเวลา 20 นาที, sonicated, และหมุนเหวี่ยงที่ 30 × g สำหรับ 10 ขั้นต่ำ supernatants ได้รับการกระตุ้นด้วยแอนติบอดีต่อต้านกระต่ายต่อต้าน p35 เพื่อให้ได้ Cdk5 / p35 ที่ซับซ้อน Cdk5 / p35 คอมเพล็กซ์และโปรตีน GST ฟิวชั่นบริสุทธิ์ผสมกับ adenosine 5′-triposphate, [γ-³²P] (NEG-502H, PerkinElmer) และบ่มในบัฟเฟอร์ไคเนส (30 mM HEPES (pH 7.2), 10 mM MgCl₂, 0.2 mM DTT) สำหรับ 1 h ที่อุณหภูมิห้อง [18], [21]. Cdk5 บริสุทธิ์ / p25 คอมเพล็กซ์ (14 – 516, มิลลิพอร์) ยังใช้สำหรับ ในหลอดทดลอง kinase assay ตามที่อธิบายไว้ข้างต้น บัฟเฟอร์การโหลดตัวอย่าง 2 ×ถูกเพิ่มลงในส่วนผสมของปฏิกิริยาและต้มที่ 100 ° C จากนั้นตัวอย่างจะถูกตรวจสอบด้วย SDS-PAGE และประเมินเจลแห้งด้วยวิธีบันทึกอัตโนมัติ

การวิเคราะห์โครมาโทกราฟีของเหลว (LC) - สเปกโตรมิเตอร์มวลสาร (MS) / MS

recombinant GST-D2i3 โปรตีนถูกวิเคราะห์โดย LC-MS / MS ตาม IP-linked ในหลอดทดลอง ไคเนสทดสอบ เราดำเนินการระบุเปปไทด์ของข้อมูล LC-MS / MS โดยใช้ X !! Tandem (รุ่น Dec-01-2008) ไฟล์ข้อมูล RAW แต่ละไฟล์จะถูกแปลงเป็น mzXML เป็นครั้งแรกโดยใช้ทรานส์โปรตีโอมิโอเมตริก (TPP; รุ่น 4.3) การสแกน MS / MS ใน mzXML ที่แปลงแล้วจะถูกค้นหาเพื่อค้นหาฐานข้อมูลลำดับโปรตีนของเมาส์ UniProt (ปล่อย 2010_07) รวมถึงลำดับ GST-D2i3 โดยใช้ X !! Tandem ความอดทนถูกตั้งค่าเป็น 3 Da สำหรับไอออนของบรรพบุรุษและ 2 Da สำหรับไอออนของแฟรกเมนต์ ใช้ความจำเพาะของเอนไซม์สำหรับทริปซิน ตัวเลือกการปรับเปลี่ยนตัวแปรถูกนำมาใช้สำหรับ carbamidomethylation ของ cysteine ​​(57.021 Da), ออกซิเดชันของ methionine (15.995 Da), การย่อยสลายของ asparagine (0.987 Da) และ phosphorylation ของ serine (79.966 Da)

immunoprecipitation

การไม่ทำการตกผลึกของเซลล์ในเซลล์ lysates ใน ELB lysis buffer แอนติบอดี Anti-GFP ถูกเพิ่มเข้าไปในไลซีนและบ่มสำหรับ 3 h ที่ 4 ° C Immunocomplexes ถูกทำให้บริสุทธิ์โดยใช้โปรตีน -A agarose ตะกอนที่ถูกบ่มด้วยบัฟเฟอร์โหลดตัวอย่าง SDS สำหรับ 30 ขั้นต่ำที่ 37 ° C และอยู่ภายใต้ SDS-PAGE และ Western blots

การทดสอบแบบดึงลง GST

10 µg ของ GST บริสุทธิ์และ GST – D2i3 ถูกบ่มด้วย lysate หนูสมองสำหรับ 1.5 h ที่ 4 ° C 30 µL ของกลูตาไธโอน (GSH) - อัดเม็ด Sepharose 4B (17-0756-01-1, GE เฮลธ์แคร์) ปรับสมดุลด้วยบัฟเฟอร์ lysis เพิ่มและบ่มสำหรับ 2,000 ชั่วโมงเพิ่มเติม ลูกปัดถูกรวบรวมโดยการปั่นแยกที่ XNUMX ×g และล้างด้วย lysis buffer 4 ครั้ง [22], [23]. Precipitates ถูกวิเคราะห์โดย Western blotting โดยใช้แอนติบอดี anti-Cdk5 และ anti-p35

immunocytochemistry

Transfected เซลล์ HEK 293 และเซลล์ประสาทตาที่เพาะเลี้ยงบนใบปะหน้าถูกล้างหนึ่งครั้งด้วยเกลือฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (PBS) และแก้ไขโดยการแช่ใน 4% paraformaldehyde / PBS เย็นเป็นเวลานาน 30 แอนติบอดีปฐมภูมิถูกเจือจางในสารละลายปิดกั้น (2% ม้าเซรั่มและ 1% Triton X-100 ใน PBS) แอนติบอดีต่อต้านหนูและแอนติบอดี Alexafluor-647-conjugated (A20990, Invitrogen) และ Alexafluor-568-ผันแอนติบอดีต่อต้านกระต่าย (A11011, Invitrogen) เป็นแอนติบอดีรอง Hoechst ใช้สำหรับย้อมสีนิวเคลียส ภาพที่ได้รับจากกล้องจุลทรรศน์ confocal (Olympus, FluoView-1000)

ตัวรับ Internalization Assay

24 h หลังจากการถ่ายเซลล์ได้รับการรักษาด้วย 1 µM ​​quinpirole (Q102, Sigma) สำหรับ 30 นาทีและ 90 นาทีที่ 37 ° C เซลล์ถูกแขวนลอยใหม่ใน PBS Cold 2 mL และ 200 µL aliquots ถูกนำมาใช้สำหรับแต่ละปฏิกิริยา การรักษาด้วยยาได้ดำเนินการที่อุณหภูมิห้องสำหรับ 3 h ที่ความเข้มข้นต่อไปนี้ 3 nM [³H] -spiperone (NET-565, PerkinElmer), 3 µM ​​sulpiride (895, TOCRIS), 10 µM ​​haloperidol (H1512, Sigma) ชอบน้ำ³H] -spiperone ถูกใช้เพื่อระบุชื่อผู้รับทั้งหมดที่แสดงออกและ hydrophilic sulpiride ถูกนำมาใช้เพื่อแทนที่เยื่อรับ - ผูก [³H] -spiperone signal สัญญาณตัวรับที่เกี่ยวข้องกับเมมเบรนถูกคำนวณโดยการลบค่าตัวรับภายในเซลล์จากค่าตัวรับที่แสดงทั้งหมด เซลล์ถูกกรองในตัวกรอง GF / B (มิลลิพอร์) และล้าง 3 ครั้งด้วยการล้างบัฟเฟอร์ (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl) ตัวกรองถูกทำให้แห้งและวัดกัมมันตภาพรังสีที่เหลือโดยใช้เคาน์เตอร์ประกายของเหลว [24].

การเตรียมเยื่อหุ้มเซลล์

เซลล์ที่ไหลมารวมกันในอาหารเลี้ยง 100 มม. หลังจากการถ่ายเลือดถูกล้างด้วย PBS เย็นและเก็บเกี่ยวในบัฟเฟอร์ 1 mL HME (25 mM HEPES (pH 7.5), 2 mM MgCl₂, 1 mM EDTA) ไลซีนที่ถูกทำให้เป็นเนื้อเดียวกันถูกปั่นแยกด้วย 500 × g สำหรับ 15 min และจากนั้น supernatants จะถูกหมุนเหวี่ยงด้วย 36,000 × g สำหรับ 30 นาที เม็ดแขวนลอยใหม่ในบัฟเฟอร์ HME ถูกนำมาใช้สำหรับการตรวจ

[³⁵S] -GTP_γS Binding Assay

การแตกของเซลล์เยื่อหุ้มเซลล์ถูกเตรียมไว้ล่วงหน้าด้วย 1 µM ​​quinpirole (Q102, Sigma) ในบัฟเฟอร์การทดสอบ (25 mM HEPES (pH 7.5), 1.5 mM MgCl₂, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA และ 0.01 mM GDP) สำหรับ 10 นาที [³⁵S] -GTP_γS (NET-030H, PerkinElmer) ถูกเพิ่มเข้าไปในความเข้มข้นสุดท้ายของ 3 nM ใน 30 µL และบ่มต่อไปเป็นเวลา 90 นาที 170 µL ของบัฟเฟอร์เย็น (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl₂และ 0.1 mM GTP) ถูกเพิ่มเข้ามาเพื่อหยุดปฏิกิริยา เมมเบรนถูกกรองบนตัวกรอง GF / B (มิลลิพอร์) และล้าง 3 ครั้งด้วยการล้างบัฟเฟอร์ (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl) ตัวกรองถูกทำให้แห้งและวัดกัมมันตภาพรังสีโดยใช้เคาน์เตอร์ประกาย [25], [26].

Radioligand Binding Assay

เยื่อหุ้มเซลล์ที่เตรียมไว้ถูกบ่มด้วย 0.01 nM [³H] -spiperone (NET-565, PerkinElmer) และการเพิ่มความเข้มข้นของ quinpirole (Q102, Sigma) สำหรับ 30 นาทีในการทดสอบบัฟเฟอร์ (25 mM HEPES (pH 7.5), 1.5 mM MgCl₂, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA) เมมเบรนถูกกรองบนตัวกรอง GF / B (มิลลิพอร์) และล้าง 3 ครั้งด้วยการล้างบัฟเฟอร์ (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl) ปฏิกิริยาถูกยกเลิกโดยการกรองอย่างรวดเร็วผ่านตัวกรอง GF / C กัมมันตภาพรังสีที่เหลือถูกวัดโดยใช้เคาน์เตอร์ประกายของเหลว [27]-[29].

ค่าย Enzyme Immunoassay

เซลล์ HEK 293 ที่ผ่านการแปลงสภาพจะถูกสร้างขึ้นด้วย 10 µM ​​rolipram (R6520, Sigma) สำหรับ 1 h และจากนั้นให้การรักษาด้วย 0.1 µM ​​forskolin (F6886, Sigma) และการเพิ่มความเข้มข้นของ quinpirole (Q102, Sigma) สำหรับ 30 เซลล์ต้นกำเนิดจากการเพาะเลี้ยงเบื้องต้นได้รับการรักษาด้วย 10 µM ​​rolipram สำหรับ 1 h จากนั้นจึงต้องใช้ 1 µM ​​dopamine สำหรับ 1 h [22]. เซลล์ไลเซสถูกเตรียมด้วย 0.1 M HCl และระดับของแคมป์ถูกตรวจพบโดยชุดเอนไซม์อิมมูโนแอสเซย์ของแคมป์ (Sapphire Bioscience) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต

เลี้ยงเซลล์ต้นกำเนิดระดับประถมศึกษา

พื้นที่ Striatal ถูกแยกออกจากสมองของตัวอ่อนหนู (E15) เนื้อเยื่อที่ชำแหละถูกแยกออกจากกันในตัวกลางสำคัญ (MEM) (11095, Invitrogen) ที่มี 0.25% trypsin (T4549-100, Sigma) และ 0.1% DNase I สำหรับ 6 ° C ที่ 37 ° C เซลล์ถูกแขวนอีกครั้งในสื่อการชุบ (MEM ที่มี 0.01 M HEPES (pH 7.4) และ 10% (vol / vol) เซรั่มม้า (16050-122, GIBCO) เซลล์ประสาทถูกเพาะเลี้ยงเป็นเวลา 7 วัน ในหลอดทดลอง (DIV 7) ใน MEM พร้อมอาหารเสริม B27 (17504-044, Invitrogen) ก่อนที่จะนำไปใช้กับเอนไซม์ภูมิคุ้มกันในค่าย

ผลสอบ

Cdk5 Phosphorylates Serine 321 ในวงในเซลล์ที่สามของ DRD2 ในหลอดทดลอง

ในการระบุวัสดุพิมพ์ Cdk5 ที่แปลกใหม่เราทำการค้นหาอย่างเป็นระบบโดยใช้ (S / T) PX (K / H / R) เป็นลำดับการรับรู้ Cdk5 [30] และระบุ DRD2 เป็นสารตั้งต้น ลำดับฉันทามติรวมถึง serine 321 ตั้งอยู่ในวงในเซลล์ที่สามของ DRD2 (D2i3) ซึ่งกลไกการกำกับดูแลต่างๆมีส่วนเกี่ยวข้อง [3], [10], [11]. ลำดับได้รับการอนุรักษ์วิวัฒนาการใน DRD2 ในสัตว์มีกระดูกสันหลังซึ่งแสดงถึงความสำคัญในการใช้งานของสารตกค้าง (รูปที่ 1A).

ดาวน์โหลด:   

• PPT

  สไลด์ PowerPoint

• PNG

  ภาพขนาดใหญ่ (2.08MB)

• TIFF

  ภาพต้นฉบับ (4.36MB)

รูปที่ 1 Cdk5 phosphorylates serine 321 ในวงในเซลล์ที่สามของ DRD2 ในหลอดทดลอง

(A) การจัดตำแหน่งลำดับกรดอะมิโนแสดงพื้นที่อนุรักษ์ของ DRD2 จากสปีชีส์ต่าง ๆ (สีเทา) ศักยภาพของฟอสโฟรีเลชั่น Cdk5 ที่มีศักยภาพถูกระบุด้วยเครื่องหมายดอกจัน (B) เชื่อมโยงกับ IP ในหลอดทดลอง ไคเนสทดสอบด้วย recombinant GST-D2i3 และ GST-D2i3 โปรตีนกลายพันธุ์ Cdk5 / p35 คอมเพล็กซ์ที่อุดมไปด้วยสารสกัดจากสมองของหนูโดยใช้ภูมิคุ้มกันต่อต้าน p35 ถูกใช้สำหรับปฏิกิริยาไคเนส autoradiograph ของโปรตีน phosphorylated จะแสดงพร้อมกับการย้อมสี Coomassie สีฟ้าสดใสของเจลเดียวกัน หัวลูกศรระบุสัญญาณกัมมันตภาพรังสีที่สอดคล้องกับ GST-D2i3 และหัวลูกศรเปิดบ่งชี้สัญญาณกัมมันตภาพรังสีจาก p35 (C) สเปกตรัม MS / MS ของเปปไทด์ฟอสโฟรีเลชั่นของ D2i3 รูปแบบการกระจายตัวตามทฤษฎีแสดงอยู่ใต้สเปกตรัม ในบรรดาไอออนของแฟรกเมนต์ทั้งหมด y- และ b-ion ที่ตรวจพบนั้นจะแสดงในสเปกตรัม ที่₆ และ y₇ ไอออนบ่งชี้อย่างยิ่ง phosphorylation ของ 321 ซีรีน (D) ในหลอดทดลอง kinase assay ด้วย Cdk5 / GST-p25 คอมเพล็กซ์บริสุทธิ์โดยใช้ GST-D2i3 และ GST-D2i3 กลายพันธุ์โปรตีน โปรตีนฟอสโฟรีเลชันถูกแสดงใน autoradiograph พร้อมกับการย้อมสี Coomassie สีฟ้าสดใส หัวลูกศรระบุสัญญาณกัมมันตภาพรังสีที่สอดคล้องกัน GST-D2i3 และหัวลูกศรเปิดหมายถึงสัญญาณกัมมันตภาพรังสีจาก GST-p25

ดอย: 10.1371 / journal.pone.0084482.g001

ในการประเมินความสามารถของ Cdk5 ต่อ phosphorylate D2i3 เราทำการเชื่อมโยง IP ในหลอดทดลอง ไคเนสตรวจสอบโดยใช้คอมเพล็กซ์ Cdk5 / p35 ที่มีการใช้งานซึ่งอุดมไปด้วยโปรตีนจากสมองของหนู lysate โดย p35 immunoprecipitation ด้วยรีคอมบิแนนต์บริสุทธิ์ GST-D2i3 (กรดอะมิโนที่เหลืออยู่ 212 – 373) โปรตีน เราสังเกตสัญญาณฟอสโฟรีเลชั่นในโปรตีน GST-D2i3 ที่บริสุทธิ์และ GST-D2i3 S297A โปรตีน แต่สัญญาณลดลงอย่างมีนัยสำคัญโดยใช้ GST-D2i3 S321A (รูปที่ 1B) ในการตรวจสอบ phosphorylation ของ serine 321 เพิ่มเติมใน GST-D2i3 เราทำการวิเคราะห์ LC-MS / MS ของตัวอย่างจากการเชื่อมโยง IP ในหลอดทดลอง kinase ทำการตรวจสอบโดยใช้มวลสาร LTQ XL อย่างต่อเนื่องฟอสฟอรัส - เปปไทด์ที่สอดคล้องกับมวลของเปปไทด์ phospho-serine 321 ถูกกู้คืน (รูปที่ 1C) พิจารณาว่าการได้มาซึ่งข้อมูลที่ขึ้นกับข้อมูลในระหว่างการวิเคราะห์ LC-MS / MS มีแนวโน้มที่จะตรวจจับโปรตีนมากมายในตัวอย่าง [31]ข้อมูลนี้แสดงให้เห็นว่าซีรีน 321 ตกค้างเป็นแหล่งฟอสฟอรัสที่โดดเด่นของ Cdk5 ในภูมิภาค D2i3 เพื่อพิสูจน์ phosphorylation โดยตรงของ serine 321 ใน GST-D2i3 โดย Cdk5 ในหลอดทดลอง kinase assay โดยใช้ Cdk5 / GST-p25 คอมเพล็กซ์ที่บริสุทธิ์ด้วย recombinant บริสุทธิ์ GST-D2i3 โปรตีน เราระบุสัญญาณฟอสโฟรีเลชั่นที่สำคัญใน GST-D2i3 ที่หายไปใน GST-D2i3 S321A (รูปที่ 1D) เมื่อนำมารวมกันผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่าสารตกค้าง D2i3 S321 เป็นเป้าหมายพิเศษสำหรับฟอสโฟรีเลชั่นที่ใช้ Cdk5

Cdk5 Phosphorylates Serine 321 ในวงในเซลล์ที่สามของ DRD2 ในเซลล์

เพื่อระบุฟอสโฟรีเลชั่นของซีรีน 321 เราได้ทำการสร้างแอนติบอดีจำเพาะสำหรับฟอสโฟ - ซีรีน 321 (pS321) ตัวอย่างจากการเชื่อมโยง IP ในหลอดทดลอง kinase assay วิเคราะห์โดย Western blotting โดยใช้แอนติบอดีต่อต้าน pS321 บลอตแสดงวงดนตรีที่แตกต่างกันในปฏิกิริยาไคเนสที่ขึ้นอยู่กับ GST-D2i3 (รูปที่ 2A) เพื่อตรวจสอบฟอสโฟรีเลชั่นที่มีศักยภาพของซีรีน 321 ใน DRD2 โดย Cdk5 ในเซลล์แอนติบอดีต่อต้าน GFP โดยใช้แอนติบอดี GFP และแอนติบอดีที่ได้รับการวิเคราะห์โดยใช้ Western anti-GFP โดยใช้แอนติบอดีที่มีการแสดงออกของ DRD293-GFP และ DRD2 S2 แอนติบอดีต่อต้าน pS321 ลักษณะสัญญาณแถบสัญญาณโดยแอนติบอดีต่อต้านแอนติบอดี GFP ที่เป็นที่รู้จักกันเนื่องจาก glycosylation ที่มากเกินไปของ DRD5 การแสดงออกร่วม (เฉพาะในการปรากฏตัวของ DRD35-GFP และแอนติบอดีต่อต้าน pS321 ตรวจพบ DRD2 ที่คล้ายกันเท่านั้นกับสัญญาณ Cdk2 / p321รูปที่ 2B) [7]. เพื่อตรวจสอบเพิ่มเติม phosphorylation ของซีรีน 321 โดย Cdk5, D2i3 (FLAG-D2i3) และรูปแบบกลายพันธุ์ของ D2i3 (FLAG-D2i3 S321A) FLAG-D2i3 และ FLAG-D2i3 S321A แสดงออกโดยมีหรือไม่มี HA-Cdk5 และ p35 ในเซลล์ HEK 293 ถูกวิเคราะห์โดย SDS-gel mobility shift พบการเปลี่ยนแปลงการเคลื่อนไหวที่ขึ้นกับ Cdk5 ที่สำคัญสำหรับ FLAG-D2i3 แต่ไม่ใช่สำหรับ FLAG-D2i3 S321A (รูปที่ 2C) นอกจากนี้เรายังประเมินระดับฟอสโฟรีเลชั่นของ DRD2 ที่ Ser321 จากการกระตุ้นแบบ Agonist เซลล์ HEK 293 แสดง DRD2-GFP และ Cdk5 / p35 คอมเพล็กซ์ถูกกระตุ้นโดย quinpirole และแอนติบอดีต่อต้าน GFP จาก lysates ตะวันตกถูกวิเคราะห์โดย Western blotting โดยใช้ anti-GFP และ anti-pS321 เราพบว่าฟอสโฟรีเลชั่นที่เป็นสื่อกลางของ Cdk5 ของ DRD2 ที่ Ser321 ไม่ได้รับผลกระทบจากการกระตุ้นแบบ Agonist ซึ่งแตกต่างจากฟอสโฟรีเลชันแบบ GRK- และ PKCรูปที่ 2D) [32], [33]. ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่า Cdk5 สามารถ phosphorylate ซีรีน 321 ตกค้าง DRD2 ซีรีนในสภาพแวดล้อมของเซลล์

ดาวน์โหลด:   

• PPT

  สไลด์ PowerPoint

• PNG

  ภาพขนาดใหญ่ (1.92MB)

• TIFF

  ภาพต้นฉบับ (3.5MB)

รูปที่ 2 Cdk5 phosphorylates serine 321 ในเซลล์ภายในเซลล์ที่สามของ DRD2 ในเซลล์

การวิเคราะห์ฟอสโฟรีเลชั่นโดยพึ่ง Cdk5 ของซีรีน 321 ถูกวิเคราะห์โดยใช้แอนติบอดีต่อต้าน pS321 (A) ตัวอย่างจากการเชื่อมโยง IP ในหลอดทดลอง kinase assay โดยใช้โปรตีน GST-D2i3 ถูกวิเคราะห์โดย Western blotting (WB) ด้วยแอนติบอดีที่ระบุ หัวลูกศรระบุ GST-D2i3 (B) DRD2-GFP และ DRD2 S321A-GFP แสดงออกด้วยหรือไม่มี HA-Cdk5 และ p35 ในเซลล์ HEK 293 immunoprecipitates Anti-GFP ถูกวิเคราะห์โดย Western blotting โดยใช้ anti-GFP และ anti-pS321 antibodies เครื่องหมายวงเล็บระบุว่าสัญญาณ DRD2 และหัวลูกศรเปิดหมายถึงสัญญาณไร้ประโยชน์จากแอนติบอดีต่อต้าน GFP 'ป้อนข้อมูล%' คือปริมาณ% ของ lysate ทั้งหมดสำหรับปฏิกิริยา IP สัญญาณ Cdk5 ภายนอกที่อ่อนแอถูกระบุด้วยเครื่องหมายดอกจัน (C) การทดสอบการเคลื่อนย้ายของเจล เซลล์ HEK 293 transfected ตามที่ระบุถูกวิเคราะห์โดย Western blotting (D) เซลล์ Transfected HEK 293 ได้รับการรักษาด้วย quinpirole และ anti-GFP immunoprecipitates ถูกวิเคราะห์โดย Western blotting ด้วยแอนติบอดีต่อต้าน GFP และ anti-pS321 หัวลูกศรเปิดหมายถึงสัญญาณไร้ผู้ชมจากแอนติบอดีต่อต้าน GFP

ดอย: 10.1371 / journal.pone.0084482.g002

Cdk5 / p35 Complex และ DRD2 นั้นมีความเกี่ยวข้องทางร่างกาย

เราตรวจสอบความสัมพันธ์ทางกายภาพที่อาจเกิดขึ้นระหว่าง Cdk5 / p35 complex และ DRD2 เนื่องจากมีการรู้กันว่าสารตั้งต้น Cdk5 มีความสัมพันธ์ทางกายภาพกับ Cdk5 / p35 [23], [34], [35]. เริ่มแรกทำการทดสอบแบบเลื่อนลง GST recombinant บริสุทธิ์โปรตีน GST-D2i3 ถูกบ่มด้วย lysate หนูสมองและตกตะกอน GST ดึงลงได้รับการวิเคราะห์สำหรับ blotting ตะวันตก ตามที่ปรากฏใน รูปที่ 3A, ภายนอก Cdk5 และ p35 ถูกระบุใน precipitates แบบเลื่อนลงซึ่งบ่งบอกถึงการมีปฏิสัมพันธ์ทางกายภาพระหว่าง DRD2 และ Cdk5 / p35 คอมเพล็กซ์ (รูปที่ 3A) ยิ่งไปกว่านั้น HA-Cdk5 และ p35 ถูกตรวจพบในแอนติบอดีต่อต้าน GFP จากเซลล์ HEK 293 lysates แสดง DRD2-GFP และ Cdk5 / p35 (รูปที่ 3B) นอกจากนี้เราดำเนินการวิเคราะห์ทางอิมมูโนไซโตเคมีและสังเกตว่า DRD2-GFP, HA-Cdk5 และ p35 แสดงสัญญาณ co-localization ที่สำคัญที่บริเวณเยื่อของเซลล์ HEK 293 (รูปที่ 3C, แผงด้านบน) นอกจากนี้เรายังตรวจสอบการแปลร่วมของ DRD2 และ Cdk5 / p35 ในบริบทของเส้นประสาท อย่างต่อเนื่อง DRD2-GFP ยังแสดงให้เห็นถึงการร่วมแปลที่สำคัญกับ Cdk5 และ p35 ที่อยู่ภายนอกในเซลล์ประสาทของทารกแรกเกิด (DIV7) ซึ่งสนับสนุนการเชื่อมโยงการทำงานระหว่าง DRD2 และ Cdk5รูปที่ 3Cแผงด้านล่าง) ผลการวิจัยพบว่า DRD2 และ Cdk5 / p35 สามารถสร้างรูปแบบที่ซับซ้อนและสนับสนุนความคิดที่ว่า DRD2 เป็นพื้นผิวทางสรีรวิทยาของ Cdk5

ดาวน์โหลด:   

• PPT

  สไลด์ PowerPoint

• PNG

  ภาพขนาดใหญ่ (3.91MB)

• TIFF

  ภาพต้นฉบับ (5.35MB)

รูปที่ 3 Cdk5 / p35 สามารถสร้างคอมเพล็กซ์ด้วย DRD2

(A) การทดสอบแบบดึงลง GST โดยใช้ recombinant บริสุทธิ์ GST-D2i3 โปรตีนบริสุทธิ์ที่มีสารสกัดจากสมองหนู การตกตะกอนแบบ GST แบบเลื่อนลงของ GST นั้นอยู่ภายใต้การวิเคราะห์แบบ blotting ตะวันตก 'Bead' หมายถึงการตกตะกอนแบบดึงลงโดยไม่มีโปรตีน GST (B) การไม่เพิ่มภูมิคุ้มกันของคอมเพล็กซ์ DRD2 และ Cdk5 / p35 Anti-GFP IP จากไลซีนจากเซลล์ transfected ถูกนำไปวิเคราะห์แบบ Western blotting เครื่องหมายวงเล็บระบุว่าสัญญาณ DRD2 และหัวลูกศรเปิดหมายถึงสัญญาณไร้ประโยชน์จากแอนติบอดีต่อต้าน GFP จุดหยดที่มากเกินไปสำหรับอินพุตจะแสดงที่ด้านขวาด้วย (C) การวิเคราะห์ภูมิคุ้มกันทางเคมีของ DRD2 และ Cdk5 / p35 เซลล์ HEK 293 ที่แสดง DRD2-GFP และ Cdk5 / p35 ถูกย้อมด้วยแอนติบอดีต่อต้าน Cdk5 และต่อต้าน p35 (แผงด้านบน) DRD2-GFP ถูกแสดงออกเพียงอย่างเดียวในเซลล์ประสาทตาและเลี้ยงด้วยแอนติบอดีต่อต้าน Cdk5 และต่อต้าน p35 (แผงล่าง) Hoechst ใช้สำหรับย้อมสีนิวเคลียส สเกลบาร์คือ 5 µm ได้รับภาพทั้งหมดโดยใช้กล้องจุลทรรศน์ confocal (Olympus, FluoView-1000)

ดอย: 10.1371 / journal.pone.0084482.g003

ฟอสโฟรีเลชั่นที่ใช้ตัวกลาง Cdk5 ของ DRD2 ลดทอนกิจกรรมของตัวรับ

มีรายงานว่าฟอสโฟรีเลชั่นปรับเปลี่ยนคุณสมบัติที่สำคัญของ GPCR เช่นการเชื่อมต่อโปรตีน G การรับภายในองค์กรการ จำกัด เซลล์ภายในเซลล์และการเชื่อมโยงกับโปรตีนโมดูเลเตอร์ [9], [11], [24]. การรับสัญญาณภายในเป็นตัว gonist เป็นกระบวนการกำกับดูแลที่สำคัญของการส่งสัญญาณ เราตรวจสอบการปรับ Cdk5 ที่เป็นสื่อกลางของการปรับภายใน DRD2 เซลล์ HEK 293 ที่แสดง DRD2-GFP และ DRD2 S321A-GFP ที่มีหรือไม่มี Cdk5 / p35 ถูกบ่มด้วย 1 µM ​​quinpiroleรูปที่ 4A) [³H] -spiperone สัญญาณของเซลล์ที่แสดง DRD2-GFP ลดลงอย่างมีนัยสำคัญที่การรักษา 30 ขั้นต่ำ quinpirole และหายเป็นปกติที่ 90 นาที ที่น่าสนใจ [³H] -spiperone สัญญาณของ DRD2-GFP และ Cdk5 / p35 ที่แสดงเซลล์ก็ลดลงที่การรักษา 30 ขั้นต่ำ quinpirole แต่ไม่สามารถกู้คืนได้ที่ 90 นาที (รูปที่ 4Aส่วนที่สอง) ในทางกลับกัน, [³H] -spiperone สัญญาณของเซลล์ที่แสดง DRD2 S321A-GFP ลดลงที่ 30 min และกู้คืนที่ 90 min โดยไม่คำนึงถึง co-expression ด้วย Cdk5 / p35 การศึกษาก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่า DRD2 ที่ผ่านการปรับสภาพแล้วกลับมาใช้ใหม่ในพลาสมาเมมเบรนเมื่อมีการกระตุ้นแบบ agonist เป็นเวลานาน [11]. Thus ปรากฏว่า Cdk5-mediated phosphorylation ของ DRD2 มีส่วนร่วมในกระบวนการ resensitization หลังจากการดำเนินการภายใน DRD2 agonist ที่เกิดขึ้นโดยตัวเอก

ดาวน์โหลด:   

• PPT

  สไลด์ PowerPoint

• PNG

  ภาพขนาดใหญ่ (387KB)

• TIFF

  ภาพต้นฉบับ (1.31MB)

รูปที่ 4 ฟอสโฟรีเลชั่นที่สื่อกลางด้วย Cdk5 ช่วยลดการแสดงออกของพื้นผิว DRD2 และการส่งสัญญาณดาวน์สตรีม

(A) การแสดงออกของพื้นผิว DRD2 วัดโดย [³H] -spiperone ผูกพันการทดสอบ Transfected เซลล์ HEK293 ถูกกระตุ้นด้วย 1 µM ​​quinpirole ตามเวลาที่กำหนดและเก็บเกี่ยวตามด้วย 3 nM [³H] -spiperone treatment เป็นเวลา 3 ชม. วัดกัมมันตภาพรังสีและคำนวณสัญญาณพื้นผิว แถบข้อผิดพลาดแสดงถึงค่าเฉลี่ย± SE (n = 8; * p <0.05, ** p <0.01; One-way ANOVA กับ Dunnett post hoc test: เปรียบเทียบคอลัมน์ทั้งหมดกับคอลัมน์ควบคุม) (B) [³⁵S] -GTP_γS การทดสอบที่มีผลผูกพัน เยื่อหุ้มเซลล์ถูกเตรียมจากเซลล์ที่ถ่ายถ่ายตามที่ระบุ การเตรียมเมมเบรนถูกบ่มด้วย 1 µM ​​quinpirole ตามด้วย 3 nM [³⁵S] -GTP_γS เป็นเวลา 90 นาที แถบข้อผิดพลาดแสดงถึงค่าเฉลี่ย± SE (n = 8; * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001; One-way ANOVA ด้วย Bonferroni post hoc test: เปรียบเทียบคู่ของคอลัมน์ทั้งหมด) (C) Quinpirole แข่งขัน [³H] -spiperone ผูกพันการทดสอบ การเตรียมเมมเบรนจากเซลล์ transfected ถูกบ่มด้วย 0.01 nM [³H] -spiperone และเพิ่มความเข้มข้นของ quinpirole เป็นเวลา 30 นาที GraphPad ได้รับการถดถอยแบบไม่เป็นเชิงเส้น แถบข้อผิดพลาดระบุค่าเฉลี่ย± SE (n = 3) (D) ระบบภูมิคุ้มกันของเอนไซม์แคมป์ในเซลล์ HEK 293 ที่เปลี่ยนถ่าย เซลล์ที่ถ่ายโอนได้รับการปรับสภาพด้วย 10 µM Rolipram เป็นเวลา 1 ชั่วโมงและต่อมาได้รับการบำบัดร่วมกับฟอร์สโคลิน 0.1 µM และเพิ่มความเข้มข้นของ quinpirole เป็นเวลา 30 นาที GraphPad ได้รับการถดถอยแบบไม่เป็นเชิงเส้น แถบข้อผิดพลาดแสดงถึงค่าเฉลี่ย± SE (n = 4; ** p <0.01; สองด้าน t-tests) (E) เซลล์ต้นกำเนิดที่ได้รับการเลี้ยงจาก Wild Wild และ p35 ตัวอ่อน knockout (DIV 7) ได้รับการรักษาด้วย 10 µM ​​rolipram สำหรับ 1 h ตามด้วย 1 µM ​​dopamine สำหรับ 1 h แถบข้อผิดพลาดแสดงค่าเฉลี่ย± SE (n = 4; **p<0.01; สองหาง t-tests)

ดอย: 10.1371 / journal.pone.0084482.g004

เราประเมินเพิ่มเติมถึงการเปลี่ยนแปลงที่อาจเกิดขึ้นของการมีเพศสัมพันธ์โปรตีนจีที่กระตุ้นโดย agonist เป็น DRD2 ที่เกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์ฟอสโฟรีเลชั่นโดยใช้ Cdk5³⁵S] -GTP_γS การทดสอบที่มีผลผูกพัน [25], [26]. DRD2-GFP และ DRD2 S321A-GFP ที่มีหรือไม่มี Cdk5 / p35 ถูกแสดงออกในเซลล์ HEK 293 เมมเบรนถูกเตรียมและกระตุ้นด้วย 1 µM ​​quinpirole และอนุญาตเพิ่มเติม [³⁵S] -GTP_γจัดตั้งขึ้น DRD2-GFP และ Cdk5 / p35 ที่แสดงให้เห็นว่าเยื่อหุ้มเซลล์มีความบกพร่องอย่างมีนัยสำคัญ [³⁵S] -GTP_γS ผูกพันเมื่อเทียบกับเยื่อหุ้มเซลล์อื่น ๆ (รูปที่ 4B) ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่าฟอสโฟรีเลชั่นที่เป็นสื่อกลางของ Cdk5 ซึ่งควบคุมโปรตีน Gonist ที่กระตุ้นโดย agonist ที่ DRD2

นอกจากนี้การแข่งขัน quinpirole [³H] -spiperone การตรวจจับที่มีผลผูกพันได้ดำเนินการเพื่อตรวจสอบการเปลี่ยนแปลงใด ๆ ที่อาจเกิดขึ้นใน agonist-affinity ที่ DRD2 โดย Cdk5 phosphorylation สื่อกลาง CdkXNUMX การแข่งขันที่มีผลผูกพันของ [³H] -spiperone เมื่อทำการรักษาความเข้มข้นที่เพิ่มขึ้นของ quinpirole เพื่อเตรียมการเมมเบรนจาก transfected ถูกวัด การแข่งขันที่มีผลผูกพันของ quinpirole และ [³H] -spiperone ที่ DRD2-GFP และ DRD2 S321A-GFP ทำบันทึกที่คล้ายกัน_i ค่า (−9.789 สำหรับ DRD2-GFP; −9.691 สำหรับ DRD2 S321A-GFP) ซึ่งบ่งชี้ว่าความสัมพันธ์ของแกนด์กับ DRD2 ไม่ได้รับผลกระทบอย่างมีนัยสำคัญโดย Cdk5-mediated phosphorylation ที่ DRD2รูปที่ 4C).

ฟอสโฟรีเลชั่นที่ใช้ตัวกลาง Cdk5 ควบคุมการส่งสัญญาณ DRD2-cAMP

ต่อไปเราตรวจสอบว่าการดัดแปลง DRD2 โดย Cdk5 มีผลต่อเส้นทางการส่งสัญญาณดาวน์สตรีมหรือไม่ เราตรวจสอบการยับยั้งของ DRD2 ที่เป็นสื่อกลางสำหรับการผลิตแคมป์ที่กระตุ้นด้วย forskolin โดย adenylyl cyclase ในเซลล์ที่แสดง DRD2-GFP และ DRD2 S321A-GFP โดยใช้เอนไซม์เอนไซม์ immunoassay DRD2-expressing cells แสดงระดับ cAMP ที่ลดลงเพื่อตอบสนองต่อ quinpirole ในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดของยา การแสดงออกร่วมกันของ Cdk5 / p35 ช่วยลดการยับยั้งสูงสุดของการก่อ cAMP (รูปที่ 4D แผงด้านซ้าย) ในทางตรงกันข้ามในการแสดงเซลล์ DRD2 S321A-GFP การก่อตัวของแคมป์นั้นถูกยับยั้งอย่างมีประสิทธิภาพในการตอบสนองต่อการรักษา quinpirole โดยไม่คำนึงถึงการแสดงออกของ Cdk5 / p35 (รูปที่ 4D แผงด้านขวา) ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่าฟอสโฟรีเลชั่นที่เป็นสื่อกลางของ Cdk5 ของ DRD2 ลดทอนกิจกรรมการยับยั้งของ DRD2 บนเส้นทางการส่งสัญญาณของแคมดาวน์สตรีม เพื่อยืนยันถึงปรากฏการณ์ในการตั้งค่าที่เกี่ยวข้องทางสรีรวิทยามากขึ้นเราได้ใช้เซลล์ประสาทที่ได้รับการเลี้ยงขั้นพื้นฐานจากตัวอ่อนที่น่าพิศวงใน p35 ซึ่งเป็นตัวกระตุ้น Cdk5 ที่สำคัญ เซลล์ต้นกำเนิดจากการเพาะเลี้ยงเบื้องต้นได้รับการรักษาด้วยโดปามีน 1 µM ​​และวิเคราะห์โดย cAMP เอนไซม์ immunoassay เซลล์ประสาทจากหนูที่น่าพิศวงของ p35 มีระดับแคมป์ลดลงเมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ประสาทชนิดป่าเมื่อถูกกระตุ้นด้วยโดปามีน (รูปที่ 4E) Tเราสรุปว่า phosphorylation ที่เป็นสื่อกลางของ Cdk5 ของ DRD2 ส่งผลให้โทนเสียงการยับยั้งลดลงบนทางเดินของแคมป์ที่ออกโดย DRD2

การสนทนา

เราระบุ DRD2 เป็นสารตั้งต้นใหม่ของ Cdk5 ฟอสโฟรีเลชั่นดูเหมือนจะควบคุมการแสดงออกของพื้นผิว DRD2 โดยส่งผลกระทบต่อชะตากรรมของ DRD2 หลังจากการปรับภายในตัวรับซึ่งจะช่วยลด DRD2 G_i-coupling และทางเดินแคมป์ดาวน์สตรีม เนื่องจาก phosphorylation ที่เหลืออยู่ S321 ทั้งใน DRD2 isoforms ยาวและสั้นกลไกที่เสนอในการศึกษาครั้งนี้อาจเป็นโหมดทั่วไปของกฎระเบียบในการส่งสัญญาณ DRD2-mediated.

DRD2 ในเซลล์ประสาทส่วนกลางแบบมีหนามไม่เพียง แต่ได้รับการยกย่องให้เป็นโดปามีนชนิดย่อยที่สำคัญเท่านั้น แต่ยังได้รับการยอมรับว่ามีความไวต่อการเปลี่ยนแปลงของความพร้อมในการตอบสนองต่อสิ่งเร้าทางสิ่งแวดล้อม desensitization ที่เกิดจาก Agonist และ resensitization ของ DRD2 ได้รับการศึกษาอย่างกว้างขวาง [11], [24]. โดยเฉพาะอย่างยิ่งการศึกษาจำนวนหนึ่งแสดงให้เห็นว่าผลกระทบของการได้รับสารออกฤทธิ์ทางจิตเรื้อรังเช่นโคเคนและแอมเฟตามีนซึ่งเพิ่มระดับของเซลล์โดปามีนในระดับเซลล์นอกร่างกายพร้อมกับการเปลี่ยนแปลงแบบไดนามิกของ DRD2 [36]. แท้จริงแล้วผู้ใช้โคเคนเรื้อรังเป็นที่รู้จักกันว่ามีการลดระดับ DRD2 ในพื้นที่ striatal และความพร้อมใช้งานของ DRD2 ในนิวเคลียส accumbens (NAcc) แสดงความสัมพันธ์เชิงลบกับพฤติกรรมการแสวงหายาเสพติดและการเสริมแรงในหนูและไพรเมต [37]-[39]. การค้นพบเหล่านี้บ่งชี้ว่าการทำงานของ DRD2 นั้นมีความอ่อนไหวต่อกฎการปรับตัวหรือชดเชยในการตอบสนองต่อสิ่งเร้าต่าง ๆ รวมถึงการได้รับยาเรื้อรัง ผลการศึกษาของเราแสดงให้เห็นว่า S321 สารตกค้างในวงภายในเซลล์ที่สามของ DRD2 สามารถ phosphorylated โดย Cdk5 ซึ่งส่งผลในการยับยั้งอิทธิพลลดลงของ DRD2 บนทางเดินของค่าย การโต้ตอบนี้เสนอกลไกการกำกับดูแลแบบใหม่ที่เกี่ยวข้องกับ Cdk5 ในเซลล์ประสาท dopaminoceptive ที่อาจเชื่อมโยงกับธรรมชาติของไดนามิกไดรฟ์พื้นผิว DRD2

ควรสังเกตว่า Cdk5 เป็นที่รู้จักกันว่าเป็นองค์ประกอบสำคัญในการเป็นสื่อกลางการเปลี่ยนแปลงแบบปรับตัวของสภาพแวดล้อมของเซลล์ประสาท ยกตัวอย่างเช่นการปรับโครงสร้างและการทำงานของกระดูกสันหลัง dendritic ในเซลล์ประสาทของวงจร limbic เป็นหนึ่งในผลที่ตามมาจากการสัมผัสซ้ำ psychostimulant [40]. การเปลี่ยนแปลงเหล่านี้จะมาพร้อมกับการเปลี่ยนแปลงระดับโมเลกุลต่าง ๆ รวมถึงการเหนี่ยวนำของโปรตีนที่จับกับองค์ประกอบการตอบสนองของค่าย (CREB) และΔFosBปัจจัยการถอดรหัสที่แสดงการควบคุมที่ยั่งยืนในการตอบสนองต่อการบริหารโคเคนเรื้อรัง [41], [42]. ที่สำคัญ Cdk5 คือเป้าหมายของΔFosB [19], และส่วนประกอบที่สำคัญหลายอย่างที่เกี่ยวข้องกับการเคลื่อนไหวของกระดูกสันหลัง dendritic เช่น PSD-95, ไคเนสที่เปิดใช้งาน p21 (PAK), β-catenin และ Spinophilin ได้รับรายงานว่าเป็นสารตั้งต้นของ Cdk5 [43]-[46]. อย่างต่อเนื่องทางพันธุกรรมหรือทางเภสัชวิทยาของกิจกรรม Cdk5 ทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงของ dendritic ลักษณะทางสัณฐานวิทยาของกระดูกสันหลังและการตอบสนองเชิงพฤติกรรมต่อโคเคนซึ่งมีบทบาทสำคัญสำหรับ Cdk5 ในการเปลี่ยนแปลงทางโมเลกุลและสัณฐานวิทยาของวงจรโดปามีน mesolimbic [47], [48]. ผลการวิจัยของเราแสดงให้เห็นว่า DRD2 เป็นเป้าหมายใหม่ของ Cdk5 ให้ข้อมูลเชิงลึกเพิ่มเติมเกี่ยวกับการเปลี่ยนแปลงแบบปรับตัวของระบบโดปามีนในการตอบสนองต่อการสัมผัสกับยาเสพติดเรื้อรังเนื่องจากการควบคุมΔFosBที่ไกล่เกลี่ยตามมาของ Cdk5 . ยิ่งไปกว่านั้น DRD2 เป็นที่ทราบกันดีว่ามีผลกระทบต่อกระบวนการเซลลูล่าร์จำนวนมากรวมถึงการควบคุมเส้นทางเดินรถไคเนสของ MAP และไคเนส [42], [49]. ดังนั้นการค้นพบในการศึกษาครั้งนี้ไม่เพียงแสดงให้เห็นถึงกฎระเบียบโดยตรงของ DRD2 โดย Cdk5 แต่ยังให้ข้อมูลเชิงลึกเกี่ยวกับการตอบสนองแบบปรับตัวของระบบโดปามีนต่อการสัมผัสกับยาเรื้อรัง

ผลงานของผู้เขียน

รู้สึกและออกแบบการทดลอง: JJ YUP DH SKP ทำการทดลอง: JJ YUP DKK YK วิเคราะห์ข้อมูล: JJ YUP DKK SL YK SAL HL YSG DH SKP เครื่องมือรีเอเจนต์ / วัสดุ / การวิเคราะห์ที่สนับสนุน: YHS เขียนบทความ: JJ SKP