J Neurosci. 2006 May 10;26(19):5131-42.
Ulery PG, Rudenko G, Nestler EJ.
Kaynak
Psikiyatri Anabilim Dalı, Temel Sinirbilim Merkezi, Teksas Üniversitesi Güneybatı Tıp Merkezi, Dallas, Teksas 75390-9070, ABD.
Özet
Transkripsiyon faktörü DeltaFosB (ayrıca FosB2 veya FosB [kısa form] olarak da bilinir), kötüye kullanım, stres ve elektrokonvülsif nöbetler de dahil olmak üzere çeşitli psikoaktif uyaranlara kronik olarak maruz kalınmasıyla beyinde indüklenen uzun süreli plastisitenin önemli bir aracıdır . DeltaFosB'nin belirgin bir özelliği, bir kez uyarıldığında, daha fazla stimülasyon olmadığında nispeten uzun bir süre boyunca beyinde kalmasıdır. Bununla birlikte, bu görünür kararlılığın altında yatan mekanizmalar bilinmemektedir. Burada, DeltaFosB'nin hücre kültüründe yaklaşık 10 saatin yarı ömrüne sahip nispeten kararlı bir transkripsiyon faktörü olduğunu gösterdik. Ayrıca, DeltaFosB'nin beyinde bir fosfoprotein olduğunu ve DeltaFosB'deki yüksek oranda korunan bir serin kalıntısının (Ser27) fosforilasyonunun onu proteasomal bozulmaya karşı koruduğunu gösteririz. Bu fosforilasyona kazein kinaz 2'in aracılık ettiğini gösteren birkaç kanıt dizisi sunuyoruz. Bu bulgular DeltaFosB'nin fosforile edildiğinin ilk kanıtını oluşturur ve fosforilasyonun beyinde uzun süreli adaptasyonlara aracılık etme kabiliyetinin çekirdeğindeki stabilitesine katkıda bulunduğunu kanıtlar.
Giriş
FosB2 veya FosB [kısa form] olarak da adlandırılan ΔFosB transkripsiyon faktörü, hemen erken genin bir C terminus-kesilmiş ek yeri varyantıdır FosB (Dobrazanski ve diğerleri, 1991; Nakabeppu ve Nathans, 1991; Yen ve arkadaşları, 1991). Tam uzunlukta FosB gibi, ΔFosB de bir DNA bağlayıcı temel alana ve birçok genin ifadesini düzenleyen aktivatör protein-1 (AP-1) transkripsiyon faktörü kompleksleri oluşturmak için Jun proteinleriyle dimerize olan bir lösin fermuarına sahiptir.Morgan ve Curran, 1995; Rylski ve Kaczmarek, 2004). FosB'nin C terminusunda bulunan işlem alanının eksik olmasına rağmen, osFosB kültürlenmiş hücrelerde ve beyinde hem güçlü bir transkripsiyonel aktivatör hem de baskılayıcı olarak işlev görür (Dobrazanski ve diğerleri, 1991; Nakabeppu ve Nathans, 1991; Chen ve arkadaşları, 1997; McClung ve Nestler, 2003; Kumar ve arkadaşları, 2005).
ΔFosB, kronik ancak akut olmayan, beyinde bölgeye özgü bir şekilde yüksek seviyelere neden olur, stres, bazı lezyonlar, antipsikotik ve antidepresan ilaçlar, kötüye kullanılan ilaçlar ve doğal ödüller dahil olmak üzere çeşitli psikoaktif uyaranlara maruz bırakılır (Hope ve diğerleri, 1994b; Hiroi ve Graybiel, 1996; Moratalla ve arkadaşları, 1996; Bing ve diğerleri, 1997; Mandelzys ve diğerleri, 1997; Kelz ve diğerleri, 1999; Werme ve diğerleri, 2002; Andersson ve arkadaşları, 2003; Colby ve diğerleri, 2003; Peakman ve diğerleri, 2003; Perrotti ve arkadaşları, 2004; Zachariou ve arkadaşları, 2006). BFosB'nin uyarılması, bu uyaranların birçoğunun beyindeki fonksiyonel etkileriyle doğrudan ilişkilidir. BFosB'nin ek stimülasyon olmasa bile kalıcılığı, onu akut uyaranlara hızlı bir şekilde endüklenen diğer tüm Fos ailesi transkripsiyon faktörlerinden ayırır, birkaç saat içinde bazal seviyelere düşer ve genellikle kronik stimülasyondan sonra duyarsızlaşma gösterir (Hope ve diğerleri, 1992; Daunais ve diğerleri, 1993; Persico ve diğerleri, 1993; Hiroi ve Graybiel, 1996; Perrotti ve arkadaşları, 2004). Bu, ΔFosB'yi, bazı kronik uyaranların neden olduğu stabil nöronal adaptasyonların altında yatan gen ekspresyonundaki bazı uzun süreli değişikliklere aracılık etmek için çekici bir aday yapar.
Çünkü ΔFosB'nin uzun süreli varlığı, mRNA'sının daha fazla indüksiyonu olmadığında ortaya çıkar (Chen ve arkadaşları, 1995), tam uzunlukta FosB ve kendinden kararsız olan tüm diğer Fos ailesi proteinlerinin aksine, BFosB’in alışılmadık derecede stabil bir transkripsiyon faktörü olabileceğini düşündük (Hope ve diğerleri, 1994b; Chen ve arkadaşları, 1997; Nestler ve arkadaşları, 2001; McClung ve arkadaşları, 2004). Ayrıca, akut ve kronik uyarılmış beyin dokusunun immünoblot analizi, BFosB’in belirgin şekilde kaydığını göstermiştir Mr (moleküler kütle) akut durumda ∼33 kDa'dan kronik tedavi sırasında ∼35 – 37 kDa'ya (Hope ve diğerleri, 1994a; Chen ve arkadaşları, 1995). Bu çeşitli izoformları kodlayabilen ilave mRNA'ların varlığına dair bir kanıt bulunmadığı için, osFosB'un post-translasyonel olarak değiştirildiğini ve belki de bunun olağandışı stabilitesine katkıda bulunduğunu iddia ettik. Ancak, bugüne kadar ΔFosB’un ciro ya da post-translasyonel modifikasyonları için biyokimyasal analizler rapor edilmemiştir. Bu çalışmanın amacı, ΔFosB'un bir fosfoprotein olup olmadığını ve fosforilasyonun stabilitesinde bir rol olup olmadığını belirlemektir.
Malzemeler ve yöntemler
Memeli hücre hatları ve DNA yapıları.
PC12 hücreleri (Clontech, Mountainview, CA) l-glutamin (L-Gln) içeren yüksek glukozlu DMEM içinde kültürlendi ve% 5% fetal sığır serumu (FBS),% 10% at serumu (her ikisi de Invitrogen, Carlsbad, CA'dan) ile desteklendi. , 100 U / ml penisilin ve 100 /g / ml streptomisin (her ikisi de Sigma-Aldrich, St. Louis, MO'dan). HeLa hücreleri (Amerikan Tip Kültür Koleksiyonu, Manassas, VA), L-Gln içeren yüksek glukozlu DMEM içinde kültürlendi ve% 10% FBS, penisilin ve streptomisin ile desteklendi. Her iki hücre çizgisi, nemli bir 37% CO içinde 5 ° C'de tutuldu2 atmosfer.
DNA ile geçici transfeksiyonlar için PC12 veya HeLa hücreleri, ertesi gün 12% 90 kaynaşmasına ulaşmak için altı oyuklu plakalara (PC100 hücreleri için kollajen I ile kaplanmış) ekildi ve daha sonra Lipofektamin 2000 (Invitrogen) kullanılarak transfekte edildi. Bazı deneylerde (bkz. Şekil. 1⇓⇓⇓⇓⇓-7,FosB, PC12 hücrelerinde, rekombinant herpes simpleks virüsü (HSV) ile enfeksiyon yoluyla geçici olarak eksprese edildi.
OsFosB ve FosB cDNA'lar kendi pTetop yapılarımızdan elde edildi (Chen ve arkadaşları, 1997) ve bir pcDNA3.1 vektörüne (Invitrogen) alt klonlanır. Bu pcDNA3.1-ΔFosB / FosB yapıları, memeli hücrelerinde ekspresyon için ve bölgeye yönelik mutajenez için bir şablon olarak kullanıldı. Rekombinant HSV-FOSB daha önce tarif edildiği gibi hazırlandı (Neve ve diğerleri, 1997) ve preparatın ∼1 × 10 titresi vardı.8 pfu / ml olmuştur.
Darbe kovalayan deneyler.
Enfeksiyon / transfeksiyondan yaklaşık 24 saat sonra, altı oyuklu plakalardaki hücreler (PC12 veya HeLa), altı çukurlu plakalardaki iki ila üç kez 2 ml PBS ile yıkandı ve 37 ml Cys / Met-içermeyen DMEM içinde 1 h için 2 ° C'de inkübe edildi (Invitrogen), Met ve Cys'in hücre içi havuzlarını boşaltmak için% 5 diyaliz FBS (Hyclone, Logan, UT) ile desteklenmiştir. Bu “açlık” süresinin sonunda ilaçlar (eğer hücreler tedavi edilecekse) eklenmiş ve hücreler 12 – 25 μCi ile etiketlenmiştir (nabız). 35S Protein Etiketleme Karışımı (Perkin Elmer, Wellesley, MA) tüm yeni sentezlenmiş proteinleri etiketlemek için 1 ° C'de ∼37 saat. Radyo etiket, hücrelerin iki veya üç kez 2 ml PBS ile yıkanmasıyla giderildi ve 35S etiketli proteinler, ortamın% 5 FBS ile desteklenmiş "soğuk" (radyoaktif olmayan) ortam ile değiştirilmesi ve hücrelerin çeşitli zaman noktalarında toplanmasıyla takip edildi (takip edildi). Hücre tedavileri takip boyunca sürdürüldü. Bu deneylerin tüm rakamları, ciro oranlarının karşılaştırılmasını optimize etmek için çeşitli proteinlerin benzer başlangıç miktarlarını göstermektedir.
Hayvanlar ve kronik elektrokonvülsif nöbet tedavisi.
Yetişkin Sprague Dawley erkek sıçanlar (200-300 g; Charles River Laboratories, Kingston, RI) günde bir kez 7-9 d için elektrokonvülsif nöbetlerle (ECS) tedavi edildi. ECS daha önce açıklandığı gibi yapıldı (Hope ve diğerleri, 1994a) kullanarak Ugo Basile (Comerio VA, İtalya) ECS ünitesi aşağıdaki ayarlara sahiptir: frekans, 100 puls / s; ile darbe, 0.5 ms; şok süresi, 1.0 s; ve akım, 75 mA. Sham kontrol hayvanları, herhangi bir elektrik akımı olmadan kulak klipsi elektrotları uygulanarak paralel olarak muamele edildi.
32 P metabolik etiketleme.
Beyin dilimlerinin etiketlenmesi için, sıçanlar kesildi, beyinler hızlı bir şekilde diseke edildi ve 300 um ön kortikal dilimleri bir DSK mikrosikeriyle (Ted Pella, Redding, CA) hazırlandı. Dilimler, plastik tüplerin içine 2 ml fosfat eksik yapay CSF (ACSF) içinde inkübe edildi ve bir O ile sürekli yumuşak kabarcıklanma altında 30 ° C'de tutuldu.2/ CO2 karışımHemmings ve arkadaşları, 1989). Dilimler (tüp başına iki dilim), okadaik asit (1.3 ng / ml) varlığında veya yokluğunda 8-10 saat için 100 mCi ile etiketlendi. Bu inkübasyonun sonunda, dilimler soğuk ACSF ile en az üç kez durulandı ve sonra soğuk radyoimmüno-çökeltme tahlili (RIPA) tamponu [PBS, pH 250, 7.4 mm NaCl, 150% (v / v% v) olarak sonikasyonla homojenize edildi. ) Igepal,% 1 (w / v) sodyum deoksikolat, 0.5% (w / v) SDS, 0.1 mm EDTA],% 1'e kadar SDS ile kullanılmadan önce, memeli hücreleri için proteaz inhibitör kokteyli (0.6 /l / ml'de kullanılır; Sigma-Aldrich), fosfataz inhibitör kokteylleri I ve II (5: 1; Sigma-Aldrich'de kullanılır), 100 mm PMSF ve% 1 gliserol. Homojenatlar daha sonra 2 dakika boyunca kaynatıldı ve 15x'te santrifüjlenerek temizlendi. g 15 dk. Elde edilen süpernatanlardaki protein konsantrasyonu, BCA protein tahlili (Pierce, Holmdel, NJ) kullanılarak değerlendirildi.
Için 32Kültürlenmiş hücrelerin P etiketlemesi, enfeksiyon / transfeksiyondan sonra ∼24 saat, hücreler iki ila üç kez fosfatsız ortam ile yıkandı ve bu ortamda in1 saat boyunca inkübe edildi. Bu açlık döneminden sonra, 0.2 – 0.3 mCi 32PH3PO4 (Perkin Elmer) her bir oyuğa ilave edildi ve hücreler, deney türüne bağlı olarak 4-12 saat olarak etiketlendi (spesifikasyonlar için bakınız Şekil 1-7). Hücreler daha sonra üç kez PBS ile yıkandı ve 15 ul takviye RIPA tamponu ile 50 dakika boyunca buz üzerinde eritildi. Lizatlar kazıma yoluyla toplandı ve 10 kez bir 25 ga iğnesinden geçirilerek DNA kesildi, 10 dakika boyunca kaynatıldı ve 15,000 ° C'de 15-30 dakika boyunca 4 rpm'de santrifüjlendi. Temizlenen lizatlar (süpernatanlar) yeni bir tüpe aktarıldı ve bir BCA protein tahlili (Pierce) yapıldı. Bu deneylerin tüm rakamları, nispi fosforilasyon seviyelerinin karşılaştırmasını optimize etmek için benzer miktarlarda toplam vahşi tip (WT) ve S27A ΔFosB proteinlerini göstermektedir.
Kimyasallar ve hücre kültürü işlemleri.
Okadaik asit (OA; Sigma-Aldrich) etanol içinde çözüldü ve nihai bir 100 ng / ml konsantrasyonunda kullanıldı. 5,6-Dikloro-1-y-d-ribofuranosil-benzimidazol (DRB; Biomol, Plymouth Meeting, PA), dimetil sülfoksitte (DMSO; Sigma-Aldrich) eritildi ve hücre kültüründe, nihai bir 50 um konsantrasyonunda kullanıldı. Spermin (Sigma-Aldrich) suda çözüldü ve nihai bir 200 concentrationm konsantrasyonunda kullanıldı. Calphostin-C (Biomol) DMSO içinde çözüldü ve 0.2 atm'de kullanıldı, oysa forbol 12-miristat 13-asetat (PMA; Promega, Madison, WI) DMSO içinde çözüldü ve 0.1 atm'de kullanıldı. miristoillenmiş-otokamit-2 ile ilgili inhibe edici peptit (m-AIP; Biomol) suda çözüldü ve nihai bir 1 ve 10 μm konsantrasyonunda kullanıldı. Geniş spektrumlu protein kinaz inhibitörleri H-7 ve H-8 (Biomol) suda çözüldü ve sırasıyla 150 ve 200 finalm nihai konsantrasyonunda kullanıldı. MG132 (Calbiochem, San Diego, CA) ve epoksomisin (Peptides International, Louisville, KY) hem DMSO içinde çözülmüş hem de son bir 12.5 ve 7.5 concentrationm konsantrasyonunda kullanılmıştır. Tüm deneylerde, tedaviler boyunca sabit bir DMSO miktarını korumak için gerektiğinde hücrelere DMSO (taşıyıcı) ilave edildi. İçin 32P etiketleme deneyleri, ilaçlar etiketin hemen önüne eklenmiş ve etiketleme süresinin geri kalanı için muhafaza edilmiştir. Darbe kovalama deneyleri için, Cys / Met “açlık” zamanında ilaçlar etiketleme dönemi boyunca tutuldu ve ardından tekrar kovalama ortamına eklendi. Proteazom inhibitörleri, bu peptitlerin hızlı dönüşümünü telafi etmek amacıyla kova boyunca her bir 3-4 saat boyunca sallandı.
OsFosB immünopresipitasyon, immünoblotlama ve otoradyografi.
İmmünopresipitasyonlar için lizatlar, immünopresipitasyona (IP) devam etmeden önce SDS konsantrasyonunu% 1'e düşürmek için düz RIPA ile 5: 0.1 seyreltildi. Özgül olmayan bağlanmayı sınırlandırmak için lizatlar ilk önce immün olmayan IgG ve en azından 4 saat boyunca protein G-Sepharose (Sigma-Aldrich) ile immüno-çökeltme ile temizlendi. OsFosB daha sonra, 48 XIUMX XGUMIX’te 0.5-1® gg'de her iki FosB ve ΔFosB'de (SC-10G; Santa Cruz Biyoteknoloji, Santa Cruz, CA) mevcut bir iç epitopu tanıyan bir keçi poliklonal antikoru kullanılarak temizlenen lisatlardan imüno-çökeltildi (50 – 300 ofg toplam protein) toplam 0.5 ml hacminde. IP'ler, en az 4 saat boyunca bir rotor üzerinde 8 ° C'de yavaşça karıştırıldı ve daha sonra 15 ul protein G-Sepharose ilave edildi ve IP'ler, en az bir başka 4 saat boyunca karıştırıldı. IP'ler, 3000 × 'de eğrilerek topaklandı; g 3 ° C'de 5-4 dakika boyunca, üç kez 0.5 ml soğuk düz RIPA ve iki kez 0.1% Tween 20 içeren soğuk PBS ile yıkandı. Daha sonra IP'ler, 0.5 ml soğuk PBS içerisinde yeniden süspanse edildi, transfer edildi, yeni bir tüp içinde topak haline getirildi ve imüno-çökeltilmiş proteinler, daha sonra, 15-25® 2x indirgeyen Laemmli protein numune tamponu ilave edilerek elüte edildi. Bu IP protokolü, lizattaki hemen hemen tüm ΔFosB'lerin spesifik ve etkili çökeltilmesiyle sonuçlandı. İmmüno çökeltilmiş proteinler, bütün IP'yi bir 12.5% Tris-HCl Kriter jeline (Bio-Rad, Hercules, CA) yükleyerek SDS-PAGE'ye tabi tutuldu ve daha sonra PVDF veya nitroselüloza transfer edildi. Transferden sonra, membran hava ile kurutuldu ve 32P- ve 35S-radyoetiketli protein bantları, Kodak (Rochester, NY) otoradiografik filmi kullanılarak otoradyografi ile ve aynı zamanda bir Storm (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) PhosphorImager kullanılarak fosfor görüntüleme ile gözlendi. Toplam (fosforile edilmemiş ve fosforile edilmiş) cell Hücre lizatlarında veya beyin homojenatlarında FOSB, immüno-çökeltilmiş proteinin immüno-lekelenmesiyle tespit edildi (tespit etmek için kullanılan aynı zarın kullanılmasıyla) 32P-işaretli protein) veya eşit miktarlarda lizat / homojenat proteini SDS-PAGE'ye tabi tutulur ve PVDF veya nitroselüloza aktarılır. Zar ilk önce 1 ° C'de 0.1% (% h / h) Tween 20 (Sigma) ile desteklenmiş PBS içinde% 1 (ağırlık / hacim) yağsız kuru süt (Bio-Rad) ile inkübe edilerek bloke edildi. Daha sonra membran, gece boyunca 25 ° C'de, kendi tavşan anti-FosB poliklonal antikorumuzla, FosB / ΔFosB'in 4-1'i (16: 1'te kullanılır) karşı üretilen kendi immüno-lekelendi. Birincil inkübasyondan sonra, zarlar, bloklama tamponu ile 10,000 dakika boyunca dört kez yıkandı ve daha sonra 5 ° C'de ∼25 saat boyunca 1 ° C'de kuluçkalanmış bir keçi anti-tavşan IgG'si ile (Vector dan, bloklama tamponunda 1: 5000'te kullanıldı) Laboratuvarlar, Burlingame, CA). Membranlar daha sonra üç kez bloke edici tamponla 10 dakika boyunca ve bir kez PBS ile 5 dakika boyunca yıkandı. Toplam ΔFosB protein bantları, Kodak MR filminde, geliştirilmiş kemilüminesans (Pierce) ve / veya ECL-Plus reaktifleri (Amersham Biosciences) ve Storm PhosphorImager kullanılarak floresansın tespiti ile görselleştirildi.
Böcek hücrelerinden rekombinant ΔFosB'nin aşırı ekspresyonu ve saflaştırılması.
ΔFosB, Sf9 böcek hücrelerinde, Bac-to-Bac bakulovirüs ekspresyon sistemi (Invitrogen) kullanılarak ve üreticinin talimatlarını kullanarak bir N terminus hexa-His-tagged proteini (N-His (6) ΔFosB) olarak aşırı eksprese edildi. Kısaca, afinite N-terminali etiketi MGHHHHHHHAG'den önce gelen ΔFosB cDNA (tortular 2-237), rekombinant bakulovirüs oluşturmak için kullanılan pFASTBacTM1 vektöründe alt klonlanmıştır. Sf9 hücreleri, rekombinant virüs ile enfekte edildi ve N-His (6) ΔFosB, bir nikel kolon (Qiagen, Valencia, CA) kullanılarak bir afinite kromatografisi, bir mono-Q kolonu (Amersham kullanılarak anyon değişimi) dahil olmak üzere birkaç kromatografik adımla hücre lizatlarından saflaştırıldı. Biosciences) ve jel filtrasyon kolonu (Amersham Biosciences) kullanarak boyut dışlaması.
In vitro fosforilasyon çalışmaları.
In vitro Zaman süreci ve stokiyometri analizi için fosforilasyon reaksiyonları, 30 substm substrat (N-His (10) ΔFosB veya bir pozitif kontrol substratı), 6 ATm ATP ve 250 μCi / [l [γ- içeren 1 volumel hacminde gerçekleştirildi.32P] ATP, kinaz üreticisi tarafından tedarik edilen tampon ve aşağıdaki kinazlardan biri: CK2 (20 ng / ul; Upstate, Charlottesville, VA), CaMKII (10 ng / ul; Upstate), PKC (1.6 ng / ul; Upstate); Calbiochem) veya p70S6K (2.5 mU / ul; Upstate). Zaman dilimi reaksiyonları, belirtilen zaman noktalarında reaksiyon çözeltisinden 5 ul alikotları çıkarılarak ve eşit miktarda 4 x azaltıcı Laemmli protein numune tamponu ilave edilerek gerçekleştirildi. CK2 reaksiyonu için Michaelis-Menten kinetik parametreleri ampirik olarak tanımlanmış doğrusal kararlı durum koşulları altında belirlenmiştir. Bu reaksiyonlar, 15 ng / Nl enzim, 10 ATm ATP, 2 μCi / [l [γ- içeren bir 250 volumel hacminde 1 dakika boyunca gerçekleştirildi.32P] ATP ve N-His (6) XFOSB konsantrasyonları 2.5 – 30 μm. Tüm reaksiyonlar, bir su banyosunda 30 ° C'de gerçekleştirildi. SDS-PAGE ve jelin Bio-Safe Coomassie (Bio-Rad) ile boyanmasından sonra, jel kurutuldu ve 32P-fosfat birleşmesi fosfor görüntüleme analizi ile değerlendirildi (aşağıya bakınız, Veri nicelemesi, hesaplamalar ve istatistikler).
İki boyutlu fosfopeptit haritası ve fosfoamino asit analizi.
Bu analizlerin her ikisi de, tarif edildiği gibi yapıldı. Ploegh ve Dunn (2000). Kısaca, kuru jel fragmanları içeren 32P etiketli ΔFosB (ya in vitro reaksiyonlar veya metabolik olarak etiketlenmiş hücrelerin immünopresipitatlarından) eksize edildi, yeniden hidratlandı, yıkandı ve triptik sindirime maruz bırakıldı. Triptik sindirim ürünlerini içeren süpernatan liyofilize edildi ve liyofilat birkaç kez yıkandı ve elektroforez tamponu, pH 10'in 1.9®'sinde yeniden süspanse edildi. Numune (3 ul), bir selüloz ince katmanlı kromatografi (TLC) plakası (Analtech, Newark, DE) üzerinde lekelenmiştir ve bir boyutta elektroforez ve diğer boyut, TLC'yi yükselterek ayrılmıştır. Elde edilen fosfopeptit haritaları, otoradyografi ve fosfor görüntüleme ile görselleştirildi. Fosfoamino asit analizi için, elektroforez tamponunda yeniden süspanse edilmiş triptik özlerin 2 ul'si, bir NN altında 105 m HCl'de 25 dakika boyunca 3 ° C'de HCl hidrolizi ile ayrıca ayrıldı.2 atmosfer. Reaksiyon, su içerisinde altı kat seyreltme ile durduruldu ve karışım liyofilize edildi. Liyofilat, 5 ul elektroforez tamponu, pH 1.9 içinde yeniden süspanse edildi ve fosfo-Ser, -Thr ve -Tyr standartları ile birlikte bir selüloz TLC plakasında lekelendi. Elektroforez TLC plakasının uzunluğunun yarısı üzerinde elektroforez tamponu, pH 1.9 kullanılarak elektroforez yapıldı ve daha sonra plaka pH 3.5 tamponuna aktarıldı ve tamamlanana kadar elektroforez yapıldı. Fosfoamino asit standartları, TLC plakasının aseton içinde bir% 1 (h / h) ninhidrin çözeltisi ile püskürtülmesiyle görselleştirildi ve 32P etiketli amino asit örnekleri hem otoradyografi hem de fosfor görüntüleme ile görselleştirildi.
siRNA'nın indüklediği CK2α devrilme.
CK2 seviyelerini seçici olarak düşürmek için bir RNA girişim yöntemi kullandık (Di Maira ve diğerleri, 2005). PC12 hücreleri, ertesi gün ∼70 -% 80% birleşmesine ulaşmak için kolajen I-kaplı altı oyuklu plakalara ekildi, bunlar, katalitik olmayan mRNA ya da katalitik mRNA'sına yönlendirilen siRNA'nın geçici olarak 20 nm (nihai konsantrasyon) ile transfekte edildi. CK Rat CK2'in bir alt birimi, transfeksiyon maddesi SilentFectin (Bio-Rad) 'den 5 μl kullanılarak ve üreticinin talimatlarını takip ederek. Yaklaşık 24 saat sonra hücreler, yukarıda belirtildiği gibi geçici olarak ΔFosB plazmiti ile transfekte edildi. Yaklaşık olarak 24 saat sonra (siRNA transfeksiyonundan sonra UM48 saat), hücreler ya 32P metabolik etiketleme veya yukarıda tarif edildiği gibi darbe takip analizi. Aşağıdaki dört CKXAUAAUUAUUAUUAUUAUUAUUAUUAUUAUUAUUAUUAUUAUUAUUAUAUUAUUAUAUUAUU Negatif kontrol olarak kullandık Susturucu negatif kontrol #3 siRNA, Ambion'dan (Austin, TX). CK2'in yıkılma derecesi, gece boyunca bir 2: 06 seyreltisinde bir anti-CK873 poliklonal antikoru (Upstate'den katalog # 1-1000) kullanılarak immünoblotlama ile izlendi. β-Tubulin bir yükleme kontrolü olarak kullanıldı ve bir 05: 661 seyreltisinde bir gece boyunca bir monoklonal antikorla (katalog # 1-20,000) gece boyunca tespit edildi.
Bölgeye yönelik mutagenez.
Ser27'in Ala veya Asp'ye mutasyonu, Hızlı Değişim Alanına Yönelik Bir Mutagenez seti (Stratagene, La Jolla, CA) kullanılarak ve üreticinin talimatlarını takip ederek gerçekleştirildi. Fare ΔFosB proteinindeki Ser27 mutasyonlarını tanıtmak için aşağıdaki mutajenez primerleri kullanıldı. Ser27 - Ala: (ters primer) 5′GCCGAAGGAGTCCACCGAAGCCAGGTACTGAGACTCGGCGGAGGG3 '. Ser27 a Asp (ileri astar) 5′CCCTCCGCCGAGTCTCAGTACCTGGATTCGGTGGACTCCTTCGGC3 '. Mutasyona uğramış bazlar koyu renktedir ve Ser27 kodonu italikleştirilir.
Biyoinformatik.
BFosB için potansiyel fosforilasyon bölgeleri ve kinazlar, fare protein sekansı, ProSite (dahil olmak üzere) özel veritabanlarına gönderilerek arandı (http://www.expasy.org/prosite/), Protein tahmin (Rost ve diğerleri, 2004) ve NetPhosK (Blom ve arkadaşları, 2004).
Veri ölçümü, hesaplamalar ve istatistikler.
PVDF veya nitroselüloz membranında bulunan protein miktarı, bir Storm PhosphorImager ve beraberindeki ImageQuant yazılımı (Amersham Biosciences / Molecular Dynamics) kullanılarak ölçülmüştür. Hücre kültürü ve beyin dilimi fosforilasyon çalışmalarında, elde edilen değerler 32P etiketli protein daha sonra toplam ΔFosB için elde edilen değerlere bölündü ve bir oran olarak ifade edildi. İçinde in vitro fosforilasyon çalışmaları, miktarı 32P-etiketli ΔFosB molü başına ΔFosB (stokiyometri) daha önce tarif edildiği gibi hesaplandı (Sahin ve diğerleri, 2004). Tüm ölçümler, kullanılan aletin doğrusallık aralığında alındı. Kinetik parametreler Michaelis-Menten modeli kullanılarak hesaplandı; V = Vmaksimum[S] / ([S]+KM) Ve Vmaksimum = k2[EToplam]. Yarı ömrü (t1/2osFosB ve FosB’nin nabzı kovalayan alanlardan (veri noktalarına en iyi uyan doğrusal olmayan regresyon kullanılarak) tahmin edildi ve kalan protein miktarının orijinalin% 50 olduğu zamana karşılık geldi. Tüm şekillerde, gösterilen sonuçlar en az iki ila üç bağımsız deneyi temsil etmektedir. Tüm grafiklerde, gösterilen veriler ortalamalar ± SEM'lerdir (3 ≤ n ≤16). Farklılıkların istatistiksel önemi bir eşleştirilmemiş kullanılarak değerlendirildi t Test, çoklu karşılaştırmalar için düzeltildi ve yıldız işaretleri gösteriyor p N 0.05.
Sonuçlar
OsFosB alışılmadık derecede stabil bir transkripsiyon faktörüdür
Daha önce ΔFosB'nin göreceli olarak istikrarlı bir transkripsiyon faktörü olduğunu tahmin etmemize rağmen (Nestler ve arkadaşları, 2001), proteinin ciro profilinin doğrudan bir analizi henüz yapılmamıştır. Bu soruyu ele almak için, ΔFosB'nin bir rekombinant herpes simpleks virüsü (HSV-ΔFosB) ile enfeksiyon yoluyla geçici olarak eksprese edildiği nöron benzeri bir hücre çizgisi olarak kullanılan PC12 hücrelerini kullanarak darbe takip deneyleri yaptık. Yeni sentezlenmiş proteinler metabolik olarak etiketlendi 35S-Met / Cys ve bozulma paterni 35S etiketli ΔFosB (35S-ΔFosB), radyo-etiketli amino asitlerin çıkarılmasından sonra çeşitli zaman noktalarında elde edilen hücre lizatlarından imüno-çökeltilerek izlendi. İmmunopresipitatların SDS-PAGE ve otoradyografi ile analizi PC12 hücrelerinde ΔFosB'nin yarı ömrünün ∼10 h (İncir. 1). Bu bulgular ΔFosB'in yarı ömrünün, hücre kültüründe yarı ömrün ∼90 dakika olduğu bildirilen tam uzunlukta FosB dahil olmak üzere, indüklenebilir transkripsiyon faktörlerinin çoğundan daha yüksek olduğunu (bakınız Tartışma)Dobrazanski ve diğerleri, 1991; Carle ve diğ. 2004). Ek olarak, ΔFosB'deki bozulmanın birinci derece üssel bir bozunum eğrisi ile uyuşmadığını, daha ziyade daha yavaş bir bozunma oranı ile başlayıp bifazik olduğunu belirtmek gerekir. Bu, birden fazla ΔFosB türünün ve / veya birden fazla bozulma yolunun varlığını ortaya koymaktadır.
Daha büyük versiyonu görüntüle:
Şekil 1.
OsFosB, alışılmadık derecede stabil bir transkripsiyon faktörüdür. BFosB'nin yarı ömrü, hücre kültüründe ∼10 saattir. ΔFosB, PC12 hücrelerinde, HSV-ΔFosB ile enfeksiyonla veya ΔFosB içeren plazmit ile geçici transfeksiyonla ifade edildi ve hücreler, Malzemeler ve Yöntemler bölümünde tarif edildiği gibi darbe takip deneylerine tabi tutuldu. ΔFosB'yi aşırı ifade etmek için kullanılan yöntemden bağımsız olarak eşdeğer sonuçlar elde edildi. Şekil ΔFosB degradasyonunun zaman seyrini (ve temsili otoradyogramı) gösterir. Çizilen veriler, en az beş bağımsız deneyden elde edilen en az 15 bireysel veri noktasının ortalama ± SEM'idir. Karşılaştırma için, tam uzunlukta FosB'nin yarı ömrünün bildirildiği belirtilmiştir.
OsFosB beyindeki bir fosfoproteindir
BFosB'un post-translasyonel modifikasyonunun görünür stabilitesine katkıda bulunabileceğini varsaydık. Çünkü fosforilasyonun, transkripsiyon faktörlerinin aktivitesini, stabiliteleri dahil olmak üzere, birçok yönden modüle ettiği gösterilmiştir (bkz. Desterro ve diğerleri, 2000; Whitmarsh ve Davis, 2000) ΔFosB'un fosfoprotein olup olmadığını araştırdık. Bu amaçla, brainFosB ekspresyonu, özellikle frontal kortekste ofFosB'nin yüksek seviyelerini indüklediği bilinen bir tedavi olan kronik ECS kullanılarak sıçan beyninde indüklendi (Hope ve diğerleri, 1994a). Son ECS işleminden bir gün sonra, ΔFosB seviyeleri yüksek kaldığında, ince ön kortikal dilimler hazırlandı ve 32P-ortofosfat. Paralel bir etiket kümesi radyoetiketli değildi ve bunlar toplam ΔFosB seviyelerini tespit etmek için kullanıldı. Spesifik bir anti-FosB / ΔFosB antikoru ile immünopresipitasyondan ve immünopresipitasyonlu proteinlerin SDS-PAGE ile ayrılmasından sonra, fosforlanmış 32P-işaretli ΔFosB, otoradyografi ile, toplam ΔFosB ise immünoblotlama ile tespit edildi. Bu analiz, ΔFosB’in, beyninde spesifik olarak kanıtlandığı gibi, fosforile edildiğini göstermiştir. 32P-etiketli brain35 kDa bandı, kronik olarak tedavi edilen beyin örneklerinde bulunur, ancak sahte olarak tedavi edilen kontrollerde neredeyse tespit edilemez (İncir. 2A). Bu, kronik stimülasyon olmadığında, bazal BFosB seviyelerinin çok düşük olması ile tutarlıdır. İmmünopresipitasyon reaksiyonunun spesifitesi, immün olmayan IgG çökeltisindeki sinyal eksikliği ile açıklanmaktadır.
Daha büyük versiyonu görüntüle:
Şekil 2.
OsFosB beyinde bir fosfoproteindir. AOsFosB beyinde fosforile edilir. Endojen ΔFosB, Materyal ve Metotlarda tarif edildiği gibi kronik ECS tedavisi ile sıçan beyninde indüklenmiştir. Ön kortikal dilimler ile metabolik olarak etiketlendi 32PH3PO4 Birkaç saatliğine. Dilimlerin homojenleştirilmesinden sonra, ΔFosB immüno-çökeltildi ve hoFosB fosforile edildi (32P-ΔFosB) otoradyografi ile tespit edildi (üst panel). Radyoaktif olmayan immünopresipitatlardaki toplam ΔFosB, immünoblotlama (alt panel) ile tespit edildi. Negatif kontroller olarak, sahte muamele görmüş bir hayvanın ve immün olmayan IgG'nin immünopresipitatı gösterilmiştir. BBiyoinformatik analizler ile aday fosforilasyon bölgeleri ve fare ΔFosB protein sekansı için karşılık gelen tahmin puanlarına sahip kinazlar elde edildi. Tahmin puanları daha yüksek olan aday bölgeler protein dizisinde vurgulanır ve tabloda listelenir. DNA bağlayıcı (bazik) bölge ve lösin fermuarı, protein sekansında koyu renklidir. C, DΔFosB fosforilasyonu, Ser / Thr fosfataz inhibitörü OA ile arttırılır. C, 32Yokluğunda (Ctr) veya 100 ng / ml OA (grafik ve üst panel) varlığında etiketli ön kortikal dilimlerden immünopresipitatlarda P-ΔFosB düzeyleri otoradyografi ile tespit edildi. Alt panel, etiketlenmemiş dilimlerden immünopresipitatlarda immünoblotlama ile tespit edilen toplam BFosB'yi gösterir. DPC12 hücreleri HSV-ΔFosB veya HSV-LacZ (vektör) ile enfekte edildi ve metabolik olarak etiketlendi 32PH3PO4 (Ctr) veya 100 ng / ml OA yokluğunda. 32İmmunopresipitatlardaki P-ΔFosB düzeyleri otoradyografi ile saptandı (grafik, üst panel). Alt panel, immünoblotlama ile hücre lizatlarında tespit edilen toplam BFosB'yi gösterir.
KinFosB fosforilasyonunda hangi kinazların ve sitelerin yer aldığının aydınlatılmasına yönelik ilk adım olarak, amino asit dizisini birkaç biyoinformatik analize tabi tuttuk. Bu, ΔFosB'nin Tyr fosforilasyonu aday siteler içermemesine rağmen, üç CaMKII bölgesi, üç CK2 bölgesi ve çok yüksek fosforilasyon tahmin skorlarına sahip iki PKC bölgesi içeren birkaç Ser / Thr kinaz konsensüs bölgesi içerdiğini ortaya koydu (İncir. 2B). Biyoinformatikte tahmin edildiği gibi, ΔFosB sadece Ser veya Thr kalıntılarında fosforile edilirse, fosforilasyonu Ser / Thr fosfatazların aktivitesi ile önemli ölçüde modüle edilmelidir. Bu hipotezi test etmek için ön kortikal dilimleri etiketledik. 32Bir Ser / Thr protein fosfataz inhibitörü olan OA'nın varlığında veya yokluğunda P-ortofosfat. Da gösterildiği gibi Şekil 2C, OA’da (∼2.5 katlama) büyük bir artışa neden oldu. 32P-ΔFosB. Ayrıca, OA'nın kanserojen etkilerini Fos proteinleri de dahil olmak üzere bazı erken erken genleri indükleme kabiliyetine bağlayan önceki raporlarla tutarlı olan toplam osFosB seviyelerinde küçük bir artışa neden olmuştur (Miller ve arkadaşları, 1998; Choe ve diğerleri, 2004). Net sonuç, fosforile ΔFosB seviyelerinde önemli bir genel artış (∼60%).
Daha sonra, deneysel manipülasyona daha elverişli olan PC12 hücrelerinde ΔFosB'un beyinde görülene benzer bir fosforilasyon paterni gösterip göstermediğini araştırdık. PC12 hücrelerinde ΔFosB'yi HSV-ΔFosB ile enfeksiyon yoluyla ifade ettik ve hücreleri metabolik olarak etiketledik. 32OA varlığında veya yokluğunda P-ortofosfat. Proteinin HSV-infectedFosB ile enfekte olmuş hücrelerden başarılı ekspresyonu ve immünopresipitasyonu, hem immünoblottaki mevcudiyeti ile gösterilir (İncir. 2D, alt panel) ve vektörle enfekte olmuş hücrelerde bulunmayan ∼35 kDa bandının otoradyografisi (üst panel). Beyinde gözlendiği gibi, OA toplam ΔFosB seviyelerinde küçük bir artışa, ancak daha yüksek (yaklaşık iki kat) artışa neden oldu. 32P-ΔFosB, osFosB fosforilasyonunda belirgin (∼50%) net artışa neden olur. Ayrıca, biyoinformatik tahminlerle tutarlı bir şekilde, PC12 hücrelerinin bir Tyr fosfataz inhibitörü ile işlenmesi, 32P-ΔFosB seviyeleri (veri gösterilmiyor). Birlikte, bu bulgular ΔFosB'nin beyindeki ve PC12 hücrelerinde Ser ve / veya Thr kalıntıları üzerinde fosforile olduğunu ve ikincisinin, osFosB'nin fosforilasyon ve bozulma profillerini daha fazla incelemek için iyi bir hücre kültür sistemi olduğunu doğruladı.
CK2 fakat PKC veya CaMKII fosforilatları ΔFosB değil in vitro
Yukarıda tarif edildiği gibi, BFosB amino asit dizisinin analizi, CK2, PKC ve CaMKII fosforilasyon bölgeleri için yüksek tahmin puanları ortaya koydu. Bu kinazlardan hangisinin ΔFosB fosforile edebileceğini belirlemek için, bir dizi in vitro saflaştırılmış kinazlar ve saflaştırılmış rekombinant ΔFosB kullanılarak fosforilasyon reaksiyonları. Da gösterildiği gibi Şekil 3AÜç aday kinazdan yalnızca CK2, ΔFosB'yi belirgin bir şekilde fosforile etti. Ek olarak, birkaç başka kinaz test edildi (örneğin, GSK3 ve p70S6K), ancak ΔFosB'u önemli ölçüde fosforile etmede başarısız oldu (veriler gösterilmemiştir). Zaman seyri analizi ile CK2 reaksiyonunun ilave karakterizasyonu, bu kinazın, ΔFosB molü başına ∼0.5 mol fosfat katılımını katalize edebileceğini ortaya koydu.İncir. 3B). CK2'in ΔFosB'yi fosforile edebilmesi in vitro önemli bir stokiyometriye (∼50%) fizyolojik olarak uygun bir reaksiyonu düşündürür. Ardından, CK2'i artan miktarda saflaştırılmış ΔFosB varlığında inkübe ederek bu reaksiyonun kinetiğini inceledik ve CK2'in ΔFosB ile fosforilat yaptığını belirledik. Vmaksimum of 5.8 pmol · dk-1 · Μg-1 enzim, bir KM 18.4 µm ve bir kkedi 0.2 / s (öğesininİncir. 3C). Bu kinetik parametreler için elde edilen değerler, bu reaksiyonun fizyolojik alaka düzeyini daha da destekler. Örneğin, KM En iyi bilinen yüzeylerinden biri olan DARPP2 için CK32'in açıklaması 3.4 μm ve kkedi ∼0.3 / s (Girault ve diğerleri, 1989); KM ATP için ∼10 – 40 μm (Cochet ve diğerleri, 1983; Silva-Neto ve diğerleri, 2002), ve kazein için ∼10 – 50 μm (Meggio ve diğerleri, 1977; Pyerin ve arkadaşları, 1987). Birlikte, bu veriler osFosB’nin CK2 için iyi niyetli bir substrat olduğunu gösteriyor in vitro.
Daha büyük versiyonu görüntüle:
Şekil 3.
CK2 fakat PKC veya CaMKII fosforilatları ΔFosB değil in vitro. Otoradyograf (üst panel) fosforlanmış ürünü gösterir ve Coomassie lekeli jeli (alt panel) reaksiyonda mevcut olan toplam ΔFosB gösterir. A, Arıtılmış rekombinant ΔFosB tabi in vitro çeşitli aday kinazlarla fosforilasyon (üçü gösterilmiştir). B, Zaman seyri ve stokiyometrik analizler, CK2'in ΔFosB fosforile edebileceğini göstermektedir in vitro ∼50% stokiyometrisi ile. C, CK2 reaksiyonunun kinetik analizi, osFosB'nin bir iyi niyetli olduğunu ortaya çıkardı in vitro alt-tabaka. Reaksiyonun lineerleştirilmesi çift-karşılıklı bir komploda (altta) gösterilmektedir, ancak kinetik parametreler Michaelis-Menten eğrisinden (üst) türetilmiştir.
CK2, sağlam hücrelerde ΔFosB'un fosforilasyonunu ve stabilitesini modüle eder
XFosB’deki CK2’in aracılık ettiği fosforilasyonun fizyolojik ilişkisini değerlendirmek için, kullanılarak karşılaştırmalı fosfopeptit haritalaması yaptık. in vitro fosforile edilmiş ve PC12 hücreli fosforile edilmiş ΔFosB. SDS-PAGE ve jel elüsyonundan sonra 32P-ΔFosB (gelen in vitro reaksiyonları veya immüno-çökeltisinden 32P-etiketli hücreler), protein tripsin ile sindirildi ve elde edilen fosfopeptitler iki boyutlu ayrılmaya tabi tutuldu. Bu analiz, CK2 reaksiyonundan elde edilen ana fosfopeptidin, PC12 hücrelerinde fosforlanmış ΔFosB'den iki majör fosfopeptitten biri ile birlikte olduğunu gösterdi (İncir. 4A), PKC veya CaMKII (veriler gösterilmemiştir) reaksiyonundan kaynaklanan fosfopeptitler olmadı. Haritadaki PC12 hücrelerinden ikinci bir BFosB fosfopeptit mevcuttu, ancak benzer bir fosfopeptit üretmek için test ettiğimiz kinazların hiçbirinin yetersizliği nedeniyle in vitroHalen, bu ikinci fosfopeptidin, diğer fosfopeptitten farklı bir fosforilasyon bölgesi içerip içermediğini veya aynı fosforilasyon bölgesini içeren ayrı bir triptik peptidi temsil edip etmediğini bilmiyoruz.
Daha büyük versiyonu görüntüle:
Şekil 4.
CK2, sağlam hücrelerde ΔFosB'un fosforilasyonunu ve stabilitesini modüle eder. A, CK2 ama PKC değil, hücrelerde ΔFosB fosforluyor gibi görünmektedir. CK2 veya PKC ile fosforile edilmiş ΔFosB'nin iki boyutlu fosfopeptit haritaları in vitro veya sağlam PC12 hücreleri ile. Oklar, CK2-fosforile edilmiş peptidin eşzamanlı olduğunu gösterir, ancak PC12 hücrelerinden elde edilen eptFosB fosfopeptitlerden biri ile fosforile edilmiş PKC'yi değil. BPC12 hücrelerinde BFosB fosforilasyonu, hücrelerin güçlü CK2 aktivatör spermini (SP) ile işlenmesiyle arttırılır ve CK2 inhibitörü DRB ile muamele edilerek azalır. Buna karşılık, PC12 hücrelerinde ΔFosB fosforilasyonu, bir PKC aktivatörü (PMA) veya PKC'ye özgü inhibitör kalphostin-C (Calph) ile yapılan tedaviden etkilenmedi. Temsili bir otoradyogram (üst panel) ve immünoblot (alt panel) gösterilmektedir. C-F, CK2 aktivitesinin ΔFosB stabilitesi üzerindeki etkisi. Şekiller, ΔFosB degradasyonunun zaman seyrini (ve temsili otoradyogramı) göstermektedir. ΔFosB'yi geçici olarak eksprese eden PC12 hücreleri, CK2 inhibitörü DRB'nin yokluğunda veya varlığında yapılan darbe takip deneylerine tabi tutuldu.C), CK2 aktivatör spermini (D) veya geniş spektrumlu kinaz inhibitörü H-8 (E), DRB'nin spesifik olmayan etkilerini kontrol etmek için kullanıldı. FCK2'in katalitik alt ünitesinin ΔFosB stabilitesi üzerindeki etkisinin düşürülmesinin etkisi. PC12 hücreleri, hedeflenmeyen bir siRNA (Ctr) veya siRNA hedefleme sıçanı CK2α ve 24 h ile daha sonra bir osFosB plazmidi ile transfekte edildi. Üst panel, CK2 siRNA'nın CK2 ve ΔFosB protein seviyeleri üzerindeki etkisini gösteren tam hücre lizatlarının immünobloklarını gösterir. Β-tubulin için karşılık gelen immünoblot yükleme kontrolü olarak gösterilmektedir.
CK2'in bir osFosB kinaz olarak fizyolojik alaka düzeyini daha da ele almak için, XFosB-eksprese eden PC12 hücrelerini CK2 aktivitesini modüle eden iki ilaçla tedavi ettik. Da gösterildiği gibi Şekil 4BPC12 hücrelerinin hücre geçirgen CK2 inhibitörü DRB ile tedavisi ile ΔFosB fosforilasyonu azaltıldı (Meggio ve diğerleri, 1990; Szyszka ve arkadaşları, 1995) ve güçlü bir CK2 aktivatörü olduğu bilinen poliamin spermin ile işlemden geçirilerek arttırılmış (Cochet ve Chambaz, 1983; Meggio ve diğerleri, 1983). Buna karşılık, PC12 hücrelerinin PKC inhibitörü calphostin-C ile tedavisi (Kobayashi ve diğerleri, 1989; Tamaoki ve diğerleri, 1990) veya PKC aktivatörü PMA (Schmidt ve Hecker, 1975; Beh ve diğerleri, 1989) osFosB fosforilasyonunda önemli değişikliklere neden olmadı. PMA durumunda, hafif (ve önemli olmayan) artış 32P-ΔFosB, bu ilacın neden olduğu toplam ΔFosB seviyelerindeki bir artıştan sorumlu olabilir; Aslında, forbol esterlerinin FosB (dahil olmak üzere birçok Fos ailesi protein ekspresyonunu indüklediği bildirilmiştir).Yoza ve diğerleri, 1992; Suh ve diğerleri, 2004). Ayrıca, hücrelerin spesifik hücre geçirgen CaMKII inhibitörü m-AIP ile tedavisi (Ishida ve Fujisawa, 1995; Stevens ve diğerleri, 1999) ayrıca BFosB fosforilasyonunun azalmasına neden olmamıştır (veriler gösterilmemiştir). Birlikte, bu sonuçlar bizim in vitro bulgular ve sağlam hücrelerde ΔFosB'nin CK2 tarafından fosforile edildiğini ancak PKC veya CaMKII olmadığını gösterir. CK2 inhibisyonunun ΔFosB fosforilasyonunu tamamen önlemediği gerçeği, protein içindeki ilave fosforilasyon bölgelerinin varlığını gösterir.
Daha sonra CK2'in ΔFosB'un cirosunda ve dolayısıyla istikrarında bir rol oynayıp oynamadığını inceledik. Bu amaçla, ya fosforilasyon çalışmasında kullanılan CK12 inhibitörü ya da CK2 aktivatörü ile muamele edilmiş ΔFosB-eksprese eden PC2 hücrelerini kullanarak darbe takip deneyleri yaptık. Da gösterildiği gibi Şekil 4CHücrelerin CK2 inhibitörü DRB ile muamele edilmesinin, bifazikten üssel bir bozunumun eğrisine yakın bir eğriye dekfdasyon eğrisi şeklindeki değişimle kanıtlandığı üzere ΔFosB'nin devir hızı üzerinde önemli bir etkisi vardır. Buna karşılık, CK2 aktivatör sperminin varlığı, kovalamanın ilk saatlerinde proteinin birikmesine neden olan ΔFosB'nin bozulma oranında önemli bir düşüşe neden olmuştur (İncir. 4D).
Birçok kinaz aktivatörü ve inhibitöründe olduğu gibi, spermin ve DRB, CK2 aktivitesinin modülasyonu dışında metabolik etkilere sahip olabilir. Aslında, DRB'nin IIH (TFIIH) ile ilişkili kinaz transkripsiyon faktörünü inhibe ettiği gösterilmiştir (Yankulov ve diğerleri, 1995), RNA polimeraz II aracılı transkripsiyonun inhibisyonu ile sonuçlanır. Bu etki ΔFosB’in stabilitesini makul bir şekilde etkileyebileceğinden, geniş spektrumlu kinaz inhibitörü H-8’in etkisini analiz ettik (Hidaka ve Kobayashi, 1992) TFIIH ile ilişkili kinazı inhibe ettiği bilinen ancak CK200'i değil (2 μm) konsantrasyonunda BFosB ciroları üzerindeYankulov ve diğerleri, 1995). Da gösterildiği gibi Şekil 4EH-8 ile yapılan tedavi ΔFosB'nin devir hızını etkilememiştir. TFIIH ile ilişkili kinazı inhibe eden, ancak CK7'i olmayan bir konsantrasyonda kullanılan, başka bir geniş spektrumlu kinaz inhibitörü olan H-2 ile benzer sonuçlar elde edilmiştir (veriler gösterilmemiştir). Bu veriler ayrıca DRB'nin neden olduğu ΔFosB stabilitesindeki azalmanın büyük olasılıkla CK2'in inhibisyonuna atfedilebileceği yorumunu desteklemektedir.
CK2'in osFosB ciroundaki rolünü daha da ortaya koymak için, CK2’i siRNA üzerinden devretmenin sonuçlarını araştırdık. Bu deneyleri, önce kontrol (hedefleme yapmayan) siRNA ya da daha sonra CKFosB ile transfekte edilmiş sıçan CK12'in (CK2a) ve 2 saatinin katalitik alt ünitesinin mRNA'sını hedefleyen bir siRNA ile kontrol edilen PC24 hücrelerini kullanarak yaptık. Da gösterildiği gibi Şekil 4FCK2a siRNA ile transfeksiyon, XFosB seviyelerini etkilemeden CK2α protein seviyelerini etkili ve spesifik olarak düşürdü (üst panel). Nabız takibi analizi, CK2'in düşürülmesinin, proteinin daha hızlı bozunması ile kanıtlandığı gibi ΔFosB devir hızında önemli bir artışa yol açtığını göstermiştir. CK2 aktivitesinin inhibe edilmesinin (DRB işlemi veya siRNA aracılığıyla) ΔFosB'nin cirosunu arttırması ve bifazik eğrinin yavaş hız bileşeninin kaybolmasına yol açması, CK2 aktivasyonunun eğrinin yavaş fazını arttırması CK2’in ΔFosB stabilitesinin düzenlenmesinde rol oynadığı fikri.
CK2 XFosB’deki Ser27’deki fosforları
CK2 ile fosforlanmış ΔFosB üzerindeki bölgeleri tanımlamaya başlamak için, CK2 ile fosforile edilmiş bFosB rekombinant fosfo-amino asit analizi yaptık. in vitro ve PC12 hücrelerinde fosforlanmış ΔFosB. Bu deneyler, her iki durumda da tespit edilen tek fosfo-amino asidin fosfo-Ser olduğunu ortaya koymuştur.İncir. 5A). Bu bulgu, CK2 için elde edilen stokiyometri ile birlikte in vitro fosforilasyon reaksiyonu (∼50%) (İncir. 3Bve CK2 fosfopeptit haritasında yalnızca bir önemli nokta bulunması (İncir. 4A), ΔFosB’nin CK2 fosforilasyonunun muhtemelen tek bir serin kalıntısı ile sınırlı olduğunu göstermektedir. Bu sonuç fosforilasyon konsensüs alanı analizi ile uyumludur (İncir. 2B) CK27 için sadece bir aday serin, yani Ser2'i öngören. Taksonomik analiz, Ser27'in Fos ailesi üyeleri arasındaki evrimlerle büyük ölçüde korunduğunu ortaya koydu (İncir. 5B) önemli bir fizyolojik fonksiyona sahip olabileceğini düşündürmektedir.
Daha büyük versiyonu görüntüle:
Şekil 5.
CK2 Ser27'te Fosforilatlar osFosB. A, CK2-fosforile edilmiş fosfoamino asit analizi (in vitro) ve PC12 hücre fosforile edilmiş ΔFosB, her iki durumda da fosforile edilmiş ana kalıntının serin olduğunu gösterir. BFosB / ΔFosB amino asit dizisinin çapraz tür analizi, Ser27'in Fos ailesi üyeleri arasında insandan zebra balığı (koyu renk vurgulama) arasında yüksek oranda koruma sağladığını ortaya koydu. Bununla birlikte, CK3 konsensüs bölgesi için gerekli olan + 2 konumundaki asidik kalıntı korunmaz (ışık vurgusu). CHeLa hücreleri, Ser27'i Ala (S27A) ile ikame etmek için bir nokta mutasyonu içeren ya doğal tipte ΔFosB (WT) veya ΔFosB ile geçici olarak transfekte edildi. Hücreler metabolik olarak etiketlendi 32PH3PO4 ve CK2'i aktive etmek için araçla veya sperminle (SP) işlemden geçirildi. Elde edilen ΔFosB immünopresipitatların temsili bir otoradyogramı (üst panel) ve immünoblot (alt panel) gösterilmektedir. Sahte transfekte hücrelerin (vektör) imünopresipitatı gösterilmiştir.
Ser27'in ΔFosB'de fosforile edilip edilmediğini belirlemek için, bu tortuyu Ala'ya mutasyona uğrattık ve proteinin fosforilasyon durumu üzerindeki sonuçları analiz ettik. Bu amaçla, WT veya S27A mutantı ΔFosB'yi geçici olarak eksprese etmek için HeLa hücreleri (daha yüksek verimlilikle transfekte edilebilir) kullandık. Transfeksiyondan yaklaşık 24 saat sonra, hücreler metabolik olarak etiketlendi 32P-ortofosfat ve bütün hücreli lisatlar hazırlandı. İmmunopresipitasyon ve SDS-PAGE’yi takiben, 32P-ΔFosB, otoradyografi ile, toplam ΔFosB ise immünoblotlama ile tespit edildi. Da gösterildiği gibi Şekil 5C (alt panel), vektörle transfekte edilmiş hücrelerde ΔFosB saptanmamıştır, oysa WT veya S27A mutantı ΔFosB ile transfekte edilmiş hücreler proteini başarıyla ifade etmişlerdir. S27A mutasyonunun, (∼30%) oranında belirgin bir azalmaya neden olduğunu bulduk. 32P-ΔFosB seviyeleri (İncir. 5C, üst panel ve grafik), canlı hücrelerde ΔFosB'nin Ser27'te fosforile edildiğini gösterir. Ser27 hücrelerinde CK2 tarafından gerçekten fosforile edilip edilmediğinin belirlenmesi için, CK2 aktivatör sperminin WT ve S27A ΔFosB fosforilasyonunu modüle etme kabiliyetini karşılaştırdık. Daha önce PC12 hücrelerinde gözlemlediğimiz gibi (İncir. 4B), HeLa hücrelerinin spermin ile işlenmesi, WT proteininin fosforilasyonunu önemli ölçüde arttırdı. Bu etkinin S27A mutasyonu ile belirgin şekilde azaldığı gerçeği (İncir. 5C) osFosB'deki Ser27’in CK2’in fizyolojik bir substratı olduğu yorumunu desteklemektedir.
Ser27’un fosforilasyonu, ΔFosB’in kararlılığını düzenler
CK2 aktif hale getirildiğinde CK2 inhibe edildiğinde ve arttırıldığında osFosB'in stabilitesinin azaldığını belirledikten sonra (İncir. 4ve CK2’in Ser27’te ΔFosB fosforile etmesi (İncir. 5), bu bölgenin fosforilasyonunun önlenmesinin proteini dengesiz hale getirmesi gerektiğini tahmin ettik. WL veya S27A mutantı tantFosB'yi geçici olarak eksprese eden HeLa hücreleri ile yapılan darbe kovalama deneyleri, tahmin edildiği gibi, S27A mutasyonunun, tahmin edildiği gibi SXNUMXA mutasyonunun ve aynı zamanda resultFosB'nin yarı ömründe bir eşzamanlı azalmaya yol açtığını ortaya koydu (İncir. 6A). Daha sonra bu düzenleyici mekanizmanın daha nöron benzeri PC12 hücre hattında da meydana gelip gelmediğini araştırdık. Bu deneyler, HeLa hücrelerinde gözlemlediğimiz gibi, S27A nokta mutasyonunun PC12 hücrelerinde ΔFosB'nin yarı ömründe (∼11'ten ∼4 saatine) yarı ömründe çarpıcı bir düşüşe neden olduğunu gösterdi (İncir. 6B). Bu kararsızlaştırma işleminin CK2 inhibisyonu veya devre dışı bırakılmasının neden olduğu ile benzer olduğu (İncir. 4) Ser2’in CK27’in aracılık ettiği fosforilasyonunun ΔFosB’in kararlılığını düzenlediği fikri için daha fazla destek sağlar. Ser27 fosforilasyonunun ΔFosB protein devri üzerindeki düzenleyici rolüne ilişkin ek kanıtlar, Asp mutasyonuna (S27D) fosfonimetik bir Ser27 kullanarak elde edildi. S27D mutasyonu, fosfonimetik olarak kabul edilir, çünkü 27 amino asidine büyük bir negatif yüklü (karboksil) grubu yerleştirir ve bu nedenle Ser27 fosforilasyonunu kısmen taklit eder. Da gösterildiği gibi Şekil 6CS27D mutasyonu, S27A mutasyonunun zıt etkisine neden oldu ve WT proteinden önemli ölçüde daha stabil bir protein ile sonuçlandı. CK2 aktivasyonundan sonra elde edilen etkiye benzer şekilde (İncir. 4D), S27D mutasyonu birikim ile sonuçlandı ve böylece ilk kovalama saatlerinde ΔFosB seviyelerini arttırdı.
Daha büyük versiyonu görüntüle:
Şekil 6.
Ser27'un fosforilasyonu, osFosB'in stabilitesini düzenler. A, CSer27 fosforilasyonunun ΔFosB'nin devir hızı üzerindeki etkisini gösteren darbe takip analizi. Bozulma profili ve vahşi tip ΔFosB (WT), Ser27 ila Ala mutant (S27A) ile tahmini yarı ömürleri ve fosfonimetik Ser27 ila Asp mutant (S27D) için tahmini ömürleri gösterilmiştir. Aynı bulgular HeLa hücrelerinde de elde edildi (A) ve PC12 hücreleri (B, C).
Ser27 fosforilasyonu, proteasomal bozulmasını önleyerek osFosB’i stabilize eder
Ser27’in fosforilasyonunun ΔFosB’i stabilize ettiği mekanizmayı açıklamaya başlamak için, proteazom inhibitörlerinin MG132’in kabiliyetini inceledik (Palombella ve arkadaşları, 1994; Tsubuki ve diğerleri, 1996) ve epoksomisin (Hanada ve diğerleri, 1992; Kim ve arkadaşları, 1999) WT ve S27A mutantı osFosB'nin bozulma oranını modüle etmek için. Darbe kovalama deneyleri, WT veya S12A ΔFosB'yi eksprese eden bir rekombinant HSV ile enfekte olmuş ve DMSO veya iki proteazom inhibitöründen biri ile tedavi edilen PC27 hücreleri kullanılarak yapıldı. Bu deneyler, WT proteininin bozulma oranının, iki proteazom inhibitöründen birinin varlığına karşı nispeten duyarsız olduğu ortaya çıkardı (İncir. 7A), S27A mutantının bu ilaçlara karşı hassastır (İncir. 7B). Bu, WT proteininden farklı olarak S27A mutantının proteasomal bozunumun bir hedefi olduğunu gösterir. Nitekim, MG132 veya epoksomisin ile hücrelerin tedavisi, S27A mutasyonunun S27A'nın ∼4’un life9’un X132’un life12’un XXNUMX’in lifeXNUMX ve NXNUMX’in lifeXNUMX’in lifeXNUMX’in yarı ömründe artması ile kanıtladığı fullyFosB’in degradasyon oranı üzerindeki etkisini tamamen tersine çevirmiştir. Epoksomisin için XNUMX h (İncir. 7B). Birlikte, bu bulgular Ser27'te ΔFosB'un fosforilasyonunun proteini proteasomal bozulmaya karşı koruduğunu ve bu nedenle olağandışı stabilitesi için gerekli olduğunu göstermektedir.
Daha büyük versiyonu görüntüle:
Şekil 7.
Ser27'un fosforilasyonu, proteasomal bozulmasını önleyerek ΔFosB'yi stabilize eder. A, B, HSV ile enfekte PC12 hücreleri ile darbe takip analizi ve bozulma profilini gösteren ve vahşi tip ΔFosB'un yarı ömürlerinin tahminiA) veya S27A ΔFosB (B) İki proteazom inhibitöründen birinin yokluğunda veya varlığında [MG132 ve epoksomisin (Epoxo)]. Her iki ilacın da vahşi tip ΔFosB'nin ciroları üzerinde önemli bir etkisinin bulunmadığına, oysa proteazom inhibitörlü hücrelerin tedavisinin S27A ΔFosB stabilizasyonuna yol açtığını unutmayın. CXFosB'nin uzun vadeli beyin plastisitesine aracılık etme kabiliyetinde Ser27 fosforilasyonunun rolü için bir model. Bir kez uyarıldıktan sonra, ΔFosB'nin bir kısmı beyinde, S2’in CK27’in aracılık ettiği fosforilasyonuyla stabilize edilir. Bu, birikimiyle sonuçlanır ve bu da gen ifadesinde uzun süreli değişikliklere neden olur. Gen ekspresyonundaki bu stabil değişiklikler, kararlı davranış adaptasyonlarına katkıda bulunur. Tersine, S27'in Ser / Thr fosfatases PP1 ve / veya PP2A tarafından fosforilasyonu, proteinin dengesizleşmesine ve proteazomal makine tarafından işlenmesine yol açar.
Tartışma
Bu çalışmada, ΔFosB’in hücre kültüründe yarı ömürlü ∼10 h ömrüne sahip olduğunu gösterdik; bu, tam uzunlukta FosB ve hücre kültüründe yarı ömürleri kısa olabilen diğer birçok uyarılabilir transkripsiyon faktörüne kıyasla stabil olmasını sağlar birkaç dakika olarak ve nadiren 3 saat değerini aştığında (Hann ve Eisenman, 1984; Dobrazanski ve diğerleri, 1991; Roberts ve Whitelaw, 1999; Ferrara ve diğerleri, 2003; Hirata ve diğerleri, 2004). Ek olarak, BFosB'nin beyinde fosforile olduğunu ve fosforilasyonunun PP1 / PP2A inhibitörü okadaik aside duyarlı olduğunu tespit ettik. Hücre kültürü çalışmalarımız, ΔFosB'in stabilitesinin, proteini stabilize eden daha yüksek CK2 aktivitesi ile CK2 tarafından modüle edildiğini göstermektedir. Son olarak, bulgularımız CK2'in yüksek oranda korunmuş bir N terminus serininde (S27) ΔFosB'yi fosforile ettiğini ve S27'un fosforilasyonunun osFosB'yi proteazomal bozulmadan koruduğunu göstermektedir. Bu nedenle, CK27 tarafından S2 üzerindeki ΔFosB'un fosforilasyonunun osFosB (osFosB’nin ciro kritik bir düzenleyici mekanizması olduğu bir model öneriyoruz)İncir. 7C). ΔFosB'nin bu tür fosforilasyon aracılı stabilizasyonu fonksiyonel olarak önemlidir, çünkü özellikle beyin bölgelerindeki ΔFosB seviyelerinin yükselmesinin sayısız nöronal genleri doğrudan düzenlediği gösterilmiştir in vivo ve çeşitli nöropsikiyatrik bozuklukların hayvan modellerinde güçlü davranışsal etkiler göstermek (bkz. Giriş).
Fosforilasyon, CREB (cAMP yanıt elemanı bağlayıcı protein) gibi bazı transkripsiyon faktörlerinin transkripsiyonel aktivitesini düzenlemenin hızlı ve geri dönüşlü bir yolu olmasına rağmen (Bohmann, 1990), transkripsiyon faktörlerinin bozulmasının modüle edilmesi, daha güçlü (daha az kolay geri dönüşlü) bir düzenleme biçimi sağlar (Desterro ve diğerleri, 2000). Fonksiyonel aktiviteleri kendi degradasyon seviyesinde düzenlenen transkripsiyon faktörleri NFκB (Desterro ve diğerleri, 2000), c-Myc (Sears ve diğerleri, 1999) ve c-Fos (Ferrara ve diğerleri, 2003), diğerleri arasında. Birçok durumda, fosforilasyon, c-Fos için gösterildiği gibi, bir transkripsiyon faktörünün stabilitesinin kilit bir düzenleyicisidir (Okazaki ve Sagata, 1995; Tsurumi ve arkadaşları, 1995), Fos ile ilişkili antijen-1 (Fra-1) (Flakon ve Marshall, 2003), Fra-2 (Manabe ve arkadaşları, 2001), c-Jun (Fuchs ve diğerleri, 1996), JunB (Fuchs ve diğerleri, 1997), ATF2 (Fuchs ve diğerleri, 2000) ve p53 (Buschmann ve arkadaşları, 2001). Bu nedenle çalışmalarımız, fosforile bağımlı stabilitesi ile fonksiyonel etkinliği düzenlenen bu transkripsiyon faktörleri listesine listFosB ekler.
CK2, şimdiye kadar tanımlanan 300'den fazla iddia edilen substratı olan ve hücre ölümü ve hayatta kalma (Litchfield, 2003; Unger ve diğerleri, 2004), hücresel stres tepkileri (Yanagawa ve diğerleri, 1997; Kato ve arkadaşları, 2003) ve DNA onarımı ve kromatin tadilatı (Barz ve diğerleri, 2003; Krohn ve diğerleri, 2003). CK2'in varsayılan substratlarının üçte birinden fazlası gen ekspresyonunun düzenlenmesinde rol oynayan proteinlerdir (Meggio ve Pinna, 2003). Aslında, CK2'in belirgin bir nükleer kinaz olduğu gösterilmiştir (Krek ve diğerleri, 1992) (inceleme için bkz. Yu ve arkadaşları, 2001) ve birkaç transkripsiyon faktörünün bZIP alanlarıyla etkileşime geçmek (Yamaguchi ve arkadaşları, 1998). CK2 aracılı fosforilasyonun, IkB (dahil olmak üzere birçok proteinin bozulmasını (arttırması veya azaltması) modüle ettiği gösterilmiştir.Schwarz ve diğerleri, 1996), PTEN (Torres ve Pulido, 2001), lens connexin (Yin ve arkadaşları, 2000), kromatin ile ilişkili protein HMG1 (Wisniewski ve arkadaşları, 1999) ve HMGB gibi birkaç transkripsiyon faktörü (Stemmer ve diğerleri, 2002), Myf-5 (Winter ve diğerleri, 1997) ve c-Myc (Channavajhala ve Seldin, 2002). CK2 beyinde en bol miktarda bulunur (Alcazar ve diğerleri, 1988; Girault ve diğerleri, 1990ve bunun aktivitesi, nöronal sağkalım dahil olmak üzere beyin fonksiyonunun birçok yönüne dahil edilmiştir (Boehning ve diğerleri, 2003), farklılaşma (Nuthall ve arkadaşları, 2004), iyon kanalı işlevi (Jones ve Yakel, 2003; Bildl ve diğerleri, 2004) ve uzun vadeli güçlenme ve nöronal plastisite (Diaz-Nido ve diğerleri, 1992; Lieberman ve Mody, 1999; Reikhardt ve diğerleri, 2003).
CK2'un nöronal fonksiyonun düzenlenmesindeki rolü hakkındaki artan kanıtlara rağmen, aktivitesini neyin kontrol ettiği hakkında çok az şey bilinmektedir. CK2'in çoğunlukla hücre içi lokalizasyonundaki değişikliklere dayanan spesifik substratları fosforile etme kabiliyetinin düzenlenmesiyle yapısal olarak aktif olduğu düşünülmektedir (örn., Sitozol ve çekirdek) (Ahmed ve Tawfic, 1994; Yu ve arkadaşları, 1999). Bu bilgi, kronik stimülasyondan sonra beyinde ΔFosB birikimini indüklemek için hangi sinyallerin gerekli olduğu konusunda önemli bir soru ortaya çıkarmaktadır (İncir. 7C). Bir gereklilik, tekrarlanan aktivasyondur. FosB andFosB mRNA'nın geni ve indüksiyonu (Chen ve arkadaşları, 1995). Verilerimiz ΔFosB’in CK2 fosforilasyonunun stabilitesi için kritik öneme sahip olduğunu göstermektedir; bu, ΔFosB’nin gen ekspresyonu üzerindeki uzun vadeli etkileri için ikinci bir sinyalin gerekebileceğini, yani CK2 tarafından proteinin fosforilasyonunu uyaran bir sinyalin gerekli olabileceğini göstermektedir. Bu, CK2'in bilinmeyen bir mekanizma tarafından aktivasyonunu veya çekirdeğe translokasyonunu içerebilir. Alternatif olarak, ΔFosB'nin CK2 fosforilasyonu, ΔFosB proteininin her bir uyarıcıya cevaben çevrilmesi, bir kısmının fosforile edilmesini ve böylece stabilize edilmesini sağlayacak şekilde gerçekleştirilebilir;
Bulgularımız, CK2 ve S27'in muhtemelen osFosB fosforilasyonundan sorumlu tek kinaz ve bölge olmadığını gösterir çünkü CK2 veya S27A mutasyonunun inhibisyonu, ΔFosB fosforilasyonunu tamamen önleyemedi. Aynı şekilde, S27A mutasyonunun fosfo-ΔFosB'de% 30 azalması ile sonuçlanması, S27'in protein üzerinde büyük bir fosforilasyon bölgesi olduğunu iddia eder. Bununla birlikte, puFosB'deki diğer olası kinazları ve fosforilasyon bölgelerini araştırıyoruz. Sonuçta, S27 fosforilasyonunu ve beyindeki ΔFosB'deki diğer herhangi bir fosforilasyon bölgesini analiz etmek de önemli olacaktır. in vivo çeşitli kronik stimülasyon türlerinden sonra, örneğin, kütle spektrometrisi veya fosfospesifik antikorlar kullanılarak.
Yukarıda belirtildiği gibi, ΔFosB'deki S27 evrim boyunca ve diğer Fos ailesi proteinleri arasında yüksek oranda korunmuştur. Bununla birlikte, CK2'in fikir birliği bölgesi şu şekilde değildir: Şekil 5Bsadece FosB / ΔFosB (ve Zebrafish xenolog), ancak c-Fos veya Fra-2 değil, + 3’te asidik bir kalıntıya sahiptir, CK2 fosforilasyonunun kilit bir belirleyicisidir (Marin ve arkadaşları, 1986; Meggio ve diğerleri, 1994). Bu nedenle, S2 üzerindeki CK27 fosforilasyonunun olmaması diğer Fos ailesi proteinlerinin neden ΔFosB kadar stabil olmadığını açıklayabilir. Bununla birlikte, bu, ΔFosB ile aynı CK2 konsensüs alanına sahip olan tam uzunlukta FosB'un benzer şekilde dengelenmediğini açıklamıyor. Tam uzunlukta FosB'nin bu korunan kalıntı üzerinde CK2 tarafından fosforile edilip edilmediğini bilmiyoruz. Sadece FosB raporları (Skinner ve arkadaşları, 1997) ve c-Fos (Okazaki ve Sagata, 1995; Chen ve arkadaşları, 1996fosforilasyon, bu proteinlerin C-terminal bölgesindeki ΔFosB'da bulunmayan bölgeleri tanımlar. Tam uzunlukta FosB ve diğer Fos ailesi proteinlerinin CK2 tarafından potansiyel fosforilasyonu doğrudan araştırma gerektirir. Bununla birlikte, fosforile edilmiş olsalar bile, diğer Fos familyası proteinlerinin, C parçalarında hızlı bir şekilde bozunma için proteinleri hedef alan motifleri içerdiği bilinmektedir (Papavassiliou ve arkadaşları, 1992; Jariel-Encontre ve diğerleri, 1997; Acquaviva ve arkadaşları, 2002). Örneğin, tüm Fos ailesi proteinlerinin C terminalinde bulunan, ancak butFosB'de bulunmayan bir ∼21 tortusunun c-Fos için kararsızlaştırıcı bir etki görevi gördüğü gösterilmiştir (Acquaviva ve arkadaşları, 2001). Her ne kadar bu dizi benzer şekilde tam uzunlukta FosB'yi dengesizleştirse de bulduk (Carle ve diğerleri, 2004) domainFosB’de bu alanın yokluğu, dengelenmesini tam olarak hesaba katmaz. Aksine, bu C terminus alanının yokluğu ve Ser27 fosforilasyonunun kombinasyonu, ΔFosB ve FosB arasındaki kararlılıktaki yaklaşık beş katlık farkı tamamen hesaba katmaktadır.
Fos familyası proteinlerinin yıkımı karmaşık ve tam olarak anlaşılmamış olmasına rağmen, proteasomal yıkım, söz konusu ana yol gibi görünmektedir (Salvat ve diğerleri, 1999; Acquaviva ve arkadaşları, 2002; Ferrara ve diğerleri, 2003). Proteasomal inhibitörlerin ΔFosB degradasyon oranını önemli ölçüde değiştirmediği burada sunulan veriler, diğer Fos familyası proteinlerinden farklı olarak ΔFosB'nin 26S proteazomundan kaçtığını ve bunun stabilizasyonunda merkezi bir rol oynadığını iddia eder. Bu nedenle, ΔFosB'nin arttırılmış stabilitesinin iki ana faktörün kombinasyonuna atfedilebileceği bir şema öneriyoruz: (1) bir C-terminali dengesizleştirici alanın olmaması ve (2) S27 tarafından S2 tarafından fosforilasyonu.
Özet olarak, bu çalışma neden erken erken genin bir ürünü olan ΔFosB'nin neden olduğu konusunda mekanik bir fikir vermektedir. FosBdiğer Fos ailesi üyelerinden farklı olarak nispeten uzun ömürlü bir proteindir. Diğer Fos ailesi proteinlerinin hızlı ancak geçici uyarıcı-transkripsiyon kaplinine aracılık ettiği düşünülse de (Morgan ve Curran, 1995,FosB'nin nispi stabilitesi, kronik stimülasyon tarafından indüklenen daha uzun süren transkripsiyonel değişikliklere aracılık etme yeteneği verir. Bu, ΔFosB'un beyinde sürekli bir moleküler anahtar işlevi gördüğü ve akut yanıtları kademeli olarak kronik adaptasyonlara dönüştürdüğü görüşünü destekler. Ser27 fosforilasyonunun, ΔFosB'un stabilitesi için merkezi bir mekanizma olarak tanımlanması, ΔFosB'in fonksiyonunu düzenleyen ve böylece sinirsel ve davranışsal plastiklik üzerindeki uzun vadeli etkilerini modüle eden araçların geliştirilmesi için yeni yollar açar.
Dipnotlar
- Kasım 21, 2005 alındı.
- Revizyon Şubat 21, 2006 aldı.
- Nisan 2, 2006 kabul edildi.
- Bu çalışma, PGU’ya Ulusal Şizofreni ve Depresyon Genç Araştırmacı Ödülü’nün Ulusal Uyuşturucu Bağımlılığı Enstitüsü (NIDA) Ulusal Araştırma Hizmeti Ödülü’nün PGU’ya verdiği Ulusal İttifak ve Ulusal Zihin Sağlığı Enstitüsü ve NIDA’dan EJN’ye James Bibb'e yardımları için teşekkür ederim. in vitro fosforilasyon analizleri, metabolik etiketleme için kullanılan beyin dilimlerinin hazırlanmasına yardım ettiği için Dr. Ming-Hu Han ve rekombinant HSV'lerin paketlenmesine yardım ettiği için Dr. Rachael Neve'dir.
- G. Rudenko'nun şu anki adresi: Yaşam Bilimleri Enstitüsü ve Farmakoloji Bölümü, Michigan Üniversitesi, 210 Washtenaw Avenue # 3163A, Ann Arbor, MI 48109-2216.
- Yazışmalar, Eric J. Nestler, 5323 Harry Hines Bulvarı, Dallas, TX 75390-9070 ile yapılmalıdır. E-posta: [e-posta korumalı]
Referanslar
Acquaviva C, Brockly F, Ferrara P, Bossis G, Salvat C, Jariel-Encontre I, Piechaczyk M (2001) G (0) -S-faz faz geçişi sırasında c-Fos proto-onkoproteinin hızlı proteasomal bozulmasının kontrolünde rol oynayan bir C-terminal tripeptid motifinin belirlenmesi. Onkogen 20:7563-7572.
Acquaviva C, Bossis G, Ferrara P, Brockly F., Jariel-Encontre I, Piechaczyk M (2002) Fos ailesi proteinleri için çoklu bozulma yolları. Ann NY Acad Bilim 973:426-434.
Ahmed K, Tawfic S (1994) Protein kinaz CK2 hücre içi düzenleme mekanizması: uyaran kaynaklı subnükleer ilişkinin rolü. Celi Mol Biol Res 40:539-545.
Alcazar A, Martin E, Lopez Fando J, Salinas M (1988) Geliştirilmiş bir saflaştırma prosedürü ve beyindeki kazein kinaz II'nin özellikleri. Neurochem Res 13:829-836.
Andersson M, Westin JE, Cenci MA (2003) Kronik dopaminomimetik tedavinin kesilmesinden sonra striatal DeltaFosB benzeri immünoreaktivite ve prodinorfin mRNA seviyeleri. Eur J Neurosci 17:661-666.
Barz T, Ackermann K, Dubois G, Eils R, Pyerin K (2003) Genom çapında ekspresyon ekranları, kromatin remodelinginde protein kinaz CK2 için global bir rol olduğunu gösterir. J Celi Sci 116:1563-1577.
Behind I, Schmidt R, Hecker E (1989) HL-60 hücrelerinde bulunan iki PKC izozimi, forbol ester TPA tarafından aktivasyonda bir fark gösterir. FEBS Lett 249:264-266.
Bildl W, Strassmaier T, Thurm H, Andersen J, Eble S, Oliver D, Knipper M, Mann M, Schulte U, Adelman JP, Fakler B (2004) Protein kinaz CK2 küçük iletkenlik Ca (2 +) - aktifleştirilmiş K + kanalları ile birlikte monte edilir ve kanal geçişini düzenler. Nöron 43:847-858.
Bing G, Wang K, Qi Q, Feng Z, Hudson P, Jin L, Zhang G, Bing R, Hong JS (1997) Fos ile ilişkili antijenin uzun süreli ekspresyonu ve sıçan hipokampus ve striatumdaki nöbetlerle ilişkili delta FosB'nin geçici ekspresyonu. J Neurochem 68:272-279.
Blom N, Sicheritz-Ponten T, Gupta R, Gammeltoft S, Brunak S (2004) Amino asit dizisinden proteinlerin translasyon sonrası glikosilasyonu ve fosforilasyonunun öngörülmesi. proteomiks 4:1633-1649.
Boehning D, Ay C, Sharma S, KJ Zarar, Hester LD, Ronnett GV, Shugar D, Snyder SH (2003) Heme oksijenaz-2’in CK2 fosforilasyonuyla aktive edilen karbon monoksit nörotransmisyonu. Nöron 40:129-137.
Bohmann D (1990) Transkripsiyon faktörü fosforilasyonu: sinyal transdüksiyonu ve gen ekspresyonunun düzenlenmesi arasında bir bağlantı. Kanser hücreleri 2:337-344.
Buschmann T, Potapova O, Bar-Shira A, Ivanov VN, Fuchs SY, Henderson S, Kızarmış VA, Minamoto T, Alarcon-Vargas D, Pincus MR, Gaarde WA, Holbrook NJ, Shiloh Y, Ronai Z (2001) Jun NH2-terminal kinaz fosforilasyonu, pxNUMX'in Thr-53 üzerindeki fosforilasyonu, strese cevap olarak p81 stabilizasyonu ve transkripsiyonel aktiviteler için önemlidir. Mol Celi Biol 21:2743-2754.
Carle TL, Ulery PG, Nestler EJ (2004) Korunmuş bir Fos ailesi C-terminal alanının olmaması, deltaFosB'nin benzersiz stabilitesine katkıda bulunur. Soc Neurosci Abstr 30: 692.2.
Channavajhala P, Seldin DC (2002) Lenfomagenezde protein kinaz CK2 ve c-Myc'nin fonksiyonel etkileşimi. Onkogen 21:5280-5288.
Chen J, Nye HE, Kelz MB, Hiroi N, Nakabeppu Y, Umut BT, Nestler EJ (1995) Delta FosB ve FosB benzeri proteinlerin elektrokonvülsif nöbet ve kokain tedavisi ile düzenlenmesi. Mol Pharmacol 48:880-889.
Chen J, Kelz MB, Umut BT, Nakabeppu Y, Nestler EJ (1997) Kronik Fos-ilişkili antijenler: Beyinde kronik tedaviler tarafından indüklenen ΔFosB'in stabil varyantları. J Neurosci 17:4933-4941.
Chen RH, Juo PC, Curran T, Blenis J (1996) C-Fos'in C-terminusta fosforilasyonu dönüşüm aktivitesini arttırır. Onkogen 12:1493-1502.
Choe ES, Parelkar NK, Kim JY, Cho HW, Kang HS, Mao L, Wang JQ (2004) Protein fosfataz 1 / 2A inhibitörü okadaik asit, in vivo olarak sıçan striatumda CREB ve Elk-1 fosforilasyonunu ve c-fos ekspresyonunu arttırır. J Neurochem 89:383-390.
Cochet C, Chambaz EM (1983) Poliamin aracılı protein fosforilasyonları: hücre içi poliamin etkisi için olası bir hedef. Mol Hücresi Endokrinol 30:247-266.
Cochet C, Feige JJ, Chambaz EM (1983) Sığır akciğer dokusundan yüksek oranda saflaştırılmış G tipi bir kazein kinazın katalitik ve moleküler özellikleri. Biochim Biophys Acta 743:1-12.
Colby CR, Fısıldayan K, Steffen C, Nestler EJ, Öz DW (2003) DeltaFosB'nin striatal hücre tipine spesifik aşırı ekspresyonu, kokain için teşvikleri arttırır. J Neurosci 23:2488-2493.
Daunais JB, Roberts DC, McGinty JF (1993) Kokain kendi kendine tatbikat, sıçan striatumunda mRNA'yı cı-fos olarak değil, preodinorfini arttırır. NeuroReport 4:543-546.
Desterro JM, Rodriguez MS, Hay RT (2000) Transkripsiyon faktörlerinin protein yıkımı ile düzenlenmesi. Celi Mol Yaşam Bilimi 57:1207-1219.
Diaz-Nido J, Armas-Portela R, Avila J. (1992) Sitoplazmik kazein kinaz II tipi aktivitedeki artış, NIA-103 nöroblastom hücrelerinde DNA sentezi inhibisyonundan sonra nörit büyümesine eşlik eder. J Neurochem 58:1820-1828.
Di Maira G, Salvi M, Arrigoni G, Marin O, Sarno S, Brustolon F, Pinna LA, Ruzzene M (2005) Protein kinaz CK2, Akt / PKB'yi fosforile eder ve düzenler. Hücre Ölümü Farkı 12:668-677.
Dobrazanski P, Noguchi T, Kovary K, Rizzo CA, Lazo PS, Bravo R, (1991) FosB geninin her iki ürünü, FosB ve kısa şekli FosB / SF, fibroblastlarda transkripsiyonel aktivatörlerdir. Mol Celi Biol 11:5470-5478.
Ferrara P, Andermarcher E, Bossis G, Acquaviva C, Brockly F, Jariel-Encontre I, Piechaczyk M (2003) C-Fos proteini proteasomal bozulmasından sorumlu yapısal belirleyiciler, ifade koşullarına göre farklılık gösterir. Onkogen 22:1461-1474.
Fuchs SY, Dolan L, Davis RJ, Ronai Z (1996) Jun N-kinaz ile c-Jun ubiquitination'un fosforilasyonuna bağlı hedeflemesi. Onkogen 13:1531-1535.
Fuchs SY, Xie B, Adler V, Kızarmış VA, Davis RJ, Ronai Z (1997) c-Jun NH2-terminal kinazları, ilişkili transkripsiyon faktörlerinin yaygınlaşmasını hedefler. J Biol Chem 272:32163-32168.
Fuchs SY, Tappin I, Ronai Z (2000) ATF2 transkripsiyon faktörünün stabilitesi, fosforilasyon ve fosforilasyon ile düzenlenir. J Biol Chem 275:12560-12564.
Girault JA, Hemmings HC Jr, Williams K, Nairn AC, Greengard P (1989) Bir dopamin ve cAMP ile düzenlenmiş fosfoprotein olan DARPP-32'un kazein kinazı II ile fosforilasyonu. J Biol Chem 264:21748-21759.
Girault JA, Hemmings HC Jr, Zorn SH, Gustafson EL, Greengard P (1990) Kazein kinazı II ile aynı DARPP-32 serin kinazın memeli beyninde karakterizasyon. J Neurochem 55:1772-1783.
Hanada M, Sugawara K, Kaneta K, Toda S, Nishiyama Y, Tomita K, Yamamoto H, Konishi M, Oki T (1992) Epoksomisin, mikrobiyal kökenli yeni bir antitümör ajan. J Antibiot (Tokyo) 45:1746-1752.
Hann SR, Eisenman RN (1984) İnsan c-myc onkojeni tarafından kodlanan proteinler: neoplastik hücrelerde diferansiyel ekspresyon. Mol Celi Biol 4:2486-2497.
Hemmings HC Jr, Girault JA, Williams KR, LoPresti MB, Greengard P (1989) ARPP-21, dopaminle tehdit edilen beyin bölgelerinde zenginleştirilmiş, siklik bir AMP-düzenlenmiş fosfoprotein (Mr = 21,000). Sağlam hücrelerde siklik AMP ile fosforile edilmiş sitenin amino asit dizisi ve fosforilasyonunun in vitro kinetik çalışmaları. J Biol Chem 264:7726-7733.
Hidaka H, Kobayashi R (1992) Protein kinaz inhibitörlerinin farmakolojisi. Annu Rev Pharmacol Toxicol 32:377-397.
Hirata H, Bessho Y, Kokubu H, Masamizu Y, Yamada Y, Lewis J, Kageyama R (2004) Hes7 proteininin dengesizliği somite segmentasyon saati için çok önemlidir. Nat Genet 36:750-754.
Hiroi N, Graybiel AM (1996) Atipik ve tipik nöroleptik tedaviler, striatumdaki farklı transkripsiyon faktörü ekspresyon programlarını indükler. J Comp Neurol 374:70-83.
B umut, Kosofsky B, Hyman SE, Nestler EJ (1992) Acil erken gen ekspresyonu ve sıçan çekirdeğindeki AP-1 bağlanmasının düzenlenmesi kronik kokain tarafından uyarılır. Proc Natl Acad Sci ABD 89:5764-5768.
BT Umut, Kelz MB, Duman RS, Nestler EJ (1994a) Kronik elektrokonvülsif nöbet (ECS) tedavisi, beyinde değişmiş kompozisyon ve özelliklere sahip uzun ömürlü bir AP-1 kompleksinin ekspresyonu ile sonuçlanır. J Neurosci 14:4318-4328.
Umut BT, Nye HE, Kelz MB, Öz DW, Iadarola MJ, Nakabeppu Y, Duman RS, Nestler EJ (1994b) Beyinde kronik kokain ve diğer kronik tedaviler tarafından değiştirilmiş Fos benzeri proteinlerden oluşan uzun ömürlü bir AP-1 kompleksinin uyarılması. Nöron 13:1235-1244.
Ishida A, Fujisawa H. (1995) Calmodulin'e bağımlı protein kinaz II'nin oto inhibitör domeni vasıtasıyla stabilizasyonu. J Biol Chem 270:2163-2170.
Jariel-Encontre I, Salvat C, Steff AM, Pariat M, Acquaviva C, Furstoz O, Piechaczyk M (1997) C-fos ve c-jun bozulması için karmaşık mekanizmalar. Mol Biol Rep 24:51-56.
Jones S, Yakel JL (2003) Kazein kinazı ii (protein kinaz ck2), ng5-3 hücrelerinde serotonin 108-ht (15) reseptör kanalı fonksiyonunu düzenler. Neuroscience 119:629-634.
Kato T Jr, Evre M, Hoffmann A, Karin M (2003) CK2, UV yanıtı sırasında NF-kappaB aktivasyonundan sorumlu bir C-terminal IkappaB kinazıdır. Mol Hücresi 12:829-839.
Kelz MB, Chen J, Carlezon WA Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, Öz DW, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Neve RL, Duman RS, Picciotto MR, Nestler EJ (1999) Beyindeki deltaFosB transkripsiyon faktörünün ekspresyonu, kokaine duyarlılığı kontrol eder. Tabiat 401:272-276.
Kim KB, Myung J, Sin N, Mürettebat CM (1999) Doğal ürünler epoksomisin ve dihidroeponemisin ile proteazom inhibisyonu: özgüllüğü ve potensi ile ilgili bilgiler. Bioorg Med Chem Lett 9:3335-3340.
Kobayashi E, Nakano H, Morimoto M, Tamaoki T (1989) Yeni bir mikrobik bileşik olan Calphostin C (UCN-1028C), protein kinaz C'nin oldukça güçlü ve spesifik bir inhibitörüdür. Biochem Biophys Res Commun 159:548-553.
Krek K, Maridor G, Nigg EA (1992) Kazein kinazı II, ağırlıklı olarak nükleer bir enzimdir. J Cell Biol 116:43-55.
Krohn NM, Stemmer C, Fojan P, Grimm R, Grasser KD (2003) Protein kinaz CK2 yüksek hareketlilik grubu alan proteini SSRP1'i fosforize eder ve UV hasarlı DNA'nın tanınmasını indükler. J Biol Chem 278:12710-12715.
Kumar A, Choi KH, Renthal K, Tsankova NM, Theobald DEH, Truong HT, Russo SJ, LaPlant Q, Whistler K, Neve RL, Öz DW, Nestler EJ (2005) Kromatin remodeling, striatumdaki kokaine bağlı plastikliğin altında yatan anahtar bir mekanizmadır. Nöron 48:303-314.
Lieberman DN, Mody I (1999) Kazein kinaz-II, hipokampal nöronlardaki NMDA kanal fonksiyonunu düzenler. Nat Neurosci 2:125-132.
Litchfield DW (2003) Protein kinaz CK2: hücresel yaşam ve ölüm kararlarında yapı, düzenleme ve rol. Biochem J 369:1-15.
Manabe T, Kuramoto N, Nakamichi N, Aramachi K, Baba K, Hirai T, Yoneyama M, Yoneda Y (2001) N-metil- ile ifade edilen c-Fos proteininin bozulmasıd- Murin hipokampüsünün nükleer fraksiyonlarında aspartik asit. Brain Res 905:34-43.
Mandelzys A, Gruda MA, Bravo R. Morgan JI (1997) Kainik asitle muamele edilmiş fosB null farelerin beyinlerinde ısrarla yükselmiş bir 37 kDa fos-ilişkili antijen ve AP-1 benzeri DNA-bağlama aktivitesinin olmaması. J Neurosci 17:5407-5415.
Marin O, Meggio F, Marchiori F, Borin G, Pinna LA. (1986) Sıçan karaciğer sitozolünden kazein kinaz-2'in (TS) alan spesifikliği. Model peptid substratları ile bir çalışma. Eur J Biochem 160:239-244.
McClung CA, Nestler EJ (2003) Gen ekspresyonu ve kokain ödülünün CREB ve DeltaFosB tarafından düzenlenmesi. Nat Neurosci 6:1208-1215.
McClung CA, Ulery PG, Perrotti LI, Zachariou V, Berton Ö, Nestler EJ (2004) DeltaFosB: Beyinde uzun süreli adaptasyon için moleküler bir anahtar. Beyin Res Mol Beyin Res 132:146-154.
Meggio F, Pinna LA (2003) Binlerce ve bir protein kinaz substratı CK2? FASEB J 17:349-368.
Meggio F, Donella-Deana A, Pinna LA, Moret V. (1977) Sıçan karaciğeri 'fosvitin kinaz' ile kazein fraksiyonlarının fosforilasyonu. FEBS Lett 75:192-196.
Meggio F, Brunati AM, Pinna LA (1983) Hem alfa hem de beta alt birimlerinde tip 2 kazein kinaz TS'nin otofosforilasyonu. Farklı efektörlerin etkisi. FEBS Lett 160:203-208.
Meggio F, Shugar D, Pinna LA. (1990) Kazein kinaz-2 ve kazein kinaz-1'in inhibitörleri olarak ribofuranosil-benzimidazol türevleri. Eur J Biochem 187:89-94.
Meggio F, Marin O, Pinna LA. (1994) Protein kinazın substrat özgüllüğü CK2. Celi Mol Biol Res 40:401-409.
Miller C, Zhang M, Y, Zhao J, Pelletier JP, Martel-Pelletier J, Di Battista JA (1998) İnsan kondrositlerinde fosfataz aktivitesinin okadaik asit inhibisyonu ile siklooksijenaz-2 geninin transkripsiyonel indüksiyonu: AP-1 ve CRE nükleer bağlayıcı proteinlerin birlikte uyarılması. J Celi Biochem 69:392-413.
Moratalla R, Elibol B, Vallejo M, Graybiel AM (1996) Kronik kokain tedavisi ve geri çekilmesi sırasında striatumdaki indüklenebilir Fos-Jun proteinlerinin ekspresyonunda ağ düzeyinde değişiklikler. Nöron 17:147-156.
Morgan JI, Curran T (1995) Hemen erken genler: on yıl. Trendler Neurosci 18:66-67.
Nakabeppu Y, Nathans D (1991) Fos / Jun transkripsiyonal aktivitesini inhibe eden doğal olarak oluşan kesilmiş bir FosB şeklidir. Hücre 64:751-759.
Nestler EJ, Barrot M, Öz DW (2001) Delta FosB: bağımlılık için sürekli bir moleküler anahtar. Proc Natl Acad Sci ABD 98:11042-11046.
Neve RL, Howe JR, Hong S, Kalb RG (1997) Glutamat reseptörü alt biriminin, bir rekombinant herpes simpleks virüsü kullanılarak in vitro ve in vivo motor nöronlarına yerleştirilmesi. Neuroscience 79:435-447.
Nuthall HN, Joachim K, Stifani S (2004) Groucho / TLE239'in serin 1'inin protein kinaz CK2 ile fosforilasyonu, nöronal farklılaşmanın inhibisyonu için önemlidir. Mol Celi Biol 24:8395-8407.
Okazaki K, Sagata N. (1995) Mos / MAP kinaz yolu, c-Fos'i fosforilasyon ile stabilize eder ve NIH 3T3 hücrelerinde dönüşüm aktivitesini arttırır. EMBO J 14:5048-5059.
Palombella VJ, Rando OJ, Goldberg AL, Maniatis T (1994) Ubiquitin-proteasome yolu, NF-kappa B1 prekürsör proteinini ve NF-kappa B'nin aktivasyonunu işlemek için gereklidir. Hücre 78:773-785.
Papavassiliou AG, Treier M, Chavrier C, Bohmann D (1992) C-Jun'ta fosforilasyona bağlı bir sinyal ile c-Fos'in hedeflenen bozunması, ancak v-Fos değil. Bilim 258:1941-1944.
Peakman MC, Colby C, Perrotti LI, Tekumalla P, Carle T, Ulery P, Chao J, Duman C, Steffen C, Monteggia L, Allen MR, Stok JL, Duman RS, McNeish JD, Barrot M, Öz DW, Nestler EJ Schaeffer E (2003) İndüklenebilir, transgenik farelerde c-Jun'un baskın bir negatif mutantının beyin bölgesine özgü ifadesi, kokaine duyarlılığı azaltır. Brain Res 970:73-86.
Perrotti LI, Hadeishi Y, Ulery PG, Barrot M, Monteggia L, Duman RS, Nestler EJ (2004) DeltaFosB'nin kronik stres sonrası ödülle ilgili beyin yapılarında indüksiyonu. J Neurosci 24:10594-10602.
Persico AM, Schindler CW, O'Hara BF, Brannock MT, Uhl GR (1993) Beyin transkripsiyon faktörü ifadesi: akut ve kronik amfetamin ve enjeksiyon stresinin etkileri. Beyin Res Mol Beyin Res 20:91-100.
Ploegh HL, Dunn BM. (2000) Çeviri sonrası değişiklik: fosforilasyon ve fosfatazlar. In: Protein biliminde güncel protokoller (Dunn BM, ed.) S. 13.01-13.02. New York: Wiley ve Oğulları.
Pyerin K, Burow E, Michaely K, Kubler D, Kinzel V (1987) Yüksek oranda saflaştırılmış fosvitin / kazein kinaz tip II'nin kültür (HeLa) içindeki insan epitelyal hücrelerinden katalitik ve moleküler özellikleri ve ekto protein kinaz ile ilişkisi. Biol Chem Hoppe Seyler 368:215-227.
Reikhardt BA, Kulikova OG, Borisova GY, Aleksandrova İY, Sapronov NS (2003) Sıçanlarda yaşa bağlı amnezideki “protein kinaz CK2-HMG14” sisteminin durumu. Neurosci Behav Physiol 33:799-804.
Roberts BJ, Whitelaw ML (1999) Temel sarmal-ilmek-sarmal / Per-ARNT-Sim homoloji domeni dioksin reseptörünün ubiquitin / proteasome yolu ile bozulması. J Biol Chem 274:36351-36356.
Rost B, Yachdav G, Liu J (2004) PredictProtein sunucusu. Nükleik Asitler Res 32:W321-W326.
Rylski M, Kaczmarek L (2004) Ap-1 beyinde hedefler. Ön Biosci 9:8-23.
Şahin B, Kansy JW, Nairn AC, Spychala J, Ealick SE, Fienberg AA, Greene RW, Bibb JA (2004) Rekombinant fare adenosin kinazın moleküler karakterizasyonu ve protein fosforilasyonu için bir hedef olarak değerlendirme. Eur J Biochem 271:3547-3555.
Salvat C, Aquaviva C, Jariel-Encontre I, Ferrara P, Pariat M, Steff AM, Carillo S, Piechaczyk M (1999) İn vivo olarak c-Fos, c-Jun ve p53 protein bozulmasına katkıda bulunan çoklu proteolitik yollar var mı? Mol Biol Rep 26:45-51.
Schmidt R, Hecker E (1975) Normal depolama koşullarında forbol esterlerin otoksidasyonu. Kanser Res 35:1375-1377.
Schwarz EM, Van Anvers D, Verma IM. (1996) IkappaBalfa'nın kazein kinaz II ile yapıcı fosforilasyonu tercihen serin 293'te gerçekleşir: serbest IkappaBalfa'nın bozulması için şart. Mol Celi Biol 16:3554-3559.
Sears R, Leone G, DeGregori J, Nevins JR. (1999) Ras, Myc protein stabilitesini arttırır. Mol Hücresi 3:169-179.
Silva-Neto MA, Fialho E, Ölüler MC, Oliveira PL, Masuda H (2002) Rhodnius prolixus oositlerinden saflaştırılmış kazein kinaz II ile vitellinin siklik nükleotit bağımsız fosforilasyonu. Böcek biyokimyası Mol Biol 32:847-857.
Skinner M, K S, Moore K, Bilgelik R (1997) Transkripsiyonel aktivasyon ve FosB proteini ile transformasyon karboksil-terminal aktivasyon alanının fosforilasyonunu gerektirir. Mol Celi Biol 17:2372-2380.
Kök C, Schwander A, Bauw G, Fojan P, Çayır KD (2002) Protein kinaz CK2 diferansiyel olarak fosforilatlar, mısır kromozomalliği yüksek mobilite grubu B (HMGB) proteinlerini stabilite ve DNA etkileşimlerini modüle eder. J Biol Chem 277:1092-1098.
Stevens I, Derua R, Rondelez E, Waelkens E, Merlevede K, Goris J (1999) Yeni bir kalsiyum / kalmodulin bağımlı protein kinaz II olarak bir siklin B2 kinazı olan cyk ve Xenopus laevis oosit olgunlaşması sırasındaki rolü. Exp Cell Res 252:303-318.
Suh HW, Choi SS, Lee JK, Lee HK, Han EJ, Lee J (2004) Primer kültürlü astrositlerde c-fos ve c-jun gen ekspresyonunun lipopolisakkarit ve sitokinler tarafından düzenlenmesi: PKA ve PKC yollarının etkisi. Arch Pharm Res 27:396-401.
Szyszka R, Boguszewska A, Grankowski N., Ballesta JP (1995) İki endojen protein kinazı ile maya hücresinden ribozomal asidik proteinlerin farklı fosforilasyonu: kazein kinazı-2 ve 60S kinazı. Acta Biochim Pol 42:357-362.
Tamaoki T, Takahashi I, Kobayashi E, Nakano H, Akinaga S, Suzuki K (1990) Calphostin (UCN1028) ve calphostin ile ilgili bileşikler, protein kinaz C'nin spesifik ve güçlü bir inhibitör sınıfıdır. Adv İkinci Messenger Fosfoprotein Res 24:497-501.
Torres J, Pulido R (2001) Tümör baskılayıcı PTEN, C terminalinde kinaz CK2 protein kinazı ile fosforile edilir. Proteazomeragrasyon degradasyona PTEN stabilitesinin etkileri. J Biol Chem 276:993-998.
Tsubuki S, Saito Y, Tomioka M, Ito H, Kawashima S (1996) Kalpain ve proteazom aktivitelerinin di-lösin ve tri-lösinin peptid aldehidleri tarafından farklı inhibisyonu. J Biochem (Tokyo) 119:572-576.
Tsurumi C, Ishida N, Tamura T, Kakizuka A, Nishida E, Okumura E, Kishimoto T, Inagaki M, Okazaki K, Sagata N (1995) C-Fos'in 26S proteasome tarafından bozulması, c-Jun ve çoklu protein kinazları ile hızlandırılır. Mol Celi Biol 15:5682-5687.
Unger GM, Davis AT, Slaton JW, Ahmed K (2004) Hücre sağkalımının düzenleyicisi olarak protein kinaz CK2: kanser tedavisi için çıkarımlar. Curr Kanser İlaç Hedefleri 4:77-84.
Flakon E, Marshall CJ (2003) Yüksek ERK-MAP kinaz aktivitesi, FOS ailesi üyesi FRA-1'i kolon karsinom hücrelerinde proteasomal bozulmaya karşı korur. J Celi Sci 116:4957-4963.
Werme M, Messer C, Olson L, Gilden L, Thoren P, Nestler EJ, Brene S (2002) OsFosB tekerlek çalışmasını düzenler. J Neurosci 22:8133-8138.
Whitmarsh AJ, Davis RJ (2000) Transkripsiyon faktörü fonksiyonunun fosforilasyonla düzenlenmesi. Celi Mol Yaşam Bilimi 57:1172-1183.
Kış B, Kautzner I, Issinger OG, Arnold HH (1997) İki varsayılan protein kinaz CK2 fosforilasyon bölgesi, Myf-5 aktivitesi için önemlidir. Biol Chem 378:1445-1456.
Wisniewski JR, Szewczuk Z, Evcil Hayvan I, Schwanbeck R, Renner U (1999) Kazein kinazı II tarafından yüksek hareketli grup 1 proteinlerinin asidik kuyruklarının yapıcı fosforilasyonu konformasyon, stabilite ve DNA bağlanma özelliklerini değiştirir. J Biol Chem 274:20116-20122.
Yamaguchi Y, Wada T, Suzuki F, Takagi T, Hasegawa J, Handa H (1998) Kazein kinazı II, çeşitli transkripsiyon faktörlerinin bZIP alanları ile etkileşime girer. Nükleik Asitler Res 26:3854-3861.
Yanagawa T, Yuki K, Yoshida H, Bannai S, Ishii T (1997) Makrofajlarda kazein kinaz II benzeri aktivite ile A170 stres proteininin fosforilasyonu. Biochem Biophys Res Commun 241:157-163.
Yankulov K, Yamashita K, Roy R, Egly JM, Bentley DL (1995) Transkripsiyonel uzama inhibitörü 5,6-dikloro-1-beta-d-ribofuranosilbenzimidazol, transkripsiyon faktörü IIH-ilişkili protein kinazı inhibe eder. J Biol Chem 270:23922-23925.
Yen J, Bilgelik RM, Tratner I, Verma IM (1991) FosB'nin alternatif bir eklenmiş şekli, Fos proteinleri tarafından transkripsiyonel aktivasyon ve transformasyonun negatif bir regülatörüdür. Proc Natl Acad Sci ABD 88:5077-5081.
Yin X, Jedrzejewski PT, Jiang JX (2000) Kazein kinaz II, lens konneksin 45.6'i fosforile eder ve bunun bozulmasında rol oynar. J Biol Chem 275:6850-6856.
Yoza BK, Brooks JW, Mizel SB. (1992) İnterlökin 1 ve forbol esterleri tarafından T hücresi aktivasyonu sırasında AP-1 transkripsiyon faktörü bileşenlerinin uyarılması. Hücre Büyümesi Farklı 3:677-684.
Yu S, Wang H, Davis A, Ahmed K (2001) CK2 sinyalinin nükleer matrikse sonuçları. Mol Hücre Biyokimyası 227:67-71.
Yu S, Davis AT, Guo C, Yeşil JE, Ahmed K (1999) Protein kinaz CK2'in, alt birimlerinin geçici olarak aşırı eksprese edilmesi üzerine nükleer matrise farklı hedeflemesi. J Celi Biochem 74:127-134.
Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Teobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchmann T, Berton O, Sim-Selley LJ, DiLeone RJ, Kumar A, Nestler EJ (2006) ΔFosB: Çekirdekteki BFosB için önemli bir rol morfin eyleminde rol oynar. Nat Neurosci 9:205-211.
Bu makaleden alıntı yapan makaleler
- Kronik Kokain'e Davranışsal ve Yapısal Tepkiler, Çekirdek Accumbens Kabuğundaki {Delta} FosB ve Kalsiyum / Kalmodulin Bağımlı Protein Kinaz II'yi İçeren Besin Verici Bir Döngüye Gerektirir Neuroscience Dergisi, 6 Mart 2013, 33(10):4295-4307
- {Delta} FosB'in Striatal Aşırı Ekspresyonu, Kronik Levodopa'nın Neden Olduğu İstemsiz Hareketleri Üretiyor Neuroscience Dergisi, 26 Mayıs 2010, 30(21):7335-7343
- Özet
- Tam metin
- Tam Metin (PDF)
- Özet
- Tam metin
- Tam Metin (PDF)
- Özet
- Tam metin
- Tam Metin (PDF)
- Özet
- Tam metin
- Tam Metin (PDF)
- Transkripsiyonel bağımlılık mekanizmaları: {Delta} FosB'in rolü Biyolojik Bilimler: Royal Society B Felsefi İşlemleri, 12 Ekim 2008, 363(1507):3245-3255
- Glial hücre çizgisi türevli nörotrofik faktör mutant farelerde metamfetamin arayışı davranışının eski haline getirilmesinde kalıcılık FASEB Dergisi, 1 Temmuz 2007, 21(9):1994-2004
- Solunum Epitel Karsinogenezinde Aktivatör Protein-1 Transkripsiyon Faktörü Moleküler Kanser Araştırması, 1 Şubat 2007, 5(2):109-120
;