DeltaFosB Cck promoter faoliyatini (2010) bilvosita boshqaradi.

Brain Res. 2010 may 6; 1329: 10-20.

2010-martda nashr qilindi. doi:  10.1016 / j.brainres.2010.02.081

PMCID: PMC2876727

Jon F. Envayt, III,1 Megan Vold,1 Madison Paddock,1 Elizabet Hoffman,1 Rachel Arey,2 Scott Edvards,2 Oddiy Spenser,2 Erik J. Nestler,3 va Colleen A. McClung2, *

Mualliflik haqida ma'lumot ► Mualliflik huquqi va litsenziya haqida ma'lumot ►

Nashriyotning ushbu maqolaning so'nggi tahrirlangan versiyasi bilan bu erda tanishishingiz mumkin Brain Res

PMCdagi boshqa maqolalarga qarang keltirilgan nashr qilingan maqola.

O'tish:

mavhum

Dori vositalarining surunkali ta'siriga duch kelgan muhim biokimyoviy, tizimli va xarakatdagi o'zgarishlar DFFning yuqori barqaror transkriptsion faktori vositasida ko'rinadi. Oldingi ishlar 2 haftalardagi sichqonlarda DFOSBning ortiqcha ifodalanganligi, striatumda ko'p sonli genlarning ifodalanishi ortishiga olib keladi, aksariyati 8 xaftida DFOSB ekspresyonidan keyin pastga tushiriladi. Qizig'i shundaki, bu genlarning ko'p qismi CREB transkripsiyasi faktori ustida ishlaydigan sichqonlarda ham tartibga solingan. Biroq, ushbu tadqiqotdan ma'lum emaski, DFF qisqa muddatli bu genlarni CREB orqali boshqaradi. 2 xaftalikida DFOSB eksperkseptsiyasini CRER ifodasini striatumda oshiradi, bu esa 8 hafta davomida tarqaladigan ta'sirga ega.. Erta indüksiyon, bu miya hududida ma'lum maqsad gen promotörlerine arttırılmış CREB ulanish bilan bog'liq. Ajablanarlisi shundaki, oldingi hisobotlarga asoslangan CREB shubhali bir gen, xoletsistokin (Cck), CREB tomonidan striatum tomonidan nazorat qilinmagan. Qoidalarni yanada kengroq o'rganish Cck Quyidagi DFB eksperimentsiyasini ko'rib chiqdikki, qisqa muddatli DFOS ekspressioni Cck promoter faoliyati va genin ifodasi. Bundan tashqari, majburiy faoliyatni CREB majburiy saytida (CRE) kuchaytiradi Cck promouter. Biroq, CRE sayt normal oddiy ifodasi uchun zarur Cck, DFOSB indüksiyonu uchun shart emas Cck. Birgalikda olingan natijalar, qisqa muddatli DFB indüksiyonunun, ba'zi gen promoterlerinde CREB ekspresyonunu va aktivitesini ziyoda bo'lsa-da, bu genlar, bu shartlar ostida yükseltildiği yagona mexanizm emas.

Kalit so'zlar: nukleus akumbenslari, transkripsiya, giyohvandlik

O'tish:

Kirish

Kasallikning surunkali ta'siri ayrim miya hududlarida biokimyoviy va tizimli o'zgarishlarga olib keladi. Ushbu o'zgarishlarni mezolimbik tizimda gen ekspresyon rejimlariga o'zgartirish kiritilgan deb hisoblashadi. Ushbu tizim midbraindan yadrodagi akumbens (NAc) (ventral striatum) va o'rta miqdordagi boshqa miya hududlarida o'rta tirnoqli neyronlarga qadar bo'lgan ventral tegmental hududdan (VTA) loyiha qiluvchi dopaminerjik neyronlardan tashkil topgan. Ikkala transkriptsiya omillari, cAMP javob elementlari bilan bog'laydigan protein (CREB) va DFOSB (Fos oilasi oqimi) faoliyatidagi o'zgarishlarning ko'pchiligi biokimyoviy, tizimli va xatti-harakatlarning surunkali ta'siriga dori-darmonlar bilan tomonidan ko'rib chiqildi Nestler, 2005).

CREB, CREB / ATF oilasining a'zosi bo'lgan, hamma joyda ifoda etilgan transkriptsiya omilidir. CREB homodimchilari ko'plab genlarni targ'ibotchilarida topilgan bir CRE sekansının (konsensus: TGACGTCA) varyasyonlarına bog'laydi. CREB ning fosforillanishlari (asosan serin 133 da, boshqa joylar aniqlangan bo'lsa-da) dopamin retseptorlari oqimining pastki qismida, shu jumladan,Cole va boshq., 1995). CREN seriyasidagi 133da fosforilatsiyadan so'ng, CRE-ning faollashtiruvchisi CREB bog'lash proteini (CBP) yoki shunga o'xshash oqsillarni chaqiradi. Johannessen va boshq., 2004). Preparatni opiat yoki psixostimulyant dorilargacha surunkali ta'sir qilish yadrodagi akumbensdagi CREB faoliyatida vaqtinchalik ortishlarni keltirib chiqaradi. (Barrot va boshq., 2002; Shaw-Lutchman va boshq., 2002, 2003), ushbu dori-darmonlarning foydali xususiyatlarini kamaytirish va giyohvand moddalarni olib tashlashning salbiy his-tuyg'ularini kuchaytirishga qaratilgan moslashtirilgan fikrdir (Nestler, 2005).

LNarkotik moddalarni suiiste'mol qilishga dosh bera oladigan moslamalar, qisman FosB tomonidan, FosB (Nestler va boshq., 1999; McClung va uning hamkorlari, 2004; Nestler, 2008). Fos oila a'zolari Jun oilasining a'zolari bilan dimerizatsiya qilish uchun faollashtiruvchi oqsil 1 (AP-1) kompleksini hosil qiladi. AP-1 transkripsiyasi komplekslari transkripsiyani tartibga solish uchun AP-1 javob elementini (konsensus: TGACTCA) o'zgarishiga bog'laydi ( Chinenov va Kerppola, 2001). Dori vositalariga o'tkir ta'sir qilish Fos-oila a'zolarining qisqa muddatli indüksiyasini (hr) olib keladi (shuningdek, CREBning faolligini oshiradi), takroriy dori ta'sir etishi yuqori darajada barqaror DFOSB (Hope va boshq., 1994; Perrotti va boshq., 2008), uning ifodasi bir necha hafta davom etmoqda.

Katta kattalardagi DFOSB yoki CREB ning ta'sirini kamaytiradigan bi-transgenli sichqonlar ko'pincha psixostimulyatorlarga yoki boshqa suiiste'mollarga duch kelgan hayvonlarda ko'riladigan biokimyoviy va qiziqishning fenotiplarini aks ettiradi. Abu transgenik hayvonlarda gen ekspresyonidagi o'zgarishlarni tahlil qilish qisqa muddatli (2 haftalar) DFFning ortiqcha ifodasi bilan yangilangan ko'p sonli genlarni aniqladi, bu preparatning mukofotlanishining birgalikda kamayishiga bog'liq. Jinsiy ekspression va DFF bilan qisqa muddatli munosabatdagi o'zgarish hayvonlarda CREN'yi 2 yoki 8 haftalar uchun haddan tashqari eksprese qilganlarga o'xshardiMcClung va Nestler, 2003). Aniq kontrastda DFOSBning uzoq muddatli haddan tashqari ekspirizatsiyasi (8 haftasi) bir xil genlarning aksariyatini ifodalaydi va giyohvand mukofotini oshiradiKelz va boshq., 1999; McClung va Nestler, 2003).

Ushbu tadqiqotlarda aniqlangan bitta gen mavjud xoletsistokinin (Cck), bir nechta miya hududlarida, shu jumladan, striatum (Xokfelt va boshq., 1980). CCK dopaminergik uzatishni modulyatsiya qilishi mumkin (Vaccarino, 1992), preparatni mukofotlash va mustahkamlashda ishtirok etadi (Josselyn va boshq., 1996; Josselyn va boshq., 1997; Hamilton va boshq., 2000; Beinfeld va boshq., 2002; Rotzinger va boshq., 2002) va surunkali giyoh tomonidan striatumda (Ding va Mokchetti, 1992). Bundan tashqari Cck promoterni CREB va AP-1 komplekslariga ham ta'sir ko'rsatdi (Haun va Dixon, 1990; Deavall va boshq., 2000; Xansen, 2001). Ko'pgina genlar (shu jumladan Cck) CREB va qisqa muddatli DFOSB ekspresyonundan so'ng oshganligi oshganligi ma'lum bo'lgan yoki CREB maqsadli genlariMcClung va Nestler, 2003), biz qisqa muddatli DFosB ifodasi bu genlarni tartibga solishga olib keladimi (aniqrog'i, Cck) CREBni tartibga solish yoki genlarni tartibga solishning murakkab mexanizmlari orqali amalga oshiriladi.

O'tish:

Natijalar

DFosB oshqozon namoyishi vaqtincha CREB darajasini oshiradi

Biz DFOSB eksperksizatsiyasining Sichqoncha striatumida CREB protein darajasini oshirishi yoki yo'qligini tekshirish uchun Western blottingni qo'lladik. Biz ushbu tadqiqot uchun ikkala NSE-tTA transgenini va TetOp-DFOSB transgenini olib yuradigan bi-transgenli sichqonchani (11A liniyasi) foydalandik. Doksisiklin bo'lmaganda, bu sichqon kattaroq dynorphin musbat neyronlarda DFosB ifodasini mustahkam tarzda oshiradi (Kelz va boshq., 1999). DFFning haddan tashqari ekspluatatsiya qilish usuli keng qamrovli hujjatlashtirilgan va surunkali kokainga uchragan hayvonlarda ko'rilgan DFOSB indüksiyasiga parallel bo'lgan hududga xos eksperimentga imkon beradi (Hope va boshq., 1994; Kelz va boshq., 1999). Biz 11A sichqonlarida DFOSB ekspressxpressingda, CREB protein darajalari 2 xaftalik ekspiratsiyadan keyin sezilarli darajada yuqoriga ko'tarilganini aniqladik va bu darajalar 8 xaftadan keyinShakl 1A, n = 8). Qisqa muddatli DFOSB haddan tashqari ekspressioni bilan CREB darajasidagi o'zgarishlarni boshqa tizimda takrorlash mumkinligini aniqlash uchun biz PC12 hujayralarida DFOSB ni vaqtincha haddan tashqari oshirib yubordik va CREB darajasi sezilarli darajada oshganligini aniqladik (p <0.05).Shakl 1B, n = 4). Ushbu natijalar qisqa muddatli DFB ekspresyoni CREB protein darajasini oshiradi.

Shakl 1

Shakl 1

CREF darajalari DFB ortiqcha ekspression bilan ortadi. Lysate'dan Western blot tahlillari (A) 11 yoki 2 haftalar uchun dox off 8A sichqonchani sichqonchani striata yoki (B) PCFNOXX hujayralari. Ma'lumotlar A "off dox" da ko'rsatilgan foizlar o'zgarishi bilan ko'rsatilgan ...

Har ikkala DFOSB va CREB qisqa muddatli DFOSB eksperkspressiyasidan so'ng striatumdagi aniq maqsadli genlarni targ'ibotchilariga bog'laydi

Biz ma'lum maqsadli gen promoterlarida DFOSB yoki CREB ulanishi paydo bo'lmagani va bu ulanishning qisqa muddatli DFB eksperksepsiyasidan so'ng oshganligini aniqlash uchun chiziqli (kromatin immunoprecipitatsiya) striatal to'qimalarni testlaridan foydalandik. Biz bog'da bog'lanishni tahlil qildik BDNF va Cck har ikkala gen qisqa muddatli DFB eksperksepsiyasi, CREB oshqozon ekspressionasi yoki surunkali giyoh davolash (McClung va Nestler, 2003). Bundan tashqari, biz ham majburiy ravishda tahlil qildik CDK5 promouter, chunki u DFBning ma'lum maqsadidir (Chen va boshq., 2000; Bibb va boshq., 2001; Kumar va boshq., 2005). Va nihoyat, biz bog'dagi o'lchashni o'lchaymiz prodynorphin oldingi tadkikotlar, u turli shartlar ostida ham DFB va CREB bilan bog'liq bo'lishi mumkinliginiAndersson va boshq., 2001; Zachariou va boshq., 2006).

11 sichqonlaridan CREF yoki DFOSB ni tanish bo'lgan antitellardan foydalanib 2 haftalar davomida DFosB dan ortiqcha bosim o'tkazuvchi stritada STM tahlil qilindi. Oddiy sharoitlarda, biz DFF bilan bog'langanligini aniqladik CDK5 va prodynorphin promouterlar, biroq aniqlanadigan ulanishlar mavjud emas BDNF or Cck targ'ibotchilar (1 stol). Bundan tashšari, DFOSB tœxtashlarini anišlash DFF ning boglanishini kattalashtirdi CDK5 promouter, lekin emas, balki prodynorphin promouter. Keyinchalik, bu promoterlarda CREBni bog'lashni o'lchaymiz va CREB bilan bog'langanligini topdik CDK5, BDNF va prodynorphin promouterlar emas, balki Cck Promoter, normal striatumda va XFXB uchun XFXB ortiqcha ekspresyoni 2 xafta davomida CREB ulanishini oshiradi. BDNF va prodynorphin promouterlar emas, balki CDK5 promouter. Birgalikda olingan ushbu natijalar DFOSB va CREB ning ikkalasi ham, masalan, ba'zi gen promoterlari bilan bog'lanishini ko'rsatmoqda prodynorphin va CDK5Biroq, CREB ulanishi kabi boshqa targ'ibotchilarga xosdir BDNF. Bundan tashqari, DFOSB ortiqcha ekspression DFOSB ga ulanishning kutilganidek, balki kutilganidek, shuningdek, ushbu vaqt nuqtasida kuzatilgan DFOSB vositasi CREB indüksiyonu bilan mos keluvchi maxsus targ'ibotchilarga ulanish uchun CRES ga ulanishga olib keladi.

1 stol

1 stol

Ikki hafta mobaynida DF-ni haddan tashqari ekspluatatsiya qilgan sichqonchalardagi turli promoterlarga proektoriya oqsillarini biriktirish.

Avvalgi ishda uzoq muddatli DFOS ekspresyoni bilan yuzaga keladigan gen ekspresyonidagi o'zgarishlar kromatin modifikatsiyasi, xususan, maxsus gen promoterlarda (masalan, histon H3) asetilatsiyalanishi bilan bog'liq ekanligini ko'rsatdiKumar va boshq., 2005). Qisqa muddatli DFB eksperksepresiyasi bo'yicha gen ekspressionida o'zgarishlarni hisobga olishni aniqlash uchun biz asetilatsiyalangan histon H3 (transektiv ravishda faol kromatin bilan bog'liq bo'lgan histon modifikatsiyasi) yoki methitlangan histon H3 (Lys9, transkripsiyadan faol bo'lmagan kromatin). 2 haftasidagi DFSB ning haddan tashqari ifodalanganligi, o'rganilayotgan gen promoterlarning hech birida asetilatlangan H3 ning birikmasida o'zgarishlar bo'lishiga olib keldi (1 stol). Methylated histone H3 ning ulashida sezilarli kamayish kuzatildi prodynorphin promouter, lekin hech qanday majburiy emas Cck Promouter va bog'lanishda o'zgarish yo'q CDK5 va BDNF bu qisqa muddatda DFOSBning gen ekspozitsiyasini tartibga soladigan umumiy mexanizm emasligini ta'kidlaydi. Biz hayratda qoldik va bu biz o'sishimiz uchun hisob-kitob qila oladigan CHIP testlarida farq yo'qligini bilish bilan qiziqdik Cck 11 sichqonlarida 2 haftalaridan keyin DFB ekspresyonini ta'qib qilgan mRNA ifodasi va bu mexanizmni yanada kengroq o'rganishga qaror qildi.

Qisqa muddatli DFB boradi Cck bir nechta tizimlarda ifodalangan

Bi-transgenli 11A sichqonlarining mikroskopik xarakteristikasi, steratumda DFSBni ortiqcha bosim bilan Cck ekspresyon darajalari 2 hafta ortiqcha tushuntirishdan keyin ortadi va undan keyin uzoq muddat davomida DFosB ifodasi bilan asta-sekin kamayadi (Shakl 2A, n = 3). Biz ushbu ta'sirni tasdiqladik Cck 2 va 8 xaftalikdagi hayvonlarning alohida guruhida real vaqtda PCR dan foydalanib va ​​ikkita vaqt nuqtasida natijalarni microarray tahliliga o'xshash deb topdi (ma'lumotlar ko'rsatilmagan).

Shakl 2

Shakl 2

DFBning qisqa muddatli haddan tashqari oshishi oshadi Cck gen ifodasi. (A) Cck 11, 1, 2 yoki 4 hafta uchun 8A sichqonchasida DFosB ortiqcha bosimini keyin quyidagi striatumda mRNA ifodasi. Mikroarray tahlillari striatal namunalarda va Cck darajasi ...

DFFning regulyatsiya qilish qobiliyatini yanada kengroq o'rganish Cck Biz PC12 hujayralarini vaqtinchalik Cckyoki -FosB ekspresyon plazmidi yoki teng miqdordagi pCDNA bo'lishi mumkin. DF fosf eksperksepsiyasining ikkala ikkalasi (n = 5-9) va uch (n = 11-13) kunlarda Cck-uziferaza ifodasi. Bundan tashqari, uch kunlik DF eksperimenti sezilarli darajada oshdi CckIkki kunlik ortiqcha bosim bilan solishtirganda,Shakl 2B). DFOS ning yuqori darajada ifodalanganligi promoutersiz lusiferaza konstruktsiyasini ifodalashga olib kelmadi (ma'lumotlar ko'rsatilmagan). Hech qanday davolanish shartlari ostida pasayish kuzatilmadi Cck-sliferat faolligi sezilarli. Ushbu natijalar, qisqa muddatli DFOSB ekspresyonunun faolligini oshiradi Cck uzoq muddatli DFOSB eksperksepresiyasini bostirish mexanizmini javobsiz qoldiradi. Cck ifoda qilish.

DFosB ortiqcha ekspressioni, joylashuvdagi CREB ulanish saytida ulanishni oshiradi Cck promouter

Tahlillarimiz shuni aniqladi Cck qisqa muddatli DFB ekspresyonidan keyin ekspreditsiya kuchaygan bo'lsa-da, bizning CHIP tahlillari CREB yoki DFOSB ning Cck promouter. Jadvalda protein bilan bog'lanishning o'zgarishi yoki yo'qligini aniqlash Cck DFOSB eksperimentidan keyingi promoter, biz elektroforetik harakatlanish smenali tahlillarini (EMSA) ishlatdik. Cck promouter. 11 haftalar davomida DOSB ni haddan tashqari ekspiratsiya qiladigan 2A sichqonlarining striatidan yadroviy ekstraktlarni qo'llash orqali biz CRE (CRE) saytiga ulanishni oshirishni aniqladik. Cck targ'ibotchi (Shakl 3 A, C, n = 4). Qizig'i shundaki, 11A sichqonlari 8 haftalar uchun DFosB ni ortiqcha bosim o'tkazmoqda. Cck Bundan tashqari, ushbu saytdaShakl 3B, C, n = 4). Taqqoslaydigan bo'lsak, 2 haftalar davomida DF-dan ortiqcha sichqonlarda konsensus CRE saytiga ulanishni ko'rib chiqdik va striatal ekstraktsiyalarda mustahkamroq CRE-ni topdik, ammo DFOSB indüksiyasidan keyingi ulanishlarda o'sish kuzatilmadi (Shakl 3F, n = 4). Shunday qilib, ushbu vaqt nuqtasida ko'rilgan CREF darajasining o'sishiga qaramasdan, bu natijalar bizning ChIP tahlillari bilan mos keladi va natijada AFF eksperkspressiyasidan keyingi promoterlarda kattalashtirilgan CREB ulanishi faqat ma'lum genlarga xosdir va global fenomen emas . CREB bilan bog'langanligini aniqlash Cck EMSA tahlilimizdagi promoter, biz CREBga xos antikor bilan supershift tahlillarni o'tkazdik. ChIP tahlillari bilan kelishilgan holda, CREB ning aga bog'lanishini topmadik Cck EMSA tahlillerindeki CRE saytini o'z ichiga olgan probu, CREB mazmunli CRE saytini birlashtirib,Shakl 3D, E, n = 4). DNKni majburiy aktivlashtirish Cck promoter shuningdek DFOSB ning xavfsiz bo'lmagan AP-1 saytlariga ulanish uchun blokirovka qilish uchun bir nechta oldingi ishda ko'rsatilgan sharoitlarda DFOSB (ma'lumotlar ko'rsatilmagan) antikoridan ta'sirlanmagan (Hope va boshq., 1994a, 1994b; Chen va boshq., 1995, Xiroy va boshqalar, 1998). 11 xaftaligi DFOSB ekspresyonidan keyin 8A hayvonlarining striata qismida CHIP tahlillarini o'tkazdik va hali ham CREB yoki DFB ning Cck Promouter (ma'lumotlar ko'rsatilmagan). Shunday qilib, DFosB ifodasi Cck 2 va 8 xaftalik xodisalaridan so'ng targ'ibotchi; Biroq, bu omillarning kimligi noma'lum.

Shakl 3

Shakl 3

Protein bilan bog'lanish Cck promouter. (A, B). Elektroforetik harakatchanlik smenasi Cck 2 haftalar (A) yoki 8 haftalar (B) uchun DFF ni haddan tashqari ekspluatatsiya qilgan hayvonlardan olingan striatal to'qimalarga ega CRE-shunga o'xshash joy. (A) da, ortiqcha noma'lum raqobatchilar bilan raqobat ...

CRE saytida joylashgan Cck Promouter promouteri faolligini oshirish uchun javobgar emas

Biz protein fragmentini foydalanib, bir qismini topdik Cck DFosB ortiqcha tushuntirishdan so'ng, CRE saytini joylashtiruvchi promoter biz ushbu saytni ko'paytirish uchun zarur yoki kerak emasligini aniqlashni istadik. Cck DFF ortiqcha ekspressini ta'qib qilgan holda ifodalangan. Ushbu imkoniyatni sinash uchun PC12 hujayralarini a CckCRE-shunga o'xshash joyni yoki CREB bilan har qanday shovqinni bekor qiladigan joyda mutatsion mavjud bo'lgan plazmitni o'z ichiga oladi. Qizig'i shundaki, CRE-shunga o'xshash sayt mutatsion bazalni pasaytirdi Cck 32% tomonidan promouter faoliyati (Shakl 4A, n = 9), lekin u ta'sir qilmadi Cck DFOSB haddan tashqari ekspressioni bilan promouterning induksiyasi (Shakl 4B, n = 11-13). Bu shuni anglatadiki, garchi Cck promoter to'liq bazal faoliyat uchun CRE-shunga o'xshash joyni talab qilsa, DFOS eksperkspressiyasidan kelib chiqadigan promoterning faolligi CRE-shunga o'xshash ketma-ketlikni talab qilmaydi.

Shakl 4

Shakl 4

The CckCRE saytiga o'xshash emas Cck DFF tomonidan indüksiyon. (A) Cck-uziferaz faolligi normal yoki transfeksiyadan keyin 2 kun davomida aniqlandi Cck-luciferase yoki CRE-ga o'xshash joy mutatsiyaga uchragan. * p <0.05 (B) Cck-siferaz ...

cFos bilan bog'lanadi Cck promouter

Avvalgi tadqiqotlar buni aniqladi cFos mRNA qisqa muddatli DFB ekspresyoni bilan ortadi, ammo uzoq muddatli DFB ekspresyonundan so'ng, kokainning striatumda cFos ni indirebilme qobiliyati kamayadi (McClung va Nestler, 2003; Renthal va boshq., 2008). Shunday ekan, cFos'un o'sishiga hissa bo'lishi mumkin Cck qisqa muddatli DFOSB ifodasini ta'riflash. CFos uchun o'ziga xos antikor bilan CHIP assaylarini o'tkazdik va Cck qisqa muddatli DFOSB ifodasi bilan va qisqa muddatli holda targ'ibotchi. Biz cFos-ga bog'langanligini topdik Cck promoter bo'lib, ushbu ulash DFosB ortiqcha ekspression (Shakl 5, n = 5). Bu esa, cFos bilan bog'langan ekan Cck promouter, u umumiy qoidalarga o'z hissasini qo'shishi mumkin Cck ifoda qilish mumkin, lekin, ehtimol, bu tartibga solish bilan bog'liq emas Cck DFOSB tomonidan targ'ibotchi.

Shakl 5

Shakl 5

cFos bilan bog'lanadi Cck promouter. Kromatin immunopresitivatsiyasi assotsiatsiyasi DFF uchun maxsus faktor antikor bilan DFOSB dan ortiqcha ekspressxpressing sichqonchadan striatal to'qimalardan yoki doxlardagi yoki 2 haftadan keyin dokslarni ajratishdan so'ng amalga oshirildi. Haqiqiy vaqtli PCR tahlil qilish edi ...

O'tish:

Munozara

Ushbu tadqiqot DFFning striatumada gen ekspozitsiyasini tartibga solishini ko'rsatadigan avvalgi topilmalar bo'yicha tasdiqlaydi va kengayadi va qisqa muddatli ifodadan keyin ko'p mexanizmlar orqali buni amalga oshiradi. 2 xaftani ortiqcha tushuntirishdan so'ng, DFOSB to'g'ridan-to'g'ri ekspirizatsiya o'zgarishiga olib keladigan ba'zi genlardagi promoterlarga bog'langanligini ko'rsatamiz (ya'ni, CDK5). Bundan tashqari, CREB protein darajasini oshiradi, madaniy xujayralar bilan bir qatorda striatumda kuzatiladigan ta'sir, bu esa boshqa gen promoterlarida (masalan, dynorphin va BDNF). O'tgan ishda biz DFF ning striatumda qisqa muddatli haddan tashqari ekspresyoni CREB ekspressiya qilinganida topilgan bir xil gen ekspozitsiyasining o'zgarishiga olib keladi va shunga o'xshash xatti-harakatlarga olib keladi,McClung va Nestler, 2003). Shunday qilib, DFOSB ning CREB ning indüksiyonuna va CREB'nin ma'lum gen promoterlerine ulanishiga olib kelishi, bu ikki transkripsiyon faktörüyle nima uchun ko'p gen ekspresyon o'zgarishlarini paylaşıldığını ochib beradi.

DFOSB tomonidan CREB ning indüksiyasi qiziqarli, chunki ekspluatatsiya dori 133-fosforillangan CREN darajasida o'zgarishlarni keltirib chiqaradi (Mattson va boshq., 2005) va CRE-mediatsiyalangan transkripsiyani (Barrot va boshq., 2002; Shaw-Lutchman va boshq., 2002, 2003), CREBning umumiy darajasini o'zgartirmagan holda. CREB darajasidagi o'zgarishlar vaqtinchalik bo'lishi mumkin va shuning uchun boshqa ishlarda osongina o'tkazib yuborilgan bo'lishi mumkin. Bizning qo'limizda CREB mRNA'sidagi kokainga bog'liq oshqozonlarning oshishi, ayniqsa, tajribalar, ammo bu ta'sir juda o'zgaruvchan (e'lon qilinmagan kuzatuv). 11A transgenli sichqonlari va PC-12 hujayralari CREB indüksiyonini qisqa muddatli DFB eksperksepsiyasidan keyin namoyon qilganligi sababli, CREB aslida DF (DFOSB) tomonidan indüklenildiğini va genda dori bilan bog'liq o'zgarishlarni tushuntirish uchun yana bir mexanizmni taqdim etadi ifoda qilish.

Ajablanarlisi shundaki, biz CREB yoki DFOSB bilan bog'lanmaganligini topdik Cck Promouter hatto bo'lsa ham Cck qisqa muddatli DFOSB ifodasi keyin aniq ifodalangan. Cck ham VTA va NAc da ifodalangan keng nevropeptiddir (Xokfelt va boshq., 1980) va, ehtimol, giyohvandlikka qarshi dori-darmonlarga munosabatida ishtirok etishi mumkin (Josselyn va boshq., 1996; Josselyn va boshq., 1997; Hamilton va boshq., 2000; Beinfeld va boshq., 2002; Rotzinger va boshq., 2002). Hujayra madaniyati assotsiatsiyalarida Cck Promoter keng tarqalgan bo'lib xarakterlanadi va CREB va AP-1 oila a'zolariga nisbatan ta'sirchanligini ko'rsatdi ( Xansen, 2001). Haun va Dixon (1990) AP-1 komplekslari unga ulanishi mumkinligini ko'rsatdi Cck CRE-kabi sayt in vitroSK-N-MC neuroblastoma hujayralaridan foydalanib, CRE-shunga o'xshash sayt mutatsiyasining oshib borishi uchun promoterning sezgirligini kamaytirishga olib keldi (cFos / cJunRourke va boshq., 1999). Darhaqiqat, biz ham ko'payganmiz Cck Promouter faoliyati (Shakl 2) va CRE-ga o'xshash elementda yoki uning atrofidaShakl 3), boshqa AP-1 oilaviy a'zosining DFSB-ning haddan tashqari ekspluatatsiyasidan so'ng, ammo biz DFFga to'g'ridan-to'g'ri ulanishni topolmaymiz. Cck promouter ning Vivo jonli or in vitro, hatto uning ortiqcha ifodasi ham mavjud.

Ko'p ishlar CREBni boshqarishda muhim rol o'ynadi Cck Promouter faoliyati. The Cck CRE-shunga o'xshash sayt umurtqali hayvonlarda saqlanadi (Xansen, 2001) va ba'zi hujayra madaniyati testlarida CREB va AP-1 komplekslari ushbu saytga ulanadi va Cck Promouter faoliyati (Haun va Dixon, 1990; Deavall va boshq., 2000; Xansen, 2001). Bundan tashqari, bir necha ma'lum aktivatörler Cck ekspresyonu (bFGF, PACAP, peptonlar va depolarizasyon kabi) CREB (Hansen va boshq., 1999; Deavall va boshq., 2000; Bernard va boshq., 2001; Gevrey va boshq., 2002; Hansen va boshq., 2004). Bizning Cck-giferaz reporterlari gen ma'lumotlarini tartibga solishda CRE-shunga o'xshash sayt uchun muhim rol o'ynaydi Cck promoter faoliyati, chunki ushbu sayt mutatsion bazalni pasaytiradi Cck promouter faoliyati va CckCRES ning konstitutiv faol shakli VP16-CREB tomonidan indüklenen dispersiyferat ifodasi, bu sayt mutatsiyaga uchraganida (e'lon qilingan kuzatish) yo'qoladi. Shunday qilib, biz CREB ning bog'lanmagan ko'rinishini topib, hayron bo'ldik Cck CREB darajalari oshirilganda, striatal ekstraktsiyalarda yoki boshlang'ich yoki qisqa muddatli DFB eksperksepsiyonida promoter. Bu CREB darajasini ta'kidlaydi boshiga tushgan ushbu saytda majburiy miqdori belgilashda yagona omil emas va bu boshqalarning ishi bilan qo'llab-quvvatlanadi (Cha-Molstad va boshq., 2004). Boshqa CREB maqsadli genlarni ilgari identifikatorlari bo'lganligi sababli BDNF va prodynorphin, CREB ga bog'langan bo'lsa, biz CREB ning bu uchun majburiy emasligini aniqlaymiz Cck striatal yadroli ekstraktlarda targ'ibotchi. Bundan tashqari, CckDFOSB tomonidan bajarilgan faollik K.D.Ushinskiy kabi saytga bog'liq emas, bu esa DFBning Cck CREB ning to'g'ridan-to'g'ri bog'lanishini tartibga solish orqali ifodalash Cck promouter.

CREB bilan o'zaro aloqani aniqlash qobiliyatimiz yo'q Cck Promouter tomonidan qo'llab-quvvatlanadi Renthal va boshq. (2009), surunkali kokainga ta'sir etgandan so'ng fosforillangan CREB (pCREB) va DFOSB biriktirilishida global o'zgarishlarni ko'rish uchun ChIP-chip yondashuvidan foydalangan. Ushbu tajribalarda DNK-protein komplekslari DFOSB yoki pCREB antikorlari bilan immunopresipitatsiya qilindi va etiketkadan keyin cho'kindi DNK bir promotor mikroarrayaga hibridlangan edi. Ushbu yondashuv bilan oldindan xarakterli CREB maqsadli genlar ko'pchilik (masalan, BDNF, prodinorfin), Cck aniqlanmagan. Bunga qo'shimcha ravishda CREB konsensus CRE saytiga ulanish madaniy hujayra chiziqlari orasida juda farq qiladiCha-Molstad va boshq., 2004). CREB bilan o'zaro aloqalarni topgan oldingi ishlar Cck promoter hujayra madaniyatida (bizning EMSA va CHIP namunalari olingan miya emas) va oqsil-DNKning o'zaro ta'sirini tekshirish uchun jel-shift tahlillarini qo'llagan. EMSA bir omilning potentsialini DNK ketma-ketligiga bog'lash uchun baholashi mumkin bo'lsa-da, ChIP tahlillari bu ta'sirlarni yangi tasavvur beradi ning Vivo jonli. Bundan tashqari, indikatsiyani ko'rsatadigan ma'lumotlar ko'p Cck Promoter faoliyati yoki CREB ga ulanish uchun Cck promoter hujayralardan olingan bo'lib, ular peptonlar (Bernard va boshq., 2001), depolarizatsiya (Hansen va boshq., 2004) yoki cAMP va ERK (shu jumladan, hujayra ichidagi signalizatsiya kaskadlarining ko'plab faollashtiruvchilari)Hansen va boshq., 1999). Tajribalarimizda qo'llanilgan yagona "rag'bat" DFF ning ortiqcha namoyishi edi, bu esa Cck ifoda qilish. Birgalikda olingan narsa, bu CREB ning (va potentsial tartibga solish) qobiliyatini ko'rsatadi Cck promoter juda ko'p hujayra turiga va maxsus signalizatsiya yo'llarini faollashishiga bog'liq. Bundan tashqari, Cck CRE-shunga o'xshash promoter elementi (hech bo'lmaganda keraksiz PC12 hujayralarida va sichqonchani striatumida) CREB yoki DFB ning to'g'ridan-to'g'ri maqsadi emas. Qizig'i shundaki, FosB CREB tomonidan ifodalangan hujayra turi va stimulyatsiya turiga ham xosdir. Andersson tomonidan olib borilgan tadqiqot va boshq. CREB antisens oligonükleotidlerinin sichqonchani striatum ichiga inyeksiyonunun qisman induksiyonun FosB giyoh qo'llanilganda (Andersson va boshq., 2001). Biroq, ular L-Dopaning in'ektsiya qilish qobiliyatini topdilar FosB 6-OHDA-lesionli striatumda ifodalangan CREB antisens oligonükleotidlarining mavjudligi ta'sir ko'rsatmadi.

CREB va DFOSB bilvosita tartibga solinadi Cck promoter va kromatin tarkibidagi o'zgarishlar, DFosB (Tsankova va boshq., 2004; Kumar va boshq., 2005; Renthal va boshq., 2008), biz DFOSning kromatin strukturasini o'zgartirgan holda bilvosita faoliyatni bilvosita modulyatsiyalashi mumkin deb o'yladik. Biroq, 2 haftalar uchun DFOSB'yi haddan tashqari sichqonchani sindirishda, histon H3 asetilasyonunda hech qanday o'zgarishlar bo'lmadi. Cck targ'ibotchi (1 stol). Bu ChIP-chip ma'lumotlari bilan quvvatlanadi Renthal va boshq. (2009), Hashorat qilingan H3 bog'lanishida hech qanday o'zgarish yo'qligini bildirgan Cck surunkali giyohga ta'sir qiladigan sichqonchani boshqaruvchi. Bu yildan beri Cck promoter striatumda faol, hech qanday repressiv metilatsiyalangan histon H3 bog'lanish kutilmagan yoki kuzatilgan. Qiziqarli tomoni shundaki, biz DFOSB oshqozon orqali asetilatlangan H3-ga ulanishda hech qanday o'zgarish ko'rmadik. BDNF Promoter (bu CREBning bajarilishini oshirganini ko'rsatdi) yoki CDK5 va prodynorphin promoterlar (DFOSBga ulanishning ortishi ko'rsatgan). Promoter faoliyatidagi o'zgarishlar bilan bog'liq bo'lgan juda ko'p sonli o'zgarish mavjud bo'lganligi uchun (qarang Rando va Chang, 2009), bu genlarni indüksiyonla bilan bog'liq boshqa kromatin o'zgarishlar bo'lishi mumkin. Ba'zi bir kromatinli modifikatsiya, ko'pincha promoter faolligining darajasini prognoz qilsa-da, ma'lum bir gen faollashuvida o'zgarmasligi mumkin. Keyingi ishda, atrofdagi kromatin tarkibidagi boshqa potentsial o'zgarishlarni ko'rib chiqish qiziqarli bo'ladi Cck DFosB ortiqcha ifodasini ta'qib etuvchi provayder. Qizig'i shundaki, surunkali giyoh (ehtimol orqali DFOSB indüksiyasiyasi) neyronal fiziologiyani, ERK signalizatsiya va kokainga nisbatan xatti-harakatlarga ta'sir ko'rsatadigan ko'rinadigan sirtuin 1 va 2, III-sinfidagi histon deasetilazlarini ifodalashni ko'rsatdiRenthal va boshq., 2009). Xiston deasetilazning indüksiyonu bir vaqtning o'zida ko'plab genlarni ifodalashni tartibga solish imkoniyatiga ega bo'ladi orqali kromatin tarkibidagi global o'zgarishlar.

Mumkin bo'lgan bir nomzod Cck DFOSB eksperkspressiyasidan keyingi tartibga solish AP-1 oila a'zosi cFos edi. CFos ifodasi CREB tomonidan boshqariladi (Sheng va boshq., 1990; Impey va boshq., 2004) va cFos ortiqcha tushuntirish (uning majburiy hamkori cJunning haddan tashqari ifodasi bilan mos keladigan) ortadi Cck Promouter faoliyati (Rourke va boshq., 1999). Shu sababli, qisqa muddatli DFOSB oshib ketishi tufayli CREB darajasining oshishi cFos darajasini oshirishi va Cck CRE-kabi sayt. cfos Ikki hafta davomida DFB eksperksepsiyasidan keyingi sichqonlarda mRNA hosil bo'ladi (McClung va Nestler, 2003) va surunkali giyohga ta'sir qiladigan sichqonlarda yoki uzoq muddatli DFB eksperksizligi (Renthal va boshq., 2008). Bu erda cFos ning to'g'ridan-to'g'ri bog'langanligini topamiz Cck Striatal to'qimalarda promoter, ammo DFB ortiqcha ekspresyoni ulanishni sezilarli darajada oshirmaydi. Bu esa, cFos'un tartibga solinishi mumkinligini ko'rsatadi Cck Umuman aytganda, faqat cFos'ların ulanishining o'zgarishi DFosB tomonidan tartibga solinadigan mexanizm bo'lishi mumkin emas Cck ifoda qilish. Biroq, DFOSB yoki cFos-dan post-translational o'zgarishlar (masalan, o'zgartirilgan fosforillanish) yoki indekslarini (masalan, cJun) yoki ko-aktivator oqsilining indulgentsiyasini keltirib chiqarishi mumkin. Biroq, buzilgan CRE-shunga o'xshash sayt (ilgari AP-1 komplekslari uchun majburiy sayt sifatida ko'rsatilgan) Haun va Dixon, 1990) oshirish uchun talab qilinmaydi Cck DFF eksperksepresiyasi (bizning muxbirimiz gen eksperimentlarida baholangan) bilan birga ko'rilgan promoter faoliyati, boshqa trans-ta'sir qiluvchi omillar ham DFB tomonidan tartibga solinishini asoslaydi.

The Cck bizning luciferase muxbirimiz gen testlarida ishlatiladigan promoter fragmenti konservalangan Sp1 ulanish saytini va E-qutini (Hansen, 2002 tomonidan ko'rib chiqilgan) o'z ichiga oladi. Ayniqsa, E-quti ketma-ketliklari ko'p sonli transkriptsion omillarni bog'lash uchun ko'rsatildi Forrest va McNamara, 2004). PC12 xujayralari yordamida E-qutining mutatsionligi pasayadi Cck promouter faoliyati, lekin promouterning DFFga (ma'lumotlar ko'rsatilmagan) javobini o'zgartirmaydi. Qizig'i shundaki, a CckCRE saytida va E-qutisida mutatsionlar mavjud bo'lgan -suliferaza muxbiri aniqlanadigan bazaviy faoliyatga ega emas va DFB eksperksizligi (nashr qilingan kuzatuv) uchun javob bermaydi. DF favqulodda vaziyatda DOSga qarshi harakatning boshqa vositasi Cck promouter ATFs bo'lib, ba'zi shakllari surunkali psixostimulant ta'sir qilish yo'li bilan striatumda paydo bo'lishi ma'lum (Yashil va boshqalar, 2008). Ammo, ushbu ATFlar uchun DFOSB indikatsiyasi uchun hech qanday dalil topilmadi (ma'lumotlar ko'rsatilmagan) va ATFlar mutatsiyaga uchragan CRE-ga o'xshash saytga ulanishni kutishmaydi. Cck promouter.

Ushbu tadqiqotning bir ogohlantirishi shuki, biz DFOSB ni ortiqcha bosim o'tkazish uchun bi-transgenli tizimdan foydalanmoqdamiz va shuning uchun bu paradigma va surunkali giyoh qo'llanishi o'rtasidagi parallellikka erishishda konservativ bo'lishi kerak. Shunga qaramay, 11A transgenli sichqonlari DFF ning o'ziga xos ta'sirini striatumda ko'rish uchun noyob imkoniyatga ega, chunki ortiqcha tushuncha bu miya hududi bilan cheklangan (Chen va boshq., 1998), giyohni qo'llash turli miya mintaqalarida o'zgarishlarni keltirib chiqarmoqda, keyin bilvosita striatumani ta'sir qilishi mumkin. Bundan tashqari, 11A sichqonlarida surunkali kokain bilan davolash qilingan transgen bo'lmagan hayvonlar bilan solishtirganda, bir necha tadqiqotlar shunga o'xshash xulq-atvori va molekulyar fenotiplarni belgiladiKelz va boshq., 1999; McClung va Nestler, 2003; Renthal va boshq., 2009). Bundan tashqari, Bibb va boshq. (2001) striatal shunga o'xshash darajalarni bildirgan Cdk5 kokain bilan davolash qilingan, transgen bo'lmagan littermates bilan solishtirganda, xuddi shu 11A suvi ichida mRNA va oqsil indüksiyonu kabi CDK5 maqsadlari, p35 va DARPP-32 kabi o'zgarishlarga o'xshash.

Xulosa qilib aytganda, qisqa muddatli DFosB ifodasi striatumda genlarni ko'p mexanizmlar orqali indüksiyasiga olib keladi. Bunga bevosita promoterni bog'lash, CREB proteininin va faolligini indüksiyonu, kromatin modifikasyonu kiradi.

O'tish:

Tajriba tartib-qoidalari

Hayvonlar

Tadqiqotda erkaklar bi-transgenik 11A hayvonlari (NSE-tTA x TetOP-DFB) qo'llanilgan. Kelz va boshq., 1999. DFOSBni ortiqcha bosim qilish uchun sichqon 3 va 6 haftalar orasida doksisiklinadan chiqarildi, nazorat sichqonlari doksisiklinada saqlandi. Barcha sichqon guruhga joylashtirilgan va 12: 12 yorug'lik / qorong'i davrda, 7-da ishlaydigan chiroqlarda saqlanib qolgan va 7-da reklama lib oziq-ovqat va suvga kirish. Barcha sichqoncha eksperimentlari Dallasdagi Texas janubi-g'arbiy tibbiyot markazining hayvonlarni parvarish qilish va foydalanish qo'mitasi tomonidan tasdiqlangan protokollarga muvofiq edi.

Hisobotchi va ifoda plazmidlari

Yovvoyi tip (WT) Cck promoter-luciferase muxbiri taxminan 200 bp PCR fragmentini pGL3-luc vektoriga (Promega) qo'shib tayyorladi. Ushbu fragment sichqonchani genomik DNKdan (primerlar: 5 "TATCCTCATTCACTGGGACGC 3" yuqorida va 5 "TACCTTTGGATGGGGAAATCG 3" pastda) olingan va dastlab pGEM-T Easy vektoriga (Promega, #A1360) kiritilgan. Keyinchalik promoter fragmenti pGL1-luc ning Kpn1 / Xho3 cheklash enzimlari saytlariga klon qilindi.

CRE nuqtasi mutatsiyasini yaratish uchun Cck promoter, ilgari xabar qilingan CRE-ga o'xshash saytga qarshi yo'naltirilgan mutagenli primer (sezgi primeri: 5'CGTGTCCTGCTGGACTGAGCTCGCACTGGTAAACA 3 ', antisense primer: 5'CTGTTACCCAGTGCGCGCTGAGTCCAGCAGGACACG 3') bilan ishlab chiqarilgan Quagen-ning buyrug'i bilan mutanosiblikda ishlatiladigan Instrument-ning ishlab chiqaruvchisi bilan almashinuvida ishlatiladigan Instrument (ishlab chiqarishning o'zgarishi) ning kombinatsiyasi bilan birgalikda ishlab chiqarilgan Quagen-ning ishlab chiqarishdagi o'zgarishi (ishlab chiqarishning o'zgarishi) bilan ketma-ketlikdagi ishlab chiqaruvchilarning ko'rsatmalariga asoslangan mutagenlikli primer. . Bu xabar qilingan CRE-ga o'xshash saytni (ACTGCGTCAGC) ACTGAGCTCC-ga o'zgartiradi. Barcha muxbir plazmidlar DNK sekvensiyasi bilan tasdiqlangan. DFOSB ekspression plazmidida pCDNA 3.1 ning ko'p klonlash joyiga kiritilgan to'liq uzunlikdagi DFOSB ketma-ketligi mavjud va u ilgari tavsiflangan (Ulery va Nestler, 2007).

Tar madaniyati va DNK infektsiyalari

Sichqoncha feoxromotsitomasi (PC12) hujayralari Dulbeckoning modifikatsiyalangan burgutining F-12 muhitida saqlanib, unga 10% ot zardobi, 5% xomilalik sigir zardobi va 1% penitsillin / streptomitsin 37 ° C va 5% CO da qo'shilgan.2. Hujayralar BTX 360 elektroporatori (350V, 0 ohm va 850 mF) yordamida 800 mkL Dulbekoning fosfat tamponli fiziologik eritmasida 4 mm bo'shliqli kyuvetalarda, muxbirning 10 mkg va 5 mkg ifoda konstruktsiyasida elektroporatsiya yordamida o'tkazildi. DNKning umumiy miqdorini normalizatsiya qilish uchun bo'sh vektorli plazmid (pCDNA) ishlatilgan. Transfektsiyadan so'ng hujayralar ko'rsatilgan vaqt davomida 35 mm kollagen bilan qoplangan idishlarda o'stirildi.

Luciferase tahlillari

Transfektsiyadan ikki-uch kun o'tgach, hujayralar 3 marta Dulbeckoning fosfat tamponli sho'r suvida yuvilib, lizislangan (25 mM glisilglisin, 15 mM MgSO yordamida)4, 4 mM EGTA, 1% Triton X-100, pH 7.8, 1 mm DTT) yig'ilib, santrifugatsiya orqali tozalanadi. 30 mL lizat 140 mL lusiferaz tahlil tampon (25 mM glycylglycine, 15 mM MgSO4, 4 mM EGTA, 1 mM DTT, 1 mM ATP, 1 mM kaliy fosfat, 1 mM koenzim A, pH 7.8). Luminesans faoliyati, har bir quduq uchun 800 mL 40 mM luciferin avtomatlashtirilgan in'ektsiyasidan so'ng, FLX-1 mikroplota floresans o'quvchi yordamida aniqlandi. Lichiferaz faoliyati, BioRad protein tahlil qilish bilan belgilangan bo'lib, jami protein tarkibiga normalize qilindi.

Elektroforetik harakatchanlik smenasi

Bi-transgenik 11A sichqonlaridan ikki tomonlama striatum bo'lakchasidan olingan yadro ekstraktlari (2 yoki 8 haftalar uchun doksisiklinni ochish yoki yopish)McClung va Nestler, 2003) bo'yicha tayyorlangan Huang va Walters (1996). 32P-etiketli ikki tomonlama oligonükleotid problar Promega Gel Shift tahlil tizimi protokoli (#E3300) yordamida tayyorlangan va problar Roche Quick Spin ustunlar yordamida tozalangan. CRE va AP-1 problari konsensuslari Promega (mos ravishda #E328A va E320B) va Cck CRE sekanslari (Cck-CRE ma'no: CTAGCGAGCTCTGGACTGCGTCAGCACTGGGTGCA; Cck-CRE antisens: CCCAGTGCTGACGCAGTCCAGAGCTCGCTAGCTTT).

Bog'lanish reaktsiyalari va elektroforez Promega Gel Shift tahlil usuli (#E3300) protseduralari yordamida amalga oshirildi. 50,000 CPM markali prob 10 ig striatal yadro ekstrakti bilan birlashtirildi. Radiolabeled problarni kiritishdan oldin sovuq raqib DNK yoki antikorlar qo'shilgan. Yuqori darajali tajribalar uchun CREN antikor (Upstate Biotechnology # 2-06) ning 083 mkg ishlatilgan. Reaktsiyalar 4% poliakrilamid jelida elektroforez qilingan, quritilgan va kino ta'siriga uchragan (1 kun uchun 2 kungacha kuchaygan ekranlar yordamida).

Immunoblotlanish

PC12 xujayralari uchun transfektsiya qilingan hujayralarning 35 mm plitalari muzli Dulbekoning fosfat tamponli sho'r suvida yuvilgan va lizatlar muzli RIPA lizis tamponida tayyorlangan (50 mM Tris pH 7.4, 5 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% deoksixolat, 1 Proteaza inhibitörlerini o'z ichiga olgan% Triton X-100, 0.1% natriy dodesil sulfat). Sonikatsiya, tozalash va Bredford oqsillarini tahlil qilishdan so'ng, lizatlar to'liq denatüre qilindi va har bir namunadan 50 mkg 10% SDS poliakrilamid jellarida elektroforez qilindi. Proteinlar PVDF membranasiga o'tkazildi, 1% Tween-3 (TBS-T suti) o'z ichiga olgan Tris tamponli fiziologik eritmada 0.1% yog'siz quruq sutda 20 soat davomida bloklandi va bir kecha-kunduzda birlamchi antitellar (CREB-) bilan tekshirildi. Upstate Biotechnology № 4-06, 083: 1da ishlatilgan; GAPDH - Sigma # G1,000, 8795: 1 da ishlatilgan) TBS-T sutida suyultirilgan. TBS-T-da bir necha marta yuvilganidan so'ng, dog'lar xona haroratida bir soat davomida ishqoriy fosfataza bilan biriktirilgan ikkilamchi antikorlar (Sigma) yordamida TBS-T sutida 80,000: 1 nisbatda suyultirildi. Tris tamponli sho'r suvda bir necha marta yuvilgandan so'ng, rang reaktsiyasi BioRad (# 5,000-170) ko'rsatmalariga muvofiq amalga oshirildi. Membranalar bir kechada quritilgan, tekis skanerda skanerlangan va ImageJ yordamida bajarilgan densitometriya (pastga qarang).

Striatal ekstraktlar uchun Western blot tahlillari avval chop etilganHope va boshq., 1994). To'qimalarining dekapitatsiya qilingan sichqonchalardan olib tashlanishi, muzga tushirilishi va miya matritsasida 1 mm qalinligida bo'linishi. Keyinchalik to'qimalarga mushtlari olinadi va ishlatilgunga qadar -80 ° C da muzlatiladi. To'qimalar, fosfataz va proteaz inhibitörlerini (Roche, Sigma) o'z ichiga olgan ta'dil qilingan, bir detarjen bazlı tamponda muzda sonikleştirildi. Sonikasyondan keyin, namunalar qaynoq suvda denatüre qilingan va 15,000xg'de 15 daqiqa davomida santrifüjlendi; Keyinchalik to'plangan va qayta ishlangan supernatant; protein kontsentratsiyasi miqdori keyinchalik Bradford assotsiatsiyasi (Bio-Rad) yordamida aniqlandi. Namunalar 10% akrilamid / bisakrilamid jelida ishlangan, PVDF membranasiga o'tkazilib, 5% sutda bloklangan va asosiy antijismlar bilan inkubatsiyalangan (Anti-CREB, Upstate, Lake Placid, NY). Keyinchalik nurlanishlar chemiluminesans tizimi (Pirs) yordamida ko'zdan kechirildi. Barcha namunalar GAPDH (Fitzgerald, Concord, Ma) ga normalizatsiya qilindi. Bizning chiziqli oraliqda ekanligimizni ta'minlash uchun standart egri chiziqlar ishga tushirildi.

Densitometriya tahlili

PC12 immunoblotlari uchun densitometriya tahlillari ImageJ yordamida rodbard kalibrlash bilan amalga oshirildi. O'rtacha fon uzatish har bir o'lchovdan chiqarildi va CREB dan GAPDH signaliga nisbati har bir namuna uchun hisoblandi. Striatal immunoblots va EMSA tahlillari uchun, fon ajratib olish bilan Scion Image 1.62c ishlatilgan.

Kromatin immunopreptitatsiyasi (ChIP)

ChIP tahlillari usullari bo'yicha amalga oshirildi Tsankova va boshq. (2004) va Kumar va boshq. (2005). Qisqacha aytganda, doksisiklinda yoki undan tashqarida saqlanadigan 11A sichqonlaridan olingan ikki tomonlama striatal namunalar 1% formaldegid bilan o'zaro bog'langan va o'zaro bog'lanish glitsin bilan o'chirilgan (yakuniy konsentratsiyasi 0.125 M). Ushbu namunalar korteks olib tashlangan holda yadro akumbensi darajasida olingan butun miya tilimlaridan olingan. Xromatin sonikatsiya orqali taxminan 0.2 dan 1 kb gacha bo'lgan qismlarga bo'linib, Protein G boncuklari (Thermo Scientific # 22852) bilan tozalangan va kirish namunalari -80 ° C da muzlatilgan. Har bir yog'ingarchilik uchun 60 dan 100 mg gacha xromatin ishlatilgan. Har bir asosiy antikorning 5-10 mkg ishlatilgan (CREB: Upstate Biotexnologiya # 06-863, DFosB: Santa Cruz Biotexnologiya # SC-48x, asetillangan H3: Upstate Biotexnologiya # 06-599, metillangan H3 (LYS9): Uyali signalizatsiya texnologiyasi, cFos: Santa Cruz Biotexnologiya # SC-7202x). Antikor-xromatin komplekslari ishlab chiqarish ko'rsatmalariga binoan Protein G plyus munchoqlari bilan immunopremitatsiyalangan (Thermo Scientific # 22852). Kirish va cho'kindi namunalarni teskari bog'lanishidan so'ng, har bir namuna miqdoriy PCR (qPCR) ta'siridan o'tkazildi. Ushbu antikorlarning barchasini ChIP uchun ishlatish juda keng tasdiqlangan (Tsankova va boshq., 2004; Kumar va boshq., 2005; Renthal va boshq., 2009).

Qiziqishning har bir gen promoterida proteinlar ulanishi darajalari qPCR (Applied Biosystems (ABI) Prism 7700, Foster City, KA) tomonidan bog'liq DNK miqdorini o'lchash orqali aniqlandi. Kirish yoki jami DNK (nonimmunopresipiatsiyalangan) va immunoprecipitatsiyalangan DNK uchburchakda SYBR Green (Applied Biosystems, CA) ishtirokida kuchaytirilgan. Har bir namunadagi Ct qiymatlari Sequence Detector 1.1 dasturidan foydalangan holda olingan. Shakli DNKning nisbiy miqdori DKT uslubi (Tsankova va boshq., 2004). Astarlar ishlatilgan: BDNF promoteri 4: CTTCTGTGTGCGTGAATTTGCT; AGTCCACGAGAGGGCTCCA CDK5 targ'ibotchisi: GCTGAAGCTGTCAGGAGGTC; GTGCCCCGCTCTTGTTATTA Cck promoter: CTTGGGCTAGCCTCATTCACTG; TTAAATAGCTCCTCCCGGTTCG Prodynorphin promoteri: GGCTTCCTTGTGCTTCAGAC; GCGCTGTTTGTCACTTTCAA.

Statistik tahlil

Barcha ma'lumotlar o'rtacha ± standart xatosi degan ma'noni anglatadi. Statistik farq talabaning ikkita quyruqli t-testi bilan aniqlandi (p <0.05). Ko'p taqqoslash o'tkazilganda p-qiymatlari Bonferroni tuzatish yordamida o'rnatildi.

O'tish:

Rahmatlar

Villi Renthal va Arvind Kumarga foydali muhokamalar uchun minnatdorchilik bildiramiz. Shuningdek, ushbu tajribalarni moliyalash uchun NIDA ga ham minnatdorchilik bildiramiz.

O'tish:

Izohlar

Nashriyotdan voz kechish: Bu nashrga qabul qilingan qabul qilinmagan qo'lyozma faylining PDF-fayli. Mijozlarimizga xizmat sifatida biz qo'lyozmaning ushbu dastlabki versiyasini taqdim etmoqdamiz. Qo'lyozma nusxa ko'chirish, nusxa olish va uning yakuniy shaklida nashr etilishidan oldin tasdiqlangan hujjatlarni ko'rib chiqadi. Iltimos, ishlab chiqarish jarayonida kontentga ta'sir qilishi mumkin bo'lgan xatolar aniqlanishi mumkin va jurnalga tegishli bo'lgan barcha qonuniy ogohlantirishlar tegishlidir.

Tasniflash shartlari:

Bo'lim: #1 Asab tizimlarining hujayra va molekulyar biologiyasi

O'tish:

Manbalar

  1. Andersson M, Konradiy S, Cenci MA. Dopaminga bog'liq bo'lgan genotiy ekspresifikatsiya uchun dopaminli denkleştirilgan striatumda emas, balki cAMP javob elementini majburlovchi protein talab etiladi. J Neurosci. 2001; 21: 9930-43. [PubMed]
  2. Barrot M, Olivier JD, Perrotti LI, DiLeone RJ, Berton O, Eisch AJ, Impey S, Storm DR, Neve RL, Yin JC, Zachariou V, Nestler EJ. Nucleus accumbens qobig'idagi CREB faoliyati emotsional stimullarga nisbatan qiziqishlariga javoblarni nazorat qiladi. Proc Natl Acad Sci AQSh A. 2002; 99: 11435-40. [PMC bepul maqola] [PubMed]
  3. Beinfeld MC, Connolly KJ, Pirs RC. Kokainni davolash uyquga olib boradigan, erkin harakatlanadigan kalamushlarning yadrosidagi accumbens qobig'ida hujayra xoletsistokinini (CCK) kuchaytiradi, bu kokainga nisbatan sezgir darajada ta'sirlangan kalamushlarda kuchayadi. J Neurochem. 2002; 81: 1021-7. [PubMed]
  4. Bernard C, Sutter A, Vinson S, Ratineau C, Chayvialle J, Cordier-Bussat M. Peptones sikli adenosin monofosfatli javob elementi bilan bog'laydigan omillar orqali ichak xoletsistokininining gen transkripsiyasini rag'batlantiradi. Endokrinologiya. 2001; 142: 721-9. [PubMed]
  5. Bibb JA, Chen J, Teylor JR, Svenningsson P, Nishi A, Snyder GL, Yan Z, Sagawa ZK, Ouimet CC, Nairn AC, Nestler EJ, Greengard P. Kokainga surunkali ta'sir qilish ta'siri nöronal protein Cdk5 tomonidan belgilanadi. Tabiat. 2001; 410: 376-80. [PubMed]
  6. Cha-Molstad H, Keller YD, Yochum GS, Impey S, Goodman RH. Transkripsiya faktori CREB ning hujayra tipiga maxsus birikmasi cAMP-javob elementiga. Proc Natl Acad Sci AQSh A. 2004; 101: 13572-7. [PMC bepul maqola] [PubMed]
  7. Chen J, Nye HE, Kelz MB, Xiroi N, Nakabeppu Y, Umid BT, Nestler EJ. Delta FosB va FosB-shunga o'xshash oqsillarni elektrokonsivulseptiv tutilish va kokain bilan davolash orqali tartibga solish. Mol Pharmacol. 1995; 48: 880-9. [PubMed]
  8. Chen J, Kelz MB, Zeng G, Sakai N, Steffen C, Shockett PE, Picciotto MR, Duman RS, Nestler EJ. Miyaning bevosita, maqsadli gen ekspozitsiyasi bilan transgenik hayvonlar. Mol Pharmacol. 1998; 54: 495-503. [PubMed]
  9. Chen J, Zhang Y, Kelz MB, Steffen C, Ang RaI, Zeng L, Nestler EJ. Surunkali elektrokonsivulseptiv tsikllar bilan hipokampustaki siklinga qaram kinoaz 5ni induktsiya qilish: DFBning ahamiyati. J Neurosci. 2000; 20: 8965-71. [PubMed]
  10. Chinenov Y, Kerppola TK. Ko'pgina turdagi yaqin aloqalar: transkripsiyaning tartibga solish xususiyatlariga vositachilik qiladigan Fos-Jun ta'sirlari. Onkogene. 2001; 20: 2438-52. [PubMed]
  11. Cole RL, Konradi C, Douglass J, Hyman SE. Amfetamin va dopaminga neyronal moslashish: rat striatumida prodynorphin genini boshqarishni molekulyar mexanizmlari. Neyron. 1995; 14: 813-23. [PubMed]
  12. Deavall DG, Raychowdhury R, ​​Dockray GJ, Dimaline R. STC-1 hujayralarida PACAP tomonidan CCK gen transkripsiyasini nazorat qilish. J.J. Fiziol gastrointest jigar kasalligi fiziologiyasi. 2000; 279: G605-12. [PubMed]
  13. Ding XZ, Mocchetti I. Sichqoncha striatumida xoletsistokinning mRNA tarkibiy qismlarining dopaminerjik regulyatsiyasi. Brain Res Mol Brain Res. 1992; 12: 77-83. [PubMed]
  14. Forrest S, McNamara C. Id, transkripsiya omillar va qon tomir lezyon shakllanishi. Arteroskler Tromb Vaz Biol. 2004; 24: 2014-20. [PubMed]
  15. Gevrey JK, Cordier-Bussat M, Némoz-Gaillard E, Chayvialle JA, Abello J. Protein gidrolizi bilan xoletsistokinining genini transkripsiyona faollashtirish uchun sikli AMP va kaltsiyga bog'liq protein kinazlarining birgalikda ishlashi. J Biol Chem. 2002; 277: 22407-13. [PubMed]
  16. Green TA, Alibhai IN, Unterberg S, Neve RL, Ghose S, Tamminga CA, Nestler EJ. Nucleus accumbens-da ATF2, ATF3 va ATF4 faollashtirilgan transkriptsiya omillarini (ATF) indüksiya qilish va ularning hissiy munosabatini tartibga solish. J Neurosci. 2008; 28: 2025-32. [PubMed]
  17. Hamilton ME, Koreya JL, Freeman AS. O'tkir preparatni qo'llashga javoban sichqon nukleusidagi akumbenslarda dopamin va xolesistokininning oqishi. Sinaps. 2000; 38: 238-42. [PubMed]
  18. Hansen TV, Rehfeld JF, Nilsen FK. Mitogen bilan faollashtirilgan oqsil kinazasi va oqsil kinazasi signalizatsiya yo'llari tsiklik adenozin 3 ′, 5′-monofosfat javob elementini bog'laydigan oqsilni faollashtirish orqali xoletsistokinin transkripsiyasini rag'batlantiradi. Mol endokrinol. 1999; 13: 466-75. [PubMed]
  19. Hansen TV, Nielsen. Neyronal xoletsistokinning gen transkripsiyasini tartibga solish. Skand J Clin Laboratoriya Invest Invest. 2001; 234: 61-7. [PubMed]
  20. Hansen TV. Kolesistokinin gen transkripsiyasi: promoter elementlari, transkriptsiya omillari va signalizatsiya yo'llari. Peptidlar. 2001; 22: 1201-11. [PubMed]
  21. Hansen TV, Rehfeld JF, Nielsen. KCl va forskolin CREB va ko-aktivator CBP ning koordinatali faollashuvi orqali xoletsistokinning gen ekssiratsiyasini sinergetik tarzda boshqaradi. J Neurochem. 2004; 89: 15-23. [PubMed]
  22. Haun RS, Dixon JE. Sichqoncha xoletsistokinining genini ifodalash uchun zarur bo'lgan transkripsiyaal kuchaytiruvchi inson c-fos genining -296 elementiga bir xil sekansni o'z ichiga oladi. J Biol Chem. 1990; 265: 15455-63. [PubMed]
  23. Xiroy N, Marek GJ, Jor JR, Ye H, Saudou F, Vaidya VA, Duman RS, Greenberg ME, Nestler EJ. Surunkali elektrokonsivulseptivlikning molekulyar, hujayrali va xulq-atvor harakatlarida fosb genining muhim roli. J Neurosci 1998. 1998; 18: 6952-62. [PubMed]
  24. Hokfelt T, Rehfeld JF, Skirboll L, Ivemark B, Goldston M, Markey K. Mezo-limbik neuronlardagi dopamin va CCKning mavjudligi uchun dalillar. Tabiat. 1980; 285: 476-8. [PubMed]
  25. Hope BT, Kelz MB, Duman RS, Nestler EJ. Surunkali elektrokonsivulseptiv (EKS) terapiyasi o'zgaruvchan tarkibi va xarakteristikalari bo'lgan miyada mo''tadil uzoq muddatli AP-1 majmuasini ifodalaydi. J Neurosci. 1994; 14: 4318-28. [PubMed]
  26. Hope BT, Nye HE, Kelz MB, O'z DW, Iadarola MJ, Nakabeppu Y, Duman RS, Nestler EJ. Surunkali kokain va boshqa surunkali muolajalarda miyada mushakdagi o'zgargan Fos kabi oqsillardan tashkil topgan uzoq muddatli AP-1 kompleksining paydo bo'lishi. Neyron. 1994; 13: 1235-44. [PubMed]
  27. Huang KX, Walters JR. Sichqoncha striatumida AP-1 transkriptsiyali faktor DNKning majburiy faolligini dopaminergik tartibga solish. Neuroscience. 1996; 75: 757-75. [PubMed]
  28. Impey S, McCorkle SR, Cha-Molstad X, Dwyer JM, Yochum GS, Boss JM, McWeeney S, Dunn JJ, Mandel G, Goodman RH. CREB regulonini belgilash: transkriptsiya faktorini tartibga soluvchi hududlarning genomdan keng tahlil qilish. Hujayra. 2004; 119: 1041-54. [PubMed]
  29. Johannessen M, Delghandi MP, Moens U. Nima uchun CREB aylanadi? Hujayra signallari. 2004; 16: 1211-27. [PubMed]
  30. Josselyn SA, Vaccarino FJ. CCK (A) va CCK (B) antagonistlarining kalamushlarda konditsioner faollikni rivojlanishiga ta'siri. Behav Farmakol. 1996; 7: 505-512. [PubMed]
  31. Josselyn SA, De Cristofaro A, Vaccarino FJ. Sakkizburchakda kokain ishlab chiqaradigan konditsioner faoliyatni sotib olishga CCK (A) retseptorlari ishtiroki uchun dalillar. Brain Res. 1997; 763: 93-102. [PubMed]
  32. Kelz MB, Chen J, Carlezon VV, Jr., Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen S, Zhang YJ, Marotti L, O'z DW, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Neve RL, tutun RS, Picciotto MR , Nestler EJ. Miya ichidagi transkripsiyon faktor deltaFosB ning ifodasi kokainga sezgirlikni nazorat qiladi. Tabiat. 1999; 401: 272-6. [PubMed]
  33. Qumar A, Choy KH, Renthal Vt, Tsankova NM, Theobald DE, Truong Ht, Russo SJ, Laplant Q, Sasaki TS, Whistler KN, Neve RL, Self DW, Nestler EJ. Kromatinni qayta tuzish striatumda kokain bilan indikatsiyalangan plyonkali asosiy mexanizmdir. Neyron. 2005; 48: 303-14. [PubMed]
  34. Mattson BJ, Bossert JM, Simmons DE, Nozaki N, Nagarkar D, Kreuter JD, Hope BT. Kokain bilan sezgirlangan kalamushlarning yadroviy akumbenslarida kokain bilan bog'liq bo'lgan CREB fosforillanish hujayradan tashqari signalga bog'liq kinazning faollashishi bilan faollashadi, lekin protein kinaz A emas, balki Neurochem. 2005; 95: 1481-94. [PubMed]
  35. McClung CA, Nestler EJ. CREB va DeltaFosB tomonidan gen ekspression va kokain mukofotini tartibga solish. Nat Neurosci. 2003; 6: 1208-15. [PubMed]
  36. McClung CA, Ulery PG, Perrotti LI, Zachariou V, Berton O, Nestler EJ. DeltaFosB: miyada uzoq muddatli moslashish uchun molekulyar kalit. Brain Res Mol Brain Res. 2004; 132: 146-54. [PubMed]
  37. Nestler EJ, Kelz MB, Chen JS. DFOSB: Uzoq muddatli neyral va yurak-tomir plastisiyasining molekulyar vositasi. Brain Res. 1999; 835: 10-17. [PubMed]
  38. Nestler EJ. Narkomaniya uchun umumiy molekulyar yo'l bormi? Nat Neurosci. 2005; 8: 1445-9. [PubMed]
  39. Nestler EJ. Narkomaniyaning transkripsiya mexanizmlari: DeltaFosB ning ahamiyati. Filos Trans R Soc London B Biol Sci. 2008; 363: 3245-55. [PMC bepul maqola] [PubMed]
  40. Perrotti LI, Weaver RR, Robison B, Renthal V, Maze I, Yazdani S, Elmore RG, Knapp DJ, Selley DE, Martin BR, Sim-Selley L, Bachtell RK, Self DW, Nestler EJ. DeltaFosBning turli xil nayranglari miyadagi suiiste'mollik bilan bog'liq. Sinaps. 2008; 62: 358-69. [PMC bepul maqola] [PubMed]
  41. Rando OJ, Chang HY. Kromatinning genomik ko'rinishi. Annu Rev Biochem. 2009; 78: 245-71. [PMC bepul maqola] [PubMed]
  42. Renthal Vt, Carle TL, Maze I, Covington HE, 3rd., Truong HT, Alibhai I, Kumar A, Montgomery RL, Olson EN, Nestler EJ. Delta FosB surunkali amfetamin ta'siridan keyin c-fos genining epigenetik desensitizatsiyasiga vositachilik qiladi. J Neurosci. 2008; 28: 7344-9. [PMC bepul maqola] [PubMed]
  43. X, X, NX, X, X, N, X, N, X, X, X, N, Nestler EJ. Kokaindan kromatinni boshqarishni genom-keng tahlil qilish sirtuinlar uchun ahamiyatga ega. Neyron. 3; 2009: 62-335. [PMC bepul maqola] [PubMed]
  44. Rotzinger S, Bush ShU, Vaccarino FJ. Mesolimbik dopamin funktsiyasining xoletsistokin modulatsiyasi: motivatsiyalangan xatti-harakatni tartibga solish. Farmakol toksikol. 2002; 91: 404-13. [PubMed]
  45. Rourke IJ, Hansen TV, Nerlov S, Rehfeld JF, Nielsen. Cholecystokinin gen promoterida yonma-yon E-quti va cAMP / TPA sezgir elementlar o'rtasidagi salbiy hamkorlik. FEBS Lett. 1999; 448: 15-8. [PubMed]
  46. Shaw-Lutchman TZ, Barrot M, Wallace T, Gilden L, Zachariou V, Impey S, Duman RS, Bo'ron D, Nestler EJ. Naltrekson-yog'inli morfin chiqarish vaqtida CRE-mediatsiyalangan transkripsiyaning mintaqaviy va hujayrali xaritalash. J Neurosci. 2002; 22: 3663-3672. [PubMed]
  47. Shaw-Lutchman TZ, Impey S, Bo'ron D, Nestler EJ. Amfetamin bilan sichqonchaning miyasida CRE-mediatsiyalangan transkripsiyani tartibga solish. Sinaps. 2003; 48: 10-7. [PubMed]
  48. Sheng M, McFadden G, Greenberg ME. Membran depolarizatsiyasi va kaltsiy CREB transkripsiyasi faktorini fosforillanish orqali c-fos transkripsiyasini keltirib chiqaradi. Neyron. 1990; 4: 571-82. [PubMed]
  49. Tsankova NM, Kumar A, Nestler EJ. O'tkir va surunkali elektrokonsivulseptiv shikastlanishlar natijasida kalamush hippokampusida gen promoteri hududlarida histone o'zgarishlar. J Neurosci. 2004; 24: 5603-10. [PubMed]
  50. Ulery PG, Nestler EJ. SerxNUMX fosforilatsiyasining DeltaFosB transkripsiyasi faoliyatini tartibga solish. Eur J Neurosci. 27; 2007: 25-224. [PubMed]
  51. Vaccarino FJ. Nukleus akumbenslari psixostimulyant mukofotda dopamin-CCK shovqinlari va ular bilan bog'liq xatti-harakatlar. Neurosci Biobehav Rev. 1992; 18: 207-14. [PubMed]
  52. Zachariu V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchmann T, Berton U, Sim-Selley LJ, DiLone RJ, Kumar A, Nestler EJ. DFOSB: Morfin ta'siridagi yadrodagi akushtenlarda DFOSB uchun muhim rol. Tabiat neyrozlari. 2006; 9: 205-11. [PubMed]