FACS tanlangan faollashtirilgan kattalardagi striatal neyronlarda noyob kokainga bog'liq gen regulyatsiyasini aniqlaydi (2011) - striatal neyronlarning ozgina qismi

J Neurosci. Muallifning qo'lyozmasi; PMC da mavjud Sep 16, 2011.
Nihoyasida tahrirlangan shaklda nashr etilgan:
PMCID: PMC3073079
NIHMSID: NIHMS279955

 

Nashriyotchining ushbu maqolaning so'nggi tahrirlangan versiyasi bepul mavjud J Neurosci
PMCdagi boshqa maqolalarga qarang keltirilgan nashr qilingan maqola.

mavhum

Nosiral faoliyat belgisi Fos bilan o'tkazilgan ko'plab tadqiqotlar kokainning kam tarqalgan tarqalgan striatal neyronlarning faqat bir qismini faollashtirayotganligini ko'rsatadi. Shu paytgacha ushbu faollashtirilgan neyronlar ichida aniqlangan neyrokimyoviy moddalarni baholash uchun samarali usullar mavjud emas edi. Biz kokainga va kokainga sezgir bo'lgan kokainga bog'liq lokomulyatsiya paytida faollashgan striatal neyronlarni tozalash uchun floresans bilan faollashtirilgan hujayra saralash (FACS) dan foydalanganmiz cfos-lacZ transgenik kalamushlar. Aktivizatsiya qilingan neyronlar lacZ genining protein hosilasiga ega bo'lgan b-galaktosidaza qarshi antikor bilan yoritilgan. Cokain neyronlarning faol bo'lmagan ko'pchiligida kuzatilmaydigan faol neyronlarning kichik nisbatlarida selektiv ravishda noyob genin ekspression profilini yaratdi. Bu genlar zudlik bilan erta genlarning o'zgargan darajalarini o'z ichiga olgan boshq, fosBva nr4a3, shuningdek, p38 MAPK signalizatsiyasi va hujayra turi o'ziga xosligi bilan shug'ullanadigan genlar. Ushbu FACS usuli zararli moddalar va boshqa o'rganilgan xatti-harakatlarning ta'sirini kodlovchi maxsus neyronlarda molekulyar neyrokodatsaptlarni o'rganishda foydalanish mumkinligini taklif qilamiz.

Kalit so'zlar: kokain sezuvchanligi, nukleus akumbenslari, neyronal ansambllar, floresans faollashtirilgan hujayra tartibida

Kirish

Kokaina giyohvandlikka qarshi mavjud bo'lgan neyrobiologik tekshiruvlarning asosiy gipotezasi surunkali kokainga ta'sir qilish stiratum va mezolimbik dopamin sovg'alari devorining boshqa tarkibiy qismlarida uzoq vaqt davom etadigan neyrokodatsifikatsiyaga olib keladi, bu esa majburiy giyohvand moddalarni iste'mol qilish va uzoq muddatli relapse zaifligiga olib keladi (Nestler, 2001; Shaham va Umid, 2005; Kalivas, 2009; Bowers va boshq., 2010; Wolf va Ferrario, 2010). Shu bilan birga, bu gipoteza miya hududlarining homogenitlarida yoki neyronlardagi xatti-harakatlar vaqtida faollashtirilgan holatidan qat'i nazar tanlangan neyroxodispatiyalarni o'lchash bilan cheklangan ko'p sonli ishlarga asoslangan.

Aktiv bo'lmagan va nooziqlanadigan neyronlarga qarshi o'tkaziladigan neuroadaptations o'rtasidagi farq muhim ahamiyatga ega, chunki ular kokainning fiziologik, qiziqishlariga va psixologik ta'sirida turli rollarni o'ynashi mumkin. Nosiral faoliyat belgisi Fos bilan olib borilgan ko'plab tadqiqotlar kokainin striatumda kam tarqalgan tarqalgan neyronlarning faqat bir qismini faollashtirayotganligini ko'rsatadi. Kontekstga xos lokomotorlar sezgirlashidan so'ng, biz Fos faqat juftlarni juftlashgan muhitda juftlashgan muhitda emas, juftlashgan muhitda emas,Mattson va boshq., 2008; Koya va boshq., 2009). Eng muhimi, biz ushbu tanlangan faollashtirilgan neyronlar kokain va narkotik bilan bog'langan muhit o'rtasidagi o'rganishdagi aloqada kontekstga xos sezgirlikni keltirib chiqaradigan natija rolini o'ynaganligini ko'rsatdik (Koya va boshq., 2009). Shunday qilib, selektiv tarzda faollashtirilgan striatal neyronlar ichidagi neyroxoddastinglar kontekstga xos sezuvchanlik va boshqa dori-darmonlar bilan bog'liq xatti-harakatlar davomida o'rganishda o'ziga xos va muhim rol o'ynashi mumkin.

Hozirgacha texnik cheklovlar xatti-harakatlar vaqtida selektiv ravishda faollashtirilgan kam tarqalgan tarqalgan neyronlar sonidagi molekulyar o'zgarishlar o'zgarishini qiyinlashtirdi. Lazerni ushlash mikrodisseksiyasi (masalan,Kwon va Houpt, 2010) va ikkilamchi immunohistokimyo (Berretta va boshq., 1992; Gerfen va uning hamkorlari, 1995; Peters va boshq., 1996) faollashtirilgan neyronlar ichida selektiv ravishda molekulyar o'zgarishlarni aniqlashga qodir, biroq ushbu texnikalar juda kam ishlov berishga ega yoki miqdoriy emas. Floresan faollashtirilgan hujayra ajratishni (FACS) molekulyar analiz uchun kattalar neyronali populyatsiyalarni tozalash uchun samarali vosita bo'lishi mumkin (Liberles va Buck, 2006; Lobo va boshq., 2006). Biroq, FACS ularning faollashtirish holatiga asoslangan holda neyronlarni tozalashda foydalanilmadi. Ushbu tadqiqotda biz FACS dan transgenik kokain-faol striatal neyronlarni cfos-lacZ neyronlarning noyob naqshlarini neyronlarning faol bo'lmagan ko'pchiligi bilan solishtirgan.

Uslublar

Hayvonlar

ayol cfos-lacZ transgenik kalamushlar (Kasof va uning hamkorlari, 1995; Koya va boshq., 2009) va Sprague-Dawley Sichqonlar (Charlz daryosi, Raleigh, NC, AQSh) harorat va namlik bilan boshqariladigan xonada standart plastmassa hujayralarda alohida-alohida joylashtirilgan. Ular 12: 12 h orqa nurida saqlanib qoldi: zulmat aylanishi (20.00-daqiqada yonib turadi) va oziq-ovqat va suvga erkin kirish imkonini berdi. Dori-darmonlardan oldin kamida 7 kun oldin bu uy-joy sharoitlariga moslashtirilgan edi. Tajriba jarayonlari NIDA hayvonlarni parvarish qilish va ulardan foydalanish bo'yicha qo'mitasi tomonidan tasdiqlangan.

Giyohvand moddalarni davolash

O'tkir giyoh tajribalari uchun kalamushlar kokain (30 mg / kg, ip; n = 8) yoki sho'r (1 ml / kg; n = 6) bilan AOK qilingan va yumaloq Plexiglass kamerasiga (38 sm diametrli) joylashtirilgan. Sichqoncha miya to'qimasini olish uchun inyeksiya qilinganidan keyin 90 daqiqadan so'ng qurbon bo'ldi. Mikroarray tahlil qilish uchun uchta biologik replikatsiya olish uchun ushbu davo alohida kunlarda uch marta takrorlangan. Bundan tashqari, kantitativ PCR (qPCR) uchun uchta mustaqil biologik replikatsiya shu tarzda ishlab chiqarilgan. QPCR tahlillari uchun boshq, pdyn, adora2a, faqat shu uchta mustaqil biologik replikatsiya ishlatilgan. QPCR tahlillari uchun fosB, nr4a3, kcnc1 va map2k6, biz ham RNKni har bir mikroarray namunasidan foydalanganmiz.

Takroriy kokain tajribalari uchun ayol sichqonlar sutkada bir marta qo'llaniladigan to'rtta kokainni (15 mg / kg ip) sezgirlashdi. Injection kunlarda, har bir rat 43 daqiqagacha bo'lish uchun 43 × 30 sm kvadrat Plexiglas lokomotor faoliyat xonasiga (Med Associates, St Albans, VT, AQSh) joylashtirildi. Sichqonlarga kokain bilan AOK qilindi va lokomotor harakatlar 60 daqiqada masofa sifatida qayd etildi. To'rtinchi marta takrorlangan kokainga qarshi jarayondan so'ng, kalamushlar 7-8 kun davomida o'z uy qafasida qolishdi. Sinov kuni mobaynida kalamushlar lokomotor faoliyat xonalarida 30 min oraliqda joylashtirildi va keyin kokain (30 mg / kg ip) yoki sho'r suvali vosita bilan o'tdi. Sichqoncha dekapitatsiya qilindi va miya bevosita inyeksiya qilinganidan keyin to'qson daqiqadan so'ng chiqarildi. QSQL tahlil qilish uchun har bir guruhning uchta biologik replikatsiyasini olish uchun barcha xurujni davolash alohida haftalardan uch marta takrorlangan.

Hujayra ajratish

Striatal to'qimalar bir hujayrali suspenziyani olish uchun ajratildi. Sichqoncha dekapitatsiya qilindi va ularning striata ikki daqiqadan so'ng chiqarildi. Har bir striatum sovuq shisha plastinka ustara pichoqlari bilan maydalangan va 1 ml Hibernate A (Cat # HALF; Brain Bits, Springfield, IL) joylashtirilgan. Striata 1 santimetrida 005 min uchun oxirgi marta aralashtirish bilan 30 ml Accutase perchinida (Cat # SCR4; Chemicon, Billerica, MA) fermentativ ravishda hazm qilindi. To'qimalar 425x g da ikki minut davomida santrifüjlanadi va 300 mL muz qatiqli Hibernate Ada qayta suspenziya qilinadi. Barcha keyingi santrifüj bosqichlari 4 ° C da amalga oshirildi.

Digested striatal to'qimasi trituratsiya bilan mexanik ravishda ajratildi. To'rt striat bir Eppendorf trubasiga birlashtirilgan va katta diametrli Pasteur pipetasi (~ 1.3mm) bilan o'n marta trituratlangan. Tublar qisman katta to'qimalar uchun muzlarga joylashtirildi; Dissociatsiyalangan hujayralarni o'z ichiga olgan 600 ml bulutli suspenziya muz ustida 15 ml Falcon trubasiga o'tkazildi. 600 mL yangi Hibernate A original Eppendorf tüpüne qo'shilgan va undan keyin o'rta va kichik diametri pipetlerle (~ 0.8mm va ~ 0.4mm) trituration bosqichlari takrorlandi. Dissociatsiyalangan hujayralarni o'z ichiga olgan har bir süspansiyon oldingi ishlab chiqarish bilan birlashtirildi.

Havuzlangan hujayra süspansiyonundaki qolgan hujayra kümeleri oldindan ıslatılmış 100mm va 40mm hujayra süzgeçleri (Falcon markasi, BD Biosciences, San-Xose, CA) orqali filtrlash orqali chiqarildi. Süspansiyonda kichik hujayra chiqindilari 3 dagi filtriattan Percoll (Cat # P430, Sigma, Sent-Luis, miloddan avvalgi) uch bosqichli zichlik gradiyenti orqali 1644 g uchun santrifüj bilan kamaydi. Bo'lakli eng quyi qatlam (taxminan 2 ml) zaharli moddalarni o'z ichiga olgan. Qolgan qatlamlardagi hujayralar qolgan Percoll eritmasiga qayta suspenzatsiya qilindi va 550xg da besh minut davomida santrifüj qilindi. Palaf 1 ml Hibernate A'da qayta süspanse qilindi.

Immunolabeling va FACS

Dissociated xujayralar aniqlandi va 50% o'rganish yakuniy konsentratsiyasi uchun teng miqdorda o'rganish qo'shib, va vaqti-vaqti bilan aralashtirish bilan muz ustida xNUMX daqiqada saqlanib o'tdi. Hujayralar 15xg da ikki minut davomida santrifüje qilingan va RNazsiz fosfat-tamponli sho'r (PBS) bilan qayta ishlangan. Hujayralar NeuN (425: 1 dilüsyonu, Cat # MAB1000B, Chemicon) va b-galaktosidaz ((b-gal, 377: 1 dilüsyonu, Cat # 10000-4600, Biogenesis, Poole'a qarshi birlamchi antikorga qarshi biotinillangan birlamchi antikor bilan inkübe qilindi , Birlashgan Qirollik) 1409 ° C da 30 daqiqa uchun asosiy antibodalarda hujayralar oxiri-uchidan aylantirildi va 4xg da uch minut davomida santrifüje qilindi Hücreler 425 mL PBS bilan yuvindi va 800 mL PBS ichida qayta süspansiyona qilindi Hücreler inkübe qilindi (Streptavidin-phycoerythrin, 700: 1 dilüsyonu, Cat # SA1000-1004, Invitrogen, Carlsbad, CA) va ikkinchi darajali antikor (Alexa Fluor 1-labelli echki-kamqon IgG, 488: 1 dilüsyonu, Cat # A- 1000, Invitrogen) va 11055-daqiqada qaytarilgan uchburchak xujayralari 15 mL PBS bilan yuvilgan, uch daqiqada 800xda santrifüj qilingan va 425 ml PBS ichida qayta ishlangan.

Immunolabeled hujayralar skanerdan o'tkazildi va Johns Hopkins Bayview kampus oqim sitometri bazasida joylashgan. Hujayra tartibida FACS Aria (BD, Franklin Lakes, NJ) ishlatilgan. Sinov namunalarini saralash uchun eng maqbul mezonlarni aniqlash uchun dastlabki nazorat namunalari tahlil qilindi. Xususan, antikor bilan ishlov berilmagan qattiq hujayralar yorug'lik tarqoq eshikni o'rnatish uchun ishlatilgan. Keyinchalik endogen to'qimalarning floresansi va streptavidin yoki ikkilamchi antikor bilan o'ziga xos bo'lmagan ulanish uchun eshiklarni o'rnatish uchun flüoresanli ikkilamchi antikor bilan davolash qilingan qattiq hujayralar ishlatildi. Keyinchalik qo'shni kanallarda floresan qoplama miqdorini qoplash uchun har bir oqsil uchun primer va sekonder antikor bilan bitta-etiketli nazorat namunalari ishlatildi (NeuN yoki b-gal). Va nihoyat, har ikki floresan belgisi bilan etiketlenmiş sinov namunalari tahlil qilindi va tartiblashtirildi. Tartiblangan xujayralar har bir trubadagi 022431081 mL PBS bilan past bog'lamli naychalarga (Cat # 100, Eppendorf, Westbury, NY) yig'ilgan.

RNK ekstrakti

Tartibga solishdan keyin kokain bilan kiritilgan kalamushlardan bqal-musbat yoki bgal-salbiy hujayralarni yoki barcha sho'rlantiruvchi kalamushlardan olingan barcha NeuN-musbat hujayralarni o'z ichiga olgan namunalar 8 ° C da 2650 × gacha 18 min uchun santrifüj qilindi. Sho'rlangan aorta orqali yuborilgan neNN-salbiy hujayralar 8 da 6000 daqiqa davomida santrifugal qilindig 18 ° C da. Mikroto'lqinli tajribalar uchun RNK Trizol Reagent (Cat # 15596-026, Invitrogen) bilan ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga binoan chiqarildi. RNKning sifati va miqdori Bioanalyzer Picochip (Cat # 5067-1513, Agilent Technologies, Palo Alto, KA) yordamida baholandi. QPCR tajribalari uchun RNK DNase davolash bilan ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq RNEasy Micro to'plami (Cat # 74004; Qiagen, Valencia, KA) bilan ekstrakte qilindi. RNK miqdori va sofligi Nanodrop spektrofotometr yordamida baholandi (Thermo Scientific, Wilmington, DE).

Microarray tajribalari

Mikroarrayslar NNN-musbat va NeuN-salbiy hujayralardan RNKni sho'r-achitadigan kalamushlardan, shuningdek, kokainga kiritilgan sichqonlardan bqal-musbat va bgal-salbiy neyronlardan tahlil qilish uchun ishlatilgan. Yuqorida aytib o'tilganidek, dori-darmonlarni davolash bo'limida mikroarrayslar to'rtta namunaning har bir turi uchun uchtadan biologik replikatsiya bor edi. Har bir namunadagi jami RNKning besh mili Illumina TotalPrep RNK Amplifikatsiya Kiti (Cat # IL1791; Ambion, Austin, TX) yordamida ikki bosqichli cDNA sintezi jarayoni bilan belgilandi in vitro Biotin-16-UTP bilan RNK transkripsiyasi. 0.75 mg biotinli etiketli cRNA 16 soat davomida Illumina Sentrix Rat Ref12_v1 BeadChips (Cat # BD-27-303; Illumina, San-Diego, KA) uchun hibridlashtirildi. Chipaga hibridlangan biotinli qilingan cRNA Cy3-etiketli streptavidin bilan aniqlandi va Illumina ning BeadStation 500GX Genetika Analiz tizimlari skaneri yordamida aniqlandi. Barcha etiketleme va tahlillar Johns Hopkins Bayview Medical Campus Lowe Family Genomics Core-da o'tkazildi.

Haqiqiy vaqtda nicel PCR

FACS va mikroto'lqin natijalarini tasdiqlash uchun real vaqtda kantitativ PCR ishlatilgan. RNK oligo (dT) primeri bilan RETROscript kit (Cat # AM1710, Ambion) yordamida cDNA'ya teskari-transkriptsiya qilindi. Har bir 25 mL PCR reaktsiyasida 12.5 mkm Taqman Gen Expression Master Mix (Cat #4369514; Applied Biosystems, Foster City, CA), 1.1 mkm dan har biri 20 mM oldinga va orqaga primerler, 0.25 mL 100 mM FAM-etiketli prob, 5 ml suv va 5 ml 1 ng / ml cDNA bo'lishi kerak. Primer va prob kombinatlari [1 stol] intra-spanning qilish uchun Roche Universal Probe Library Assay Design Center yordamida yaratilgan. PCR reaktsiyalari Opticon Light Cycler (Biorad, Hercules, MD) yordamida kuzatilgan. Dastur 20 plastinka bilan 50 ° Cda fotovollash uchun o'qiy boshladi, undan keyin 5 ° Cda 95 min, so'ngra 40 santimetrda 20 siqimning 94 siqilishi, 1 santimetrda 60 daqiqada o'qiladi va bir plastinka o'qiladi.

1 stol 

QPCR uchun ishlatiladigan primerlar va problar

Amplifikatsiya samaradorligini aniqlash uchun birinchi navbatda har bir gen uchun standart egri reaktsiyalari bajarildi [1 stol]. Har bir kuchaytirilgan gen uchun ifoda darajalari ^ DK samaradorligi yordamida hisoblab chiqilganq Bu erda DKq = Cq(eksperimental gen) - C.q(Yo'naltiruvchi gen) har bir biologik replika uchun. Gorasp2 bir nechta neyronlar va glia o'rtasida mikroarray tahlillari bilan ifodalanmaganligi uchun referent gen sifatida tanlangan. Xuddi shu miqdorda shablonni yuklashda barcha namunalar bo'yicha teng qPCR kuchaytirilishi tufayli mos yozuvlar geni sifatida tasdiqlangan. Texnik tahlil uchraydigan Cq D qiymatini hisoblashdan avval o'rtacha qiymatlar aniqlandiq namunadagi har bir gen uchun. QPCRda o'lchanadigan har bir mRNA uchun gen ekspression qiymatlari biologik replikatsiyalar bo'yicha o'rtacha baholandi. Keyinchalik bu o'zgaruvchan qadriyatlarni aks ettirish uchun biz ushbu o'rtacha miqdorini ne'N-musbat hujayralarning sho'r-achitadigan kalamushlardan olingan o'rtacha gen ekspression qiymatlari bilan taqsimladik. Ushbu qiymatlar grafikalar va jadvallardagi vositalar va standart xatolar sifatida ko'rsatiladi.

Immunohistokimyo

Miya to'qimasi yuqumli jinsli ayol Spraque-Dawley kalamushlaridan mikroarray va qPCR tajribalari uchun yuqorida ta'riflangan bir xil va takrorlangan kokainli davolanishdan so'ng olingan. Ammo sinovdan o'tgan kundan keyin 90 daqiqadan so'ng, kalamushlar izofluran bilan chuqur xiralashgan va 100 ml PBS bilan perfuz qilinadi va keyin 400 ml 4% paraformaldehid (PFA). Brainlar PFAda 2 soatdan keyin o'rnatildi va 30-4 kun davomida 2 ° S da 3% sukroz eritmasiga o'tdi. Badanlar quruq muz ustida muzlatilgan va kesishgunga qadar -80 ° C da saqlangan. Koronali qismlar Bregma 40 va -2.5 (o'rtasida) o'rtasida 0.5 mkm qalinlikda kesilganPaxinos va Watson, 1998).

Bo'limlar Fos va Arc uchun immünolojikleştirildi. Qisqacha aytganda, bo'limlar uch marta Tris-tamponli sho'r suvda (TBS) yuvilgan va 30% Triton X-0.2 bilan TBSda 100 min oraliqda o'tkazildi. Bo'limlar yana TBSda yuvilgan va 0.3% Triton X-100 bilan PBS ichida seyreltilmiş va 24 ° C'de 4 soatda shakar ustida birlamchi antikorlar inkübe qilingan. Biz c-Fos antikoriga qarshi quyon poliklonalini (1: 500 diluatsiyasi, Cat # sc-52, Santa Cruz Biotexnologiya, Santa Cruz, KA) va sichqonchani monoklonal arc antibody (1: 100 dilution, Cat # sc-17839, Santa Cruz biotexnologiyasi). Bo'limlar TBSda uch marta yuvilgan va PBS ichida seyreltilmiş sekonder antikorlarda 1.5 soat davomida xona haroratida bir çalkalayıcı ustida inkübe qilingan. Biz Alexa Fluor 488-belgili eshak piyodalarga qarshi quyon antikoridan (1: 200 dilution, Cat # A21206, Invitrogen) va Alexa Fluor 568-etiketli echki anti-sichqonchani antikor (1: 200 dilution, Cat # A11004, Invitrogen). Bo'limlar TBS-da yuvilgan, xrom-alum bilan qoplangan slaydlarga o'rnatilgan va VectaShield qattiq o'rnatish vositasi bilan qoplangan.

Zeiss Axioskop 2.0 mikroskopiga biriktirilgan CCD kamera (Coolsnap Photometrics, Roper Scientific Inc., Trenton, NJ) yordamida kaudat-pitamen va NAc (taxminan 2 mm oldida Bregma) da Fos va arx immunoreaktivligi fotosuratlari qo'lga kiritildi. Belgilangan hujayralarni hisoblash uchun rasmlar 200x kattalashtirishda olingan; Fos va arc kolokalizatsiyasini aniqlash uchun tasvirlar 400x kattaligida olingan. Issiq boshiga to'rtta yarim sharning yoritilgan xujayralari avtomatik ravishda Macintosh uchun IPLab dasturidan, 3.9.4 versiya r5 (Scanalytics, Inc., Fairfax, VA) uchun ishlatilgan. Har bir to'rtburchakning har biri uchun bitta qiymatni olish uchun o'rtacha to'rtta yarim sharning soni hisobga olingan.

Ma'lumotlarni tahlil qilish

Lokomotorlarni sezgirlash to'g'risidagi ma'lumotlar bir tomonlama ANOVA yordamida tahlil qilindi, 4 ta in'ektsiya kuni davomida vaqtning asosiy ta'siri uchun takroriy choralar. Statistik ahamiyatga p <0.05 darajasida o'rnatildi. Mikroarray ma'lumotlari SAS JMP 6.0-ga asoslangan elektron jadvalga asoslangan DIANE 7.0 dasturida tahlil qilingan,Garg va uning hamkorlari, 2009). Mikroorrayslardan olinadigan floresans zichligi ma'lumotlarini aniqlash orqali filtrlash ishlari olib borildi pqiymatlari va Z normallashtirish. Sampling sifati scatterplots, asosiy komponentlarni tahlil qilish va gen namunasi yordamida tahlil qilindi Z- mumkin bo'lgan chegaralarni istisno qilish uchun ballar asosida ierarxik klasterlash. Keyinchalik har bir taqqoslash guruhida katta farqlarga ega genlarni yo'q qilish uchun ANOVA testlaridan foydalanildi. Genlar, agar p <0.01, mutlaq bo'lsa, differentsial tarzda ifodalangan Z-ratio ≥ 1.5 va kashfiyotning noto'g'ri nisbati (fdr) <0.07. QPCR ma'lumotlari uchun har bir gen uchun ma'lumotlarni taqqoslash uchun bir tomonlama ANOVA ishlatilgan. Statistik ahamiyatga p <0.05 darajasida o'rnatildi. Fos va Arc immunohistokimyosi uchun statistik ahamiyatni hisoblash uchun teng bo'lmagan dispersiyani qabul qilgan t-testidan foydalanilgan, p <0.05.

Natijalar

kfos-lacZ transgenik faralari

The cfos-lacZ Ushbu farelerde transgene, bir c-fos shunga o'xshash endojenli promoter c-fos gen va shunga o'xshab, xuddi shu tarzda, yuqori darajadagi eksitatori sinaptik kiritish orqaliShin va boshq., 1990; Labiner va uning hamkorlari, 1993; Sgambato va boshq., 1997). Ushbu protein mahsuloti cfos-lacZ transgene, b-galaktosidaza (bgal), kuchli faollashtirilgan neyronlarda c-Fos bilan birgalikda ifodalanadi (Koya va boshq., 2009) va FACSni tozalash jarayonida faollashtirilgan striatal neyronlarni belgilashda foydalanilgan.

FACS aktiv aktiv striatal neyronlarni bitta suyuq kokaina in'ektsiyasidan keyin tozalash

Barcha striata olingan cfos-lacZ 90 daqiqadan so'ng, 30 mg / kg kokain yoki fiziologik in'ektsiyani o'zlarining uy qafasidan tashqarida kuzatib borishadi. Shu tarzda davolangan kalamushlardan ajratilgan striatal hujayralar keyingi mikroarrayada va nicel PCR (qPCR) tahlillarida biologik replikatsiyalarning har biri uchun FACS tozalashidan oldin to'plandi. Dissociated striatal hujayralar dastlab, ularning oldinga va yon nur-sochib turadigan xususiyatlariga ko'ra tahlil qilindi [Shakl 1a]. NeuN-etiketli neyronlarning aksariyati hodisaning pastki qismida sodir bo'lgan voqealar zonasida topilgan. Shunday qilib, barcha keyingi tahlillar faqatgina ushbu chiziq ichida topilgan voqealarni qamrab oladigan bo'ldi.

Shakl 1 

Flokansa faollashtirilgan hujayralarni hujayralardagi bqal-etiketli neyronlarning saralanishi, bitta kokain

Ushbu darvoza ichidagi hujayralar neuronal marker NeuN va nektial faollashtiruvchi marka bqgal bilan immüno-etiketlash darajasiga ko'ra ajratildi. Kokainga kiritilgan kalamushlardan olinadigan to'qimalarda taxminan 15% NeuN-belgilangan neyronlar yuqori darajada bbq [Shakl 1b], bu taxminan 100,000ga -ga belgilangan. Barcha bqal-etiketli hujayralar NeuN ni ifodalaydi, bu faqatgina neyronlarning bqalni ifodalaganini ko'rsatadi. Aksincha, sho'rlangan aorta orqali olingan NeuN-etiketli neyronlarning juda kam miqdori, bqal yoki Fos faollashtiruvchi markerlarni ifodalaydi, bu esa kqainga qarshi sichqonlarda neytral faollashuv belgisi sifatida bqal va Fos immunoreaktivligini qo'llab-quvvatlaydi. Shilin bilan kiritilgan ratlardagi bqal-ifodalangan neyronlarning past soni keyingi molekulyar analiz uchun etarli hujayralarni ta'minlamagan. Shunday qilib, neyronal neyronal bo'lmagan hujayralardan sho'rlangan aorta orqali yuborilgan striatal to'qima bilan keyingi barcha tajribalarda neyronalni ajratish uchun faqat NeuN-etiketkadan foydalanganmiz. Umuman olganda, barcha striatal hujayralardagi taxminan 30% ni NeuN-musbat, bu esa har bir rat uchun taxminan 600,000 striatal neyronga to'g'ri keladi. FACS bilan tozalangan hujayralar flüoresans mikroskopi bilan tekshirilganda, barcha hujayralar yumaloq va jarayonlardan mahrum bo'lgan [Shakl 2]. Mikroskopik kuzatish FACS bo'yicha saralangan hujayralar NeuN− va βgal-immunoreaktivlik uchun mos ravishda etiketlanganligini tasdiqladi. FACS bilan tozalangan hujayralar namunalari oqim sitometriyasining ikkinchi davri bilan baholanganda> 90% toza ekanligi aniqlandi (ma'lumotlar ko'rsatilmagan).

Shakl 2 

FACS-tozalangan hujayralar va binoning mikroskop fotosuratlari

FACS bilan tozalangan hujayralarni genetik ifodalash modellarini tahlil qilish uchun FACSni tozalash jarayonining tanlanganligini mikroarray bilan aniqladik. Biz bbq-pozitiv va bgal-negativ neyronlarda gen ekspresyonini kokain-in'ektsion kalamushlardan, shuningdek, sho'rlangan achitqilarning NeuN-positive va NeuN-negative hujayralaridan solishtirdik. Asosiy komponentlar va klaster tahlillari asosiy farqlovchi omil hujayralar nöron yoki glia [Shakl 3a]. Ikkinchi farqlovchi omil aktivatsiyalangan neyronlardan ajratish uchun ishlatiladigan βgal ekspressioni edi. Genlar, agar p <0.01, mutlaq bo'lsa, differentsial tarzda ifodalangan Z-ratio ≥ 1.5 va kashfiyotning noto'g'ri nisbati (fdr) <0.07. Βgal-musbat neyronlarda kokain bilan yuborilgan kalamushlarning bir xil striatal to'qimasidan olingan βgal-salbiy neyronlarga nisbatan 125 gen ko'paygan va 467 gen kamayganligini aniqladik.Shakl 3b]. Kokain bilan yuborilgan kalamushlardan bir xil βgal-musbat neyronlar sho'rlangan AOK qilingan kalamushlardan olingan NeuN bilan belgilangan barcha neyronlarning nazorat namunalari bilan taqqoslaganda, 133 gen ko'paygan va βgal-musbat neyronlarda 890 gen kamaygan. Ayniqsa, ikkita nazorat guruhi - kokain bilan yuborilgan kalamushlardan qalg-negativ neyronlar va sho'rlangan AOK qilingan kalamushlardan olingan barcha NeuN-etiketli neyronlar - juda o'xshash gen ekspression naqshlari; gen ekspressioni ushbu nazorat guruhlari o'rtasida sezilarli farq qilmadi [Shakl 3b].

Shakl 3 

Kokain yoki sho'r suvni bir marta yuborishdan keyin, rat striatiga qarab ajratilgan hujayralarni mikroarray tahlil qilish

Turli xil namuna guruhlarida topilgan maxsus genlar aktivizatsiya qilinmagan neyronlardan faollashtirilganligini va FACS yordamida neyronal bo'lmagan hujayralardagi neyronlarning ajratilishini tasdiqladi [2 stol]. kokainga kiritilgan kalamushlardan olingan bqal-musbat neyronlar bir xil kokain-in'ektsion kalamushlardan olingan bqal-negativ neyronlarga nisbatan ko'plab neyron faollashtiruvchi marker genlarni yoki sho'rlangan achitqilarning barcha NeuN-etiketli neyronlari [Shakl 3c]. Ushbu faoliyat marker genlari tarkibiga kiritildi c-fos, junB, boshq, egr oila (1, 2, 4) va boshqalar nr4a3 (Guzovski va boshq., 2005). Qizig'i shundaki, bu bgal-musbat neyronlar D1 dopamin retseptorlari hujayra tipidagi o'ziga xos marker prodynorphin geni va D2 dopamin retseptorlari genining sezilarli darajada past darajalarini sezilarli ravishda yuqori darajada ifoda etgan.

2 stol 

O'tkir giyoh eksperimentidan mikroarray va qPCR ma'lumotlarining qisqacha mazmuni.

Microarray gen ekspresyon ma'lumoti qPCR yordamida tasdiqlangan. Faoliyat belgisi genlari fosB, boshqva nr4a3 giyohvand moddalar bilan qo'shib yuborilgan ratlarning bqal-pozitif nöronlannın yuqori darajalarida, xuddi shu kokain-qarshi sıçanlardan kelgan bqal-negatif nöronlara va sho'rlangan AOK qilingan sıçanlardan barcha nöronlara nisbatan [Shakl 4a; ma'lumotlar va statistik ma'lumotlar 2 stol]. bqal-musbat neyronlar prodynorphin genining yuqori darajasini ham ifoda etdi [Shakl 4b]. Vaginal pozitiv neyronlar A2A adenosin retseptorlari, jumladan KX3.1 kaliy kanali va map2k6 / MEKK6 genlari, faqat Kv3.1 va map2k6 / MEKK6 ekspiratatsiyasi darajalari qPCRdan farqli ravishda statistikaga xilma-xil bo'lib,Shakl 4c]. Umuman, qPCR bilan baholangan gen ekspresyon o'zgarishi, mikroarray tajribalari bilan baholangan gen ekspresyonu o'zgarishlar bilan deyarli bir xil edi.

Shakl 4 

Kantitativ PCR xuddi shu kalamushlardan olingan bgal-salbiy neyronlarga yoki sho'rlangan AOK qilingan kalamushlardan olingan barcha neyronlarga nisbatan baqal-pozitiv neyronlarning aktiv kokain in'ektsiyasidan keyin boshqa gen ekspression profilini namoyish etadi

Aktiv neyronlarning mRNA o'zgarishlarini oqsil darajasida aks ettiruvchi yoki yo'qligini aniqlash uchun koronal miya qismlarini kokain va sho'r-achitqili yovvoyi turdagi ayol sichqonlaridan immunohistokimyoviy tahlilni qo'lladik [Shakl 5]. Ushbu bo'limlar dissotsiatsiya yoki FACSdan o'tmadi va shuning uchun immunohistokimyoviy tahlil FACS protsedurasida topilgan hujayra ayrışmasından ta'sirlanmadi. Kokainga qarshi sichqonlardan ventral striatumda [Shakl 5aNosiral faollik belgilari Fos va arc bir xil hujayralarda birgalikda ifodalangan: barcha Fos-musbat hujayralarning 85 ± 4%, Arc-musbat, barcha Arc-musbat hujayralarida esa 82 ± 3% Fos-pozitif bo'lgan. Kokaina in'ektsiyalari Fos-etiketli neyronlarning 2.7-marta ko'payishi va Arc-neyron neyronlaridagi 2.7-marta kattalashgan. Kokainga qarshi sichqonlardan dorsal striatumda [Shakl 5b], Barcha Fos-musbat hujayralarning 80 ± 2%, Arc-musbat, barcha Arc-musbat hujayralarida esa 86 ± 3% Fos-pozitif bo'lgan. Kokaina in'ektsiyalari Fos-etiketli neyronlarning 4.4-marta ko'payishi va Arc-neyron neyronlaridagi 3.8-marta kattalashgan.

Shakl 5 

Fos va arc (a) ventral striatum va (b) dorsal striatumda bir marta kokainga

FACS faollashgan striatal neyronlarni kokain-sezgirlashgan kalamushlardan tozalash

Ikkinchi FACS eksperimentida barcha kalamushlar takrorlangan kokain inyeksionlari bilan sezgirlangan. Lokomotor qutidagi takrorlangan giyoh qo'llanishi rivojlangan kokain bilan bog'liq lokomotiv: 7 kunidagi lokomotiv 180 lokomotivining 18 ± 1% (4 takrorlanadigan inyeksiya orqali vaqtning asosiy ta'siri, F3, 363 = 24.9, p <0.001), bu sezilarli psixomotor sezgirlikni ko'rsatdi. Etti kundan so'ng, sinov kunida, xuddi shu harakatlantiruvchi qutidagi kalamushlarga kokain yoki fiziologik eritma yuborildi. To'qson daqiqadan so'ng, NAc, shu jumladan striatal to'qima chiqarildi va hujayralar yuqorida tavsiflangan protsedura yordamida FACS bilan tozalandi.

O'tgan eksperimentdagi kabi bir xil yorug'lik bo'ylab chizilgan chiziqlardagi hujayralar neuronal marker NeuN va nektural faollashtiruvchi marka bqgal bilan immüno-plastinka darajasiga ko'ra ajratildi. Kokainga kiritilgan kalamushlardan olinadigan to'qimalarda taxminan 10% NeuN-belgilangan neyronlar yuqori darajada bbq [Shakl 6], bu taxminan 60,000ga -ga belgilangan. Barcha bqal-etiketli hujayralar NeuN ni ifodalaydi, bu faqatgina neyronlarning bqalni ifodalaganini ko'rsatadi. Shunga qaramay, sinov kuni bilan sho'r suv bilan yuborilgan kalamushlardan olingan to'qima juda kam miqdordagi bgal yoki Fos-ekspress neyronlarni ishlab chiqardi va natijada keyingi molekulyar analizlar uchun etarli hujayralar mavjud emas edi. Shuning uchun, neuronalni sho'rlangan in'ektsion kalamushlardan olingan neuronal bo'lmagan hujayralardan ajratish uchun faqat NeuN-markalashdan foydalanganmiz. Sho'rlangan erituvchilarning barcha hujayralarining taxminan 30% -i NeuN-ijobiy bo'lgan, bu tajribada taxminan 400,000 striatal neyronlarga to'g'ri keladi.

Shakl 6 

Flokansa faollashtirilgan hujayrali hujayralarni xujayralangan neyronlarning bqal-etiketli neyronlari sortirovkasi 7 kundan takrorlangan kokainni davolashdan keyin kokain bilan shikastlangan

Biz kPCain yuborilgan kalamushlardan gal-musbat va gal-manfiy neyronlarda, shuningdek kokain sensibilizatsiyasidan so'ng sho'rlangan AOK qilingan kalamushlarning barcha NeuN-musbat neyronlarida gen ekspressionini solishtirish uchun qPCR dan foydalanganmiz. Kokain bilan yuborilgan kalamushlardan qalg-musbat neyronlar uchta asabiy faollik marker genining yuqori darajasini ko'rsatdi - fosB, boshqva nr4a3- xuddi shu kokain bilan yuborilgan kalamushlardan gal-manfiy neyronlarga va sho'rlangan AOK qilingan kalamushlardan barcha neyronlarga bog'liq [Shakl 7a; ma'lumotlar va statistik ma'lumotlar 3 stol]. bqal-musbat neyronlar, shuningdek bitta kokainga qarshi tajribasida shunga o'xshash prodynorphin genining yuqori darajasini ifoda etdi [Shakl 7b]. Aksincha, bqal-musbat neyronlar bir nechta genlar uchun past darajadagi ifodalar [Shakl 7c], shu jumladan Drd2 D2 dopamin retseptorini kodlash va Map2k6 p38 MAPKni faollashtiradigan kinazni kodlash, xuddi bir aktiv kokain qarshi tajribasiga o'xshash. Natijada, bqal-pozitiv neyronlar ekspansionatsiya darajasini oshirdilar dusp1, Shuningdek, mkp1 [Shakl 7c], bu p38 MAPK ni inaktiv qiluvchi fosfatazni kodlaydi (Sgambato va boshq., 1998).

Shakl 7 

Kantitativ PCR xuddi shu kalamushlardan olingan bgal-negativ neyronlarga yoki neyronlarning sho'rlangan-shikastlangan kalamushlardan farqli o'laroq, sezgirlangan kokain-ixtiyoriy ratlardan bqal-musbat neyronlarda turli xil gen ekspression profilini namoyish etadi
3 stol 

Takrorlangan kokain tajribasidan qPCR ma'lumotlarining qisqacha tavsifi.

Aktiv neyronlarning mRNA o'zgarishlarini oqsil darajasida aks ettiradimi yoki yo'qligini aniqlash uchun testdan o'tgan kunlarda koronali miya qismlarini kokain yoki sho'rlangan in'ektsiyalardan so'ng yovvoyi turdagi giyoh-sensitize qilingan ayol sichqonlardan immünohistokimyoviy tahlilni qo'lladik. Kokainga kiritilgan kalamushlardan olingan ventral striatumda Fos va arc neytral faollik belgilari bir xil hujayralar bilan birgalikda ifodalangan: Barcha Fos-musbat hujayralardagi 90 ± 2%, Arc-musbat, va barcha Arc-musbatlarining 83 ± 2% hujayralar Fos-ijobiy edi. Qo'qonli test inyeksionlari Fos-etiketli neyronlarning 2.3-marta ko'payishi va Arc-neyron neyronlaridagi 2.2-qavatga ko'paygan. Kokainga kiritilgan kalamushlardan olingan dorsal striatumda barcha Fos-musbat hujayralarning 93 ± 2% lari Arc-positive, va barcha Arc-musbat hujayralaridan 90 ± 3% Fos-pozitif bo'lgan. Qo'qonli test inyeksionlari Fos-etiketli neyronlarning 4.4-marta ko'payishi va Arc-neyron neyronlaridagi 4.5-qavatga ko'paygan. Shunday qilib, juda kam bo'lmagan Fos-etiketli hujayralar Arc va kam bo'lmagan arka-belgisi bo'lmagan hujayralar, saralangan hujayralardagi topilmalarimizni qo'llab-quvvatlaydigan Fos ifodasini ifodaladi.

Munozara

Biz kokain bilan indikator lokomotor faoliyat davomida faqat avvalgi aktivizatsiya holati bilan aniqlangan neyronlar ichidagi molekulyar o'zgarishlarni tozalash va baholash uchun protsedura ishlab chiqdik. Mikroto'lqinlar, qPCR va immunohistokimyodan olingan tajribalar mustaqil ravishda FACS protsedurasi tomonidan aniqlanganidek, faol neyronlar ichidagi noyob molekulyar o'zgarishlarni aniqladi c-fos bqq ifodasining promoteri indüksiyonu. Ushbu protseduradan foydalanadigan asosiy biologik topilma, darhol erta genlar (IEG) faqatgina faollashtirilgan neyronlarda, IEG ekspresyon esa neyronlarning faol bo'lmagan ko'pchiligida o'zgarmagan yoki hatto kamaygan. Ushbu IEG neytral faoliyat belgilarining ko'pchiligi transkriptsiya omillari bo'lgani sababli, ushbu aktiv neyronlar ichida turli xil genin ifodalarini shakllantiradi, bu kokainning fiziologik va xatti-harakatlariga hissa qo'shishi mumkin (masalan,Curran va Franza, 1988; Nestler va boshq., 1993; McClung va uning hamkorlari, 2004; Loebrix va Nedivi, 2009).

Aktiv va faol bo'lmagan neyronlar orasidagi farqli IEG induksiyasi kokain bilan bog'liq lokomulyatsiya paytida faqatgina oz sonli neyronlar faollashtirilganligi haqidagi farazni qo'llab-quvvatlaydi, holbuki aksariyat nöronlar juda kam darajada faollashadi yoki umuman yo'q. Yovvoyi tipli kalamushlarda elektrofizyologik tajribalar Fos proteinining ekspiratsiyaning yuqori darajali eksitatori sinaptik kiritish bilanShin va boshq., 1990; Labiner va uning hamkorlari, 1993; Sgambato va boshq., 1997). Fos va bqalning ifodasi xuddi shu neyronlarda regulyatsiya qilinganligini bilamiz cfos-lacZ kalamushlar (Koya va boshq., 2009). Shunday qilib, faqat kichik sonli striatal neyronlarda bqal va IEG ekspresyonunun ortishi striatal neyronların ozchilikni, giyoh ilovasiga javob sifatida yuqori darajada eksitatör sinaptik kiritish ega ekanligini ko'rsatadi.

Striatal neyronlarning alohida-alohida faollashuvi dopaminning striatal neyronal ta'sirga qarshi ta'sirini tavsiflaydigan yuqoridagi shtat-gipotezasi gipotezasi bilan mos keladi. Kokainga bog'liq dopamin yuqori faollik va past faoliyat neyronlari orasidagi farqni kuchaytiradi, chunki u yuqori faollik holatida bo'lgan neyronlarning davom etadigan elektrofizyologik faolligini kuchaytiradi, shu bilan birga ko'p sonli neyronlarning past samaradorligi (Wilson va Kawaguchi, 1996; Hernandez-Lopez va boshq., 1997; Nikola va boshq., 2000; O'Donnell, 2003; Nikola va boshq., 2004). Signalning shovqin nisbati natijasida yuzaga keladigan o'sish nafaqat aktiv signalizatsiya paytida tanlanganlikni kuchaytiradi, balki bizning ishimizda taklif etilganidek, noyob molekulyar neyroxoddeptsiyalarni faqat yuqori faollikdagi neyronlarda indüksiyalashga yordam berishi mumkin. Shu bilan birga, ko'plab striatal neyronlarni kokainga kiritilgan kalamushlardan hosil qiladigan bgal-negativ neyronlarning gen ekspozitsiyasi sho'r-achitilgan kalamushlardan striatal neyronlarda gen ekspresyonidan farq qilmaydi; bu striatal neyronlarning aksariyati kokainga ta'sir qilish vaqtida pastdagi holatida qoladigan farazni qo'llab-quvvatlaydi.

P38 Map kinaz signalizatsiyasi yo'llarining komponentlari ham faollashtirilgan va faol bo'lmagan neyronlar o'rtasida farqli ravishda o'zgartirilgan. P2ni faollashtiradigan kinazning Map6k6 / MEKK38 ning gen ekspressioni Mkp1 / Dusp1 ning gen ekspressioni, p38ni (pXNUMXni inaktiv qiluvchi fosfataz)Sgambato va boshq., 1998), faollashtirilgan neyronlarda ko'paygan, ammo faol bo'lmagan neonlarda emas edi. Shunday qilib, umumiy p38 MAPK signalizatsiyasi, sinaptik plastisitada (masalan,Bolshakov va boshq., 2000; Izumi va boshq., 2008) faollashtirilgan neyronlarda neyronlarning faol bo'lmagan ko'pligiga nisbatan zaiflashishi mumkin.

FACS shuningdek, aktiv yoki takrorlangan giyoh ta'siridan keyin faollashtirilgan neyronal turlarni aniqlashga yordam berishi mumkin. Aktiv neyronlarda D1 neyronal marker gen prodinorfinining yuksak ifodasi topildi va faollashtirilgan neyronlarda D2 nöronal marker genlari D2 dopamin retseptorlari va A2A adenosin retseptorlarining pastki ifodasi topildi. Bu esa, Fos'un D1 striatal nöronlarda birinchi navbatda indüklendiğini ko'rsatadi. Bu esa, Fos indüksiyonunun primer sifatida D1 nöronlarında hisobot qilingan psikostimülan enjeksiyonlardan so'ng, ko'p immunohistokimyasal tadqiq uy qafasi (Berretta va boshq., 1992; Cenci va boshq., 1992), bu psixostimulyant inyeksiyalardan keyin topilgan D1 va D2 neyronlarining teng ravishda faollashuviga qarama-qarshidir. yangi muhit sichqonchaning uy qafasidan tashqaridaJaber va boshq., 1995; Badiani va boshq., 1999; Hope va boshq., 2006).

Biz ilgari ta'rif etilgan Daun02 inaktivatsiya protsedurasida foydalanilganimizdek FACS davomida faollashtirilgan neyronlarni aniqlash uchun bir xil bqal markerini ishlatganimizdan (Koya va boshq., 2009), biz kokainga bog'liq lokomotivning tarkibiy o'ziga xosligini sezgirlash uchun o'rganilgan komponent uchun zarur bo'lgan neyronal guruhlar ichidagi noyob molekulyar o'zgarishni kuzatishimiz mumkin. Biz ilgari ma'lum bo'ldiki, noaniq tarqalgan neyronlarning kam sonli qismi noaniq ansambl ichidagi kontekstga xos kokainga psixomotor sezuvchanlikni (masalan,Koya va boshq., 2009). Ushbu topilma xuddi shu ayol yordamida takrorlandi cfos-lacZ Ushbu ishda ishlatiladigan kalamush va sezuvchanlik rejimi [http://irp.drugabuse.gov]. Ushbu neyronlar barcha ogohlantirishlarga tabiiy ravishda sezgir bo'lmaydilar, chunki giyohvand moddalar kiritilgan muhit yoki kontekst kokain in'ektsiyasidan so'ng turli xil striatal neyronlarni faollashtiradi (Mattson va boshq., 2008; Koya va boshq., 2009). Muayyan striatal neyronal ansamblni tanlash birinchi navbatda kortikal va subkortikal glutamatergik eferentlardan faoliyat turiga bog'liq (Pennartz va boshq., 1994; O'Donnell, 2003), va bu kirib, o'zini tutish davomida mavjud bo'lgan muayyan ekologik va interoseptiv stimullar bilan belgilanadi. Ushbu oldingi ishimizdan va biz hozirgi ma'lumotlardan tashqari, biz sezgirlik rejimi davomida ekologik ogohlantirishlar bilan takroriy kokain juftligini bir necha marta faollashtirilgan neyronal ansambllar ichida noyob molekulyar o'zgarishlar hosil qiladi, bu kontekstga xos sezgirlikni asoslagan o'rgangan uyushmalarga yordam berishi mumkin.

Umuman olganda, aktiv kokainga bog'liq lokomotor faoliyat va takrorlangan kokain ta'siridagi lokomotor sezuvchanlik davrida kattalar neyronlarini tanlab faollashtiradigan FACS ning yangi ilovasini namoyish qildik. Ushbu yondashuv, shuningdek, noto'g'ri ishlatilgan dorilarning va boshqa o'rganilgan xatti-harakatlarni kodlovchi neyronal guruhlardagi noyob molekulyar neyrokodaptitlarni aniqlash uchun ham foydalanish mumkinligini taklif qilamiz. Neytral plastinkada va xulq-atvorda ushbu noyob molekulyar neyroxoddeptsiyalarning nedensel rollari oxir-oqibat faqat aktifleştirilmiş nöronlarda gen ekspresyonunu manipüle qilish orqali tekshirilishi kerak; Biroq, bu usul hali ishlab chiqilmagan.

rahmat

Tadqiqot Narkotik moddalarni suiiste'mol qilish milliy institutining "Intramural Research" dasturi tomonidan qo'llab-quvvatlandi. D. Guez-Barber NIH MSTP TG 5T32GM07205, Narkotik moddalarni suiiste'mol qilish milliy institutining F30DA024931 mukofoti va Yale universiteti Psixiatriya kafedrasi Charles BG Murphy tomonidan qo'llab-quvvatlandi. FACS bilan o'zining ajoyib texnik yordami uchun Jo Chrestga va mikrizoda ishlashlari uchun Chris Cheadle, Tonya Uotkins va Alan Bergerga minnatdorchilik bildiramiz. Qo'lyozma haqida foydali fikrlar uchun Yavin Shohinga minnatdorchilik bildiramiz.

Izohlar

 

Ushbu maqolaning mualliflari uchun hech qanday nizolar yo'q.

Manbalar

  1. Badiani A, Oates MM, Day HE, Watson SJ, Akil H, Robinzon T. D1da D2 striatal neyronlarga qarshi amfetamin bilan indikatsiyalangan c-fos ifloslanishining ekologik modulatsiyasi. Behav Brain Res. 1999; 103: 203-209. [PubMed]
  2. Berretta S, Robertson HA, Graybiel AM. Dopamin va glutamat agonistlari striatumdagi Fos-o'xshash oqsilning neyronga xos ekspresasini rag'batlantiradilar. J Neurophysiol. 1992; 68: 767-777. [PubMed]
  3. Bolshakov VY, Karboni L, Cobb MH, Siegelbaum SA, Belardetti F. Dual Map kinaz yo'llari CA3-CA1 sinapslarida uzoq muddatli plastisitik qarama-qarshi vositalar vositalaridir. Nat Neurosci. 2000; 3: 1107-1112. [PubMed]
  4. Budda MS, Chen BT, Bonci A. AMPA retseptorlari sinoptik plastisitiv: psevdostimulyatorlarni keltirib chiqaradi: o'tmish, hozirgi va terapevtik kelajak. Neyron. 2010; 67: 11-24. [PMC bepul maqola] [PubMed]
  5. Cenci MA, Kempbell K, Viktorin K, Bjorklund A. Striatal c-fos Kokin yoki apomorfin tomonidan indüksiyon, chiqadigan neyronlarda, sutda Subra-nigra Nigra uchun loyihalashtiriladi. Eur J Neurosci. 1992; 4: 376-380. [PubMed]
  6. Curran T, Franza BR, Jr Fos va Jun: AP-1 aloqasi. Hujayra. 1988; 55: 395-397. [PubMed]
  7. CNS joylashgan hujayralar tomonidan GGS, Nichols JR, Esen N, Liu S, Phulwani NK, Syed MM, Wood WH, Zhang Y, Becker KG, Aldrich A, Kielian T. MyD88 ifodasi miya xo'ppozlarida himoya immunitetni keltirib chiqarish uchun muhimdir. ASN Neuro. 2009: 1. [PMC bepul maqola] [PubMed]
  8. Gerfen CR, Keefe KA, Gauda EB. D1 va D2 dopamin retseptorlari funktsiyasi: D1 va D2-dopamin retseptorlarini neyronlarning alohida populyatsiyalariga biriktirish natijasida D1 o'z ichiga olgan neyronlarda erta gen ta'sirini kuchaytiradi. J Neurosci. 1995; 15: 8167-8176. [PubMed]
  9. Guzovski JF, Timlin JA, Roysam B, McNoaton BL, Worley PF, Barnes KA Zudlik bilan erta gen ifodasi bilan xulq-atvori bilan bog'liq neyron davrlarini xaritalash. Curr Opin Neurobiol. 2005; 15: 599-606. [PubMed]
  10. Hernandez-Lopez S, Bargas J, Surmeier DJ, Reyes A, Galarraga E. D1 retseptorlari faollashuvi L-turi Ca2 + o'tkazuvchanligini modulyatsiya qilish yo'li bilan neostriatal vosita o'mrovli neyronlarda uyg'otilgan deşarjni kuchaytiradi. J Neurosci. 1997; 17: 3334-3342. [PubMed]
  11. Hope B, Simmons D, Mitchell T, Kreuter J, Mattson B. Yadro akumbenslaridagi kokain ta'siridagi lokomotor harakatlar va Fos ifodasi uy qafasi tashqarisida takrorlangan kokainga administratsiyadan so'ng 6 oy davomida sezuvchanlikka ega. Eur J Neurosci. 2006; 24: 867-875. [PubMed]
  12. Izumi Y, Tokuda K, Zorumski CF. Past darajadagi N-metil-D-aspartat retseptorlari faollashuvi bilan uzoq muddatli potentsializatsiyani inhibe qilish kalsineyrin, nitrat oksidi va p38 mitojen bilan faollashtirilgan protein kinazni o'z ichiga oladi. Hippokampus. 2008; 18: 258-265. [PubMed]
  13. Jaber M, Cador M, Dumartin B, Normand E, Stinus L, Bloch B. O'tkir va surunkali amfetaminli davolanishlar rat striatal neyronlarda nevropeptid xabarchi RNK darajasini va Fos immunoreaktivligini boshqacha tartibga soladi. NEUROSCIENCE. 1995; 65: 1041-1050. [PubMed]
  14. Kalivas PW. Narkomaniyaning glutamat gomeostazi gipotezasi. Nat Rev Neurosci. 2009; 10: 561-572. [PubMed]
  15. Kasof GM, Mahanti NK, Pozzo Miller LD, Curran T, Connor JA, Morgan JI. Spontan va uyarilgan glutamat signalizatsiyasi transgenik kalamushlardan olingan hipokampal tilim madaniyatlarida Fos-lacZ ekspressini va piramidal hujayra o'limiga ta'sir qiladi. Brain Res Mol Brain Res. 1995; 34: 197-208. [PubMed]
  16. Koya E, Golden S, Harvey B, Guez-Barber D, Berkow A, Simmons D, Bossert J, Nair S, Uejima J, Marin M, Mitchell T, Farxuar D, Gosh S, Mattson B, Umid B. kokain bilan faollashtirilgan yadro akumbens neyronlari kontekstga xos sezuvchanlikni oldini oladi. Nat Neurosci. 2009; 12: 1069-U1152. [PMC bepul maqola] [PubMed]
  17. Kwon B, Houpt TA. C-Fosga xos neyronlarda gen ekspresyonini tahlil qilish uchun lazerli mikdisseksiya va X-Gal histologiyasining birlashtirilgan usuli. J Neurosci usullari. 2010; 186: 155-164. [PMC bepul maqola] [PubMed]
  18. Labiner DM, Butler LS, Cao Z, Xosford DA, Shin S, McNamara JO. Yonayotgan seizlar bilan c-fos mRNA indüksiyasini: neyronal portlashlar bilan murakkab aloqalar. J Neurosci. 1993; 13: 744-751. [PubMed]
  19. Liberles SD, Buck LB. Olfaktor epiteliyada kimyoviy emissiya retseptorlari ikkinchi klassi. Tabiat. 2006; 442: 645-650. [PubMed]
  20. Lobo MK, Karsten SL, Grey M, Geschwind DH, Yang XW. Yosh va kattalar sichqonchani miyalarida striatal proektsion neyron subtipalarini FACS-array profilini yaratish. Nat Neurosci. 2006; 9: 443-452. [PubMed]
  21. Loebrich S, Nedivi E. Nerv tizimidagi faoliyatni boshqaradigan genlar funksiyasi. Physiol Rev. 2009; 89: 1079-1103. [PMC bepul maqola] [PubMed]
  22. Mattson B, Koya E, Simmons D, Mitchell T, Berkow A, Crombag H, Hope B. Sichqon nukleusidagi akumbenslarda kokain bilan indikator lokomotor faoliyat va kontaktli neyronal ansambllarning kontekstga xos sezuvchanligi. Eur J Neurosci. 2008; 27: 202-212. [PubMed]
  23. McClung CA, Ulery PG, Perrotti LI, Zachariou V, Berton O, Nestler EJ. DeltaFosB: miyada uzoq muddatli moslashish uchun molekulyar kalit. Brain Res Mol Brain Res. 2004; 132: 146-154. [PubMed]
  24. Nestler E, Hope B, Vidnell K. Giyohvandlik - asab plastisiyasining molekulyar asoslari uchun model. Neyron. 1993; 11: 995-1006. [PubMed]
  25. Nestler EJ. Narkomaniyaga asoslangan uzoq muddatli plastisiyaning molekulyar asoslari. Nat Rev Neurosci. 2001; 2: 119-128. [PubMed]
  26. Nikola SM, Surmeier J, Malenka RC. Striatum va nukleus akumbenslarida neyronal eksitativlikning dopaminerjik modulyatsiyasi. Annu Rev Neurosci. 2000; 23: 185-215. [PubMed]
  27. Nikola SM, Hopf FW, Hjelmstad GO. Kontrastni kuchaytirish: striatal dopaminning fiziologik ta'siri. Hujayra to'qimalarining quduqlari. 2004; 318: 93-106. [PubMed]
  28. O'Donnell P. Dopaminning oldingi neyron ansambllari. Eur J Neurosci. 2003; 17: 429-435. [PubMed]
  29. Paxinos G, Watson S. Stereotaksik koordinatlardagi rat miyasi. 4. San-Diyego: Academic Press; 1998.
  30. Pennartz CM, Groenewegen HJ, Lopes da Silva FH. Nukleus funktsional jihatdan turli xil neyronal ansambllar majmuasi sifatida quyidagilarni bajaradi: xulq-atvor, elektrofizyologik va anatomik ma'lumotlarning integratsiyasi. Prog Neurobiol. 1994; 42: 719-761. [PubMed]
  31. Peters RV, Aronin N, Schwartz WJ. Sichqoncha intergenikulyar leafletda c-Fos ifodasi: fotosintezni boshqarish, Fos-B bilan birgalikda lokalizatsiya qilish va uyali identifikatsiya qilish. Brain Res. 1996; 728: 231-241. [PubMed]
  32. Sgambato V, Abo V, Rogard M, Besson MJ, Deniau JM. Miya yarim korteksining bazal gangliondagi Fos proteinini ifodalovchi elektr stimulyatsiyasi ta'siri. Neurosci. 1997; 81: 93-112. [PubMed]
  33. Sgambato V, Sahifalar S, Rogard M, Besson MJ, Caboche J. Extracellular signal-regulyatsiya kinaz (ERK) kortikostriatal stimulyatsiya bo'yicha darhol erta gen induksiyasini nazorat qiladi. J Neurosci. 1998; 18: 8814-8825. [PubMed]
  34. Shaham Y, Hope BT. Neyrokatalogiyani narkobiznesga qayta tiklashdagi roli. Nat Neurosci. 2005; 8: 1437-1439. [PubMed]
  35. Shin S, McNamara JO, Morgan JI, Curran T, Kohen DR. Sadoqatli va yondirilgan kalamushlarning hipokampusidan keyin c-fos mRNA ifodasini indüksiyalash. J Neurochem. 1990; 55: 1050-1055. [PubMed]
  36. Wilson CJ, Kawaguchi Y. Neostriatal spiny neyronlarning ikki-davlatli spontan membran potensial potensial dalgalanishlar kelib chiqishi. J Neurosci. 1996; 16: 2397-2410. [PubMed]
  37. Wolf ME, Ferrario CR. AMPA retseptorlari plastinkasi yadroda takrorlanadigan giyohvandlikda takrorlanib turgandan keyin. Neurosci Biobehav Rev 2010 [PMC bepul maqola] [PubMed]