Kokain bilan indikatsiya qilingan plastisite (9) da histon metiltransferaza G2010a ning asosiy roli

PMCID: PMC2820240

NIHMSID: NIHMS174679

Nashriyotning ushbu maqolaning so'nggi tahrirlangan versiyasi bilan bu erda tanishishingiz mumkin fan
PMCdagi boshqa maqolalarga qarang keltirilgan nashr qilingan maqola.

mavhum

Kokaindan kelib chiqqan genlarning ifodalangan o'zgarishlari hujayraning morfologiyasi va giyohvandlikka bog'liq bo'lishi mumkin bo'lgan xatti-harakatlarning o'zgarishiga olib keladi. Biz koksin tarkibiga kiruvchi tizimli va xulq-atvorli plastiklarda histon 3 lizin 9 (H3K9) dimetilasyon va lizin dimetiltransferaza G9a uchun muhim rolni aniqladik. Takrorlangan giyoh qo'llanishi yadrodagi akumbenslarda global miqdordagi H3XNNMX dimetilatsiyasini pasaytirdi. Thiston metilida uning kamayishi bu miya hududida G9a repressiyasi orqali kelib chiqdi, bu esa kokain bilan indikatsiyalangan transkriptsiya faktori DFS bilan tartibga solindi. Shartli mutagenez va virus bilan bog'liq gen transferini qo'llash orqali biz G9a pastki regulatsiyasi nukleus akumbens neyronlarining dendritik o'murtqa plastinkasini kuchaytirganini va kokain uchun kengaytirilgan imtiyozni oshirganini aniqladik va shu bilan kokainning uzoq muddatli harakatlarida histon metilatsiyasini ta'minlashda hal qiluvchi rolni belgiladilar.

Kirish

Takrorlangan kokainga ta'sir qilish gen ifodasida doimiy o'zgarishlarga va miya mukofot tizimining muhim tarkibiy qismiga ega bo'lgan yadro gulxanalari (NAc) ichidagi neyronal morfologiyaning o'zgarishi bilan tavsiflanadi.1-2). Xromatinni qayta tuzish bu miya mintaqasida buzilgan transkripsiyadan tashqari o'zgarishlar uchun ahamiyatga ega, bu kokainga bog'liq (3-9). NAc natijasidagi kromatin tuzilishini kokainni tartibga solish, qisman kromatin fermenti mashinasining to'g'ridan-to'g'ri kokain bilan bog'liq modifikatsiyalari natijasida, histon asetilasyon va fosforilasyon4, 7-9); Shu bilan birga, histon metilasyonunu nazorat qiluvchi fermenti uchun vazifalar hali araştırılmamıştır.

Mikroarrayslarga (ChIP-Chip) biriktirilgan kromatin immunoprecipitatsiyasini qo'llagan so'nggi genomli promoter tahlillari takrorlangan kokainni davolashdan keyingi NAcdagi maxsus gen promoterlarida repressiv xiston H3 lizin 9 (H3K9) va 27 (H3K27) methylationining o'zgaruvchan naqshlarini aniqladi6). Shuning uchun H3K9 yoki H3KNNMX metilasyonunu nazorat qilish uchun ma'lum bo'lgan juda ko'p lizin metiltransferazlar (KMTs) va demetilazlar (KDM'ler)Shakl 1A). G9a va GLP faqat ikkita ferment, takroriy kokainga buyurilganidan keyin 24 soat davom etadigan transkripsiyadan tashqari regulyatsiya ko'rsatdi, har ikki genning ham ifodasi sezilarli darajada pastga tushirildi. G9a va GLP ayniqsa, H3K9 (H3K9me2) ning dimetilatsiyasini katalizatsiyalashgani uchun, ularning giyohvand moddalarni kamaytirish jarayoni ushbu vaqt nuqtasida kuzatilgan eukromatik H3K9me2 global miqdori bilan mos keladi.Shakl 1B). Buning aksincha, global heterokromatik H3K27 metilasyonu, takrorlab, giyoh ta'sir qilishInternet-materiallarni qo'llab-quvvatlash uchun S1-rasm). Har ikkala katalitik faoliyatning yuqori darajasi tufayli in vitro va ning Vivo jonli (10), NAc'ta takrorlangan kokain ta'siridan keyin G9a repressiyasining funktsional ahamiyatini yanada tergov qilishga kirishdik. G9a proteinining darajalari, uning mRNA darajasi kabi, takroriy kokainga buyurilganidan keyin 24 soatdanShakl S2). G9a mRNA ekspressi NAc'de 35% bilan kamaytirilishiga qaramay, immünohistokimyasal tahlil qilish, G15a protein darajasida, H9K21me3'ta takrorlab, kokain uygulandıktan keyingi 9% kamayish bilan izchil bo'lgan 2%Shakl 1B). G9a mRNA ifodasi, shuningdek, ushbu miya hududida 20% tomonidan kokainni takroriy o'z-o'zini boshqarish (Shakl S3).

Anjir. 1  

Takrorlangan kokain NAXda G9a ifodasini bir DFSBga qarama-qarshi mexanizm orqali qaytaradi. (A) H3K9 / K27 KMTs va KDM'larning NAX 24 soatiga qayta kokaindan keyin mRNA ifodasi. (B) NAX 3da H9K2me24 darajalari takrorlangan kokaindan keyin. (C) Genni tahlil qilish ...

Eoksromatik H3K9me2dagi o'zgarishlar NAc ning gen ekspresyonidagi genom-kenglik o'zgarishi bilan bog'liqmi yoki yo'qligini aniqlash uchun oldingi kokain ta'siriga ega bo'lgan yoki bo'lmagan homilador hayvonlarda giyohvand dozasini keltirib chiqaradigan gen ekspluatatsiya profillerini o'rganish uchun mikrodizika tahlillarini qo'lladik (qo'shimcha ma'lumotni ko'ring). gen ro'yxatlari S1-S3 jadvallari). Takroriy kokainga ega bo'lgan hayvonlar, giyohvand moddalarni iste'mol qilish bilan bog'liq kasalliklarga nisbatan qiynoqlardan so'ng 1 soatlik gen ekspiratsiyasini keskin oshirib yubordi (Shakl 1C). Ushbu ortdi gen ifodasi, yana bir marta 1 haftasi takrorlangan kokaindan chiqarib yuborilganidan keyin berilgan kokain chaqirig'iga javoban sodir bo'ldi. Oldingi ma'ruzalarga muvofiq, genlarning kichik miqdori (~ 10%) takrorlangan kokainga administratsiyadan keyin nostandart transkripsiyadan tashqari javoblarni ko'rsatdi (Shakl 1C; qarang Jadval S1) (5). Takroriy kokaindan keyin kuzatilgan takomillashgan gen ekspresyonidagi G9a pastga regulyatsiya rolini to'g'ridan-to'g'ri tekshirish uchun sichqon GFP yoki G9a ni ifodalovchi Herpes simplex virusi (HSV) vektorlarini intra-NAc in'ektsiyasini oldi va G9a ortiqcha bosimi yoki yo'qligini aniqlash uchun sho'r yoki takrorlangan kokain bilan davolash qilindi gen ekspressionining takroriy kokainga bog'liq rivojlanishiga to'sqinlik qilish uchun etarli edi. Takroriy kokainni takomillashtirish natijasida yuqori darajadagi ifoda darajasini ko'rsatadigan 12 tasodifiy tanlangan genlar to'plamidan biz G9a bu genlarning 50% gacha oshirilgan ifodasini sezilarli darajada qisqartirganliginiJadval S4).

G9a ifodasining takrorlangan kokain bilan bog'liq repressiyalariga vositachilik qiluvchi yuqori transkripsiyadan tashqari hodisalarni aniqlash uchun biz darhol erta genning yuqori darajadagi stabil mahsuloti bo'lgan DFB uchun mumkin bo'lgan rolni tekshirdik. fosB. DF fosbi kokainning takrorlanuvchan ta'siridan keyin NAcda to'planadi, u erda kokain to'yining ko'payishi (11). DFF mavjud bo'lgan genga qarab transkripsiyaal faollashtiruvchi yoki repressor vazifasini bajarishi mumkin (3, 5, 6, 12). Bitransgenli NSE-tTA × tetOP-DFosB bu erda DFosB ifodasi kattalar hayvonlarining NAc va dorsal striatumida selektiv ravishda indüklenebilmektedir13), biz NAFda H3K9me2 va KMTlarning kokainni tartibga solishida DFOSB ifodasini ta'sirini o'rganib chiqdik. DFosB ortiqcha bosimi H3K9me2 (Shakl 1D) va G9a ifodasi (Shakl 1E), shuning uchun takrorlangan giyoh ta'sirini taqlid qiladi. Aksincha, DFOSB bu miya hududida GLP ekspressini kamaytirmadi va SUV39XNNMXX va EX1, H2K3 va H9K3 uchun asosiy trimetilatuvchi fermentlarga (Shakl S4). Ushbu ma'lumotni mustaqil DFB eksperimenti yordamida tasdiqlash uchun, yovvoyi tipli kattalar sichqonlari GFP yoki DFBni ifodalovchi Adeno bilan assotsiatsiyalangan virus (AAV) vektorlarini ikki tomonlama NAC in'ektsiyasini oldi. Virus orqali yuborish orqali DFOSB bu miya hududida G9a ifodasini kamaytiradi (Shakl 1E).

G9a ning bunday aniq va o'ziga xos reglamenti bizga NAX neuronlarida G9a ifodasini o'zgartirishni kokainga nisbatan xatti-harakatlarni tartibga solib qo'yishini tekshirishga olib keldi. Wildtype sichqonlari GFP yoki G9a ifodalaydigan HSV vektorlarini ichki ichi INV in'ektsiyalarini oldi va keyinchalik giyohvand mukofotini bevosita o'lchov bilan ta'minlaydigan xolis kokainli shartli joyni tanlash paradigmasi yordamida tahlil qilindi. NAc nöronlaridagi G9a viral haddan tashqari ekspressionlari xatti-harakatlarni tekshirishdan keyin tasdiqlandi (Shakl 2A). G9a oshqozon ekspressioni GFP-ni haddan tashqari ekspluatatsiya qilgan hayvonlar bilan taqqoslaganda giyoh uchun afzallikni sezilarli darajada kamaytirdiShakl 2B) va NAc (H3K9me2 darajalari)Shakl 2C). G9a (G9aH1093K) ning katalitik tarzda o'lik mutantini haddan oshiqligi (14), giyoh afzalligi (Shakl 2B) va bu miya hududida H3K9me2 darajalariga ta'sir ko'rsatmadi (Shakl 2C).

Anjir. 2 

NAc'dagi G9a kokainga bog'liq yurak xolatini tartibga soladi. (A) NAc da HSV orqali transgen ta'sirining vakili surati. Koronal miya dilimining karikaturasi sichqonchani miya atlasidan olingan. (B) Kokain va kokain uchun shartli joy tanlovi ...

G9a-ni giyohning qiziqishlariga ta'sirida o'rganish va ko'proq NAc-da G9a ifodasini takrorlangan kokain bilan bog'liq repressiyani taqlid qilish uchun kattalar G9afl fl sichqonchani (14) Kreg rekombinatsiyasini yoki GFP ni nazorat sifatida ifoda etgan AAV vektorlarining ichki ichi in'ektsiyasini oldi. NAX ning G9a ning AAV-Cre knockdown'si immunohistokimyoviy sifatida tasdiqlangan (Shakl S5), kokainning shamollatuvchi tajribalardagi ta'sirini sezilarli darajada oshirdi va NAX (H3K9me2) darajasini kamaytirdiShakl 2D, E). G9a va GLP, BIX01294 (masalan,15-16), enzim inhibisyonunun xuddi shunday tarzda giyoh uchun qiziqishlariga munosabat ta'sir bormi, deb aniqlash uchun ishlatilgan. Haqiqatan ham, G9a va GLP ning farmakologik inhibisyonu kokain uchun afzalliklarni sezilarli darajada oshirdi va NAX (H3K9me2)Shakl 2F, G).

Kokainning takroriy qo'llanilishi dendritik o'murtqa zichligini NAc o'rta zarrachali neyronlarga oshiradi (17), ushbu neyronlarga eksitatori glutamatergik sinapslarda funktsional o'zgarishlar bilan bog'liq jarayon (18-19) va preparatga sezuvchan xatti-harakatlar (17, 20). Shunday qilib, NSKdagi takrorlangan kokain tomonidan G9a samaradorligini kamaytirish Kokainning NAc neyronlarning dendritik orqa miya zichligini tartibga solishga qodirligini kafolatlashi mumkin. Anti-G9a antikoru bilan kromatin immunoprecipitation (ChIP) dan foydalanib, NAc ichida bir nechta taxminli G9a gen maqsadlarini aniqladik, ularning har biri ilgari kokain bilan indikatsiyalangan dendritik plastisiteyaga (Shakl 3A) (20-26). Biz takrorlangan giyohiy amaliyot G9a bilan bir qatorda H3K9me2 darajasini sezilarli darajada kamaytirdi, bu gen promoterlarda (Shakl 3B). Aksincha, aktiv giyoh qo'llanishi G9a ni tezda G9a ni bir xil gen promoterlariga jalb qildi, bu esa kuchli dozda kokaindan keyin NAC 1 soatida kuzatilgan GXNUMXa gipertoniya sonini oshirdiShakl S6). Muayyan gen promoterlarida G9a ulanishi uning ifodasi o'zgarishi bilan bog'liq bo'lsa-da, bunday voqealar NAc'dagi o'zgaruvchan global darajalarda G9a vositachiligida va / yoki akutdan keyin G9a bo'yicha farqlar bilan bog'liqligini aniqlanmagan boshqalar takrorlangan giyoh qo'llanishi.

Anjir. 3  

NAc'dagi G9a kokainga bog'liq dendritik o'murtqa plastinkani boshqaradi. (A) 9 yoki 1 soatda, navbati bilan kokain bilan keskin yoki ko'p marta davolash qilingan hayvonlardan NAc ning kantitativ G24a ChIP. APRT salbiy nazorat sifatida ishlatilgan. Ma'lumotlar nisbatan sifatida taqdim etiladi ...

NAcdagi plastika bilan bog'liq ko'plab genlarni G9a tomonidan tartibga solish asosida biz takroriy kokainni davolashdan so'ng ushbu miya mintaqasida G9a ifodasini saqlashni kokain bilan indikatsiyalangan dendritik o'murtani barpo etish uchun etarli ekanligini tekshirdik. Oldindan dendritik o'murtqa indüksiyani NAc (ya'ni,20), biz HSV-GFP yoki HSV-G9a bilan yuborilgan hayvonlarda o'murtqa zichligini tekshirdik. O'tkazilgan oldingi topilmalar bilan kelishilgan holda, kokainni davolashdan so'ng NAcdagi dendritik o'mtoqning zichligi sezilarli darajada ko'payganini kuzatishgan, natijada G9a overexpresssiya (Shakl 3C). G9a faqat oshqozon ekspressionlari kokain bo'lmaganida NAc dendritik o'murtqa zichligini kamaytirish uchun etarli emas edi. Ushbu ma'lumotlarni to'ldirish uchun G9afl fl HSV-Cre ichidagi narkologik in'ektsiyani oldi va o'murtqa zichligi miqdori aniqlandi va giyoh bo'lmasa HSV-GFP olgan hayvonlar bilan taqqoslandi. G9a ifodasi knockdown, NAc o'rta zararli nöronlarda o'murtqa zichligini sezilarli darajada oshirdi (Shakl 3C).

Takroriy kokaindan keyingi NAXda G9a pastga regulyatsiyasi DFB tomonidan vositachilik qilganligi haqidagi dalillarni hisobga olib, biz bu transkripsiya faktorining NAc dendritik spinalarni. DFOSB ilgari bunday dendritik plastisite bilan bog'liq bo'lmagan bo'lsa-da, Cdk5 va NFKB subunitsiyalari, shu jumladan bir nechta maqsadlari shunga o'xshashdir (20-23), NAc neyronlarda DF'ning qat'iy ifodasi takrorlangan kokainni davolashdan keyin dendritik o'mtning zichligiga ortdi (27). Birinchidan, biz G9a va H3K9me2 ifodasini pastga tushiradigan kokainin yo'qligida, Bitstansenik sichqonlardagi DFB ning indüksiyasini topdik.Shakl 1D, E) ko'p miqdorda plastisite bilan bog'liq bo'lgan genlarni G9a ga ulanishni kamaytirdi, ularning ko'pchiligi DFO ning o'zi to'g'ridan-to'g'ri maqsadlari (Shakl 3D) (3, 6). Bundan tashqari, NAc'teki DFF'nin Virusli haddan tashqari ekspresyonunun bazal sharoitda dendritik orqa zichligini sezilarli darajada arttığını, Takroriy kokainga buyurilganidan keyin kuzatilganShakl 3E). Aksincha, DFFQ transkripsiyonuniy harakatini antagonize qiluvchi dominant salbiy mutant protein DJunD ning NAc'idagi ortiqcha tushuntirish, takrorlangan kokainning NAcdagi dendritik orqa miya shakllanishini kuchaytirishi qobiliyatini blokladi (Shakl 3C).

Bizning kuzatishimiz DFOSB NAXda G9a ifodasini tartibga soladi va DFosB va G9a bir xil maqsad genlarni tartibga soladi, bizni DFOSB va G9a o'rtasidagi boshqa o'zaro ta'sirlarni o'rganishga olib bordi. G9a darajalari kuchayganida, aktiv hujayradan keyin G9a to fosB G9a ifodasi bastırıldığında takrorlab, kokain so'ng, G9a, fosB geni kamaydi (Shakl 3A). Takroriy kokaindan keyin bunday kam G9a ulanishi kuzatilmadi c-fos, bu erda G9a ulashni takrorlangan kokain (Shakl S7). Bu, farqli o'laroq, mos keladi fosB, c-fos surunkali psixostimulant ta'sir qilish yo'li bilan ta'qib qilinmagan,5). Bittsenjen sichqonlarida DF-dan ortiq ekspressiya G9a-ni ulash uchun fosb gen (Shakl 3D). Bundan tashqari, G9a oshqozon ekspressioni takrorlangan kokainga administratsiyadan keyingi DFOSB ifodasini kamaytirish uchun etarli edi (Jadval S4). Ushbu ma'lumotlar GRNUMXa dastlab DFOSning induktsiyasini aktiv kokainga qo'llash orqali cheklaydi, bu esa autoregulyatsiya davrlarini ko'rsatadi. Ammo, DFOSB takrorlanadigan dori ta'sirida to'planib qolsa, u G9a-ni repressiyalashtiradi va shu bilan birga o'zining keyingi indüksiyasini kuchaytiradi.

Xulosa qilib, NAc'deki histon lisin metilasyonunun, kokainga javoban nöronal gen ekspresyonunun tartibga solinishi bilan bog'liq ekanligini ko'rsatdik. G9a va H3K9me2 ni takror takrorlash kokainni takroriy takomillashtirish orqali qisman dendritik plastisitenin aberrant shakllarini tartibga soluvchi ko'p sonli genlarni transkripsiyaal faollashuvi orqali kokain afzalligini ta'minlaydi. Bunday mexanizmlar orqali boshqariladigan genlarni yaxshiroq tushunish giyohvandlikning kompleks biologik asosini bilishimizni yaxshilaydi va o'ziga qaramlikdagi kasalliklarning samaraliligini oshirishga yordam beradi.

Materiallar va usullari

Hayvonlar va davolanish

Aks belgilanmagan sichqonlarga 12 soatlik engil / quyuq aylanishli (7: 00 AM dan 7: 00 PMgacha) haroratli haroratda (23 ° C) bir koloniyada har bir qafta uchun to'rtdan beshta xona qo'yilgan. ad libitum suvga va oziq-ovqatga kirish. Barcha hayvon protokollari IACUC tomonidan UT janubi-g'arbiy tibbiy markazi va Sinay tibbiyot maktabi tomonidan tasdiqlangan.

Qo'qon tajribalari uchun [immunohistokimetriya, g'arbiy blokirovkalash, kinetik PCR (qPCR), mikroarray tahlil qilish va kromatin immunopresititatsiyasi (ChIP)), 8-10-haftalik erkak C57BL / 6J sichqonlariga ishlatildi. Hayvonlar "sho'rlangan" (7 davolashda sho'r, ip), "o'tkir" kokain (6 davolashda sho'r + bir marta davolash), "takrorlangan" kokain (20 usullari 7 mg / kg) kokain-HCl, ip). Sichqoncha oxirgi davolanishdan so'ng 20 soat yoki 1 soat ichida qurbon bo'lishdi. Mikroto'lqinlarning tekshiruvi uchun hayvonlarga har kuni "sho'rlangan" (24 davolashda sho'r, ip), "o'tkir" kokain (15 davolash sho'rligi + 14 muolajasi 1 mg / kg kokain-HCl, ip), "takrorlangan + o'tkir" kokain 20 protezlari + 7 usullari 8 mg / kg kokain-HCl, ip) yoki "takroriy tortish + o'tkir" kokain (20 usullari 7 mg / kg kokain-HCl + 20 davolashda + 7 davolanish 1 mg / kg kokain HCl, ip) va yakuniy davolanishdan so'ng 20 soatdan keyin qurbon bo'lishdi. Xulq-atvorda tajribalar sichqonlardan jarrohlikdan keyingi holatga joylashtirilgan va quyida ta'riflanganidek, 1 mg / kg kokain-HCl, ip bilan ishlangan. HSV-GFP va HSV-G10a-GFP infektsiyasidan keyin mikroorray tekshiruvi va dendritik tekshiruvlar uchun sichqonlarga «sho'r» (9 davolash, sho'r, ip) yoki «takrorlangan kokain» (5 usulida 5 mg / kg kokain-HCl, ip ) 20 kun davomida, bu qarshi protokoli ilgari Gerpes simplex virusi (HSV) transgen ekspresyoni vaqtida yadroli accumbens (NAc) neyronlari bo'yicha orqa miya zichligini oshirish uchun ko'rsatildi,Qo'shimcha ref S1). Dendritik o'murtani tahlil qilish uchun ishlatiladigan sichqonlar so'nggi davolanishdan keyingi 4 soatdan so'ng qurbon bo'lishdi.

NAc neyronlari bilan chegaralangan G9a transkriptining mahalliy o'chirilishiga sabab bo'lish uchun boshqa joylarda batafsil tavsiflangan floxli G9a alleli uchun mutatsion sichqonni homozigot ishlatgan (S2). Krema indikatorli rekombinatsiya EXNON 22ni 25-ga mos kelmaydigan transkriptsiyani nonsense-mediatsiyaviy parchalanishiga olib keladigan kosmik biriktirilishga olib keladi. Biz C9BL / 57J sichqonchasiga to'liq qaytarib olingan G6a floxed sichqonlardan foydalanganmiz. Sichqoncha 2 va 7 xaftaligi orasida GFP yoki Cre-GFP ifodalaydigan Adeno bilan bog'liq virus (AAV) vektorlari (serotip 10) bilan NAcga sterotaksik sifatida kiritildi. Immunohistokimyoviy tahlil Cre-vositachilik qilishning rekombinatsiyasi samaradorligini tekshirish uchun ishlatildi (qarang Qo'shimcha shakl S5). Biz jarrohlikdan keyingi 21 kundan keyin AAV tomonidan kiritilgan hayvonlarni qo'lladik, chunki G9a sichqonlarida rekombinatsiya bu vaqt nuqtasida barqaror va maksimal bo'lgan va e'lon qilingan hisobotlarga (S3-S4). G9a va DJunD haddan tashqari eksperiment tajribalari shunga o'xshash tarzda GFP, wildtype G9a-GFP, katalitik tarzda o'lik G9aH1093K-GFP yoki DjunD-GFP (ifodalash uchun) ni ifodalovchi HSV virus vektorlari yordamida amalga oshirildi (qarang S2 G9a konstruksiyalarini rivojlantirish bo'yicha tafsilotlar uchun). 3 kundan ortiq jarrohlik amaliyotidan HSV sichqonlari qo'llanildi, chunki bu vaqt davomida immunohistokimyo orqali kuzatilganidek, haddan tashqari ekspiratsiya maksimal darajada edi. HSV ekspressionining vaqtinchalik tabiati va AAV ifodasi ancha barqaror bo'lganligi sababli HSV vektorlari tez, qisqa muddatli transgen ekspresyonini talab qiladigan eksperimentlarda qo'llanildi, AAV vektorlari esa uzoq muddatli transgen ekspresyonini talab qiluvchi eksperimentlarda qo'llandi. Har ikkala vektor, avvalgi tadkikotlar keng tarqalgan bo'lib, afera infektsiyalangan yoki efferent neyronlarning infektsiyasini olib tashlamasdan, AOK qilingan miya hududida faqatgina nöronal hujayra jismlarini infektsiya qilish uchun ko'rsatildi.

BIX9 (01294 ng / ml) iqtisodiyotidagi G25a / GLP inhibitori yordamida xulq-atvorli tajribalar uchun sichqon NAc ichiga ikkita subkutanli mini-nasos bilan birga ikki tomonlama hidoyat kanülleriyle sterotaksik sifatida joylashtirildi. Mini-nasoslar 12 kun davomida har qanday transport vositasini (0.25 gidroksipropil b-siklodekstrin) yoki preparatning uzluksiz yetkazib berishini (5 ml / soat) joylashtirishdan oldin 14 soatdan keyin faollashtirildi, bu vaqt davomida xulq-atvor baholash o'tkazildi.

DFosB ortiqcha ekspression tajribalari uchun [Western blotting, qPCR va ChIP], erkak bitransgenik NSE-tTA × tetOP-ΔFosB sichqon (10 haftalik) ishlatilgan, shuning uchun tetratsiklin lotin doksisiklin yo'qligi (8 xafta doksisiklin), hayvonlarda kuchli striatal cheklovli DFOSB (S5). Ushbu sichqonlarda FFBning ortiqcha ifodasi qPCR orqali tasdiqlangan. NSE-tTA × tetOP-ΔFosB 8-haftalik C57BL / 6J erkak sichqonchasi sichqonlari GFP yoki DFOSB-GFPni ifodalovchi AAV vektorlari bilan sterotaksik tarzda AOK qilingan NAc edi. AAV vektorlari 8 xromosoma operatsiyasidan keyingi davrda maksimal DFosB ekspresyonini ta'minlash uchun virusli infektsiyalangan va bitransgen DFOSB sichqonlarini to'g'ridan-to'g'ri taqqoslash imkonini berdi. Virusli ekspression operatsiyadan keyingi 8 haftada qPCR yordamida tasdiqlandi (15-gauge NAc punchlari qarshi inshootida ajratilgan). QPCR uchun ishlatilmaydigan AAV-GFP va AAV-AFosB-GFP sichqonlari 14 haftadan boshlab boshlangan sho'r (14 davolashda sho'r, ip) yoki takrorlangan kokain (30 usullari 6 mg / kg kokain-HCl, ip) jarrohlik. Yakuniy davolanishdan so'ng 4 kundan keyin miyalar 4% paraformaldehid bilan biriktirilib, vibratomga bo'linib, dendritik omurgalarda tahlil qilish uchun ishlatilgan.

Western blot tahlil qilish

14-gauge NAc punchlari zanglamaydigan po'latdan sichqonchani miya matritsasi yordamida olingan 1 mm koronal kesimlardan olingan va proteaz va fosfataz inhibitörlerini o'z ichiga olgan 1 M HEPES liziz tamponida (1% SDS) sonikatsiyalangan. 10-30% SDS jelida jami proteinning 18 μg namunalari elektroforez qilingan. Proteinlar PVDF membranalariga o'tkazildi va anti-H3K9me2 (sichqonchani monoklonal, 1: 500), anti-b-tubulin (sichqonchani monoklonal, 1: 60,000), anti-total histon H3 (quyon poliklonal, 1: 5,000), (quyon poliklonal, 1: 1000), anti-H3K27me3 (quyon poliklonal, 1: 500) yoki piyodalarga-aktinli antikorlar (sichqonchani monoklonal, 1: 60,000) bilan kechada 4 ° C (barcha membranalar 5% sut yoki 5% bosh sigirning sarum albuminida bloklandi). Keyinchalik membranlar peroksidaza yoritilgan ikkilamchi antikorlar bilan inkübe qilindi (1: 15,000-1: ishlatilgan asosiy antikorga qarab 60,000) va guruhlar SuperSignal West Dura substratidan foydalangan holda ko'rib chiqildi. Guruhlar NIH Image J Programma bilan aniqlandi va H3K9me2 bantlari teng ravishda yoki aktin yoki b-tubulinga va teng ravishda o'rnatish uchun nazorat qilish uchun jami H3-ga normallashtirildi. Takrorlangan kokain aktin darajalariga ta'sir ko'rsatmadi (Shakl S8) yoki umumiy histone 3 (Shakl S1). Bundan tashqari, HSV-G9a-GFP va HSV-G9aHXNNMXK-GFP infektsiyasi NAcdagi b-tubulinning umumiy darajalariga ta'sir ko'rsatmadiShakl S8).

Immunohistokimyo

Sichqonlarning dozasi xloral hidratning o'ldiradigan dozasi bilan sedativ qilindi va 4% paraformaldehid bilan perfuz qilingan, ilgari aytib o'tilganidek, bir yoki ikkita immunohistokimya bilan tahlil qilingunga qadarS6). Qisqacha aytganda, keyinchalik aniqlangan miyalar xona haroratida 30% sukroz bilan kechikib 35 mkm (kesma uchun ishlatiladigan miyalar, 100% sukroz bo'lmagan holda 30 ìm bo'limlarida vibratome bo'yicha ajratilgan). Erkin yuruvchi NAc bo'limlari 1X PBS bilan yuvilib, (3% normal eshak sarum, 0.1% tritonX, 1X PBS) bloklandi va keyinchalik anti-GFP (tovuq poliklonal, 1: 8000) va / yoki piyodalarga qarshi G9a (quyon poliklonal , 1: 500) antikorlarini blokirovka qilishda ishlatiladi. Dendritik spinalar uchun tahlil qilingan bo'limlar 1: 200 da quyon poliklonal anti-GFP antikoru bilan inkübe qilindi. Kecha davomida inkubatsiyadan so'ng, NAc bo'linmalari 3X PBS bilan 10 daqiqada 1 marta yuvildi, keyin 2X uchun 3X PBS blokirovkalash solig'ida Cy1 va / yoki Cy2 fluoresants bilan biriktirilgan ikkilamchi antikorlar bilan inkubatsiya qilindi. Morfologik tadqiqotlar uchun ishlatiladigan bo'limlar kecha davomida xona haroratida ikkinchi darajali antikordada inkübe qilindi. Yadro bilan boyanma 1X 1X daqiqalar uchun DAPI (50,000: 10) o'z ichiga olgan PBS qismlarini inkübe qilish yo'li bilan erishildi. Bo'limlar yana yuvilib, keyinchalik o'rganishsiz dehidratsiya va DPX bilan o'rnatildi. Barcha bo'limlar konfokal mikroskop yordamida ko'rsatildi.

RNK izolyatsiyasi va qPCR

Ikki tomonlama 14-o'lchovli NAc zarbalari Trizolda bir hil holga keltirildi va ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq qayta ishlandi. RNK RNAesy Micro ustunlari bilan tozalangan va spektroskopiya bilan RNK 260/280 va 260/230 ratsionlari> 1.8 bo'lganligi tasdiqlangan. Keyin RNK Bio-Rad iScript to'plami yordamida teskari transkripsiyadan o'tkazildi. cDNA qPCR tomonidan SYBR Green yordamida aniqlandi. Har bir reaksiya ikki nusxada yoki uch nusxada bajarildi va normalizatsiya nazorati sifatida glitseraldegid-3-fosfat dehidrogenaza (GAPDH) yordamida ilgari tasvirlangan DCt usuli bo'yicha tahlil qilindi (S7). Qarang qo'shimcha jadval S5 mRNA primer sekansları uchun.

DNK mikroarray tahlil qilish

3 mikroto'lqinlarini jamlagan mikroarray tadqiqotlari uchun to'rt guruh (har bir guruh uchun 12 mustaqil biologik replikatsiya) ishlatilgan. 1 soatdan so'ng oxirgi kokain inyeksiyasi natijasida hayvonlar tezda dekapitatsiya qilindi va miyalar olib tashlandi va muzlarga joylashtirildi. NAc dispersiyasi 15 o'lchovli igna zarbasi yordamida olingan va RNK chiqarilgunga qadar quruq muzda tezda muzlatilgan edi. Ikkitomonlama zımbalar bir nusxada har bir guruh uchun 12 sichqonchani jami to'rtta hayvondan to'plangan. RNK izolyatsiyasi, mikroto'lqinli ishlov berish va ma'lumotlarni tahlil qilish oldindan aytib o'tilganidek (S8). Qisqacha aytganda, RNK ajratilgan va yuqorida ta'riflanganidek tozalangan va sifatini Agilent Bioanalyzer yordamida tekshirgan. Illumina MouseWG-6 v2.0 massivlariga teskari transkripsiya, amplifikatsiya, markalash va duragaylash UT Southwestern-ning mikroarray yadrosi tomonidan standart protseduralar yordamida amalga oshirildi. Xom ma'lumotlar Beadstudio dasturidan foydalangan holda fon chiqarildi va normativlashtirildi. Normallashtirilgan ma'lumotlar GeneSpring dasturi yordamida tahlil qilindi va umumiyistlar p <1.3 p-qiymati bo'lmagan p-qiymati bilan birgalikda 0.05 baravar o'zgarishi kesimining muhimlik mezonlari yordamida ishlab chiqildi.

Ushbu ma'lumotlarga bir necha sabablarga ko'ra yuqori darajadagi ishonchni saqlaymiz. Birinchidan, barcha hayvonlar bir xil sharoitlarda, bir vaqtning o'zida, ishlov berilgan va o'ldirilgan. Shuningdek, barcha RNK va qatorlarni qayta ishlash bir vaqtning o'zida amalga oshirildi. Ikkinchidan, biz uch qatorli ketma-ketliklarni qildik va massa namunasiga bir nechta hayvonlarni to'pladik, shuning uchun individual o'zgaruvchanlik va statistik kuchning ortishiS9). Uchinchidan, MicroArray Quality Control loyihasi tomonidan bizning tadqiqotimiz uchun ishlatiladigan ma'lumotlar tahlil qilish mezonlari tavsiya etiladi, chunki bu mezonlarga yuqori darajada qayta ishlashga imkon beruvchi yuqori darajali va inter-va planlamali qayta ishlab chiqilgan (S10-S11).

Virusli vektorlarni qurish

Virusli vektorni kiritishda o'lchov cheklovlari tufayli yoki wildtype G9a (G9a) yoki katalitik ravishda o'lik G9a (G9aH1093K) uchun kodlash tartiblari GFPni ifodalovchi bicistronic p1005 + HSV plazmidiga insonning darhol erta sitomegalovirus promoteri (CMV) (G9a Qo'shib qo'yish hajmi ~ 3.96 kb edi, bu AAV-2 vektorlari uchun maksimal kattalik hajmidan kattaroq). IE4 / 5 promoteri G9a ifodasini ishlatadi. Fragmanlar Bikistronik p1005 + HSV plazmidiga Klenow bilan muomala qilingan PmeI va EcoRI digested G9a (pcDNA3.1 dan) va EcoRI oshqozonidan keyin CIP bilan muomala qilingan p1005 + bilan blunt so'nggi ligatsiya orqali pastki klonlangan. HSV-DJunD-GFP ishlab chiqarish uchun EcoRI chegara hududlari bilan o'rab olingan DJunD kodlash tartibini EcoRI maydonini o'z ichiga olgan primer oligonükleotidler yordamida PCR ishlab chiqarildi. PCR mahsuloti keyinchalik p1005 + vektorining EcoRI saytiga bog'langan. NAc neyronlarda Cre rekombinatsiyasining mahalliy ifodasi, AAV vektori bilan ta'riflanganidek, virus orqali vositachilik qilish orqali erishildi (S12). GFP yoki GFPning Cre-ga N-terminalli termoyadroviyligi A-2ning rekombinatli AV-XNUMX vektoriga biriktirildi, bu splice donor qabul qiluvchi sekansı va poliadenilasyon signali bo'lgan CMV promoterini o'z ichiga oladi. Barcha vektorli qo'shimchalar dideoksi-sekans bilan tasdiqlangan. Virusli vektorlar yuqorida aytib o'tilganidek, uchta transfeksiyali, yordamsiz usul yordamida ishlab chiqarilgan (S13). Saflangan virus -80 ° C da saqlangan. Virusli sifat HEK293 hujayralarida baholangan yuqumli titr bilan baholandi. AAV-DF-GFP viruslari ham xuddi shunday tayyorlangan. HSV-Cre uchun CRE iborasini İRENUMX / 4 promoteridan farqli o'laroq, IREX promoteri boshqarib, Cre'ni ifodalashni kamaytirish va neyronlarning toksikligini oldini olish maqsadida S14 Virusli qurilish uchun). Har ikkala holatda ham virusli ovsiz ekspression tekshirildi in vitro va ning Vivo jonli qPCR orqali viruslar immunohistokimyoviy tekshiruvdan so'ng NAc-cheklangan ifodasini namoyish qilish uchun tasdiqlandi.

Stereotaksik jarrohlik

Ketamin (100 mg / kg) / ksilazin (10 mg / kg) behushlik ostida sichqon kichik hayvon stereotaksik asbobida joylashtirilgan va kranial sirt ta'siriga uchragan. 0.5 ° burchagida (AP + 10; ML + 1.6; DV-1.5) 4.4 mL / min tezligida NAc ichiga 0.1 mL virusni ikki tomonlama tarzda infektsiya qilish uchun o'ttiz uch o'lchovli shpritsli ignalar ishlatildi. HSV in'ektsiyasini olgan hayvonlarga operatsiyadan keyingi 2 kundan keyin tiklanish uchun ruxsat berilgan, shu bilan birga AAV vektorlarini qabul qilgan xatti-harakatlarni tekshirish uchun ishlatiladigan sichqonlarga 20 kun ichida shamollatilishga joylashtirildi. Bu vaqtlar ikki vektor uchun maksimal virusli vositalar bilan transgen ekspresyoni davriga mos keladi. BIX01294 infuziyalari uchun ikkita mini-nasosning har biri sichqonchaning orqasida teri ostiga joylashtirilgan. Kannula joylashtiruvlariga NAc ustida ikkita kichkinagina kranial teshiklarni va brigma (AP + 1.5; ML + 1.0; DV - 5.4) dan kanülni yetkazib berish orqali erishildi. Sichqonlarga 4-dan jarrohlik amaliyotidan 5 kungacha shifokorlarni qaytarish uchun ruxsat berildi.

Konditsioner joy tanlovi

Joyni joylashtirish jarayoni ilgari ta'riflanganidek amalga oshirildi va quyidagi o'zgarishlar (S7). Qisqacha, HSV-G3a-GFP, HSV-G9aH9K-GFP yoki HSV-GFP ning intra-NAc infuziyalaridan 1093 kun o'tgach, sichqonlar uchta alohida muhitdan iborat konditsioner kameralariga joylashtirildi. Ikkala konditsioner xonaning har ikkalasi uchun katta afzallik ko'rsatgan sichqonlar tadqiqotdan chetlashtirildi (barcha hayvonlarning <10%). Keyin konditsionerlar guruhlari hali ham mavjud bo'lishi mumkin bo'lgan har qanday xona tanqisligini moslashtirish uchun muvozanatlashtirildi. Keyingi kunlarda hayvonlarga fiziologik eritma yuborildi va tushdan keyin bir kamerada 30 minut ushlab turildi, so'ngra kokain (10 mg / kg, ip) ukol qilindi va kechqurun boshqa kameraga 30 kun davomida 2 kun (ikki sho'r suv va ikkita kokain juftligi). Sinov kuni sichqonlar 20 daqiqa davomida davolanmasdan apparatga qayta joylashtirildi va qaysi tomonni afzal ko'rganligini baholash uchun sinovdan o'tkazildi. Kokainga lokomotor reaktsiyalar giyohvand moddalarni davolash samaradorligini ta'minlash uchun kokain bilan bog'langan xonalarda nurlanish tanaffuslari orqali baholandi. AAV va BIX01294 CPP tajribalari uchun biroz o'zgartirilgan protokol ishlatilgan. Hayvonlarga yana fiziologik eritma yoki kokain (10 mg / kg, ip) AOK qilindi va 30 daqiqalik mashg'ulotlar davomida maxsus xonalarda saqlandi, ammo buning o'rniga kuniga bir marta faqat 4 kun davomida konditsionerlashdi, so'ngra 5-kuni sinov (hayvonlar konditsionerlashtirildi) kechqurun va konditsioner davolash navbat bilan almashtirildi). Barcha guruhlar uchun lokal harakat virusli yoki inhibitorli davolanishga ta'sir qilmasligini ta'minlash uchun sho'r suvga javoban dastlabki harakatlanish baholandi.

Vena ichiga suyuqlik ichish

Eksperiment boshida 230-250 g og'irligi bo'lgan erkak o'smir Long-Evans kalamushlari olinadi. 12 soatlik nurli / quyuq aylanish tizimida namlikni va haroratni nazorat qilish muhitida joylashtirilgan (9: 00-da yoritilgan). ad libitum oziq-ovqat va suvga kirish. Sichqonlarga o'zlarining yangi sharoitlariga moslashish uchun ruxsat berildi va tajriba boshlanishidan oldin har kuni 1 hafta davomida muhokama qilindi. Barcha usullar laboratoriya hayvonlarini parvarish qilish va ulardan foydalanish bo'yicha Milliy Sog'liqni saqlash qo'llanma tomonidan ishlab chiqilgan va Sinay tog'ining Hayvonlarni Xizmat va Foydalanish Qo'mitasi tomonidan tasdiqlangan. O'z-o'zini boshqarish apparati infraqizil nurlari bilan lokomotor harakatlarni o'lchash uchun mo'ljallangan. O'z-o'zini boshqarish avvalroq aytib o'tilganidekS15-S16) izofluran (2.4-2.7%) behushlik ostida o'ng bo'yin tomiriga joylashtirilgan kateterlar bilan. Kateterlarni 0.1 U geparin va ampitsillin (10 mg / kg) o'z ichiga olgan 50 ml fiziologik eritma bilan yuvib tashladilar. Jarrohlikdan so'ng bir haftalik tiklanishdan so'ng, o'z-o'zini boshqarish bo'yicha mashg'ulotlar yorug'lik / qorong'u tsiklning qorong'u bosqichida boshlandi. Belgilangan nisbati-3 (FR0.75) ni kuchaytirish jadvali bo'yicha hayvonlarga kokainga (1 mg / kg / infuzion) kuniga 1 soatlik kirish huquqi berildi, bu erda 1 ta faol qo'lni bosish preparatning bitta infuzioniga olib keldi. Kalamushlar 6 kundan keyin o'zlarining kokain iste'molini barqarorlashtirdilar (ketma-ket 15 kun ichida <3% o'zgarish darajasi, kamida 75% kuchaytirilgan qo'lda javob berishadi). Oxirgi o'z-o'zini boshqarish sessiyasidan 24 soat o'tgach, kalamushlar tezda boshini kesib tashladilar, miyalar tezda olib tashlandi va RNK izolyatsiyasi va qPCR uchun qayta ishlandi.

Kromatin immunopreptitatsiyasi (ChIP)

Yangi NAc punklari formaldehid bilan o'zaro bog'langan va oldindan aytib o'tilganidekS17-S18) kichik o'zgarishlar bilan. Qisqacha aytganda, har bir hayvonga 4 14-gauge NAc punchlar (5 har bir namunadir to'plangan hayvonlar) yig'ilib, 1% formaldegid bilan o'zaro bog'langan va -2 ° C da muzlashdan oldin 80 M glisin bilan susayib ketgan. Misol sonicationdan oldingi 1 kun oldin qo'y anti-quyon / sichqonchani (yomg'irli antikorga bog'liq) IgG magnitli boncuklar piyodalarga qarshi G9a (quyon poliklonal daraja darajasi) yoki anti-H3K9me2 (sichqonchani monoklonal chip navi) blok eritmasida doimiy aylanish jarayonida 4 ° C da bir kecha davomida antikorlar. To'qimalarining sonikatsiyasi va kromatin kesmasi yuqorida ta'riflanganidek (S17). Sonication so'ng, kromatin teng konsentratsiyasi yangi quvurlarga o'tkazildi va yakuniy mahsulotlar ~% 5% "kirish" nazorat qilish uchun saqlandi. Birlashtirilgan boncuk / Antikor Aralashmalarining yaxshilab yuvish va qayta süspansiyonundan so'ng, har bir kromatin misoliga teng miqdorda Antikor / boncuk Aralashmalarning (~ 7.5gg Antikor / namuna) qo'shilgan va 16 ° C da doimiy aylanish ostida ~ 4 soat davomida inkübe qilingan. Namunalar yana bir marta yuvilgan va PCR tozalash vositasi yordamida DNKni tozalashdan avval 65 ° Cda teskari o'zaro bog'langan. DNKni tozalashdan so'ng, namunalar qPCRga bo'ysundirildi va ularning "mos keladigan" kirish elementlari bilan ilgari tasvirlangan ("S17). Sichqoncha poliklonal anti-IgG antikoridan foydalanadigan an'anaviy sichqonchani IgG immunoprecipitations ham signal kuchaytirilishini to'g'ri boyitish uchun nazorat qilindi. Adenin fosforiboziltransferaza (APRT) kokain va DFF eksperksepsiya tajribalari uchun salbiy nazorat sifatida ishlatilgan. Qarang Qo'shimcha jadval S5 Promoter primeri sekansları uchun.

Dendritik o'murtani tahlil qilish

In Vivo jonli neyronal morfologiyani tartibga solishda G9a rolini o'rganish uchun avval quyidagi modifikatsiyalari (S1). HSV-GFP, HSV-G9a-GFP, HSV-DJunD-GFP (barcha viruslar wildtype C57Bl / 6J sichqonchasida ishlatilgan) yoki HSV-Cre-GFP (G9afl fl sichqonlarga perfüze qilindi, miyalar cryoprotected qilindi va keyinroq vibratome ustida 100 μm'de kesildi. Keyinchalik bo'limlar yuqorida aytib o'tilganidek, GFP ga qarshi antikor yordamida immunostained qilindi (qarang Immunohistokimya). G9a haddan tashqari ekspression va knockoutning omurilik soniga ta'siri va DJunD overspression ta'siri bilan birga biz GFP ekspresitsient NAc-muhitidan kamida 1 mkm dendritlarni tashkil etuvchi neyronga nisbatan taxminan 2-299 neytriksida o'mtoq sonini o'lchagan edik zararli neyronlar (MSN). MSNning NAcdagi boshqa neyronal populyatsiyalardan morfologik jihatdan farq qiladiganlari va oldingi ma'ruzalar HSV asosan bu miya hududida DARPP-32ni ifodalovchi neyronlarniS19), biz MSNs faqat ushbu tadqiqotlarda baholanganligiga aminmiz. Har bir hayvon uchun biz 6-8 neyronlarini 3-4 guruhidagi har bir guruhda (7 guruhlar) tekshirdik, undan keyin statistik tahlil uchun har bir hayvon uchun o'rtacha qiymat olinadi. DFOSB ekspresyonunun NAc o'murtqa zichligi bo'yicha ta'sirini o'rganish uchun mo'ljallangan tajribalar, AAV vektorlari GFP yoki DFOSB-GFP ni uzoq vaqt davomida ifodalash uchun ishlatilgan (8 haftalar) bundan mustasno, yuqorida ta'riflanganlarga o'xshash tarzda o'tkazildi. Barcha HSV tasvirlari konfokal mikroskop yordamida 100X yog 'moylash maqsadlari bilan qo'lga kiritildi (AAV rasmlarni 63X yog' moylari maqsad bilan qo'lga kiritildi). Rasmlar 1 o'zboshimchalikli birligida o'rnatilgan va 1024 × 1024 ramka o'lchamlari bilan aniqlangan pinhole bilan olingan. Dendritik uzunligi NIH Image J dasturi yordamida o'lchandi va orqa miya raqamlari eksperimental tekshiruvdan oldin slaydlar kodlanganligi sababli asosiy eksperimentator tomonidan ko'zdan kechirildi. 10 mn dendrit boshiga o'rtacha o'rgimchak soni hisoblab chiqildi.

Statistik tahlil

Konditsioner joy tanlovi va dendritik ommaviy tahlil uchun ikki guruhdan ortiq bo'lgan ahamiyatni aniqlash uchun bir va ikki tomonlama ANOVAlar bajarildi. G9a-da HSV-GIF HSV-GFP ni GXNUMXa bilan taqqoslagan holda qPCR, western blotting, dendritik orqa miya tahlillarini o'z ichiga olgan boshqa taqqoslashlar uchun talabalar t-testlari ishlatilganfl fl sichqonlar, mikroarray tahlillari (yuqoriga qarang) va xromatin immunoprecipipitatsiya tajribalari. Rejalashtirilgan talabalarning t-testlari DFOSB haddan tashqari ekspressionidan keyin dendritik o'murtqa zichligini ANOVA ikki tomonlama tahlilidan so'ng ishlatilgan va giyohvand moddalar bilan davolash va virusning muhim ta'sirini tasdiqlagan. Shakl afsonalariga kiritilgan barcha qiymatlar o'rtacha ± SEM (* p-0.05; ** p <0.001) ni anglatadi. Uchun batafsil statistik tahlillar Shakl. 1-3 Asosiy matnda quyidagilar ko'rsatiladi: Statistikani o'z ichiga olgan batafsil ma'lumot.

Qo'shimcha materiallar

Izohlar

Qo'lyozma tarkibiga kiritilgan materiallarning hech biri vakolatsiz ekanligini tasdiqlayman Kokaina bilan bog'liq bo'lgan plastisitada histon metiltransferaza G9a ning asosiy roli ilgari nashr etilgan yoki boshqa joylarda, shu jumladan Internetda ko'rib chiqilmoqda.

Hayvonlarni ishlatish bilan bog'liq barcha ishlar Texasning Southwestern Southwestern Medical University va Sinay Tibbiyot maktabi universitetlarida institutsional va IACUC yo'riqnomalariga muvofiq o'tkazildi.

Zikr va izohlar

1. Robinson TE, Kolb B. Neuropharmacology. 2004; 47 (Suppl 1): 33. [PubMed]
2. Hyman SE, Malenka RC, Nestler EJ. Annu Rev Neurosci. 2006; 29: 565. [PubMed]
3. Kumar A va boshq. Neyron. 2005; 48: 303. [PubMed]
4. Renthal Vt va boshq. Neyron. 2007; 56: 517. [PubMed]
5. Renthal Vt va boshq. J Neurosci. 2008; 28: 7344. [PMC bepul maqola] [PubMed]
6. Renthal Vt va boshq. Neyron. 2009; 62: 335. [PMC bepul maqola] [PubMed]
7. Stipanovich A va boshq. Tabiat. 2008; 453: 879. [PMC bepul maqola] [PubMed]
8. Borrelli E, Nestler EJ, Allis CD, Sassone-Korsi P. Neuron. 2008; 60: 961. [PMC bepul maqola] [PubMed]
9. Brami-Cherrier K, Roze E, Girault JA, Betuing S, Caboche J.J.Neurokm. 2009; 108: 1323. [PubMed]
10. Tachibana M, Sugimoto K, Fukushima T, Shinkai Y. J.Biol Chem. 2001; 276: 25309. [PubMed]
11. Nestler EJ. Filos Trans R Soc London, B Biol Sci. 2008; 363: 3245. [PMC bepul maqola] [PubMed]
12. McClung CA, Nestler EJ. Nat Neurosci. 2003; 6: 1208. [PubMed]
13. Kelz MB va boshq. Tabiat. 1999; 401: 272. [PubMed]
14. Sampath SC va boshq. Mol hujayralari. 2007; 27: 596. [PubMed]
15. Kubicek S va boshq. Mol hujayralari. 2007; 25: 473. [PubMed]
16. Chang Y va boshq. Nat Struct Mol Biol. 2009; 16: 312. [PMC bepul maqola] [PubMed]
17. Robinson TE, Kolb B. J Neurosci. 1997; 17: 8491. [PubMed]
18. Ungless MA, Whistler JL, Malenka RC, Bonji A. Tabiat. 2001; 411: 583. [PubMed]
19. Tomas MJ, Malenka RC. Filos Trans R Soc London B Biol Sci. 2003; 358: 815. [PMC bepul maqola] [PubMed]
20. Russo SJ va boshq. J Neurosci. 2009; 29: 3529. [PMC bepul maqola] [PubMed]
21. Bibb JA va boshq. Tabiat. 2001; 410: 376. [PubMed]
22. Norrholm SD va boshq. Neuroscience. 2003; 116: 19. [PubMed]
23. Pulipparacharuvil S va boshq. Neyron. 2008; 59: 621. [PMC bepul maqola] [PubMed]
24. Ujika H, ​​Takaki M, Kodama M, Kuroda S.Enn NY Bosh Sci. 2002; 965: 55. [PubMed]
25. Toda S va boshq. J Neurosci. 2006; 26: 1579. [PubMed]
26. Graham DL. Nat Neurosci. 2007; 10: 1029. [PubMed]
27. Lee KW va boshq. Proc Natl Acad Sci AQSh A. 2006; 103: 3399. [PMC bepul maqola] [PubMed]
28. Bu ish Narkotik moddalarni suiiste'mol qilish milliy institutining grantlari: P01 DA08227 (EJN), R01 DA07359 (EJN) va P0110044 (PG) tomonidan tasdiqlangan.