Periadolzensiya sichqonlari kokain va amfetamin (2002) ga javoban takomillashtirilgan DFOSB regulyatsiyasi.

J Neurosci. 2002 Nov 1;22(21):9155-9.
 

manba

Neytan Klin instituti, Orangeburg, Nyu-York, 10962, AQSh. [elektron pochta bilan himoyalangan]

mavhum

Bolalar va o'smirlar psixostimulyatorlarga, ya'ni noqonuniy ravishda yoki umumiy nöropsikiyatrik sharoitlarni davolashda, masalan, giperaktivlikda va nochorligi mavjud bo'lgan diqqat etishmovchiligi buzilishiga olib keladi. Yosh yosh guruhlarida psixomotor stimulyatorlarning keng tarqalgan shaklda qo'llanilishiga qaramasdan, noaniq miyada bu agentlarga surunkali molekulyar neuroadaptiv javoblar haqida kam ma'lum. Bu erda psixostimulyatorlarning surunkali boshqaruvidan keyin ko'rsatamiz Qo'qon va amfetamin, Transkripsiyon faktor DeltaFosB nukleus akumbenslarida upregulyatsiya qilinadi periadolzent Sichqonlar ammo post-nola yoki kattalarda emas Sichqonlar. İndüksiyon DeltaFosB shuningdek, faqat kaudat pusununda paydo bo'ladi periadolzent Sichqonlar so'ng amfetamin boshqarish. Ushbu natijalar, psixostimulyator ta'sirni tartibga soluvchi va tanqidiy molekulaning o'smir miyasida noyob plastisitni namoyon etadi va bu neyroxadaptiv o'zgarishlarning mediatsiyaning rivojlangan kattalarnikiga qaramasdan, o'smirlikdagi odatiy tendentsiyalar.

kirish

Psikostimulantlar, umumiy nuqson etishmovchilik giperaktivligi buzilishi kabi umumiy bolalik asab kasalliklarini davolashda ishlatiladi. Bundan tashqari, amfetamin va kokainni o'z ichiga olgan ogohlantirgichlarni suiiste'mol qilish o'smirlar orasida keng tarqalgan bo'lib, kattalarga nisbatan rivojlangan qo'shadi tendentsiyalariga oid dalillar mavjudEstroff va boshq., 1989; Myers va Anderson, 1991). Rivojlantirilgan tartibga soluvchi ta'sirga ega ta'sir ko'rsatadigan ma'lumotlarga qaramasdan, bu agentlar qo'llash vaqtida yuzaga kelmagan olgunlaşmamış miyada molekulyar neuroadaptif javoblar haqida juda kam narsa ma'lum. Kokain va amfetamin qisman Dopamin D ni stimulyatsiya qilish orqali uzoq davom etadigan yurish-turish o'zgarishiga ta'sir qilishi mumkin1dorsal striatumda (masalan, kaudat piteni) va ventral striatumda (ya'ni, yadroli akumbens) DFOSB, shu jumladan transkriptsiya omillarining darajasini oshiradi (Chen va boshq., 1997). DFSB darajasida o'sish, ehtimol oqsil mahsulotlari stabilizatsiyasi orqali, surunkali kokain yoki amfetamin ta'siriga uchraganidan keyin bir necha hafta davomida saqlanadi va hech bo'lmaganda qisman dopamin signallarini uzatish yo'li orqali (Chen va boshq., 1997; Nestler va boshq., 2001).

Yosh hayvonlarning markaziy dopaminergik tizimi an'anaviy rivojlanish jarayonida kritik molekulalarning o'zgaruvchan darajalari, shu jumladan, dopamin D1DARPP-32 retseptorlari (dopamin va cAMP regulyatsiya qilingan fosfoprotein; Mr 32 kDa) va cAMP (Ehrlich va boshq., 1990;Teicher va boshq., 1993; Perrone-Capano va boshq., 1996; Tarazi va boshq., 1999;Andersen, 2002). Ushbu davrda dopaminerjik nörotransmisyonu kuchaytiradigan psikostimülanlara ta'sir qilish, DFF ekspresyonundaki o'zgarishlar, shu jumladan, miqdoriy va / yoki sifat jihatidan turli xil molekulyar javob berishi mumkin. Gipotezani psixostimulyatorlarga surunkali ta'sir qilish paytida yoshga bog'liq neyroxadaptiv javoblar mavjudligini tekshirish uchun ketma-ket eksperimentlarda sichqonning uchta guruhi tahlil qilindi: kattalar (60 d oldindan inyeksiya boshlanganda), periadolzent (33 d oldindan inyeksiya boshlanganda) va naychadan keyin parchalanish (24 d oldindan inyeksiya boshlanganda). Bu uch yosh guruhidagi surunkali psixostimulyar ta'sirga nisbatan molekulyar neuroadaptiv javoblarni birinchi to'g'ridan-to'g'ri taqqoslash. Biz shuni aniqladikki, bir xil davolash paradigmalaridan keyin periadolz sichqonlari ham kokain, ham amfetaminga javoban DFOSB regulyatsiyasi yaxshilanganini ko'rdik.

MATERIALLAR VA USLUBLAR

Hayvonlar va dori vositalarini boshqarish. Erkak CD-1 sichqonlari (Charlz daryosi laboratoriyalari, Kingston, NY) 12 soatlik yorug'lik / quyuq aylanish (6: 00 AM - 6: 00 ad libitumoziq-ovqat va suvga kirish. Hayvonlarni hayvon xonasiga kamida 10 d dozada inyeksiya boshlanishidan oldin joylashtirishga ruxsat berildi. Hayvonlar hayvonlarga joylashtirilgan xonada barcha in'ektsiyalarni amalga oshirgan ikkita tergovchilar hayvonlarni olib ketishdi. Barcha hayvonlarni 21 d yoshida ekiladi. Kiritish 24 (post-weanling), 33 (periadolzent) yoki 60 (kattalar) d yoshida boshlandi. 20 va 5 o'rtasida 4 mg / kg kokain (Sigma, Sent-Luis, MO), 00 mg / kg amfetamin (Sigma), yoki 5: 00 va 7 o'rtasida o'zaro teng hajmda sho'rlangan: Hayvonlar CO ga qisqa muddatli ta'siridan so'ng dekapitatsiya bilan o'ldirilgan2 10 da: 00 AMda oxirgi enjeksiyadan keyingi kuni. Malla darhol bosh suyagidan chiqarildi va kaudat pushti va yadro gulxanlari tez muzda buzilgan edi. Barcha dissektsiyalar bitta tergov tomonidan koronal miya bo'laklaridan qilingan va muzlatilgan holda yangi to'qimalardan oqsillar ekstrakti tayyorlangan. Barcha chorvachilik usullari Institutional Hayvonlarni Qo'llab-quvvatlash va Foydalanish Qo'mitasi tomonidan tasdiqlangan va Milliy Sog'liqni saqlash institutlariga muvofiq keltirilgan Laboratoriya hayvonlarini saqlash va ulardan foydalanish bo'yicha qo'llanma.

Western blot tahlil qilish. Har bir namunadan Western blot tahlillari uchun har bir namunadan teng miqdordagi protein (kaudat pitamen uchun 40 ig / ng va nukleus akumbens uchun 20 μg) BCA assay bilan oqsil miqdori o'lchanilgandan so'ng har bir 10% SDS-poliakrilamid jeliga o'rnatildi (Pierce, Rockford, IL). Teng protein hosil qilish, shuningdek, nitrosellulozaga o'tkazilgach va / yoki piyodalarga antiinitinli antikor (1: 500; Sigma) bilan blotirovka qilinganidan keyin Ponceau Qizil tomonidan umumiy oqsilni ko'rish orqali tasdiqlangan. Fosb bilan bog'liq antigen (FRA) antiserum, DFosB izoformlarini tanigan, saxiylik bilan 1: 4000 konsentratsiyasida ishlatilgan doktor M. Iadarola (Milliy Sog'liqni saqlash Institutlari, Bethesda, MD) tomonidan taqdim etilgan. Avvalgi tadqiqotlar (Chen va boshq., 1997; Xiroy va boshqalar, 1997), shu jumladan, FR-ning antiserumini M-peptid immunogen bilan pretssorbtsiyasi, bu antiserumning o'ziga xosligini ko'rsatdi. 32: 5 da ishlatiladigan DARPP-1 10,000a monoklonal antikor saxiylik bilan Drs tomonidan taqdim etildi. Hugh Hemmings va Pol Greengard (Rokfeller universiteti, Nyu-York, NY). Dopamin tashuvchisi (DAT) antikoridan olingan Chemicon (Temecula, KA). Blen'ler NEN-DuPont (Boston, MA) chemiluminesans sistemasi bilan reaksiyaga kirishib, kino ta'siriga uchradi. DFosB immunoreaktivligi uchun densitometrik qiymatlar ScanAnalysis for Apple (Biosoft, Ferguson, MO) yordamida olingan. Statistik ahamiyatga bir tomonlama ANOVA yordamida aniqlandi post hoc Tukeyning ko'p marta taqqoslash testi yoki juft bo'lmagan, ikki dumli talaba t rasm afsonalarida ko'rsatilganidek, sinovdan o'ting. Dori-darmonlarni davolash bo'yicha tajribalar uchun har bir yosh guruhini tahlil qilish alohida blokka asosida amalga oshirildi va shuning uchun har bir sho'rlangan guruh o'z navbatida yosh guruhlari bilan taqqoslash uchun 100% qiymatiga ega bo'ldi. Ontogenli tadqiqotlar uchun barcha yoshdagi guruhlardan olingan namunalar bir-biridan tahlil qilingan.

Natijalar

Kokaindan va amfetamindan so'ng DFBning indulatsiyasi faqat periadolz sichqonlarining yadroidagi akumbenslarda uchraydi

DFOSB ning ekspressioni 7 d amfetamin yoki kokainga administratsiyadan so'ng naychadagi shilimshiqlar, periadolzent va kattalar sichqonlarining yadroidagi akumbenslar va kaudat plyonkalarida o'lchandi. Yadro akumbenslari psixostimulyatorlarning foydali samaradorligini oshirish uchun eng muhim deb hisoblangan miya mintaqasidir. Amfetaminning surunkali administratsiyasidan so'ng periodolzentsiya hayvonlarining yadro gulxanlarida VFosB immunoreaktivligi (35 kDa) selektiv tarzda indüklendi (Fig. 1 A) yoki kokain (Fig. 1 B). Aksincha, DFosB darajalari (35 kDa) post-nayza yoki katta yoshli hayvonlarning yadro gulxanalarida sezilarli darajada o'zgarib bo'lmadi (6-rasm).1 A,B). Kozok plyusida DFosB darajalari (35 kDa) surunkali amfetaminni qo'llashdan keyin faqat periadolent hayvonlarda qayd etildi (Fig.2 A). Barcha uchta yosh guruhlari kokainning surunkali administratsiyasidan so'ng kozok pusinda DFOSB (35 kDa) ifodasida sezilarli darajada oshganligini ko'rsatdi (Fig.2 B). Induktsiya kattaligi periadolz hayvonlarida, ayniqsa, sutdan keyingi xayvonlar bilan taqqoslaganda (Fig. 2 B). Boshqa FRA va Fos izoformlari barcha yosh guruhlarida o'zgartirilmagan (ma'lumotlar ko'rsatilmagan).

Shakl 1.

Surunkali psixostimulyatorli dori vositasidan so'ng yadrodagi akumbenslarda DFOSB immunoreaktivligi. CD-1 sichqonlari kuniga bir marta shirin, amfetamin yoki 7 dagi 24 (kun) uchun kokain bilan AOK qilinganP24; kundan-kunga), kun 33 (P33; periadolzent) yoki kun 60 (Voyaga). Nucleus accumbens-da DFOSB (35 kDa) immunoreaktivligi darajalari surunkali amfetamin (A) yoki kokain (B) boshqaruvi. Tuzli immunoblota - (S), amfetamin- (A) va kokain- (C).P24), periadolzent (P33) va kattalar sichqonlari ko'rsatilgan yuqori paneli. Pastki panellar o'rtacha ± FOSB ifodasini o'rtacha ± SEM foizini ko'rsatish. n har bir guruh uchun qiymatlar barlar. Faqatgina periadolen sichqonlarning yadro gumbazida DFOSB ning sezilarli ortishi aniqlandi. *p <0.05; **p <0.01 (Talabalarniki t sinov; sho'rlangan va boshqalar).

Shakl 2.

Surunkali psixostimulyatorli davolanishdan so'ng kozok peptamida DFOSB immunoreaktivligi. CD-1 sichqonlari kuniga bir marta shirin, amfetamin yoki 7 dagi 24 (kun) uchun kokain bilan AOK qilinganP24; kundan-kunga), kun 33 (P33; periadolzent) yoki kun 60 (Voyaga). Kozok plyonkasida DFOSB (35 kDa) immunoreaktivligi darajasi surunkali amfetamin (A) yoki kokain (B) boshqaruvi. Tuzli immunoblota - (S), amfetamin- (A) va kokain- (C) periadolen pushti sichqonchani (P33)yuqori paneli. Pastki panellar o'rtacha ± FOSB ifodasini o'rtacha ± SEM foizini ko'rsatish. n har bir guruh uchun qiymatlar barlar. DFOSB immunoreaktivligidagi amfetaminning indikatorli oshishi faqat periadolent sichqonchalarning kaudat plyonkasida (A). Surunkali giyoh qo'llanishi, barcha yoshdagi guruhlarda DFS ning ortishi (B). *p <0.05; **p <0.01 (Talabalarniki t sinov; sho'rlangan va boshqalar).

DAT va DARPP-32 darajalari surunkali giyoh yoki amfetamindan keyin o'zgarmaydi

Dopaminerjik va / yoki dopaminotseptiv neyronlar, jumladan, DARPP-32, D1 dopamin retseptorlari va DAT, psostostimulyatorlarga o'tkir va surunkali javob berishga yordam beradi (Moratalla va boshq., 1996; Fienberg va boshq., 1998; Sora va boshq., 1998; Gainetdinov va boshq., 2001). DARPP-32, D dan olingan ma'lumotlar1 retseptorlari va DAT null va DAT knock-down sichqonchalari ularning darajalari o'rtasida murakkab munosabatlarni, dopaminergik faollikni tartibga solish va psixostimulyatorlarga javoblarni ko'rsatadi. Darhaqiqat, DARPP-32 nukleusida surunkali kokainga ega bo'lgan sichqonlarda DFOSB indüksiyoni bo'lmaydi (Fienberg va boshq., 1998). Katta sichqonlarda 7 d 20 mg / kg kokainga ta'sir qilish DARPP-32 (Fienberg va boshq., 1998). Dopamin transporteriga psixostimulyatorlarga ta'sir etilgandan so'ng radiologik ta'sir ko'rsatadigan o'zgarishlar va ba'zi turlarda (psixostimululyantlar ta'sirida) o'zgarishlar bildirilgan bo'lsa-da,Letchworth va boshq., 2001). Bu erda DARPP-32 va DAT oqsili darajasini o'lchadi, bu oqsillarning ifodasi sichqonning uch yoshidan boshlab surunkali psixostimulyar ta'siridan keyin o'zgarib ketadimi-yo'qligini aniqlash uchun. Bizning topilmalarimiz shuni ko'rsatadiki, karyotin yoki amfetaminning uch yosh guruhidan har qandayida surunkali tatbiq etilgandan so'ng, kaudat pusun yoki yadro gulxanlarining umumiy DARPP-32 yoki DAT darajalarida sezilarli o'zgarishlar bo'lmadi (jadval 1).

Ushbu jadvalni ko'ring:

Jadval 1.

Emphetamin va kokain bilan davolash qilingan P32, P24 va kattalar sichqonlarida DARPP-33 va DAT uchun nisbiy dansitometriya qiymatlari nazorat qilish, sho'rlanganlik qiymatlariga ko'ra, o'zboshimchalik bilan 100%

DFOSBning asosiy bosqichlari rivojlanish darajasini belgilaydi

DFOSBning ontogenezini o'rganib chiqdik, chunki genetik jihatdan ishlab chiqilgan kattalar sichqonlari DFOSBning striatumdagi ifodalanganligini oshirdilar, chunki psevdo-stimulyatorlargaKelz va boshq., 1999). Biz DFOSBning asosiy darajalari kattalar bilan solishtirganda yosh hayvonlarda kaudat pusamen va yadro gulxanlarida sezilarli darajada past bo'lganligini aniqladik (ular.3 A). Dopamin tizimining funktsional markerlari darajalari, shu jumladan DARPP-32 (Ehrlich va boshq., 1990), DAT (Perrone-Capano va boshq., 1996) va dopamin retseptorlari (Teicher va boshq., 1993; Tarazi va boshq., 1999) ham rivojlanish tartibini belgilaydi. CD-1 sichqonchasidagi oldingi hisobotlar postnatal kuni 32 (P28) da DARPP-28-dagi shoshilinch pikni ko'rsatadi (Ehrlich va boshq., 1990). Sichqoncha kaudat piteni va nukleus akumbenslari, D1P28 dan P40gacha bo'lgan retseptorlari darajalariTeicher va boshq., 1993; Tarazi va boshq., 1999), ammo shunga o'xshash tadqiqotlar sichqonchada bajarilmagan. Buning aksincha, bu erda kaudat peptan va yadro akumbensidagi DAT oqsilining darajasi postnatal kun 24 va kattalar orasida sobit bo'lganligini aniqladik (Fig. 3 B). Shunday qilib, D. bilan nisbiy nisbatlar1 retseptorlari, DAT, DARPP-32 va DFOSB yosh guruhlari orasida farq qiladi, natijada D1 DFOSB induktsiya darajasiga ta'sir etadigan retseptorlarning faolligi.

Shakl 3.

DF va DAT ning rivojlanish ifodasi. A, Yoshi funktsiyasi sifatida sodda CD-35 sichqonlarining kaudat pusum va yadro akumbenslarida DFosB (37-1 kDa) immunoreaktivligi. Vakillik immunoblotlari ko'rsatilgan yuqori paneli.Pastki panellar har bir guruh uchun uchta sichqonchadan ± SEM degan ma'noni anglatadi. *p <0.05, kattalarga nisbatan P24; #p <0.05, kattalarga nisbatan P36 (Tukeyning ANOVA dan keyin ko'p marta taqqoslash testi). B, Tug'ilishning funktsiyasi sifatida sodda CD-1 sichqonlari uchun kaudat plyamen va nucleus accumbenslarda DAT immunoreaktivligining dansitometrik qadriyatlari. DAT darajalari uch yosh guruhida farq qilmadi.

Munozara

Psikomotor ogohlantiruvchilarning qiziqishlariga ta'sir yoshga bog'liq. Noqonuniy moddalarni iste'mol qilishda o'sib boruvchi o'smirlik davrida giyohvand moddalarga qo'shilish tendentsiyalari eng yuqoridir (Estroff va boshq., 1989; Myers va Anderson, 1991). Aslida, yosh bolalar psixostimulyatorlarga duch kelganida tez-tez dysforik bo'lishadi, lekin o'smirlar va kattalar eforiyaRapoport va boshq., 1980). Kemirgen modellarida ayrim ishlar periadolent hayvonlarning asosiy faoliyat darajalariga (Nayzali va tormoz, 1983) va yosh va katta hayvonlarga nisbatan psixostimulyatorlarga ta'sirini o'zgartirdi. Shunday qilib, ular past dozali psixostimulyatorlarni emizish va kattalar hayvonlariga nisbatan kamroq lokomotor stimullash va yangilanishni izlaydilar, ammo yuqori dozali davolanishdan keyin giperaktivlik kuchayadi. Surunkali qo'zg'atuvchilik bilan birga, kokainga bog'liq lokomozaga sezgirlik kattalar bilan solishtirganda periadolzent ratlarda ko'proq bo'lsa, stereotipiyaga nisbatan sezgirlik past bo'ladi. Bundan tashqari, mikrodializ ma'lumotlari amfetamin bilan indikatsiyalangan dopamin salınımına duyarlılaşmaya nisbatan periadolz va kattalar sichqonchani orasidaLaviola va uning hamkorlari, 1995; Adriani va boshq., 1998; Adriani va Laviola, 2000;Laviola va uning hamkorlari, 2001). Shu bilan birga, adolesan sichqonlarda metilfenidat berilgandan keyin kokainga uzoq muddatli reaktivlik bo'yicha qarama-Brandon va uning hamkorlari, 2001; Andersen va boshq., 2002). Ushbu oxirgi ikki hisobotda turli xil eksperimental paradigmalardan foydalangan holda ishlarni taqqoslashda qiyinchilik mavjud. Kichik hayvonlardagi xulq-atvorli tadqiqotlar bilan solishtirishga urinishlar, turli turlar va shtammlardan foydalanish orqali yanada chigallashadi.

Sichqoncha psixostimulyatorlarni ishlatish va suiiste'mol qilishni o'rganishda tobora muhim hayvon modeliga aylanib bormoqda va bu sichqonchani yoki boshqa turdagi boshqa turdagi uch xil rivojlanish davridagi molekulyar neuroadaptiv javoblarni birinchi sistematik tahlil qilish. Bizning davolash paradigmalaridan olingan ilgari ishlanmalar surunkali kokain va amfetaminni qo'llashdan so'ng yovvoyi tipdagi kattalar kalamushlarida izolyatsiyalangan dorsal va ventral striatumda DFB ning o'sishini ko'rsatdi (Hope va boshq., 1994; Nye va boshq., 1995; Turgeon va boshq., 1997), ammo surunkali giyohdan so'ng yovvoyi tipli kattalar sichqonlarining estrodiol dorsal va ventral striatum yoki izolyatsiya qilingan dorsal striatumidaFienberg va boshq., 1998; Zachariou va boshq., 2001).

Endi psevostimulyatsiyaga uchragan DFB ning post-sutdan tashqari, periadolzent va kattalar sichqonlarida bo'shliq va miqdoriy farq bor. Periadolzentsiya hayvonlarida kattalar va nikohdan keyingi bolalar bilan solishtirilganda yuqori darajadagi javobni kuzatish kokain va amfetamin bilan davolash qilingan sichqonchalarda o'xshashligi bilan kuchayadi. Psikostimulantlar kokain va amfetamin sinaptik dopaminni, shuningdek serotonin va norepinefrinni ko'paytiradi, ammo turli mexanizmlar orqali. Kokain, dopamin, serotonin va norepinefrin uchun plazmalemma tashuvchilariga bog'lanadi va ularning qayta yuklashini presinaptik terminali ichiga to'sqinlik qiladi. Aksincha, amfetamin ushbu transmitterlarning chiqarilishiga yordam beradi. 7 d stimulyatorni qo'llashdan keyin faqat periadolzentsion yoshdagi guruhda DFOSBning selektiv indüksiyasiyasi va kaudat peptamida DFB ning nisbatan balandlashishi indikatsiyasi neyrobiologik tavsif bo'lishi mumkin yoki ilgari qayd etilgan psevdo-stimulyatorlarni suiiste'mol qilish tendentsiyasining sababi bo'lishi mumkin yosh guruhi (Estroff va boshq., 1989; Myers va Anderson, 1991) va gen ekspresyonidagi boshqa uzoq muddatli o'zgarishlar, yosh guruhlari orasida farqAndersen va boshq., 2002). Bundan tashqari, ushbu farqlar asosiy molekulalarning darajasida, jumladan, DFBning o'zi rivojlanish o'zgarishlari bilan o'z-o'zidan tartibga solinishi mumkin. DFF ning yosh guruhlari orasidagi boshlang'ich saviyasidagi farqning potentsial natijalari rat suyaklari o'rtasidagi farqlargaHaile va boshq., 2001). Darhaqiqat, shunga o'xshash jinsiy farqlar sindirilmaydigan sichqonlar orasida topiladi. Bundan tashqari, turli yoshdagi sichqonlarning miyadagi turli xil molekulyar moslashuvlarni yadro gulxanlaridan tashqari ko'rsatishi mumkin. Key molekulalarning genetik modifikatsiyalangan o'zgarishlari va bir vaqtda harakatlanuvchi kuzatishlarga ega bo'lgan periadolen sichqonlardan foydalangan holda qo'shimcha tahlillar ushbu farazlarni ham sinab ko'radi.

Izohlar

    • Qabul qildi Aprel 8, 2002.
    • Tahrir olindi Avgust 6, 2002.
    • Qabul qilingan Avgust 8, 2002.
  • Ushbu ish Milliy Sog'liqni saqlash Institutlari / Milliy Nevrologik Bozoklar Instituti va NS41871 (MEE va EMU) inqirozi Grant P30-DA13429 (EMU) Milliy Instituti tomonidan qo'llab-quvvatlandi.

  • Xat yozishni doktor Mishel E. Ehrlich, Tomas Jefferson universiteti, Curtis 310, 1025 Walnut Street, Filadelfiya, PA 19107 deb nomlash kerak. E-mail: [elektron pochta bilan himoyalangan].

Adabiyotlar

Ushbu maqolaga asoslanib maqola