Cdk5 Dopamin D2 retseptorlari va pastki oqimli signallarni fosforillantiradi (2013)

Sharhlar: Cdk5 ning dopamin D2 retseptorlarini tartibga solishiga sabab bo'lishini ko'rsatadi. Ajablanarlisi shundaki, tarjima faktor deltafosb Cdk5 mahsulotini ishlab chiqaradi.

Jeong J, Park YU, Kim DK, Lee S, Kwak Y va boshq. (2013) PLOS ONE 8 (12): e84482. doi: 10.1371 / journal.pone.0084482

mavhum

Dopamin D2 retseptorlari (DRD2) ruhiy holat, mukofot va hissiyot kabi dopamin bilan bog'liq miya funktsiyalariga vositachilik qiluvchi asosiy retseptor hisoblanadi. Cyclin-dependent kinaz 5 (Cdk5) prolinga yo'naltirilgan salqin va treonin kinaz bo'lib, uning funktsiyasi miya mukofot tizimiga taalluqlidir. Ushbu ishda DRD321 (D321i2) ning uchinchi hujayrali loopidagi serin 2 qoldig'i (S3) Cdk5ning yangi tartibga soluvchi sayt ekanligini aniqladik. D5i321da S2 ning Cdk3-ga qarama-qarshi fosforlanishi in vitro va hujayra madaniyati tizimlari.

Bundan tashqari, S321 ning fosforillanishini DRD2 ning agonist-stimulyatsiya qilingan sirt ekspresyonu va DRD2 ga G oqsili protein bog'lanishiga salbiy ta'sir ko'rsatdi. Bundan tashqari, past oqimdagi cAMP yo'llari, heterolog tizimda va asosiy neyronal madaniyatlarda DRX35ning inhibitiv faolligini kamayganligi sababli p2 nekroz embrionlaridan ta'sirlandi. Ushbu natijalar S5 ning Cdk321 vositachiligi bilan fosforlanishini DRD2 funktsiyasini inhibe qilganligini ko'rsatadi va dopamin signalizatsiyasi uchun yangi tartibga solish mexanizmini ta'minlaydi.

Shakllar

Izoh: Jeong J, Park YU, Kim DK, Lee S, Kwak Y va boshq. (2013) Cdk5 Dopamin D2 retseptorlari bilan fosforli va fosforlarni pastga chastotali signalizatsiyani bartaraf qiladi. PLOS ONE 8 (12): e84482. doi: 10.1371 / journal.pone.0084482

muharriri: Jeyms Porter, Shimoliy Dakota universiteti, Amerika Qo'shma Shtatlari

Qabul qildi: May 20, 2013; Qabul qilingan: Noyabr 14, 2013; Chop etilgan: Dekabr 31, 2013

Mualliflik huquqi: © 2013 Jeong va boshq. Ushbu shartnoma shartlariga muvofiq tarqatiladigan ochiq maqola Creative Commons Attribution litsenziyasi, original muallif va manba hisobga olingan holda, cheklanmagan foydalanish, taqsimlash va har qanday muhitda reproduktsiyani amalga oshirish imkonini beradi.

Moliyalashtirish: Ushbu ish Koreya hukumati tomonidan taqdim etilgan grantlar (NRF-2012R1A2A2A01012923 va NRF-2012R1A4A1028200A2012) tomonidan qo'llab-quvvatlandi va Koreya Respublikasining NRF (2K1A2033117A2031) va Koreya Brain Tadqiqot Instituti (KBRI) tomonidan boshqariladigan xalqaro hamkorlik dasturi doirasida ham qo'llab- MSIPning asosiy tadqiqot dasturi (415-2004). SKP 2006 va XNUMX Shizofreniya va Depressiya tadqiqotlari bo'yicha milliy alyans (NARSAD) yosh tadqiqotchi mukofotlari olindi. Tadqiqotchilar loyihani tayyorlashda, ma'lumotlar to'plashda va tahlil qilishda, nashr qilish yoki maqolani tayyorlashda moliyachilarning ahamiyati yo'q edi.

Raqobatbardosh qiziqishlar: Mualliflar hech qanday raqobatbardosh manfaatlar mavjud emasligini e'lon qildilar.

Kirish

Dopamin signalizatsiyasi turli miya funktsiyalarida, shu jumladan vosita muvofiqlashtirishda, kayfiyatni nazorat qilish va mukofot mexanizmlarida ishtirok etadi [1]. Omurgalılarda dopamin signalizasyonunun asosiy komponenti, dopamin reseptörlerinin bir guruhini selektif bir tarzda ifoda etgan va asosan ventral tegmental olgan (VTA) va substantia nigra (SN) dan olingan dopaminerjik kirishni olgan striatal vosita o'murtqa neyronlar (MSN)) [2]. Dopamin retseptorlari 7 ta transmembran maydonga ega G protein bilan bog'langan retseptorlari (GPCR) va ikkita kichik tipdan iborat bo'lib, Dxamin-shunga o'xshash va D1-o'xshash retseptorlari, dopamin signalizatsiyasidagi o'zaro harakatlarga vositachilik qiladi [1]. Misol uchun, dopamin D1 o'xshash retseptorlari (D1, D5) G orqali adenilil siklaza faollashtiradias va cAMP ning hujayra ichidagi darajasini oshiradi, ammo dopamin D2 o'xshash retseptorlari (D2, D3, D4) G orqali adenilil siklaza inhibe qiladiai va CAMP ning hujayra ichidagi darajasini kamaytiradi [1], [3].

Dopamin retseptorlari orasida D2 retseptorlari (DRD2) shizofreniya va giyohvandlik kabi ko'plab asosiy psixiatrik kasalliklar patofizyologiyasiga taalluqlidir. [4]Shunday qilib, ko'p antipsikotik dorilar kamida qisman DRD2'u maqsad qilib qo'ygan. DRD2 faoliyati hayvon modellarida suiiste'mol qilishning dori-darmon oqibatlari bilan yaxshi bog'liqligi ham ma'lum [5]. Antidepressantlar va kayfiyat stabilizatorlarining samaradorligi shuningdek DRD2 ning hujayra sirtini ifodalovchi o'zgarishlar yoki PKA, ERK va GSK3 vositachiligida pastga yo'naltirilgan hujayra ichidagi signalizatsiya bilan bog'liq. [1], [4], [6]. DRD2 uchun miyadagi bu muhim rollarga qaramay, DRD2 xususiyatlariga heterojenlik va karmaşıklık beruvchi batafsil tartibga mexanizmlar to'liq tushunilmagan.

Birlashtiruvchi dalillar dalillari DRD2 faoliyatini takomillashtirishda bir nechta posttranslatsion modifikatsiyaning ishtirok etayotganligini ko'rsatadi. DRD2 ning keng glikozilatsiyasi erta fotosintezlik etiketleme ishlarida aniqlandi [7]va DRD2 ichidagi disulfide rishtalari shakllanishi ligantga ulanish uchun muhim o'zgarishlar sifatida ham aniqlandi [8]. Bundan tashqari, DRD2ning fosforlanish joylari dastlab aniqlandi in vitro radioizotoplar bilan tahlil qilish, turli kinazlar vositachiligidagi turli tartibga solish usullari uchun marshrutlarni taqdim etish [9]. Haqiqatan ham, protein kinaz S (PKC) hujayra ichidagi kaltsiyning DRD2 orqali vositachiligini boshqaradi va DRD2 ning sitoskeletal oqsillar bilan o'zaro ta'sirini tartibga soladi [10]. GPCR kinaz 2 (GRK2) tomonidan fosforilashish DRD2 ning agonist tomonidan indikatsiyalangan retsenzitizm modellarini tartibga soladi [11].

Cyclin-dependent kinaz 5 (Cdk5) - uning asosiy faollashtiruvchilari miya xos ekspresiyasi tufayli imtiyozli faoliyatga ega bo'lgan prolinga yo'naltirilgan serine / treonin kinaz. p35 va p39 [12]. Cdk5 turli neyronal jarayonlarda, jumladan neyronal migratsiya va akson yo'l-yo'riqlarida ishtirok etadi va Cdk5 va p35 null sichqonlarda kortikal qatlamda nuqsonlar mavjud [13]. So'nggi paytlarda, WAVE1 va ephexinning Cdk5 tomonidan fosforillanishi dendritik o'murtqa morfogenezni [14]. Bundan tashqari, Cdk5 shuningdek, NMDA retseptorlari, NR2B va NR2A-vosita NMDA oqimlarining sirt ifoda darajalarini tartibga soladi [15], [16]. Shuni ta'kidlash kerakki, ko'plab dalillar Cdk5 va dopamin tizimi o'rtasida yaqin munosabatlarga olib keladi. Cdk5 fosforilat tirozin gidroksilaza (TH), uning barqarorligini tartibga soladi va shuning uchun dopaminergik homeostazni [17]. Postinaptik neuronlar, T75 dopamin va siklik-AMP bilan boshqariladigan fosfoprotein-32kD (DARPP-32) fosforilatlangan bo'lsa Cdk5 tomonidan fosforilatlanganda, u PKA faoliyatini inhibe qiladi va shuning uchun dopamin DRD1 vositasida PKA signalizatsiyasini antagonize qilishi mumkin [18]. Qizig'i shundaki, dopamin retseptorlari bilvosita agonisti kokain, kalamushlarda surunkali bo'lib, o'rta mushak nöronlardagi mRNA va Cdk5 protein darajalariga ko'tariladi [19]. Cdk5 birgalikda dori bilan ta'minlangan sinaptik moslamalarga jalb qilingan. Ushbu ishda DRD2 va Cdk5 ning funktsional o'zaro ta'sirini ko'rsatamiz, bu esa dopamin signalizatsiya tizimida Cdk5 rolini yanada kengaytiradi.

Materiallar va usullari

Antikorlar

Quyonga qarshi quyonlar DRD321 (D321i2) uchinchi hujayra ichi loopining fosforik-serine 2 (pS3) ni o'z ichiga olgan peptidlarga qarshi ko'tarildi. Fosfo-peptid, CNPDpSPAKPEK (PEPTRON), afinitni tozalash uchun peptid-konjugent kolon (20401, PIERCE) qilish uchun ishlatilgan. Anti-pS321 antikoru ishlab chiqaruvchining yo'riqnomasidan kelib chiqqan holda afinitni tozalash tizimi bilan boyitildi. Tozalangan fosfano-antikor 0.1% natriy azid va 0.1% jelatin bilan PBSda saqlangan. Cdk5 / p249 ning Western blotting va immunosytochemistry for anti-Cdk35 antikor (sc-820) va anti-quyon anti-p5 antikoru (sc-35) ishlatildi. DRD9996-GFP ning immunoprecipitation va Western blotting uchun anti-mouse anti-GFP antikor (sc-2) ishlatilgan. Anti-quyon anti-FLAG antikoru (sc-807), anti-quyon anti-HA antibody (sc-805), piyodalarga-GST antikor (sc-138) va piyodalarga qarshi-GAPDH antikor (sc- 32293) Santa Cruz Biotexnologiyalaridan xarid qilindi.

Hayvonlar

P35 knockout sichqonchasi, Yaponiyada RIKEN Brain Science Institute'da doktor Katsuhiko Mikoshiba'dan bir xil sovg'a bo'ldi va asosiy nöron madaniyati uchun ishlatildi. Genotyping uchun boshlang'ich silsilasi 5'-GGTCTCCTCTTCTGTCAAGAAG, 5'-GCTCTGCTAGACACATACTGTAC va 5'-TCCATCT GCACGAGACTAGT, ilgari tasvirlanganidek, [20]. ICR sichqonlari va Sprague Dawley faralari miya lizat tayyorlash uchun ishlatilgan. Barcha chorvachilik usullari Poxang Fan va Texnologiya Instituti Hayvonlarni Xizmat va Foydalanish Qo'mitasi tomonidan tasdiqlangan.

Plazmid ishlab chiqaradi

PFLAG-CMV-2 plazmid vektorida EGFP-N1 plazmid vektoridagi inson DRD2ning uzun izoformi va DRD212ning uchinchi hujayralararo loopi (DRNX373 uzoq izoformga xNUMX qo'shimcha amino kislotalar qoldiqlarini o'z ichiga olgan) ishlatilgan. Inson Cdk29 pCMV-HA plazmid vektoriga kiritilgan va inson p2 pcDNA 2 plazmid vektoriga kiritilgan. Inson Cdk5, immüno sitokimyaya, retseptorlarning ichki tuzilishining assotsiatsiyasiga mo'ljallangan ikkilamchi ifoda konstruktsiyasini (Cdk35 / p3.1) yaratish uchun pcNNAX ​​ning p5 bilan birga sitomegalovirus (CMV) promoteri ostida kiritildi [35S] -GTPγS ulash assosiatsiyasi, radioligand ulanish testi va cAMP ferment immunoassay.

In Vitro Kinaz tekshiruvi

IP bilan bog'langan in vitro kinaz tahlil quyidagi tarzda amalga oshirildi. 3 mL eritrosit liziz tamponida (50 mM Tris (pH 8.0), 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% NP-40) 20 zarbalari bilan homogenlangan miya lizatlarini olish uchun bir Dounce homogenizatori . Lizatlar 30 daqiqa davomida muz ustida inkübe qilindi, soniklanadi va 16,000 da santrifüj qilinadi g 10 daqiqa. Supernatantlar faol Cdk35 / p5 kompleksini olish uchun anti-quyon anti-p35 antikor bilan immunopresipitatsiya qilindi. Cdk5 / p35 kompleksi va saflangan GST termoyadroviy oqsili adenosin 5'-triposfat, [g-32P] (NEG-502H, PerkinElmer) va kinaza tamponida (30 mM HEPES (pH 7.2), 10 mM MgCl2, 0.2 mM DTT) xona haroratida 1 soat uchun [18], [21]. Samarali Cdk5 / p25 kompleksi (14-516, Millipore) shuningdek, in vitro kinaz tahlilini o'z ichiga oladi. 2 × namunaviy o'rnatish buferi reaksiya aralashmasiga qo'shilgan va 100 ° C da qaynatilgan. Keyinchalik namunalar SDS-PAGEga bo'ysundirildi va quritilgan gels autoradiografiya bilan baholandi.

Suyuq kromatografi (LK) - Bosh spektrometriyasi (MS) / MS tahlil

Rekombinatlangan GST-D2i3 oqsillari IP bilan bog'liq bo'lgan LC-MS / MS tomonidan tahlil qilingan in vitro kinaz tahlil qilish. Biz X-tandem yordamida LC-MS / MS ma'lumotlarining peptid identifikatsiyasini o'tkazdik (version Dec-01-2008). Har bir RAW ma'lumot fayli trans-proteomik quvur (TPP; versiya 4.3) dan foydalanib, avval mzXML ga aylantirildi. O'tkazilgan mzXML'lardagi MS / MS taramaları UniSTPr sichqonchani protein sekans ma'lumotlar bazasiga (2010_07 versiyasiga), X! Tandem yordamida GST-D2i3 qatorini o'z ichiga oladi. Tolerantlik 3 Da ga prekursor ionlari va 2 Da qismli ionlar uchun o'rnatildi. TRIPS uchun fermentning o'ziga xosligi ishlatilgan. Sistein (57.021 Da), metioninning oksidlanishi (15.995 Da), asparaginning (0.987 Da) gidrolizi va serinning fosforillanish (79.966 Da) uchun karbamidometilasyon uchun o'zgaruvchan modifikatsiyalash usullari ishlatilgan.

Immunoprecipitation

ELB lizis tamponasida hujayra lizatlarida immunopreptitatsiya qilindi. Anti-GFP antikorlari lizatlarga qo'shilib, 3-da 4-da inkübe qilindi. Immunokomplekslar oqsil-A agaroz yordamida tozalanadi. Çökeltiler, 30 ° C'de 37 min uchun SDS namuna o'rnatish tamponu bilan inkübe qilindi va SDS-PAGE va Western blottları ta'siri ostiga olingandi.

GST Pull-down assay

10 igrdan tozalangan GST va GST-D2i3 1.5 ° S uchun 4-soat uchun issiq miya lizat bilan inkübe qilindi. 30 mL glutation (GSH) - ajratilgan Sefarose 4B boncuklari (17-0756-01, GE Healthcare) lizis tampon bilan muvozanatlashgan va qo'shimcha 1 soat uchun inkübe qilingan. Boncuklar, 2,000 × da santrifüjleme yo'li bilan to'plangang va 4 marta buziladigan bufer bilan yuvilgan [22], [23]. Cho'kindilar anti-Cdk5 va anti-p35 antikorlari yordamida Western blotting tomonidan tahlil qilingan.

Immunitetokimyo

Nopoklikda olingan HEK 293 xujayralari va striatal neyronlar bir marta fosfat tamponli sho'r suv bilan (PBS) yuvilgan va 4 min uchun sovuq 30% paraformaldehid / PBS bilan batırılarak sabitlendi. Asosiy antikor blokirovka eritmasida (2% ot sarum va PBS ichida 1% Triton X-100) suyultirildi. Ikkinchi darajali antikorlar sifatida Alexafluor-647-konjuge anti-sichqonchani antikor (A20990, Invitrogen) va Aleksafluor-568-konjuge anti-quyon antikoru (A11011, Invitrogen) ishlatilgan. Hoechst, yadro lekelenmesi uchun ishlatilgan. Rasmlar konfokal mikroskopiya (Olympus, FluoView-1000) yordamida olingan.

Qabul qiluvchilarni ichki tekshirish

Transfeksiyadan keyin 24 soatdan so'ng, xujayralar 1-daqiqada 102 mM kinpirol (Q30, Sigma) va 90-daqiqada 37-daqiqada ishlov berishdi. Hujayralar 2 ml sovuq PBSda qayta susayib, har bir reaksiya uchun 200 mL alikotlardan foydalanildi. Dori-darmonlar xona haroratida 3 soat uchun quyidagi konsentratsiyalarda o'tkazildi; 3 nM [3H] -spiperone (NET-565, PerkinElmer), 3 mM sulpirid (895, TOCRIS), 10 mM haloperidol (H1512, Sigma). Hidrofobik [3H] -spiperon jami ekspreditsion retseptorlari yoritilgani uchun ishlatilgan va membranali retseptorlari bilan bog'langan gidrofil sulfirid [3H] -spiperon signallari. Membran bilan bog'liq retseptorlari signallari hujayra ichidagi retseptorlari qiymatlarini jami ifoda etilgan retseptorlari qiymatlaridan chiqarib hisoblab chiqilgan. Hujayralar GF / B (Millipore) filtrida süzüldü va yuvish tamponu (3 mM Tris-HCl (pH 50), 7.4 mM NaCl) bilan 100 marta yuvindi. Filtrlar quritilgan va qoldiq radioaktivlik suyuq sintilasyon hisoblagich yordamida o'lchandi [24].

Hujayra membranasini tayyorlash

Transfeksiyadan so'ng 100 mm madaniyatli idishdagi konklü hujayralar muzlatilgan PBS bilan yuvilgan va 1 ml HME tamponida (25 mM HEPES (pH 7.5), 2 mM MgCl2, 1 mm EDTA). Homojenize lizatlar 500 min uchun 15 × gan santrifüje qilindi va süpernatanlar 36,000 daqiqa uchun 30 × g bilan santrifüj qilindi. HME tamponida qayta ishlangan pelletlar tajriba uchun ishlatilgan.

[35S] -GTPγS ulash testi

Hujayra membranasi fraktsiyalari tahlil tamponida (1 mM HEPES (pH 102), 25 mM MgCl (7.5 mMCl)) 1.5 mM kinpirol (QXNUMX, Sigma) bilan oldindan inkubatsiya qilingan2, 100 mM NaCl, 1 mm EDTA va 0.01 mM GSYH) uchun 10 min. [35S] -GTPγS (NET-030H, PerkinElmer) 3 nM ning xNUMX nM ning yakuniy konsentratsiyasiga qo'shilgan va 30 min uchun inkubatsiyalangan. 90 mL muzli sovuq tampon (170 mM Tris-HCl (pH 10), 8.0 mM NaCl, 100 mM MgCl2, va 0.1 mM GTP) reaktsiyani to'xtatish uchun qo'shilgan. Membranlar GF / B filtrida (Millipore) suzilgan va yuvish tamponu (3 mM Tris-HCl (pH 50), 7.4 mM NaCl) bilan 100 marta yuvilgan. Filtrlar quritilgan va radioaktivlik sintilasyon hisoblagich yordamida o'lchandi [25], [26].

Radioligand ulanadigan tahlil

Preparatlangan membranalar 0.01 nM bilan inkübe qilindi [3(565 mM HEPES (pH 102), 30 mM MgCl) va 25 min uchun xinpirol (Q7.5, Sigma) kontsentratsiyasining ortib borishi (X-1.5, PerkinElmer)2, 100 mM NaCl, 1 mm EDTA). Membranlar GF / B filtrida (Millipore) suzilgan va yuvish tamponu (3 mM Tris-HCl (pH 50), 7.4 mM NaCl) bilan 100 marta yuvilgan. Reaksiya GF / S filtrlari orqali tez filtratsiya bilan yakunlandi. Qoldiq radioaktivlik suyuq sintilasyon hisoblagich yordamida o'lchandi [27]-[29].

CAMP Enzim Immunoassay

O'tkazilgan HEK 293 xujayralari 10 soat uchun 6520 mM rolipram (R1, Sigma) bilan oldindan tuzilgan va keyin 0.1 mkM forskolin (F6886, Sigma) va 102 min uchun katpirol konsentratsiyasi (Q30, Sigma) bilan ishlangan. Dastlabki madaniyatli striatal neyronlar 10-larni uchun 1 μM rolipram bilan davolangan va undan keyin 1-H uchun 1 μM dopamin [22]. Hujayra lizatalari 0.1 M HCl bilan tayyorlangan va cAMP darajalari ishlab chiqaruvchining ko'rsatmasiga binoan cAMP enzim immunoassay kiti (Sapphire Bioscience) tomonidan aniqlangan.

Asosiy madaniyatli Striatal neyron

Striatal hudud sichqon embrion miyasidan (E15) ajratilgan. 11095 ° C da 0.25% tripsin (T4549-100, Sigma) va 0.1% DNase I o'z ichiga olgan minimal zarur muhitda (MEM) (6, Invitrogen) ajratilgan to'qimalar dissotsiatsiya qilindi. Hujayralar qoplama vositasida (37 M HEPES (pH 0.01) va 7.4% (vol / vol) ot sarig'i (10-16050, GIBCO) bilan qayta ishlangan. Neyronlar 122 kun davomida yetishtirildi in vitro (DIV 7) ning B27 qo'shimcha bilan (17504-044, Invitrogen) MAEM enzim immunoassaylariga qo'llanilishidan oldin.

natijalar

DRD5ning uchinchi hujayra ichidagi loopida Cdk321 fosforli sintezi 2 in vitro

Yangi Cdk5 substratlarini aniqlash uchun Cdk5 aniqlash konsensus sekanslari sifatida (S / T) PX (K / H / R) [30] va nomzod substrat sifatida DRD2 ni aniqladi. 321 seriyasini o'z ichiga olgan konsensus ketma-ketligi DRD2 (D2i3) ning uchinchi hujayrali loopida joylashgan va turli xil tartibga solish mexanizmlari qo'llanilgan [3], [10], [11]. Bu ketma-ketlik DRD2 da umurtqali hayvonlarda evolyutsion ravishda saqlanib qoladi va bu qoldiqning funktsional ahamiyatini (Shakl 1A).

thumbnail

Shakl 1. DRD5 ning uchinchi hujayrali loopida Cdk321 fosforini serine 2 in vitro.

(A) turli turdagi DRD2ning (soyali) himoyalangan hududlarini ko'rsatadigan aminokislota ketma-ketligi. Potensial Cdk5 fosforillanish maydoni yulduzcha bilan ko'rsatiladi. (B) IP bilan bog'langan in vitro kinaz assotsiatsiyasi, GST-D2i3 va GST-D2i3 mutant oqsillari bilan reaksiyaga kirishgan. Kinaz reaktsiyalari uchun anti-p5 immunoprecipitation tomonidan sichqonchani miya ekstrakti boyitilgan Cdk35 / p35 kompleksi ishlatilgan. Fosforli oqsillarning autoradiografiyasi xuddi shu jelning Coomassie porloq moviy binoni bilan birga ko'rsatiladi. Ok tugmasi GST-D2i3sga mos keladigan radioaktiv signali va ochiq-oydin o'qi p35-dan radioaktiv signallarni ko'rsatadi. (C) D2i3 ning fosforli peptid fragmentining MS / MS spektri. Nazariy jihatdan parchalanish naqshlari spektrning quyida ko'rsatilgan. Barcha fragmentlar ionlari orasida y- va b-ionlari spektrda ko'rsatiladi. Y6 va y7 ionlari serin 321 ning fosforillanishini kuchli ko'rsatadi. (D) In vitro GST-D5i25 va GST-D2i3 mutant oqsillarini qo'llagan holda saflaştırılmış Cdk2 / GST-p3 kompleksi bilan kinaz tahlil qilish. Fosforli oqsillar Coomassie parlak ko'k binoni bilan birga autoradiografda ko'rsatildi. Ok tugmachasi tegishli GST-D2i3 radioaktiv signali va ochiq-oydin o'qi GST-p25-dan radioaktiv signallarni ko'rsatadi.

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g001

D5i2ni fosforilash uchun Cdk3 imkoniyatlarini baholash uchun biz IP bilan bog'liq in vitro substrat sifatida tozalangan rekombinat GST-D5i35 (amino kislotalar qoldiqlari 35-2) oqsillari bilan p3 immunoprecipitation orqali sichqonchani miya lizatidan boyitilgan faol Cdk212 / p373 kompleksi yordamida kinazli assaysiyalar. Biz GST-D2i3 va GST-D2i3 S297A oqsillarida fosforillanish signallarini kuzatdik, ammo signal GST-D2i3 S321A (Shakl 1B). GST-D321i2da serin 3 ning fosforillanishini yanada aniqroq tekshirish uchun IP-ga bog'liq bo'lgan namunalarning LC-MS / MS tahlilini o'tkazdik in vitro LKQ XL massa spektrometrisi yordamida kinazli tajribalar. Fosfor-serin 321 peptidlari massasiga mos keladigan fosforopeptidlar doimiy ravishda qayta tiklandi (Shakl 1C). LC-MS / MS taxlilida ma'lumotlarga bog'liq bo'lgan xaridni o'rganish natijasida namunadagi mo'l oqsillarni [31], bu ma'lumotlar salqin 321 qoldig'i D5i2 hududida Cdk3 ning dominant fosforlanish maydoni ekanligini ko'rsatadi. GST-D321i2 da Cdk3 tomonidan serine 5 ning to'g'ridan to'g'ri fosforlanishini isbotlash uchun, in vitro saflaştırılmış rekombinat GST-D5i25 proteinlar bilan saflaştınlmış Cdk2 / GST-p3 kompleksi yordamida kinaz tahlil qilish amalga oshirildi. Biz GST-D2i3 S2A (GST-D3i321 SXNUMXA (GST-DXNUMXiXNUMX SXNUMXA) da yo'qligi uchun GST-DXNUMXiXNUMXda muhim fosforlanish signalini aniqladikShakl 1D). Birgalikda olingan ushbu natijalar D2i3 S321 qoldig'ining Cdk5-vositachilangan fosforillanish uchun imtiyozli maqsad ekanligini ko'rsatadi.

Cdk5 hujayralarda DRD321ning Uchinchi hujayra ichidagi loopida fosforli xlorli fosfatlar

Serin 321ning fosforillanishini aniqlash uchun fosforiksin 321 (pS321) uchun o'ziga xos antikorni ko'tardik. IP bilan bog'langan namunalar in vitro kinazni tahlil qilish anti-pS321 antikor yordamida Western blotting tomonidan tahlil qilingan. Blotlar GST-D2i3 (Shakl 2A). DRD321 da serine 2 ning Cdk5 tomonidan salqin hujayralardagi potentsial fosforlanishini tekshirish uchun, DRD293-GFP va DRD2 S2A-GFP-ni ifodalovchi HEK 321 hujayralarining anti-GFP immunoprecipitatlari HA-Cdk5 yoki p35 bilan yoki bo'lmasdan GFP antivirus yordamida G'arb blokirovkasi bilan tahlil qilindi va anti-pS321 antikorlari. DRD2 ning haddan tashqari glikozilatsiyasidan kelib chiqqan ma'lum bo'lgan anti-GFP antikorlari bilan xarakterli bulgan tovushli signallar faqat DRD2-GFP borligida kuzatiladi va anti-pS321 antikorlari shunga o'xshash DRD2 signallari bilan faqat Cdk5 / p35 co ifodasi bilan aniqlanadi (Shakl 2B) [7]. Cdk321, D5i2 (FLAG-D3i2) va D3i2 mutant shakli (FLAG-D3i2 S3A) tomonidan serin 321 ning fosforilatsiyasini yanada aniqroq tekshirish uchun. HEK 2 hujayralarida HA-Cdk3 va p2 bilan ifoda etilgan FLAG-D3i321 va FLAG-D5i35 S293A SDS-jel harakatlanish smenali assaysi bilan tahlil qilindi. FLAG-D5i2 uchun muhim Cdk3-ga bog'liq harakat harakati kuzatildi, lekin FLAG-D2i3 S321A (Shakl 2C). Shuningdek, SerxNUMX da DRD2ning fosforillanish darajasini agonist stimulyatsiya bilan baholaymiz. DRD321-GFP va Cdk293 / p2 kompleksini ifoda etgan HEK 5 hujayralari kinopirol bilan ogohlantirildi va hujayra lizatlaridan olingan GFP qarshi immunoprecipitatlar GFP va anti-pS35 antikorlari yordamida G'arb blokirovkasi bilan tahlil qilindi. Biz SerxNUMX da DRD321 ning Cdk5 vositachiligi bilan fosforlanishini GRK va PKC vositachiligidan farqli bo'lgan fosforillanishlardan farqli bo'lgan agonist stimuldan ta'sir qilmaganligini aniqladik (Shakl 2D) [32], [33]. Birgalikda, bu natijalar Cdk5 ning hujayra sharoitida DRD321 ning serine 2 qoldig'ini fosforlashtirishi mumkinligini ko'rsatadi.

thumbnail

Shakl 2. Cdk5 xujayralari ichida DRD321 ning uchinchi hujayra ichi loopida serin 2ni fosforilatlaydi.

5 seriyali Cdk321-vositachiligi fosforillanishi anti-pS321 antikoridan foydalanib tahlil qilindi. (A) IP bilan bog'langan namunalar in vitro GST-D2i3 oqsillarini qo'llagan holda kinetik assotsiatsiya antikorlari bilan Western blotting (WB) tomonidan tahlil qilingan. Ok tugmalari GST-D2i3s belgisini bildiradi. (B) DRD2-GFP va DRD2 S321A-GFP HEK 5 hujayralarida HA-Cdk35 va p293 bilan ifodalangan. Anti-GFP immunoprecipitat'lari antifrimal va anti-pS321 antikorlari yordamida Western blotting tomonidan tahlil qilindi. Qavslar DRD2 signallarini ko'rsatadi va ochiq-oydin sarlavha boshi anti-GFP immunoprecipitates dan nonspesifik signallarni ko'rsatadi. "% input" - IP reaktsiyasi uchun jami lizatning miqdori. Zaif endogen Cdk5 signallari yulduzlar bilan ko'rsatilgan. (C) Jelning harakatlanish smenasi. Ko'rsatilgan kabi transfekte qilingan HEK 293 hujayralari Western blotting tomonidan tahlil qilindi. (D) HEK 293 xujayralari transplantatsiya qilinganida quinpirol bilan davolash qilindi va anti-GFP immunoprecipitates antifrimal anti-GFP va anti-pS321 antikorları bilan Western blotting tomonidan tahlil qilindi. Ochiq boshli bosh anti-GFP immunoprecipitates dan nonspesifik signallarni ko'rsatadi.

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g002

Cdk5 / p35 kompleksi va DRD2 jismoniy jihatdan bog'liqdir

Biz Cdk5 / p35 kompleksi va DRD2 o'rtasidagi potentsial jismoniy shovqinni tekshirdik, chunki ko'p Cdk5 substratlari Cdk5 / p35 kompleksi bilan jismonan bog'langanligi ma'lum [23], [34], [35]. Birinchidan, GST pasayish tajribasi amalga oshirildi. Tozalangan rekombinat GST-D2i3 oqsillari rat miya lizati bilan inkubasiya qilindi va G'arbning g'ovakli cho'kindilari G'arbni lektsiyalash uchun tahlil qilindi. Ko'rsatilganidek Shakl 3A, DRD5 va Cdk35 / p2 komplekslari o'rtasidagi jismoniy shovqinni ko'rsatib, endogen Cdk5 va p35 aniqlangan cho'kindilarda aniqlandiShakl 3A). Bundan tashqari, DRD5-GFP va Cdk35 / p293 (HEK 2 hujayra lizatlaridan) anti-GFP immunoprecipitatlarida HA-Cdk5 va p35 aniqlandiShakl 3B). Bundan tashqari, biz immuno-sitokimyoviy tahlillarni o'tkazdik va DRD2-GFP, HA-Cdk5 va p35 HEK 293 hujayralarining membranaviy hududida muhim ko-lokalizatsiya signallarini ko'rsatdiShakl 3C, yuqori panellar). Shuningdek, biz neyronal kontekstda DRD2 va Cdk5 / p35 ning birgalikda joylashishini tekshirdik. DRD2-GFP barqaror ravishda striatal neyronlarda (DIV5) endogen Cdk35 va p7 bilan birgalikda lokalizatsiya ko'rsatdi va DRD2 va Cdk5 / p35 (Shakl 3C, pastki panellar). Natijalar DRD2 va Cdk5 / p35 ning murakkablashishi va shuning uchun DRD2 ning Cdk5 ning fiziologik substrati ekanligini tushunish mumkinligini ko'rsatadi.

thumbnail

Shakl 3. Cdk5 / p35 DRD2 bilan kompleks yaratishingiz mumkin.

(A) RST miya sintezi bilan tozalangan rekombinat GST-D2i3 oqimi yordamida GST pull-down assay. GST cho'kindi cho'kindilari Western blotting analizlariga ta'sir ko'rsatdi. "Boncuk" GST proteynisiz ochiladigan cho'kkani ko'rsatadi. (B) DRD2 va Cdk5 / p35 komplekslarining immunoprecipitatsiyasi. Transfektsion hujayralardan olingan lizatlardan olingan anti-GFP IP G'arb blotting tahlillariga ta'siri. Qavslar DRD2 signallarini ko'rsatadi va ochiq-oydin sarlavha boshi anti-GFP immunoprecipitates dan nonspesifik signallarni ko'rsatadi. O'ngga kirish uchun ortiqcha orzunli blot ham ko'rsatiladi. (C) DRD2 va Cdk5 / p35 ning immunokytokimyoviy tahlillari. DRD293-GFP va Cdk2 / p5ni ifodalovchi HEK 35 hujayralari anti-Cdk5 va anti-p35 antikorlari (Yuqori panellar) bilan bo'yandi. DRD2-GFP madaniyatli striatal neyronlarda yolg'iz va eksklyuziv Cdk5 va anti-p35 antikorlari (pastki panellar) bilan bo'yalgan. Hoechst, yadro lekelenmesi uchun ishlatilgan. O'lchamli satr 5 mkm. Barcha tasvirlar konfokal mikroskop yordamida (Olympus, FluoView-1000) olingan.

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g003

DRD5 ning Cdk2-vositachiligi bilan fosforillanishi retseptorlarning ta'sirini kamaytiradi

Fosforillanish GPCRlarning G protein birikmasi, retseptorlari ichkiizatsiyasi, hujayra ichidagi lokalizatsiya va modulator oqsillari bilan aloqasi kabi muhim xususiyatlarini modulyatsiya qilganligi xabar qilindi [9], [11], [24]. AGontsereya ta'sir qiladigan retseptorlarni ichkiizatsiya qilish signal uzatishni muhim tartibga solish jarayonidir. Biz DRD5 ichkiizatsiyasining Cdk2 vositachiligini modulyatsiyasini tekshirdik. DRD293-GFP va DRD2 S2A-GFP bilan yoki Cdk321 / p5 bo'lmagan yoki bo'lmagan holda chiqaradigan HEK 35 xujayralari agonist sifatida ogohlantiruvchi DRD1 ichkiizatsiyasini (2mM kinpirol bilan inkubatsiya qilindi)Shakl 4A). [3H] -spiperon signallari 2-daqiqada xinpirolli davolashda sezilarli darajada kamaydi va 30 daqiqada tiklandi. Qizig'i shundaki,3DRD2-GFP va Cdk5 / p35 eksperiment hujayralarining H] -spiperon signallari ham 30 minkimpirolli davolashda kamaydi, lekin 90 daqiqada (Shakl 4A, ikkinchi qism). Boshqa tarafdan, [3DRD2 S321A-GFP eksprese qilgan hujayralarni 30 daqiqada pasaytirildi va Cdk90 / p5 bilan birgalikda namoyon bo'lishidan qat'iy nazar 35 daqiqada tiklandi. Avvalgi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, ichaklangan DRD2 uzoq muddatli agonist stimullashda plazma membranasiga qayta aylanadi [11]. TDRD5 ning Cdk2-vositachiligi bilan fosforillanish jarayoni agonist tomonidan kiritilgan DRD2 ichkiizatsiyasidan so'ng rezentsitizatsiya jarayonlarida ishtirok etadi.

thumbnail

Shakl 4. Cdk5 vositachiligidagi fosforilasyon DRD2 sirt iborasini va pastga yo'naltirilgan signalizatsiyani kamaytiradi.

(A) DRD2 sirt iborasi [3H] -spiperon ulash assayini ishlab chiqardi. Transfekte qilingan HEK293 xujayralari, belgilangan vaqt uchun 1 mM kinpirol bilan ogohlantirildi va hosil bo'lgan, keyin 3 nM [3H] -spiperonni 3 soat davomida davolash. Radioaktivlik o'lchandi va sirt signallari hisoblandi. Xato satrlari o'rtacha ± SE ni ifodalaydi (n = 8; * p <0.05, ** p <0.01; Dunnett post hoc testi bilan bir tomonlama ANOVA: barcha ustunlarni boshqarish ustuniga solishtiring). (B) [35S] -GTPγS ulash tajribasi. Hujayra membranalari ko'rsatilgandek transfekte qilingan kameralardan tayyorlangan. Membran preparatlari 1 μM kinpirol bilan inkubatsiya qilindi va keyin 3 nM [35S] -GTPγ90 daqiqa davomida S Xato satrlari o'rtacha ± SE ni ifodalaydi (n = 8; * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001; Bonferroni post hoc testi bilan bir tomonlama ANOVA: barcha juft ustunlarni taqqoslang). (C) Kvinpirol bilan raqobatlashadigan [3H] -spiperon ulash assayini ishlab chiqardi. Transfektsiyalangan kameralardan membran preparatlari 0.01 nM [3H] -spiperon va xinpirolning 30 minut davomida ortib borayotgan konsentratsiyasi. Lineer bo'lmagan regressiya GraphPad tomonidan olingan. Xato satrlari o'rtacha ± SE (n = 3) ni bildiradi. (D) transfekte qilingan HEK 293 hujayralaridagi cAMP fermenti immunoassaylari. Transfektsiya qilingan hujayralar 10 soat davomida 1 µM rolipram bilan oldindan muomala qilindi va keyinchalik 0.1 µM forskolin va 30 minut davomida kinpirol konsentratsiyasining ortishi bilan birgalikda davolandi. Lineer bo'lmagan regressiya GraphPad tomonidan olingan. Xatolar o'rtacha ± SE ni ifodalaydi (n = 4; ** p <0.01; ikki dumli) t- testlar). (E) yovvoyi turdagi va p35 nekroz embrionlaridan (DIV 7) olingan madaniy striatal neyronlar 10 h uchun 1 mM rolipram bilan va 1-daqiqada 1 mM dopamin bilan muomala qilindi. Xato plitalari o'rtacha ± SE (n = 4; **p<0.01; ikki dumli t- testlar).

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g004

Bundan tashqari, Cdk2-vositachilashtirilgan fosforillash bilan bog'liq DRD5ga agonist tomonidan ogohlantirilgan G protein birikmasini potentsial o'zgarishini [35S] -GTPγS ulash tajribasi [25], [26]. DRD2-GFP va Cdk2 / p321 bo'lmagan yoki bo'lmagan holda DRD5 S35A-GFP HEK 293 hujayralarida ifodalangan. Membranlar 1 μM kinpirol bilan tayyorlangan va rag'batlantirilgan va bundan keyin [35S] -GTPγS birlashishi. DRD2-GFP va Cdk5 / p35 hujayra membranasini ekspiratatsiyasi sezilarli darajada buzilganligini ko'rsatdi [35S] -GTPγBarcha boshqa hujayra membranalariga nisbatan SShakl 4B). Ushbu natijalar Cdk5-vositachiligi bilan fosforillanishning DRD2 da agonist-stimulyatsiya qilingan G protein birikmasini pastga-tartibga solishini ko'rsatadi.

Bundan tashqari, quinpirol-raqobatlashuvchi [3H] -spiperton ulash tajribalari Cdk2-vositachiligi bilan fosforillanish orqali DRD5 da agonist-afiniteki mumkin bo'lgan o'zgarishlarni tekshirish uchun bajarilgan. Raqobat bilan bog'lanish [3H] -spiperon xinpirolning kontsentratsiyasini ko'tarishdan keyin membrana preparatiga transfektsiyadan o'lchandi. Xinpirol va [3H] -spiperon DRD2-GFP va DRD2 S321A-GFP da shunga o'xshash logKi (DRD9.789-GFP uchun -2; -9.691, DRD2 S321A-GFP uchun), DRD2 ga ligandning yaqinligi DRD5 da Cdk2 vositachiligi bilan fosforilanmasidan sezilarli darajada ta'sir qilmaganligini ko'rsatuvchiShakl 4C).

Cdk5-vositachiligi bilan fosforillanish Down-DRD2-cAMP signalizatsiya yo'lini boshqaradi

Keyinchalik, DRD2 ning Cdk5 tomonidan modifikatsiyasini pastga yo'naltirilgan signalizatsiya yo'llariga ta'sir qilishini tekshirdik. DRAM2-GFP va DRD2 S2A-GFP ni ifodalovchi hujayralardagi cAMP enzim immunoassayasidan foydalanib, adenilil siklaz yordamida forkolin bilan ogohlantiruvchi cAMP ishlab chiqarishni DRD321 vositasida inhibishini kuzatishdi. DRD2-expressing hujayralari dozaga qaramlik bilan kinopirolga javoban cAMP darajasining kamligini ko'rsatdi. Qayd etish joizki, Cdk5 / p35 ning birgalikda ifodasi cAMP shakllanishining maksimal inhibisyonini sezilarli darajada qisqartirgan (Shakl 4D, chap panel). Boshqa tomondan, DRD2 S321A-GFP eksperiment qilgan hujayralardagi cAMP shakllanishi Cdk5 / p35 (ekspluatatsiya qilishdan qat'iy nazar) ning quinpirolli davolashga javoban samarali tarzda inhibe qilinganShakl 4D, o'ng panel). Ushbu natijalar DRD5 ning Cdk2 vositachiligi bilan fosforlanishini DRD2 ning inhibitorlik faoliyatini past oqimdagi cAMP signalizatsiya yo'lida susaytirayotganligini ko'rsatadi. Keyinchalik fiziologik jihatdan tegishli bo'lgan sharoitda ushbu hodisalarni tasdiqlash uchun asosiy Cdk35 faollashtiruvchisi bo'lgan p5 da etishmayotgan nokaut embrionlaridan birlamchi madaniyatli neyronlardan foydalanganmiz. Dastlabki madaniyatli striatal neyronlar 1mM dopamin bilan davolangan va cAMP enzim immunoassayasi bilan tahlil qilingan. P35 nekroz sichqonlaridan olingan neyronlar dopamin bilan stimullangan vaqtda yovvoyi turdagi neyronlarga nisbatan kamroq cAMP darajasini ko'rsatdi (Shakl 4E). Taken bilan birgalikda DRD5 ning Cdk2 vositachiligini fosforillanish natijalari DRD2 tomonidan qo'llaniladigan cAMP yo'lidagi inhibitiv tonnada pasayishiga olib keladi degan xulosaga keldik.

muhokama

DRD2ni yangi substrat Cdk5 deb aniqladik. Fosforilash DRD2 sirtini ifodalaydi, chunki DRD2 ning retseptorlari ichkiizatsiyasidan so'ng, DRD2 giCAMP yo'lini kesish va pastga tushirish. S321ning fosforillanish qoldig'i DRD2 ning uzun va qisqa izoformlarida mavjud bo'lgani uchun, ushbu tadqiqotda tavsiya etilgan mexanizm DRD2-vositachiligida signalizatsiya jarayonida umumiy tartibga solinishi mumkin.

DRD2 o'rta tirnoqli neyronlarda faqat katta dopamin retseptorlari subtibi sifatida qaraldi, shuningdek, atrof-muhitga ta'sir etuvchi ogohlantirishlarga javob berishda mavjud bo'lgan o'zgarishlarga nisbatan sezuvchanligi uchun ham e'tirof etildi. DRD2 ning agonist tomonidan kiritilgan desensitizatsiyasi va reensitizatsiyasi keng qamrovli o'rganildi [11], [24]. Ayniqsa, bir qator tadqiqotlar, striatal sinapsda dopaminin hujayra tashqari darajasini ko'targan kokain va amfetamin kabi surunkali psikostimülan ta'sir qilish ta'sirini DRD2 postinaptik sifatida dinamik o'zgarishlar bilan birga ko'rsatdi [36]. Haqiqatan ham, surunkali giyoh foydalanuvchilari striatal sohada DRD2 darajasini pasaytirishgan va yadrodagi akumbenslarda (NAcc) DRD2 mavjudligi sichqonchani va primatlarda dori izlash va takomillashtirish bilan bog'liq salbiy munosabatni ko'rsatadi [37]-[39]. Bu topilmalar DRD2 ning funktsional imkoniyatlari surunkali dori ta'siriga, shu jumladan turli ogohlantirishlarga javoban moslashuvchan yoki kompensatsion tartibga solish darajasiga sezilarli ta'sir ko'rsatadi. Bizning natijalarimiz shuni ko'rsatadiki, DRD321 ning uchinchi hujayrali ichak devoridagi S2 qoldig'i Cdk5 tomonidan fosforlanishi mumkin, bu esa DRD2 ning cAMP yo'lidagi inhibitör ta'sirining pasayishiga olib keladi. Ushbu o'zaro ta'sirlar dopaminotseptiv neyronlarda Cdk5 bilan bog'liq bo'lgan yangi tartibga solish mexanizmini taklif qiladi, ular DRD2 sirt mavjudligi dinamik tabiatiga bog'liq bo'lishi mumkin.

Shuni ta'kidlash kerakki, Cdk5 neyronal muhitni uyg'unlashtirilgan o'zgarishlar vositachiligida asosiy komponent hisoblanadi. Misol uchun, limbik devordagi neyronlarda dendritik spinlarning strukturaviy va funktsional o'zgarishlari takrorlangan psixostimulyator ta'sirining natijasidir [40]. Ushbu o'zgarishlarga turli xil molekulyar o'zgarishlar qo'shiladi, jumladan cAMP reaktsiyasi elementi bilan bog'laydigan protein (CREB) va DFB, transkriptsiya omillari, surunkali giyoh qo'llanilishiga [41], [42]. Eng muhimi, Cdk5 - DFBning maqsadi [19], PSD-95, p21-faollashtirilgan kinaz (PAK), b-katenin va spinofilin kabi dendritik o'mush dinamikasiga taalluqli bo'lgan juda muhim tarkibiy qismlar Cdk5 substratlar [43]-[46]. Cdk5 faoliyatining genetik yoki farmakologik manipulyatsiyasi doimiy ravishda dendritik o'murtaning morfologiyasini va giyohga ta'sir o'tkazishni keltirib chiqaradi, bu mezolimbik dopamin davrlarining molekulyar va morfologik o'zgarishlarida Cdk5 uchun muhim rollarni nazarda tutadi [47], [48]. DRD2 ning Cdk5ning yangi maqsadi ekanligini ko'rsatadigan natijalar surunkali dori ta'siriga javoban dopamin tizimining moslashuvchan o'zgarishlarini o'rganish imkonini beradi. Keyinchalik, Cdk5 ning FosB-vositachiligida yuqoriroq regulyatsiyasi DRD2 ning fosforilatsiyasini toniklashtirishi mumkin . Bundan tashqari, DRD2 ko'p hujayrali jarayonlarga, jumladan cAMP va Map kinaz yo'llarini va quyi oqim transkripsiyoniy tadbirlarini [42], [49]. Shunday qilib, ushbu tadqiqot natijalari Cdk2 tomonidan DRD5ning to'g'ridan-to'g'ri tartibini tasvirlash bilan bir qatorda dopamin tizimining surunkali dori ta'siriga moslashuvchan javoblarini yangi tushuntirishni ham ta'minlaydi.

Mualliflar hissasi

Tajribalarni ishlab chiqdi va ishlab chiqdi: JJ YUP DH SKP. Tajribalarni amalga oshirdi: JJ YUP DKK YK. Ma'lumotlarni tahlil qilish: JJ YUP DKK SL YK SAL HL YSG DH SKP. Katkandek reagentlar / materiallar / tahlil vositalari: YHS. Qog'ozni yozib qo'ying: JJ SKP.

Manbalar

  1. 1. Missale C, Nash SR, Robinson SW, Jaber M, Caron MG (1998) Dopamin retseptorlari: tuzilishdan funksiyaga. Physiol Rev 78: 189-225.
  2. 2. Wise RA (2002) Brain mukofot tizimi: noaniq rag'batlardan tushunchalar. Neuron 36: 229-240. doi: 10.1016 / s0896-6273 (02) 00965-0
  3. Maqolani ko'rib chiqing
  4. PubMed / NCBI
  5. Google Scholar
  6. Maqolani ko'rib chiqing
  7. PubMed / NCBI
  8. Google Scholar
  9. Maqolani ko'rib chiqing
  10. PubMed / NCBI
  11. Google Scholar
  12. Maqolani ko'rib chiqing
  13. PubMed / NCBI
  14. Google Scholar
  15. Maqolani ko'rib chiqing
  16. PubMed / NCBI
  17. Google Scholar
  18. Maqolani ko'rib chiqing
  19. PubMed / NCBI
  20. Google Scholar
  21. Maqolani ko'rib chiqing
  22. PubMed / NCBI
  23. Google Scholar
  24. Maqolani ko'rib chiqing
  25. PubMed / NCBI
  26. Google Scholar
  27. Maqolani ko'rib chiqing
  28. PubMed / NCBI
  29. Google Scholar
  30. Maqolani ko'rib chiqing
  31. PubMed / NCBI
  32. Google Scholar
  33. Maqolani ko'rib chiqing
  34. PubMed / NCBI
  35. Google Scholar
  36. Maqolani ko'rib chiqing
  37. PubMed / NCBI
  38. Google Scholar
  39. Maqolani ko'rib chiqing
  40. PubMed / NCBI
  41. Google Scholar
  42. Maqolani ko'rib chiqing
  43. PubMed / NCBI
  44. Google Scholar
  45. Maqolani ko'rib chiqing
  46. PubMed / NCBI
  47. Google Scholar
  48. Maqolani ko'rib chiqing
  49. PubMed / NCBI
  50. Google Scholar
  51. Maqolani ko'rib chiqing
  52. PubMed / NCBI
  53. Google Scholar
  54. Maqolani ko'rib chiqing
  55. PubMed / NCBI
  56. Google Scholar
  57. Maqolani ko'rib chiqing
  58. PubMed / NCBI
  59. Google Scholar
  60. Maqolani ko'rib chiqing
  61. PubMed / NCBI
  62. Google Scholar
  63. Maqolani ko'rib chiqing
  64. PubMed / NCBI
  65. Google Scholar
  66. Maqolani ko'rib chiqing
  67. PubMed / NCBI
  68. Google Scholar
  69. Maqolani ko'rib chiqing
  70. PubMed / NCBI
  71. Google Scholar
  72. Maqolani ko'rib chiqing
  73. PubMed / NCBI
  74. Google Scholar
  75. Maqolani ko'rib chiqing
  76. PubMed / NCBI
  77. Google Scholar
  78. Maqolani ko'rib chiqing
  79. PubMed / NCBI
  80. Google Scholar
  81. Maqolani ko'rib chiqing
  82. PubMed / NCBI
  83. Google Scholar
  84. Maqolani ko'rib chiqing
  85. PubMed / NCBI
  86. Google Scholar
  87. Maqolani ko'rib chiqing
  88. PubMed / NCBI
  89. Google Scholar
  90. Maqolani ko'rib chiqing
  91. PubMed / NCBI
  92. Google Scholar
  93. Maqolani ko'rib chiqing
  94. PubMed / NCBI
  95. Google Scholar
  96. Maqolani ko'rib chiqing
  97. PubMed / NCBI
  98. Google Scholar
  99. Maqolani ko'rib chiqing
  100. PubMed / NCBI
  101. Google Scholar
  102. Maqolani ko'rib chiqing
  103. PubMed / NCBI
  104. Google Scholar
  105. Maqolani ko'rib chiqing
  106. PubMed / NCBI
  107. Google Scholar
  108. Maqolani ko'rib chiqing
  109. PubMed / NCBI
  110. Google Scholar
  111. Maqolani ko'rib chiqing
  112. PubMed / NCBI
  113. Google Scholar
  114. Maqolani ko'rib chiqing
  115. PubMed / NCBI
  116. Google Scholar
  117. Maqolani ko'rib chiqing
  118. PubMed / NCBI
  119. Google Scholar
  120. Maqolani ko'rib chiqing
  121. PubMed / NCBI
  122. Google Scholar
  123. Maqolani ko'rib chiqing
  124. PubMed / NCBI
  125. Google Scholar
  126. Maqolani ko'rib chiqing
  127. PubMed / NCBI
  128. Google Scholar
  129. Maqolani ko'rib chiqing
  130. PubMed / NCBI
  131. Google Scholar
  132. Maqolani ko'rib chiqing
  133. PubMed / NCBI
  134. Google Scholar
  135. Maqolani ko'rib chiqing
  136. PubMed / NCBI
  137. Google Scholar
  138. Maqolani ko'rib chiqing
  139. PubMed / NCBI
  140. Google Scholar
  141. Maqolani ko'rib chiqing
  142. PubMed / NCBI
  143. Google Scholar
  144. 3. Neve KA, Seamans JK, Trantham-Davidson H (2004) Dopamin retseptorlari signalizatsiyasi. J Qabul qilish signallari 24: 165-205. doi: 10.1081 / lrst-200029981
  145. 4. Amar S, Shaltiel G, Mann L, Shamir A, Dean B va boshq. (2008) Shpezofreniyaning patofizyologiyasida post-dopamin D2 retseptorlari signalizatsiya qismlarining ishtirok etishi. Int J Neuropsychopharmacol 11: 197-205. doi: 10.1017 / s1461145707007948
  146. 5. Caine SB, Najuz SS, Mello NK, Patel S, Bristow L va boshq. (2002) Kokainning o'z-o'zini boshqarishida dopamin D2-o'xshash retseptorlarning roli: D2 retseptorlari mutant sichqonlari va yangi D2 retseptorlari antagonistlari bilan tadqiqotlar. J Neurosci 22: 2977-2988.
  147. 6. Lee S, Jeong J, Park YU, Kwak Y, Lee SA va boshq. (2012) Valproat Par-4 protein ekspresyonunun indüksiyonu bilan bog'liq ravishda dopamin signalingini o'zgartiradi. PLoS One 7: e45618. doi: 10.1371 / journal.pone.0045618
  148. 7. Fishburn CS, Elazar Z, Fuchs S (1995) D2 dopamin retseptorlarining uzoq va qisqa izoformlari uchun differentsial glikozilatsiya va hujayra ichidagi odam savdosi. J Biol Chem 270: 29819-29824. doi: 10.1074 / jbc.270.50.29819
  149. 8. Dopamin D1992 retseptorlari bilan bog'lanish: Disulfid va sulfhidril guruhlarining o'rni. Preparat: T. TA, Molina-Xolgado E, Lima L, Boulianne S, Dewar KM (3) 2H raplopride. Neurochem Res 17: 749-759. doi: 10.1007 / bf00969008
  150. 9. NG GY, O'Dowd BF, Caron M, Dennis M, Brenning MR va boshq. (1994) Sf2 hujayralarida inson D9L dopamin reseptorining fosforillanish va palmitoilatsiyasi. J Neurochem 63: 1589-1595. doi: 10.1046 / j.1471-4159.1994.63051589.x
  151. 10. Li M, Bermak JC, Vang ZW, Zhou QY (2000) Dopamin D (2) retseptorlari signalini aktin bilan bog'laydigan protein (ABP-280) yordamida modulyatsiya. Mol Pharmacol 57: 446-452.
  152. 11. Cho D, Zheng M, Min S, Ma L, Kurose H va boshq. (2010) Agonist tomonidan kiritilgan endositoz va retseptorlari fosforillashlari dopamin D (2) retseptorlarining resensitlanishiga vositachilik qiladi. Mol Endokrinol 24: 574-586. doi: 10.1210 / me.2009-0369
  153. 12. Tsai LH, Delalle I, Caviness VS Jr, Chae T, Harlow E (1994) p35 siklinga qaram kinaza 5 ning neyronga oid regulyativ bo'limi hisoblanadi. Tabiat 371: 419-423. doi: 10.1038 / 371419a0
  154. 13. Dhavan R, Tsai LH (2001) CDK5ning o'n yilligi. Nat Rev Mol hujayralari Biol 2: 749-759. doi: 10.1038 / 35096019
  155. 14. TU AK, Ip NY (2007) Cyclinga qaram kinaz 5 dendritik o'murtqa rivojlanish davrida hujayraning tsitoskeletoniga ta'sir ko'rsatadigan hujayralarni belgilaydi. Cell Adh Migr 1: 110-112. doi: 10.4161 / cam.1.2.4617
  156. 15. Cdk2003 faollashuvi to'g'ridan-to'g'ri NMDA retseptorlarini fosforlanish orqali hippokampal CA5 hujayralarining o'limini keltirib chiqarmoqda (Wang J, Liu S, Tuxi Y, Wang JH, Lu Y (1). Nat Neurosci 6: 1039-1047. doi: 10.1038 / nn1119
  157. 16. Jang S, Edelmann L, Liu J, Crandall JE, Morabito MA (2008) Cdk5 tirozin 1472 NR2B ning fosforilatsiyasini va NMDA retseptorlarining sirtini ifodalashni tartibga soladi. J Neurosci 28: 415-424. doi: 10.1523 / jneurosci.1900-07.2008
  158. 17. Moy LY, Tsai LH (2004) Cyclinga qaram kinaz 5 fosforilat tirozin gidroksilaza serin 31 va uning barqarorligini boshqaradi. J Biol Chem 279: 54487-54493. doi: 10.1074 / jbc.m406636200
  159. 18. Bibb JA, Snyder GL, Nishi A, Yan Z, Meijer L va boshq. (1999) DARPP-32 ning Cdk5 bilan fosforilashlanishi neyronlarda dopamin signalini modullashtiradi. Tabiat 402: 669-671.
  160. 19. Bibb JA, Chen J, Teylor JR, Svenningsson P, Nishi A va boshq. (2001) surunkali ta'sirini kokainga ta'siri nöronal protein Cdk5 tomonidan reglamentlanadi. Tabiat 410: 376-380.
  161. 20. Ohshima T, Ogawa M, Veeranna, Hirasawa M, Longenecker G va boshq. (2001) Cytlinga bog'liq kinaz 5 / p35 va Reelin / Dab1 ning sintezator rivojlanish sichqoncha miyasida kortikal neyronlarning joylashishiga sinerjistik hissa. Proc Natl Acad Sci AQSh 98: 2764-2769. doi: 10.1073 / pnas.051628498
  162. 21. Cytlin-dependent kinaz 2004 neyronlarda postsinaptik zichlikdagi PSD-5 proteinining N-terminalini fosforga keltiradi. J Neurosci 95: 24-865. doi: 876 / jneurosci.10.1523-4582
  163. 22. Park SK, Nguyen MD, Fisher A, Luqo deputati, Affar al B va boshq. (2005) Par-4 dopamin signalizatsiyasi va depressiyasini bog'laydi. Hujayra 122: 275-287. doi: 10.1016 / j.cell.2005.05.031
  164. 23. Niethammer M, Smith DS, Ayala R, Peng J, Ko J va boshq. (2000) NUDEL - LIS5 va sitoplazmik dynein bilan birikadigan yangi Cdk1 substrat. Neuron 28: 697-711. doi: 10.1016 / s0896-6273 (00) 00147-1
  165. 24. Kim KM, Valenzano KJ, Robinson SR, Yao WD, Barak LS va boshq. (2001) G-protein bilan bog'langan retseptor kinazlari va beta-tutmalar bilan dopamin D2 va D3 retseptorlarining differentsial regulyatsiyasi. J Biol Chem 276: 37409-37414. doi: 10.1074 / jbc.m106728200
  166. 25. A1998 adenosin va D1 dopamin retseptorlarini suramin va didemetilatsiyalangan suramin (NF2) yordamida differensial ajratish. Mol Pharmacol 037: 53-808.
  167. 26. Bofill-Cardona E, Kudlacek O, Yang Q, Ahorn H, Freissmuth M va boshq. (2000) Calmodulinni D2-dopamin retseptorlari bilan bog'lash G proteini faollashtiruvchi kalitni ushlab turuvchi retseptor signalini pasaytiradi. J Biol Chem 275: 32672-32680. doi: 10.1074 / jbc.m002780200
  168. 27. SJ, Seeman P (1981) ro'yxati [3H] spiperonning miya joylariga bog'langan dopamin va serotonin retseptorlari komponentlari. Proc Natl Acad Sci AQSh 78: 2620-2624. doi: 10.1073 / pnas.78.4.2620
  169. 28. Gardner B, g'alati PG (1998) D2 (uzoq) dopamin retseptorlarida agonist harakat: ligandni bog'lash va funktsional tahlillar. Br J Pharmacol 124: 978-984. doi: 10.1038 / sj.bjp.0701926
  170. 29. Dopamin DPamin dpamin D2003 retseptorlari yuqori distionli joylaridan [3H] domperidonni chiqaradi, ammo izotonik muhitda [2H] raclopride yoki [3H] spiperon emas: inson pozitron emissiya tomografiyasining ta'siri. Synapse 3: 49-209. doi: 215 / syn.10.1002
  171. 30. Obenauer JC, Cantley LC, Yaffe MB (2003) Scansite 2.0: Qisqa ketma-ket motiflardan foydalanib hujayra signalizatsiya qilishning o'zaro bog'liqligi. Nuklein kislota qoldig'i 31: 3635-3641. doi: 10.1093 / nar / gkg584
  172. 31. Liu X, Sadygov RG, Yates JR 3rd (2004) Tasodifiy namunalar olish va ov tüfegi protomikasida nisbiy oqsil miqdorini baholash uchun model. Xamma Xem 76: 4193-4201. doi: 10.1021 / ac0498563
  173. 32. Dopamin D1999 retseptorlarining sintezi G-protein bilan bog'langan retseptor kinazlari 2 yoki 2 ning o'zaro kelishuviga bog'liq. Eur J Biochem 5: 260-112. doi: 119 / j.10.1046-1432.x
  174. 33. Namkung Y, Sibley DR (2004) Protein kinaz S fosforilasyon, desensitizasyon va D2 dopamin retseptorlari savdosiga yordam beradi. J Biol Chem 279: 49533-49541. doi: 10.1074 / jbc.m408319200
  175. 34. Vong AS, Lee RH, Cheung AY, Yeung PK, Chung SK va boshq. (2011) Parkinson kasalligida modifikatsiyalanadigan otofagiya uchun endoxin B5 ning Cdk1-vositachiligi fosforillanishi talab etiladi. Nat Cell Biol 13: 568-579. doi: 10.1038 / ncb2217
  176. 35. Kesavapany S, Lau KF, McLoughlin DM, Brownlees J, Ackerley S, va boshq. (2001) p35 / cdk5 beta-kateninni bog'laydi va fosforli qiladi va beta-katenin / presenilin-1 ta'sirini boshqaradi. Eur J Neurosci 13: 241-247. doi: 10.1046 / j.1460-9568.2001.01376.x
  177. 36. Kuhar MJ, Ritz MC, Boja JW (1991) Kokainning mustahkamlovchi xususiyatlarining dopamin gipotezasi. Trends Neurosci 14: 299-302. doi: 10.1016 / 0166-2236 (91) 90141-g
  178. 37. Volkow ND, Fowler JS, Wolf AP, Schlyer D, Shiue CY va boshq. (1990) surunkali giyoh suiiste'molini postsinaptik dopamin retseptorlari ustiga ta'siri. Am J Psychiatry 147: 719-724.
  179. 38. Dalley JW, Fryer TD, Brichard L, Robinson ES, Theobald, ShU, et al. (2007) Nucleus accumbens D2 / 3 retseptorlari spektr impulsivligini va kokainni kuchaytirishni taxmin qiladi. Fan 315: 1267-1270. doi: 10.1126 / science.1137073
  180. 39. Nader MA, Morgan D, Gage HD, Nader SH, Calhoun TL va boshq. (2006) maymunlarda surunkali giyohni o'z-o'zini boshqarish vaqtida dopamin D2 retseptorlarini PET ko'rsatish. Nat Neurosci 9: 1050-1056. doi: 10.1038 / nn1737
  181. 40. Robinson TE, Kolb B (1997) Amfetamin bilan avvalgi tajriba natijasida ishlab chiqarilgan yadroli akumbens va prefrontal korteks neyronlarida doimiy tizimli o'zgarishlar. J Neurosci 17: 8491-8497.
  182. 41. Robinson TE, Kolb B (1999) Amfetamin yoki kokain bilan takroriy davolanishdan so'ng yadrodagi akumbens va prefrontal korteksdagi dendritlar va dendritik o'moqlar morfologiyasidagi o'zgarishlar. Eur J Neurosci 11: 1598-1604. doi: 10.1046 / j.1460-9568.1999.00576.x
  183. 42. McClung CA, Nestler EJ (2003) CREB va DeltaFosB tomonidan gen ekspressioni va kokain mukofotini tartibga solish. Nat Neurosci 6: 1208-1215. doi: 10.1038 / nn1143
  184. 43. Feng J, Yan Z, Ferreira A, Tomizawa K, Liauw JA va boshq. (2000) Spinofilin dendritik uzuklarning shakllanishi va funktsiyalarini tartibga soladi. Proc Natl Acad Sci AQSh 97: 9287-9292. doi: 10.1073 / pnas.97.16.9287
  185. 44. Prange O, Murphy TH (2001) Ksortikal neyronlarning erta rivojlanishida postinaptik zichligi-95 klasterlarining modulli transporti va barqaror orqa miya prekursorlari bilan aloqasi. J Neurosci 21: 9325-9333.
  186. 45. Murase S, Mosser E, Schuman EM (2002) Depolarizatsiya beta-Cateninni sinonstik struktura va funktsiyalardagi o'zgarishni rag'batlantiruvchi neyronal naychalarga suradi. Neuron 35: 91-105. doi: 10.1016 / s0896-6273 (02) 00764-x
  187. 46. Hayashi ML, Choi SY, Rao BS, Jung HY, Lee HK va boshq. (2004) Transgenik sichqonchaning oldingi salbiy bo'lmagan PAK transgenik sichqonlarida kortikal sinaptik morfologiyani va buzilgan xotira konsentratsiyasini o'zgartirdi. Neuron 42: 773-787. doi: 10.1016 / j.neuron.2004.05.003
  188. 47. Benavides DR, Quinn JJ, Zhong R, Hawasli AH, DiLeone RJ va boshq. (2007) Cdk5 kokain mukofotini, turtki va striatal neyronlarning qo'zg'aluvchanligini modul qiladi. J Neurosci 27: 12967-12976. doi: 10.1523 / jneurosci.4061-07.2007
  189. 48. Meyer ULARNING, Richer E, Benkovic SA, Hayashi K, Kansy JW, va boshq. (2008) Cdk5 ning striatal disregulatsiyasi kokain, motorni o'rganish va dendritik morfologiyaga ta'sir ko'rsatadigan lokomotor javoblarni o'zgartiradi. Proc Natl Acad Sci AQSh 105: 18561-18566. doi: 10.1073 / pnas.0806078105
  190. 49. Impey S, Obrietan K, Storm DR (1999) Yangi ulanishlarni yaratish: Nöronal plastisitada ERK / Map kinaz signallarining o'rni. Neuron 23: 11-14. doi: 10.1016 / s0896-6273 (00) 80747-3