Diabetologiya. 2017; 60 (8): 1502-1511.
Onlayn 2017 may 20 nashr qilindi. doi: 10.1007/s00125-017-4305-4
PMCID: PMC5491592
1mavhum
Maqsadlar / faraz
Oziq-ovqat yog'larining ovlanishi odamlarda va kemiruvchilarda semirishga olib keladi. Odamlar va kemiruvchilarda o'tkazilgan so'nggi tadqiqotlar yog'larga qaramlik miya mukofotlari tizimining disfunktsiyasi nuqtai nazaridan spirtli ichimliklar, nikotin va giyohvand moddalarga qaramlik bilan umumiy mexanizmni payqashini ko'rsatdi. Yuqori yog 'dietasi (HFD) miya mukofot tizimining asosiy regulyatori bo'lgan striatumda dopamin D2 retseptorlari (D2R) signalizatsiyasini kamaytirishi va bu bilan hedonik pishishni keltirib chiqarishi ta'kidlangan. Biz ilgari xabar berdikki, jigarrang guruchga xos bo'lgan bioaktiv tarkibiy γ-oryzanol hipotalamusli nazorat orqali HFD uchun afzallikni kuchaytirdi. Shuning uchun g-oryzanolning sichqonlardagi miya mukofot tizimining ishlashini modulyatsiya qilish imkoniyatini o'rganib chiqdik.
usullari
HFD bilan ta'minlangan erkak C57BL / 6J sichqonlari glyozanol yordamida og'iz orqali davolangan va D2R signalizatsiyasi bilan bog'liq bo'lgan striatal darajadagi molekulalar baholandi. G-oryzanolning D2R promoterining DNK metiligasiga ta'siri va parhez yog'i uchun afzalliklardagi keyingi o'zgarishlar o'rganildi. Bundan tashqari, 5-aza-2'-deoksisitidin, DNK metiltransferazlarining (DNMTs) kuchli inhibitori, oziq-ovqat afzalligi, D2R signalizatsiyasi va striatumdagi DNMTs darajalari ta'siri tekshirildi. G-oryzanolning DNMTlarning faoliyatiga qarshi ta'sirlari in-vitro sifatida enzimatik baholandi.
natijalar
HFD bilan oziqlanadigan sichqonlardan striatumda D2Rlarning ishlab chiqarilishi D2R promoter qismining DNK metilatsiyasida o'sish hisobiga kamaydi. G-oryzanolni og'izdan tatbiq etish DNMTlarning ekspreditsiyasi va faolligini pasaytirdi va shu bilan striatumda D2Rs darajasini tikladi. 5-aza-2-deoksitsitin bilan DNMTlarning farmakologik inhibatsiyasi ham parhez yog'i holatini yaxshilandi. Ushbu topilmalarga muvofiq enzimatik in vitro tajribalar g-oryzanolning DNMTlarning faoliyatini to'xtatib qo'yganligini ko'rsatdi.
Natijalar / talqin
G-oryzanolning sichqonlar striatida D2R ning promoter qismini HFD bilan indikatsiyalangan DNKning gipermetilatsiyasini yaxshilashini ko'rsatdik. Eksperimental paradigmimiz yangi epigenetik modulyator bo'lish xususiyatiga ega umid beruvchi antiobezlik moddasi sifatida g-oryzanolni ta'kidlaydi.
Elektron qo'shimcha material
Ushbu maqolaning onlayn versiyasi (doi: 10.1007 / s00125-017-4305-4) vakolatga ega foydalanuvchilar uchun mavjud bo'lgan qo'shimcha tekshiruvlar, ammo qayta tiklanmagan qo'shimcha materiallarni o'z ichiga oladi.
Kirish
Obez kishilarning iste'mol qilishlari, hech bo'lmaganda qisman spirtli ichimliklar, nikotin va giyohvand moddalarga qaram bo'lgan umumiy mexanizmlar [1]. Hipotalamik va gormonal ishtahani regulyatsiyasi bilan bir qatorda, miya mukofot tizimi, ayniqsa dopamin retseptorlari signalizatsiyasi, giyohvandlik yoki hedonik oziqlantirish bilan chambarchas bog'liq [2]. Sichqoncha ustida o'tkazilgan avvalgi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, striatal dopamin D2 retseptorlari (D2R) ning lentivirus vositachiligi bilan qisqa muddatli shpalning RNKga to'sqinlik qiladigan tezkor taqsimlanadigan giyohvandlikka o'xshash kamchiliklar va majburiy oziq-ovqat izlanishlari [3]. Kichkina D2R zichligi tufayli, dorsal striatum obez odamlarda va kemiruvchilarda yupqa nazorat guruhlari bilan taqqoslaganda oziq-ovqat mukofotiga kam javob beradi [3-5]. Ushbu tushunchaga muvofiq, TaqIA allelasi ANKK1 D2R ishlab chiqarishni kamaytiradigan gen locus (DRD1 / ankyrin takrorlash va 2 ni o'z ichiga olgan kinaz domenini kodlash) insonlarda obez fenotip bilan bog'liq [6], bariatrik jarrohlikdan keyingi kilogrammning yo'qotilishi yuqori striatal D2R zichligi bilan bog'liq [7]. Ushbu ma'lumotlar, striatal D2R'yi obezitenin davolash uchun yangi terapötik maqsad sifatida muhim ahamiyatga ega. Shu bilan birga, miya mukofot tizimida ishlaydigan ba'zi bir dorilar jiddiy psixiatrik muammolar, jumladan, jiddiy salbiy oqibatlarga olib keldi va natijada klinikalardan olib chiqilishi [8].
Epigenetik o'zgarishlar faqat rivojlanish va farqlash uchun emas, balki ekologik o'zgarishlarning natijasida, jumladan, xun va hayot tarzida paydo bo'lishi uchun juda muhimdir [9]. DNK metilasyonu gen ekspressionining barqarorligi uchun bosh epigenetik voqeadir [9]. Sichqonchalarda yuqori yog'li dietaga (HFD) homiladorlik davrida naslda markaziy mukofot tizimi doirasida DNK metilatsiyasini o'zgartiradi, bu esa chaqaloqlarda HFD ni ortiqcha iste'mol qilishiga olib keladi [10]. Xususan, DNK metiltransferazlari (DNMTs) oziqlantirish xatti-harakati va jismoniy faoliyatni tartibga solishda muhim rol o'ynamoqda [10, 11], DNMTlarning obezlik-diabet sindromini davolash uchun terapevtik maqsadlarni va'da qilishlari mumkinligini ko'rsatmoqda. Muhimi, kaffein kislotasi va epigallokatsinni o'z ichiga olgan ba'zi tabiiy oziq-ovqat moddalari DNMT inhibitörleri sifatida ma'lum [12, 13].
Biz so'nggi paytlarda gipotalamik endoplazmik retikulum (ER) stresining kamayishi orqali biologik faol, jigarrang guruchga xos tarkibiy qism, ferulik kislota eritmasi va bir nechta fitosterollarning aralashmasi, xun yog '14]. Sichqoncha va quyonlarda og'iz orqali kiritilgan g-oryzanol tezda ichakdan so'riladi va asosan miyaga tarqatiladi [15, 16]. Ushbu topilmalarni birgalikda qabul qilib, markaziy asab tizimida ishlaydigan tabiiy oziq-ovqat mahsulotlari mahsuloti obezlikda buzilgan oziqlantirish xatti-harakatlarini xavfsizligini yaxshilash uchun alternativ bo'lishi mumkin. Shu nuqtai nazardan, g-oryzanolning miya mukofot tizimida DNKning metilatsiyasi holatini o'zgartirishi haqidagi farazni sinab ko'rdik. Bu esa sichqonlarda HFD ni afzal ko'rishiga olib keldi.
usullari
Hayvonlar
Yaponiyaning Charlz River Laboratories kompaniyasidan (Kanagava, Yaponiya) olingan etti haftalik erkak C57BL / 6J sichqonlari patogenlarsiz maxsus sharoitda 3 ° C da 4 soat / 24 soat yorug'lik ostida joylashtirildi / qorong'u tsikl. Bir haftalik iqlimdan so'ng, 12 haftalik sichqonlar vaznga moslashtirilib, har bir tajribadan o'tish uchun ikki yoki uch guruhga bo'lingan. Sichqonlarga oziq-ovqat va suvdan bepul foydalanish huquqi berildi. Barcha hayvonlar eksperimentlari Ryukyus universiteti hayvonlar eksperimenti axloqiy qo'mitasi tomonidan tasdiqlangan (12, 8 va 5352-sonlar).
G-oryzanol va 5-aza-2'-deoksitsitidinni boshqarish
HFD uchun imtiyozni baholash uchun oldindan aytib o'tilganidek, oziq-ovqat tanlash imtihonida gavaj tomonidan GNUX-xaftalik sichqonlarga gigment yoki gyazonol (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Yaponiya) kiritildi [14, 17]. Boshqa tajribalar uchun 12079% γ-oryzanolni o'z ichiga olgan HFD (D0.4B; Research Diets, New Brunswick, NJ, USA) granul bo'lib ishlab chiqarilgan. Xunning tarkibiy qismlari elektron qo'shimcha materialda (ESM) berilgan 1. 12 xafta ovqatlangandan so'ng striatum va gipotalamusdan to'qima yig'ildi. Sichqonlarning o'rtacha ovqatlanish miqdoridan hisoblangan b-oryzanolning kunlik iste'moli tana vazniga taxminan 320 mg / g ni tashkil etdi. B-oryzanolning dozalari ilgari ta'riflanganidek aniqlandi [14]. 5-aza-2′-deoksitsitidin (5-aza-dC; Sigma-Aldrich, Sent-Luis, MO, AQSh) intraperitoneal in'ektsiya qilindi (tana vazniga 0.25 mg / g) 12 hafta davomida [18].
Oziqlantiruvchi yog'larning afzalligi
Oziqlantiruvchi yog 'uchun imtiyozlarni baholash uchun oziq-ovqat sinovlari chow va HFD (D12450B va D12451; Research Diets)14]. Xun tarkibiy qismlari ESM jadvalida ko'rsatilgan 1. Qisqacha aytganda, sichqonlar chow va HFD-ga bepul kirish huquqiga ega bo'lishdi. Chow va HFD iste'mollari har hafta o'lchangan va parhez yog'iga bo'lgan afzalliklarning o'zgarishi uchun tahlil qilingan. HFD afzalligi quyidagi formula bo'yicha hisoblab chiqilgan: HFD afzalligi = [(HFD qabul qilish / umumiy ovqatlanish) × 100].
DNK metilatsiyasi uchun bisulfit navbati
DNK DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN, Tokio, Yaponiya) yordamida tozalangan. DNK eritmasi yangi tayyorlangan 3 mol / l NaOH bilan aralashtirildi, 37 ° C da 15 daqiqa davomida inkübe qilindi va 5.3 mol / l karbamid, 1.7 mol / l natriy bisulfit va 4.9 mmol / l gidrokinonga qo'shildi. Eritma 15 tsentrda 95 sekund davomida 30 tsentur denatürasyona va 50 daqiqa davomida 15 ° C'de inkübe qilingan.19]. Bisulfite bilan muomala qilingan DNK MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN) yordamida tozalangan va KAPA HiFi HotStart Uracil + ReadyMix PCR vositasi (KAPA Biosystems, Woburn, Ma, AQSh) va PCX orqali kuchaytirilgan D2R . Primer sekanslari quyidagicha edi: oldingi primer, 5'-GTAAGAATTGGTTGGTTGGAGTTAAAA-3 '; teskari primer, 5'-ACCCTACCCTCTAAAACCACAACTAC-3 '. Keyinchalik, Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, Brea, CA, AQSh) yordamida adapter tartiblari qo'shilgan va tozalangan. Keyinchalik namunalar birlashtirildi va ishlab chiqaruvchi protokoli bo'yicha navbati uchun GS Junior (Roche Diagnostics, Tokio, Yaponiya) ustiga qo'yildi. Metilatatsiya darajasi barcha sitosin qoldiqlarida metillangan sitosinlarning ulushi sifatida ifodalangan.
DNMT faoliyat tekshiruvi
DNMT fermenti faolligi assotsiatsiyasi ishlab chiqaruvchi protokoli bo'yicha EpiQuik DNKning metiltransferaza kirish / inhibisyon tekshiruvi vositasi (Epigentek Group, Bruklin, NY, AQSh) va EPIgeneous Methyltransferase Assay kiti (Cisbio Japan, Chiba, Yaponiya) yordamida bajarilgan.
Har bir tarkibni DNK metilatsiyasida inhibitivligini baholash uchun S-adenosil-l-homosistein (SAH) har bir birikma (skrining tahlillari uchun 20 mkmol / l) ishtirokida o'lchandi, S-adenosil metionin (SAM; 10 mkmol / l) va DNMT substrat (4 ng / ml) 37 ° C da 90 minut davomida. Michaelis-Menten kinetikasini baholash uchun DNMT1 (20 mkmol / l) b-orizanol, SAM (5 mkmol / l) va poli dI-dC ning ko'rsatilgan konsentratsiyasi 37 ° C da 90 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi. DNMT3a (100 mkmol / l) va DNMT3b (100 mkmol / l) b-oryzanol, SAM (5 mkmol / l) bilan inkubatsiya qilingan va poli dG · dC ning konsentratsiyasi 37 ° C da 120 daqiqa davomida. Tahlillar to'rt nusxada amalga oshirildi. Ekstrakte qilingan oqsil (0.75 mg / ml) SAM (5 mkmol / l), poli dI-dC (5 mkg / ml) va poli dG · dC (5 mkg / ml) bilan 40 ° C da 120 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi va SAH hosil bo'lishi o'lchandi.
Estrogen bilan bog'liq retseptor-g samaradorligini tekshirish
B-oryzanolning estrogen bilan bog'liq retseptorlari-b (ERRγ) bo'yicha potentsial antagonistik faolligi inson estrogeniga bog'liq retseptorlari Gamma Reporter Assay System (INDIGO Bioscience, State College, PA, USA) yordamida ishlab chiqaruvchining protokoliga muvofiq baholandi. Qisqacha aytganda, faol ERRni tashkil etuvchi sutemizuvchilarning muxbir bo'lmagan hujayralari 24 soat davomida uch nusxada har bir birikmaning ko'rsatilgan kontsentratsiyasiga duch keldi.
Western blotting
Yuqorida aytib o'tilganidek,20] D2R (1: 500, quyon), dofamin tashuvchisi (DAT; 1: 500, quyon), tirozin gidroksilaza (TH; 1: 1000, quyon) (AB5084P, AB1591P va AB152, Merck Millipore, Billerica, MA, AQSh), signal transduser va transkripsiyaning faollashtiruvchisi 3a (STAT3a; 1: 1000, quyon), DNMT1 (1: 1000, quyon), DNMT3a (1: 1000, quyon) (8768, 5032 va 3598-raqamlar; Uyali signalizatsiya texnologiyasi, Tokio, Yaponiya), DNMT3b (1 mg / ml, quyon), ERRγ (1: 1000, quyon) va b-aktin (1: 10,000, sichqoncha) (ab16049, ab128930 va ab6276; Abkam, Kembrij, MA, AQSh).
Raqamli real vaqtda PCR
Gen ekspresyonu ilgari ta'rif qilingan tarzda incelenmiştir [14]. mRNA darajalariga normalize qilindi Rn18s (18S rRNA). Raqamli real vaqtda PCR tahlillari uchun ishlatiladigan primer ESM jadvalida umumlashtiriladi 2.
Statistik tahlil
Ma'lumotlar o'rtacha ± SEM sifatida ifodalanadi. Muvofiq bo'lgan joyda bir tomonlama ANOVA va takroriy o'lchov ANOVA, so'ngra ko'p taqqoslash testlari (Bonferroni-Dann usuli) ishlatilgan. Talaba t ikki guruh o'rtasidagi farqlarni tahlil qilish uchun test ishlatilgan. Turli xil holatlar sezilarli hisoblanadi p <0.05.
natijalar
DNMTlarning 5-aza-dC tomonidan farmakologik inhibatsiyasi sichqonlarda dietal yog'ning afzalligini kuchaytirdi
HFD bilan oziqlanadigan sichqonlarda, striatumdagi D2R ning promoter mintaqasida DNK metilasyonu chaynash dieti bilan ta'minlangan sichqonlarga nisbatan sezilarli darajada oshgan (Fig. (Fig. 1a) .1a). Boshqa tomondan, D2R ning promoter mintaqasida hipotalamik DNK metilasyonu, choy dietasi ostida striatumdan (masalan,p <0.01) (shakl. (Rasm 1a, 1a, f) va HFD tomonidan o'zgartirilgan (Şek. (Fig. 1f) .1f). HFD bilan oziqlanadigan sichqonlarda, striatumdagi D2R ning promoter qismidagi kengaytirilgan DNK metilasyonu 5-aza-dC bilan kuchli DNMT inhibitori bilan regulyatsiya qilingan (Fig. (Fig. 1a) .1a). Aksincha, gipotalamusdagi D2R ning promoter mintaqasida DNK metilasyonu 5-aza-dC bilan davolashda sezilarli darajada o'zgarib bo'lmadi (Fig. (Fig. 1f) .1f). 20 hafta davomida HFD bilan oziqlangan 12 haftalik erkak sichqonlarning striatumida mRNA va D2R oqsil darajasi sezilarli darajada kamaydi (XNUMX-rasm). (Shakl 1b, 1b, k, l). Buning aksincha, dopamin D1 retseptorlari darajalari (D1Rs, kodlangan Drd1), aksincha, adenilil siklaz va CAMP orqali vositachilik qilingan hujayra ichidagi signalizatsiya bo'yicha D2Rsga ta'sir ko'rsatadigan, o'zgarmagan (Fig. (Fig. 1c) .1v). Bundan tashqari, mRNA va / yoki protein darajasida TH va DAT kabi D2R signalizatsiyasi bilan bog'liq boshqa molekulalarning darajasida hech qanday o'zgarish bo'lmadi (6-rasm). (Rasm 1d, 1d, e, k, m). Boshqa tomondan, gipotalamusda, shu jumladan D2R (Fig. (1g-m) .1g-m). Ayniqsa, D2R va TH ning hipotalamusdagi protein darajalari striatumda bo'lganlarga qaraganda ancha past (Fig. (Rasm 1l, 1l, m)balki gipotalamus bilan solishtirganda miya mukofot tizimida dopamin retseptorlari signalining nisbiy ahamiyatini aks ettiradi.
D2R promoteri mintaqasida DNK metilatsiyasining parhez yog'i holatini o'zgartirishi uchun tekshirish uchun 5-aza-dC bilan davolash qilingan sichqonlarning oziqlantirish xatti-harakati tahlil qilindi. Kutilganidek, 5-aza-dC HFD-beriladigan sichqonchalarning striatomida D2R uchun mRNA va protein darajasini sezilarli darajada oshirdi (ular b. (Shakl 1b, 1b, k, l). Boshqa tomondan, darajalariga hech qanday ta'siri yo'q edi Drd1, Th va Slc6a3 (DATni kodlash) striatumda yoki darajalarda Drd2, Drd1, Th va Slc6a3 gipotalamusda (Fig. (Shakl 1c-e, 1c-e, g-m). Transport vositasi bilan ishlov berilgan sichqonchalar HFD ni afzal ko'rsada, 5-aza-dC-davolash qilingan sichqonlarda (HKMX qiymatida vosita bilan ishlov berilgan sichqonchani qiymatining 88%) HFD uchun imtiyoz sezilarli darajada kamaydi (6-rasm). (Fig. 1n) .1n). Natijada, 5-aza-dC bilan davolovchi tana vaznining o'sishini kamaytirdi (Fig. (Qarang: 11u).
g-oryzanol HFD bilan oziqlangan sichqonchalarning striatumida DNMT darajasini pasaytiradi
Avval biz [14], gavaj orqali erkak sichqonlarga gyumrizonolning og'iz orqali kiritilishi HFD uchun afzalliklarni sezilarli darajada kamaytirdi (transport vositasida davolangan sichqon uchun qiymatlarning 93%) (Fig. (Fig. 2a), 2a) tanasining vaznining oshishi natijasida paydo bo'lgan zaiflashuvga olib keladi (Fig. (Fig. 2b) .2b). Shuning uchun g-oryzanolning striatumdagi D2Rlarning epigenetik modulatsiyasiga potentsial ta'sirini o'rganib chiqdik.
Sutemizuvchilardan uchta asosiy DNMTs-DNMT1, 3a va 3b mavjud. DNMT1 funktsiyalari DNKning metillanishini saqlab qolish uchun, DNMT3a va 3b esa nNN DNK metilatsiyasini osonlashtirishda rol o'ynaydi [21]. G-oryzanolning DNMTs ning in vivo jonli ta'siriga ta'sirini o'rganish uchun biz HFD bilan ta'minlangan sichqon miyalarida DNMT darajasini baholaymiz. HFD ning mRNA va protein darajalariga, yoki striatum yoki gipotalamustada hech qanday ta'siri bo'lmasa-da, g-oryzanol bilan qo'shilishi striatum darajasida DNMT darajasini sezilarli darajada kamaytirdi, lekin gipotalamusda emas edi (6-rasm). (Shakl 2c-e, 2c-e, g-i, k-n). Ushbu ma'lumotlar g-oryzanolning DNMT darajasini striatumga xos tarzda boshqarishi mumkinligini oshiradi. Shunga o'xshash tarzda, 5-aza-dC, striatumda DNMT3a va 3b ning mRNA darajasini sezilarli darajada pasaytirdi (ESM. 1a-d).
DNMT1 ning mRNA darajasi, hech bo'lmaganda qisman, yadro retseptorlari ERRy tomonidan ijobiy tartibga solinayotganligini ko'rsatadigan avvalgi tadqiqotlar asosida [22], biz g-oryzanolning ERRb ta'siriga potentsial ta'sirini tekshirdik. Inson bo'lmagan darrandalar hujayralarida faol ERRgni ifodalovchi, ERRg ning kuchli teskari agonisti bo'lgan 4-gidroksi tamoksifen ERRg aktivligini sezilarli darajada kamaytirdi. Shuni ham ta'kidlash kerakki, g-oryzanol ERRg faolligini qisman pasaytirdi (tug'ma qiymatdan taxminan 40% kamayishi) (Fig. (Fig. 3a) .3a). Eng muhimi, ERRy striatumda yuqori darajada ifodalangan, ammo gipotalamusda emas (2-rasm). (Fig. 3b-d) .3b-d). Striatum holatidan farqli o'laroq, g-oryzanol DNMT1 ning protein darajasini faqat gipotalamusda sezilarli darajada oshirdi (Fig. (Rasm 2k, 2k, l). Ushbu natijalarni, hech bo'lmaganda qisman, bizning DNMT3 darajasining ijobiy regulyatori bo'lgan STAT1a [23], ko'pincha gipotalamusda ifodalangan, lekin striatumda emas (2-rasm). (Qarang: 33e-g).
G-oryzanolning in Vivo jonli faolligiga ta'sirini yanada yaxshiroq baholash uchun DNK metilatsiyasining yon mahsuloti va DNMTsning kuchli inhibitori bo'lgan SAH ning shakllanishi HFD bilan oziqlanadigan g-oryzanol bilan davolash qilingan sichqonlarda baholandi. HFD bilan oziqlangan sichqonlar orasida striatum yoki gipotalamusda SAH hosil bo'lishida sezilarli o'zgarishlar bo'lmadi (ular b. (Rasm 2f, 2f, j). E'tibor beradigan bo'lsak, g-oryzanol striatumda SSh shakllanishini sezilarli darajada kamaytirdi (6-rasm). (Fig. 2f) 2f) gipotalamusda emas (Fig. (Shakl 2j), 2j), g-oryzanolning HFD bilan ta'minlangan sichqonlarda DNMTlarning harakatlarini striatum-o'ziga xos tarzda bostirishga olib kelishi mumkinligini bildiradi.
DNMT ning in vitro uchun gyizanolning inhibitiv xususiyatlari bo'yicha enzimatik tahlil
Biz kelgusida g-oryzanolning DNMT ning in vitro ta'siriga ta'sirini baholaymiz. G-oryzanol, ferulik kislota, 5-aza-dC, haloperidol (vakillik D2R antagonisti), quinpirol (D2R vakili) va DNMTlarga qarshi SAHning inhibitor potentsiallari baholandi. Ijobiy nazorat sifatida SAH DNMTlarning faoliyatini doza qaramlik bilan kuchaytirdi (2-rasm). (Fig. 4a-f) .4a-f). Kutilganidek, haloperidol va quinpirol DNMTlarning faoliyatiga ta'sir ko'rsatmadi (ESM shakl. 2). E'tiborli jihatdan, g-oryzanol DNMT1 (IC50 = 3.2 mkmol / l), 3a (IC50 = 22.3 mkmol / l) va 3b (maksimal inhibisyon 57%) (XNUMX-rasm). (Fig. 4d-f) .4d-f). Aksincha, g-oryzanolning metabolitiga mansub ferul kislotasining inhibitiv faolligi g-oryzanolga qaraganda ancha past (Fig. (Qarang: 44d-f).
Biz DNMTlarda g-oryzanolning inhibitiv xususiyatlarini ham o'rganib chiqdik. DNMTlarda in-vitro ta'sirida g-oryzanolning inhibitiv faolligini baholash uchun SAHning shakllanishi baholandi. DNMT orqali mediatsiya qilingan DNK metillanishi davomida SAH shakllanishi haqida ma'lumot, gibsonizol mavjudligi yoki yo'qligi uchun Michaelis-Menten kinetikasining to'yingan naqshini ko'rsatadi (ular b. (4g-i) .4g-i). DNMT1 orqali vosita qilingan DNK metilida Eadie-Hofstee tahlilida g-oryzanolning V max SAH hosil bo'lishining darajasi (vosita, 597 pmol / min; b-oryzanol 2 mkmol / l, 619 pmol / min; b-oryzanol 20 mkmol / l, 608 pmol / min), b-oryzanol esa aftidan K m (transport vositasi, 0.47 mkg / ml; b-oryzanol 2 mkmol / l, 0.67 mkg / ml; g-oryzanol 20 mkmol / l, 0.89 mkg / ml) (rasm. (Fig. 4j) .4j). Ushbu natijalar G-oryzanolning DNMT1 ni hech bo'lmaganda qisman raqobatbardosh tarzda inhibe qilishini ko'rsatadi. Boshqa tomondan, DNMT3a- va 3b vositasida DNK metillanish uchun, g-oryzanol V max SAH hosil bo'lishi (DNMT3a: transport vositasi, 85.3 pmol / min; b-oryzanol 2 mkmol / l, 63.1 pmol / min; b-oryzanol 20 mkmol / l, 42.5 pmol / min; DNMT3b: transport vositasi, 42.3 pmol / min; γ -oryzanol 2 mkmol / l; 28.0 pmol / min, b-oryzanol 20 mkmol / l, 15.0 pmol / min) va shunga o'xshash tarzda K m bu reaksiya uchun (DNMT3a: vosita, 0.0086 mg / ml; b-oryzanol 2 mkmol / l, 0.0080 mkg / ml; b-oryzanol 20 mkmol / l, 0.0058 mkg / ml; DNMT3b: transport vositasi, 0.0122 mkg / ml; γ- oryzanol 2 mkmol / l, 0.0097 mkg / ml; b-oryzanol 20 mkmol / l, 0.0060 mkg / ml). (Rasm 4k, 4k, l). Ushbu natijalar g-oryzanolning DNMT3a va 3b ni hech bo'lmaganda qisman raqobatdosh bo'lmagan tarzda inhibe qilishini ko'rsatadi.
g-oryzanol HFD-beriladigan sichqonchani striatumida D2R darajasini oshiradi
Keyin, g-oryzanolning DNMTs inhibisyonu orqali striatal D2R mazmunini oshirishi mumkinligini sinovdan o'tkazdik. HFD bilan ta'minlangan sichqonlarda G-oryzanolning og'iz orqali yuborilishi D2Rsning promoter qismida striatal DNKning metilatsiyasini sezilarli darajada kamaytirdi (6-rasm). (Fig. 5a), 5a), lekin buni buni gipotalamusda qilmagan (Fig. (Fig. 5f) .5f). Ushbu topilmalar bo'yicha D2R ning mRNA va protein darajalari o'zaro o'zaro kuchaygan (Şek. (Shakl 5b, 5b, g, k, l). 5-aza-dC bilan davolash bo'yicha ma'lumotlarga o'xshash (Şek. (Shakl 1), 1), RNK va protein darajalariga sezilarli ta'sir ko'rsatmadi Drd1, Th va Slc6a3 (DAT) striatumda va uning darajalariga ta'sir qilmaydi Drd1, Th va Slc6a3 gipotalamusda (Fig. (Shakl 5c-e, 5c-e, h-k, m).
Avvalgi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, D2R va DNMT1 darajalari arteriya stressi va yallig'lanish bilan kamida qisman NF-kB [17, 24, 25]. Shuning uchun ERning stress bilan bog'liq va yallig'lanishli genlari darajalarini o'rganib chiqdik. Yuqorida ko'rsatib o'tilganidek [26], HFD TNF-a kodlayan genlarni ifodalaydi (Tnfa), monosit litografiya-xNUMX (MCP-1) (monocyte chemoattractant protein)Ccl2), C / EBP homologli protein (Chop), ER-lokallashtirilgan DnaJ 4 (ERdj4) (Dnajb9) va X-qutini majburiy protein 1 (Xbp1s) gipotalamusda, ammo striatumda emas (2-rasm). (Fig. 6) .6). Ayniqsa, GFD ni glyozanol bilan qo'shib qo'yish, kengaygan ifodasini sezilarli darajada kamaytirdi Ccl2, Chop, Dnajb9 va Xbp1s faqat gipotalamusda, lekin striatumda emas (Fig. (Qarang: 66).
muhokama
Ushbu tadqiqotning asosiy natijasi shundaki, g-oryzanol sichqonlar striatumida kuchli DNMT inhibitörü vazifasini bajaradi va shu bilan hech bo'lmaganda qisman striatal D2R epigenetik modulyatsiyasi orqali HFD ni afzal ko'radi. HFD bilan ta'minlangan sichqonlardan olingan striatumda D2R darajalari sezilarli ravishda pasaygan, D1R, TH va DAT bo'lganlar o'zgarmas edi (Fig. (Shakl 1b-e, 1b-e, k-m). Ushbu ma'lumotlar steratral D2R-ning regulyatsiya qilinishini HFDda oziq-ovqat mukofotini qabul qilishda muhim rol o'ynashini anglatadi va bu obez hayvonlarda HFD ning geyonik ortiqcha iste'moliga olib keladi [3]. Ushbu tadqiqotda 5-aza-dC bilan HFD bilan oziqlangan sichqonlarning davolash striatal D2R darajasini sezilarli darajada oshirdi (Fig. (Shakl 1b, 1b, k, l), ehtimol, D2R ning promoter qismida DNK metilasyon darajasining pasayishi orqali (Fig. (Fig. 1a), 1a), va natijada parhez yog 'uchun imtiyozini zaiflashtirgan (Fig. (Fig. 1n) .1n). Ushbu topilma shuningdek, HFDda oziq-ovqat mukofotini olishda striatal D2Rsning muhim rolini ham qo'llab-quvvatlaydi.
Bizning in vitro assaysida g-oryzanolning DNMTlarga qarshi inhibitiv faolligi, uning metabolit ferul kislotasidan ko'ra kuchliroq ekanligini ko'rsatdi (Fig. (Shakl 4d-f), 4d-f), uning DNMT-larda inhibitiv harakati uchun g-oryzanolning to'liq tuzilishining ahamiyatini ko'rsatib beradi. HFD bilan oziqlangan sichqonlarda, bizning tekshiruvlarimiz, og'iz orqali buyurilganidan so'ng, g-oryzanolning miyani kompleks strukturaga aylantirishi va DNMTlarning striatumdagi darajalari va faoliyatini kamaytirishi va uning promoter mintaqasida DNK metilatsiyasining pasayishi bilan bog'liq. Striatumda D2R. Bundan tashqari, bizning in vitro tadqiqotlarda g-oryzanolning ERRgga qarshi qisman antagonist vazifasini bajarayotganligi namoyon bo'ladi, bu esa asosan DNMT1 ishlab chiqarish uchun ijobiy tartibga soluvchi vazifani bajaradi [22], shuning uchun DNMT1 ning faolligini kamaydi (Fig. (Fig. 3a) .3a). E'tirof etish kerakki, ERRg striatumda yuqori darajada ifodalangan, ammo sichqonlardagi gipotalamustada emas (2-rasm). (Fig. 3b) .3b). Ushbu ma'lumotlar g-oryzanolning DNMT1 ning mRNA darajasini, hech bo'lmaganda qisman, ERRgning inhibisyonu orqali kamaytirish mumkinligini ko'rsatadi. Striatumdan farqli o'laroq, g-oryzanol HFD bilan ta'minlangan sichqonlardan gipotalamusda D2R darajasiga ta'sir ko'rsatmadi (Fig. (Rasm 5g, 5g, k, l).
Boshqa tarafdan, g-oryzanolning gipotalamusda DNMT1 darajasini sezilarli darajada oshirganini ko'rsatdi, ammo striatumda emas (2-rasm). (Rasm 2k, 2k, l). STAT3 DNMT1 tarkibini malign T-lenfoma hujayralarida kuchaytirayotganligini ko'rsatdi [23]. Ayniqsa, ilgari glyatsinanolning HFD bilan oziqlangan sichqonlardan gipotalamusda leptin bilan indikatsiyalangan STAT3 fosforillanishini sezilarli darajada oshirganligini ko'rsatdik [14]. Shuni ta'kidlash kerakki, STAT3a gipotalamusda sezilarli darajada ifodalanadi, ammo sichqonchadagi striatomada emas (2-rasm). (Fig. 3e-g) .3e-g). Bu ma'lumotlar bizga gipergiyalik va striatum orasidagi DNMT1 darajasida g-oryzanol ta'siridagi aniq farqni hech bo'lmaganda qisman SITI3a va ERRg ning hududdagi o'ziga xos sichqon mitida ( Anjir. (Fig. 3b-g) .3b-g). Birgalikda, sichqonlarda striatum va gipotalamus o'rtasida ERRγ va STAT3a ning o'zaro ifodalangan shakli ko'rinadi. Bizning natijalarimiz asosida, ERRy ishlab chiqarish ko'paygan bo'lsa, striatumda, g-oryzanol mRNA darajasini va DNMT1 ning ferment faolligini ERRy ning salbiy regulyatori sifatida kamaytirishi mumkinligi haqida spekulyativ fikr bildiradi. Aksincha, STAT3a ishlab chiqarish dominant bo'lgan gipotalamusda g-oryzanol DNMT1 darajasini afzal ko'rsata oladi.
Yaqinda o'tkazilgan bir ishda, HFD tomonidan indikatsiyalangan striatal D2R signalizatsiyasi susayib borayotganini ko'rsatdi.3], semirib ketganlarni davolash uchun striatal DNMT'lerin inhibisyonunun mumkin bo'lgan ahamiyatga ega ekanligini ilgari suradi. Boshqa tomondan, avvalgi ishda, ma'lum hipotalamik yadrolarda ifodalangan melanokortin retseptorlari 4 genining DNK metilatsiyasining holati, agutli jonli sariq sichqonlardagi obezlikning transgenjensial shakllarini modulyatsiya qilishi mumkinligini ko'rsatdi [27]. Garchi keyingi tadqiqotlar asosiy mexanizmlarni tushuntirishga kafolatlangan bo'lsa-da, bu tadqiqotlar HFD-ning obstruktsiyasining patofizyologiyasida to'qima, gen va sekansga xos DNK metilatsiyasining ahamiyatini ko'rsatadi.
Biz so'nggi paytlarda sichqon pankreatik adacıklarında HFD'nin D2R darajasini oshirganini bildirdik [17, 24]. Bunday o'sishni NF-kB orqali arterial bosim va yallig'lanish bilan hech bo'lmaganda qisman vositachilik qilishi ehtimoldan yiroq, chunki D2R ning promoter qismida bir nechta NF-kB-sezgir elementlar [17, 24]. Bundan tashqari, yaqinda o'tkazilgan tadqiqotlar TNF-a va IL-1β DFQ bilan ta'minlangan sichqonlardan yog 'to'qimasida DNMT1 ning darajasi va faolligini oshirganligini ko'rsatdi [25]. Muhim ma'lumotlarga ko'ra, ushbu izlanish HFD ning striatumda emas, balki gipotalamusda, ayniqsa, Hr stressini va yallig'lanishini indamasligini ko'rsatdi (2-rasm). (Fig. 6) .6). Eksperimental paradigmimizda to'qima, mintaqa va saytga xos DNK metilasyonu va demetilatsiyasining chuqur mexanizmlari keyingi tekshiruvlarni kutish kerak.
Oldingi ma'ruzamiz bilan birga, g-oryzanolning sichqonlardagi ER stressini gipotalamik tartibga solish orqali HFD ni afzal ko'rganligini ko'rsatadigan [14], g-oryzanol, shuningdek, oziqlanish xatti-harakatlarining hemodinamik va metabolik muvozanatining yo'qotilishining yagona xususiyatini ifodalaydi. Rivojlangan ayrim piyodalarga chalinishga qarshi vositalar tanqidiy salbiy ta'sirlarga sabab bo'lganligi [8], miya mukofot tizimiga yo'naltirilgan tabiiy oziq-ovqatga asoslangan yondashuv obezlik-diabet sendromini ishonch bilan davolash uchun mo'ljallangan [16]. Ushbu paradigmada g-oryzanol epigenetik modulyator bo'lishning o'ziga xos xususiyatiga ega istiqbolli antiobezlik nomzodidir.
Rahmatlar
Biz qo'lyozmalarni ko'rib chiqish uchun S. Okamoto (Ryukus universiteti, Yaponiya) uchun minnatdormiz. X. Xirata, H. Kaneshiro, I. Asato va S.Noguchi (Ryukus universiteti, Yaponiya) sekreterlik yordami uchun minnatdormiz.
Qisqartmalar
| 5-aza-dC | 5-aza-2'-deoksisitidin |
| D1R | Dopamin D1 retseptorlari |
| D2R | Dopamin D2 retseptorlari |
| DAT | Dopamin tashuvchi |
| DNMT | DNK metiltransferasi |
| ER | Endoplazmik retikulum |
| ERR | Estrogen bilan bog'liq retseptor |
| HFD | Yuqori yog'li xun |
| SAH | S-Adenosil-1-homosistein |
| SAM | S-Adenosil metionin |
| STAT3a | Signalning transduser va transkriptsion 3a aktivatori |
| TH | Tirotsin gidroksilaz |
Eslatmalar
Ma'lumotlar mavjudligi
Joriy tadqiqot davomida ishlab chiqarilgan va / yoki tahlil qilingan ma'lumotlar to'plamlari tegishli muallifdan oqilona so'rovlar bo'yicha mavjud.
moliyalashtirish
Ushbu ish qisman Yaponiyaning Fanni targ'ib qilish jamiyati (JSPS, KAKENHI Grant Numbers 15K19520 va 24591338), Fan, Texnologiya va Innovatsiya Kengashi (CSTI) tomonidan amalga oshirilgan Grantlar ko'magida, Vazirliklararo Strategik Innovatsiyalarni Rivojlantirish Dasturi (SIP) "Yangi avlod qishloq xo'jaligi, o'rmonchilik va baliqchilikni yaratish texnologiyalari", Lotte fondi, Yaponiyada amaliy enzimologiya, yangi energiya va sanoat texnologiyalarini rivojlantirish tashkiloti (NEDO), "Life Science Network" ) (Okinava prefekturasi, Yaponiya) va Yaponiyaning Okinava prefekturasining tibbiy kümelenmesinin tanitishi loyihasi, ilg'or tibbiyot (Okinawa prefekturasi, Yaponiya) tanlovi uchun Okinava prefekturasi bilan birgalikda.
Qiziqishning ikkiligi
Mualliflar ushbu qo'lyozma bilan bog'liq bo'lgan ikki tomonlama qiziqish yo'qligini e'lon qilishadi.
Taqdimot bayonoti
CK va HM tadqiqotlarni ishlab chiqdi. CK va TK eksperimentlarni o'tkazdi va ma'lumotlarni tahlil qildi. TK, CS-O, CT, MT, MM va KA ma'lumotlarni sharhlashga yordam berdi. CK va XM qo'lyozmasini yozdi. Barcha mualliflar ma'lumotlarni tahlil qilishda yordam berdi. Barcha mualliflar qo'lyozmalarni qayta ko'rib chiqishda qatnashdilar va yakuniy versiyasini tasdiqladilar. HM bu ishning kafolatidir, barcha ma'lumotlarga to'liq kirishgan va ma'lumotlar butunligini va ma'lumotlar tahlilining aniqligi uchun to'liq javobgarlikni o'z zimmasiga oladi.
Izohlar
Elektron qo'shimcha material
Ushbu maqolaning onlayn versiyasi (doi: 10.1007 / s00125-017-4305-4) vakolatga ega foydalanuvchilar uchun mavjud bo'lgan qo'shimcha tekshiruvlar, ammo qayta tiklanmagan qo'shimcha materiallarni o'z ichiga oladi.
Manbalar
;
