Nat Neurosci. Muallifning qo'lyozmasi; PMC da mavjud Jan 1, 2014.
Nihoyasida tahrirlangan shaklda nashr etilgan:
Nat Neurosci. Jul 2013; 16 (7): 10.1038 / nn.3420.
Onlaynda nashr etilgan Jun 2, 2013. doi: 10.1038 / nn.3420
PMCID: PMC3703824
NIHMSID: NIHMS477621
Hui Vang,*,1,2,3 Florian Duklot,*,1,2 Yan Liu,2,3 Zuoxin Vang,2,3 va Mohamed Kabbaj1,2
Nashriyotning ushbu maqolaning so'nggi tahrirlangan versiyasi bilan bu erda tanishishingiz mumkin Nat Neurosci
PMCdagi boshqa maqolalarga qarang keltirilgan nashr qilingan maqola.
mavhum
Ijtimoiy-monogam paxta dalalarida (Mikrotus ochrogaster), juft-juftlik juftlik-sherik tanlovi tomonidan boshlangan va oksitotsin, vazopressin va dopaminni o'z ichiga olgan turli xil neyrotransmitterlar tomonidan tartibga solingan juft-bog'lanishlarni keltirib chiqaradi. Bu erda ikki tomonlama munosabatlarni tartibga soluvchi epigenetik mexanizmlarni ko'rib chiqdik. Biz histon deasetilaza natriy butirat va TrichoStatin A (TSA) inhibitörlerinin çiftleşmemesi taqdirda ayol paxta dalalarida sherik tanlash afzalliklarni engillashtirishini ko'rsatamiz. Bu o'z navbatida ularning promoterida histon atsetiligini oshirish orqali yadrodagi akumbenslarda oksitotsin (OTR) va vazopressin V1a retseptorlari (V1aR) ning maxsus regulyatsiyasi bilan bog'liq. Bundan tashqari, TSA tomonidan qo'llab-quvvatlangan sheriklar uchun afzallik OTR yoki V1aR blokirovkasi tomonidan yadro apparatida himoya qilindi. Muhimki, juftlikning kelib chiqishiga asoslangan sherik imtiyozi TSA sifatida OTR va V1aR gen protokollarini bir xil epigenetik tartibga solishga sabab bo'ldi. Bunday kuzatuvlar shuni ko'rsatadiki, TSA va juftlik epigenetik hodisalar orqali sherikning afzalligini engillashtiradi, bu juft-bog'lanishning epigenetik tartibini belgilovchi birinchi to'g'ridan-to'g'ri dalillarni beradi.
Kirish
Ijtimoiy munosabat insonning ijtimoiy harakatlarining muhim xususiyatidir va ijtimoiy bilim kamchiliklari shizofreniya va autizm spektri kasalliklari, shu jumladan giyohvandlik va depressiya kabi ko'plab nöropsikiyatrik kasalliklardagi umumiy xususiyatlar1. Ijtimoiy-monogam paxta tolasi (Mikrotus ochrogaster) ijtimoiy bog'lanishning neyrobiologik asoslarini o'rganish uchun juda qiziqarli model sifatida paydo bo'ldi, chunki laboratoriya va erkin hayotga ega shaxslar uzoq muddatli juftlik aloqalarini2-4birinchi navbatda sheriklik ustunligiga chaqirilgan sherigiga nisbatan tanlangan affiliatsion xatti-harakatlarning shakllanishi bilan boshlanadi5. Ushbu sheriklik holatining shakllanishi turli nörotransmitterlar va gormonal tizimlar, jumladan oksitosin va vazopressin (AVP) va mesolimbik dopamin5.
In umumiy, sherik tanlov shakllanishi erkaklarda ventral pallid va lateral septum (LS) da AVP neyrotransmpeksiya orqali va nukleus akumbensida (NAcc) oksitotsin nörotransmisyonu va ayol prelimbik korteks6-8.
Odatda, juftlik kabi tabiiy mukofot bilan shug'ullanadiganlar, dopamin ham poraxo'rlikdagi sheriklik holatining muhim vositachisi bo'lib xizmat qiladi. NAcc dopamin D2-turi retseptorlari (D2R) ni faollashtirish dopamin D1-turi retseptorlari (D1R) aktivatsiyasini erkak va ayol juftlaridagi sherik tanlash tartibini inhibe qiladi,9-11.
Muhimki, oksitotsin va AVP V1a retseptorlari, OTR va V1aR ning gen ekspresyonidagi navbatlar, o'z navbatida, sherikning afzalliklariga sezilarli ta'sir ko'rsatishi mumkin. Misol uchun, NAccdagi OTRning ortiqcha namoyishi juftlik yo'qligida sherikning afzal ko'rilishiga yordam beradi.12-14.
Oksitotsin va AVP juftlarni bog'lashni tartibga solishdan tashqari, ijtimoiy ma'rifat, agressiya va onalikni parvarish qilish kabi keng ko'lamli ijtimoiy harakatlarga ham taalluqlidir15, 16. Ayniqsa, kemiruvchilarda keyingi harakatlarning buzilishi epigenetik mexanizmlar orqali uzoq vaqt davom etadigan neyroxodizatsiyani keltirib chiqarmoqda, shu jumladan estrogen retseptorlari alfasining DNK metilatsiyasi17 va AVP genlari18, shuningdek, glyukokortikoid retseptorlari promoterining histon atsetilatsiyasini o'z ichiga oladi19. Bundan tashqari, gormon deasetilaz (HDAC) inhibitörleri, kemiruvchi miya ichida ortdi histon asetilasyonu orqali gen ekspresyonunu kuchaytirish20, bu o'zgarishlarni qaytarishi mumkin19va bevosita jinsiy munosabatda bo'lish kabi ijtimoiy harakatlarga bevosita ta'sir ko'rsatadi21. Eng muhimi, o'pka saratoni hujayra chizig'ida HDAC inhibitörü trichostatin A (TSA), OTR transkripsiyasini to'g'ridan-to'g'ri mahalliy ravishda histon asetilatsiyasini22.
Shu sababli, shtatdagi sheriklar uchun imtiyozlar paydo bo'lishining epigenetik asoslarini taklif qilish mumkin. Ushbu gipotezani sinash uchun avvalo, ikkita HDAC inhibitörünün, natriy butirat (NaB) va TSA'nın, kattalar ayol jinsiy olatni ustidagi sherik imtiyozlarni shakllanishi ta'siri baholandi. Keyinchalik, TSA'nın ayol paxta dalalarida sherik afzalliklarini yaratishda ta'sirini yuzaga keltirgan molekulyar mexanizmlarni araştırdık. Nihoyat, birgalikda yashash vaqtida TSA tomonidan epigenetik o'zgarishlarning juftlashuvi bilan bog'liqligini aniqlashga harakat qildik.
natijalar
TSA davolash hamkorlarning afzalliklarini osonlashtiradi
Jinsiy jinsiy aloqa bilan shug'ullanadigan ayollarni qorin bo'shlig'iga yuborishicv.) 0.08, 0.4 yoki 4ni o'z ichiga olgan CSF yoki CSF bilan n6-soatlik turmushga chiqishdan oldin, TSA bilan bir jinsli erkak bilan birgalikda va ularning sheriklari imtiyozi sinovdan o'tkazildi. Turmush qurmagan erkak bilan birga olti soatlik yashash joylari ayol paxta teshiklarida hamkor tanlash tartibini keltirib chiqarmaydi4 shuning uchun ushbu qiziqishdagi paradigma turli dorilarning sherik tanlovi shakllanishiga yordam berishini baholash uchun keng tarqalgan5.
CSF bilan muomala qilingan hayvonlarni 6 soatlik yashash joyidan so'ng juftlik qilmasdan hamkori yoki begona kishi bilan yonma-yon aloqada bo'lmagant15= 0.76, P = 0.46; Shakl 1a). Shu bilan birga, TSA bilan davolangan hayvonlarning barcha dozalarda sinovdan o'tishi, mushtariyga nisbatan ko'proq vaqt ajratib,t8= 4.35, P = TSA 0.002 uchun 0.08 ng guruhi; t15= 3.63, P = TSA 0.002 uchun 0.4 ng guruhi; va t8= 2.58, P = TSA 0.03 uchun 4 ng guruhi). Eng muhimi, lokomotor faoliyatda guruhdagi farqlar topilmadi (F3,46 = 1.25, P= 0.30, Shakl 1b) va test ayolning begona yoki sherigiga nisbatan tajovuzkor xatti-harakatlari kuzatilmadi, bu esa TSA ta'sirining ijtimoiy holatga xos ekanligini ko'rsatdi, aksincha, lokomotivni o'zgartirish yoki begona odamga nisbatan ijtimoiy nafratni o'zgartirishga o'xshardi.
TSA sheriklik holatini shakllantirishda miya strukturalarida histon atsetilatsiyasini kuchaytirishi kerakligini tekshirish uchun, TSA ning o'rtacha dozasi (0.4 ng) va 30 daqiqada, 2 yoki 9 soat ichida juftlik bo'lmasa, erkak bilan yashagan. Ayniqsa, global xistondagi H3 asetilasyonu (Lys14) darajasida sezilarli o'zgarishlar hech qanday NAcc va kaudat pusamen (har qanday vaqtda)P > Barcha guruhlar uchun 0.05, Shakl.1c & d). Bu NAA ning NAcc yoki kaudat piteni ichida global xronometrik H3 asetilasyonuna ta'sir qilmagan bo'lsa-da, juftlik bo'lmasligi taqdirda, TSA'nın sherik tanlash imtiyozlarni osonlashtirilishini ko'rsatadi.
Eng muhimi, natriy butirat 6 soatlik erkaklar bilan birgalikda erkaklar bilan birgalikda erkaklar bilan birgalikda juftlikdagi ayollarni tanlashda imtiyozlarni engillashtirdi, bu esa NAcc (XI3) aktsilatsiyasini (Lys14)Qo'shimcha 1 shakl). Shunday qilib, TSAni sheriklar uchun imtiyozli shakllantirish ta'siri boshqa HDAC inhibitori bilan qayta ishlab chiqilishi mumkin, bu esa TSA ning hamkorlarning afzal ko'rilishiga yordam berishning o'ziga xos bo'lmagan ta'siri emas, balki HDAC inhibitsiyasini nazarda tutadi. TSA aniq va afine sinf I / II HDAC inhibitori ekanligi e'tiborga olinadi23, 24va TSA ning xulq-atvor effektlari NaBga qaraganda ko'proq aniqlanganligi sababli, tadqiqotning quyidagi qismlarida muayyan molekulyar korrelyatlarni o'rganish uchun NAA orqali TSA dan foydalanishni tanladik.
TSA tomonidan qo'llab-quvvatlangan hamkor tanlovining molekulyar korrelyatsiyasi
Vokta NAccdagi gen ekspression darajalarining o'zgarishi, monogam va monogamsiz teshiklar o'rtasida turli xil juftlashma strategiyalari bilan bog'liq bo'lib, ayniqsa, ayniqsa, pervazlardagi sheriklar uchun afzalliklarni shakllantirishni o'zgartirish bilan bog'liq12, 13, 25, 26, TSA-qulaylashtirilgan sherik imtiyozining shakllanishi NAcc-da gen ekspresyoni o'zgarishi bilan bog'liqligini baholaymiz.
TSA davolash (0.4 ng, icv.) 2 soatlik birgalikda yashash vaqtidan keyin NAQdagi OTR mRNA darajasini CSF bilan muomala qilingan nazoratlarga nisbatan (t10 = 2.38, P = 0.038, Shakl 2a), bu 9 soatlik yashash joyidan so'ng davom etishi kerak edi (t9 = 2.17, P = 0.058, Shakl 2b). V1aR mRNKidagi engil, lekin sezilarli darajada oshmagan bo'lsada, TSA ning in'ektsiyasidan keyingi NAcc 2 soatlarida kuzatilishi mumkin edi, ammo boshqa bir mRNAning o'lchami, jumladan, D1R yoki D2R (P > 0.05, Shakl 2a, b). Eng muhimi, kaudat plyajida har qanday vaqt nuqtasida va har qanday mRNA uchun o'lchangan (P > Barcha guruhlar uchun 0.05, Shakl 2c, g), TSA bilan muomala qilingan hayvonlarda kuzatilgan OTR mRNA o'sishining NAccga xos ekanligini ko'rsatdi. Bundan tashqari, bunday regulyatsiya nafaqat erkaklar bilan birgalikda quyidagi o'zaro kelishuvda mavjud edi, chunki NAccdagi OTR va V1aR mRNA darajalari birgalikda TSA in'ektsiyasidan keyin 2 soat ichida o'zgarmasdan qoldi (OTR: CSN guruhi uchun 100.0% ± 11.70, TSA uchun 86.7% ± 12.11 guruh, t12 = 0.79, P = 0.444; V1aR: CSN guruhi uchun 100.0% ± 26.24, TSA guruhi uchun 92.3% ± 13.75, t9 = 0.27, P = 0.791).
Yuqori OTR mRNA darajalariga muvofiq, TSA bilan muomala qilingan hayvonlar, NAccdagi har ikkala vaqt oralig'ida ham yuqori OTR protein darajasini namoyish qildi (2 soat: t10 = 2.34, P = 0.041; 9 soat: t10 = 3.16, P = 0.01, Shakl 2e, f), lekin kaudat pusamen emas (t10 = 0.41, P = 0.69, Shakl 2g, h). Qizig'i shundaki, V1aR mRNA darajalarining sezilarli o'zgarishi NSAQda 2 yoki 9 soatdan keyin TSA ning in'ektsiyasidan (Shakl 2a, b), V1aR protein darajalari CSN bilan davolash qilingan hayvonlar bilan solishtirganda 9 soatlab sezilarli darajada ko'paygan, NAcc (t9 = 3.46, P = 0.007, Shakl 2f), lekin kaudat pusamen emas (t10 = 0.98, P = 0.35, Shakl 2h). Ba'zi varyasyonlar bilan birga, NACC va kaudat pıtıramında D1R va D2R protein darajalariga TSA ilovasidan mazmunli darajada ta'sir qilmagan (P > 0.05, Shakl 2e-h).
TSA oxtr va avpr1a ning histonli asetilatsiyasini osonlashtiradi
TSA davolashdan so'ng, mRNA va OTR uchun protein darajasining ortishi, TSA, ehtimol, oxtr, oqsilni tarjima qilish yoki aylanishini o'zgartirishdan ko'ra, OTR uchun kodlovchi gen. Bundan tashqari, NAXda V1aR protein darajalari TSA davolashdan keyin mRNA darajasida engil, lekin sezilarli darajada oshmaganligi bilan bog'liqAnjir. 2). TSA kuchli va I va II HDAC inhibitori ekanligini inobatga olgan holda23, 24, 27Biz, TSA'da, histon asetilasyonunu ortdi oxtr va avpr1a NAccdagi targ'ibotchilar, keyinchalik transkripsiyasini kuchaytirdilar. Hayvonlarning yangi partiyasi qabul qilindi icv. TSA ning in'ektsiyasi (0.4 ng) va qurbonlik qilishdan oldin 30 daqiqa davomida juftlik qilmasdan erkaklar bilan birga yashagan. 30-min vaqtli oynasi oldingi ish hisoboti asosida, kalamushlarda va sichqonlarda mahalliy TSA in'ektsiyasidan keyin histon atsetilatsiyasining maksimal ko'payishi asosida tanlangan28, 29. H3X14 atsetilatsiyasida oxtr va avpr1a promoterlar kromatin immunoprecipitation orqali tahlil qilindi.
Oldindan kuzatilgan OTR mRNA va protein darajasining oshishi bilan, TSA bilan muomala qilingan hayvonlarda histon H460 asetilizasiyasida juda yuqori o'sish kuzatildi (+ 3%). oxtr gen promoteri, CSF bilan davolash qilingan tekshiruvlarga nisbatan NAcc (t10 = 5.88, P = 0.0002), lekin kostyum pusamen emas (t9= 0.31, P = 0.76, Shakl 3a). Bundan tashqari, histon H3 asetilasyonu avpr1a NACC (TSA administratsiyasi) dan keyin (+ 30%) keyin promoter 196 min balandlikda ko'tarildit10 = 3.12, P = 0.01), ammo kaudat pusamen emas (t9= 0.38, P = 0.71), CSF bilan muomala qilingan elementlarga nisbatan (Shakl 3b). Shuning uchun, TSA, erkak bilan birga yashash boshlanishidan 30 daqiqadan so'ng, ayniqsa, NAcc'de histon asetilasyon maydonini ziyoda qildi.
TSA OTR va V1aR orqali hamkor tanlashni osonlashtiradi
Ilgari eksperimentlar to'plamidan molekulyar ta'sirchanlik modeli paydo bo'ladi, bu erda birgalikda, TSA stabilizatorda histon atsetilatsiyasini kuchaytiradi. oxtr va avpr1a keyinchalik ularning transkripsiyasini kuchaytirishi va birgalikda yashash davri boshlanganidan keyin 1 soatgacha bo'lgan yuqori OTR va V9aR protein darajalariga erishishiga olib keladi. Eng muhimi, bu TSA ta'siri saytga xosdir, chunki kaudat pomadasi ta'sir etmaydi. Bu erda OTR va V1aRdagi ushbu TSAning sababli ortishi sheriklar uchun imtiyozlarni shakllantirishga bog'liqligini tekshirib chiqdik. Xotin-qizlar peshoblari TSA ichidagi NAKBga qarshi in'ektsiya oldi (0.04ng tomoni) oldindan in'ektsiyalangan yoki bo'lmagan holda (30 daqiqa TSA qarshi, 0.5ng) ikki xil OTR antagonistlaridan, OTA (B) va OTA (T) yoki V1aR antagonistlaridan birini (V1aRA) o'z ichiga olgan CSF yoki CSF. TSA ning in'ektsiyasidan so'ng, urg'ochilar 6 soat jinsiy aloqa qilmasdan erkaklar bilan birga yashab, keyin esa sherik imtiyozi testidan o'tkazildi.
CSF bilan ishlov berilgan hayvonlarning hamkori afzal ko'rmadi (t5 = 0.17, P = 0.87, Shakl 4a). Shu bilan birga, TSA bilan ishlov berilgan hayvonlarni «sherik» bilan yonma-yon aloqada ko'proq vaqt o'tkazib, «begona» ga emas, balki bevosita NAccga yagona TSA in'ektsiyasini juftlashtirmasdan,t5 = 7.04, P = 0.0009). Qizig'i shundaki, OTA (B), OTA (T) yoki V1aRA bilan oldindan davolash orqali OTR yoki V1aR ning blokadasi TSAP > Barcha guruhlar uchun 0.05). Harakatlanish faoliyatida guruh farqlari topilmagani uchun (F4,32 = 1.89, P = 0.14, Shakl 4b), ushbu ma'lumotlar NAccdagi TSA OTR- va V1aR-vositachiligi mexanizmlari orqali xarakatlarga xos tarzda sheriklar uchun afzalliklarni shakllantirishga yordam beradi.
Birgalikda shu kabi neyrookontaktlarni TSA sifatida keltirib chiqaradi
Oldingi kuzatishlarimizdan so'ng, ayol NAccdagi oksitotsin va vazopressin nörotransmissionning epigenetik kuchlanishining juftlik bo'lmasligi sharoitida sherikni tanlash imtiyozini yaratish uchun etarli ekanligini aniqladik. Ushbu neyroxoddastinglar sheriklik holatining tabiiy shakllanishi vaqtida ham paydo bo'ladimi-yo'qligini tekshirish uchun, xotin-qizlar paxta terilari 24 soatda bir erkak bilan yashab, juftlik ishtirokida,4, va qurbonlik qildi. NAcc'taki OTR va V1aR mRNA'sı va protein darajasini jinsiy irsiy ayollarga nisbatan (OTR: + 38%, t10 = 2.68, P = MRN uchun 0.02 va + 58%, t8 = 3.05, P Protein uchun 0.01; V1aR: + 89%, t14= 2.53, P = MRN uchun 0.02 va + 26%, t20 = 2.23, P Protein uchun 0.037 = Shakl 5a, b).
OTR va V1aR uchun mRNA va protein miqdori juftlashuv bilan birga yashash sharoitida ko'payganligi sababli, ushbu keyingi reglamentning epigenetik rivojlanish bilan bog'liqligini tekshirib chiqdik. oxtr va avpr1a genlar transkripsiyasi. Shunday qilib, ayollarning yangi guruhi 6 soatlik erkaklar bilan juftlashgan va H3K14 asetilizatsiyasi bilan birga yashagan. oxtr va avpr1a kromatin immunoprecipitation bilan o'lchanadigan promoterlar. OTR va V1aR mRNA va protein darajalariga mos keladigan ayol platinalar, H3K14 asetilasyonu oxtr va avpr1a NAcc'teki promotörler, jinsiy irsiy ayollarga nisbatan (oxtr: t9 = 2.64, P = 0.02; avpr1a: t9 = 2.91, P = 0.017 Shakl 5c, g). Ushbu ma'lumotlar, ayol jinsiy a'zolardagi sheriklik holatini ishonchli tarzda uyg'unlashtiradigan turg'unlik paradigmalari TSA davolashdan keyin kuzatilganidek, epigenetik mexanizmlar orqali NAccdagi OTR va V1aR ifodalarini yuqorilashga olib keladi.
muhokama
Ushbu ishda, birinchi marta, sherik imtiyozlarni shakllanishi epigenetik tartibga solinishi haqida xabar beramiz. Birinchidan, bir HDAC inhibitörünün tatbiqi bilan NAcc'da histon asetilasyonunun borayotganini, juftlikning yo'qligi bilan birga, kattalar ayol paçal bo'shliqlaridagi sherik imtiyozlarni shakllanishiga yordam beradi ekanligini ko'rsatdik. TShunga qaramay, biz ayollarda sherikning ustunlik shakllanishining epigenetik tarzda boshqarilayotgani haqida to'g'ridan-to'g'ri ma'lumotni taqdim etdik, chunki erkaklar bilan birga yashash va juftlashish oxtr va avpr1a NAcc ichida rivojlangan histon asetilasyonu orqali genlarni ifoda qilish. NAcc tomonidan uyg'unlashtirilgan sherik afzalliklarida TSA boshqaruvi va NAccdagi yuqori OTR mRNA va oqsillarga olib keldi. Bundan tashqari, TSA bilan davolangan ayollarda global xossani H3 asetilatsiyasiga ta'sir etilmaganiga qaramasdan, histon atsetilatsiyasini oxtr NAccdagi targ'ibotchi TSA ma'muriyatidan keyingi 30 daqiqadan so'ng kuzatildi. Va nihoyat, NAccdagi OTRni blokirovkalash TSA tomonidan qo'llab-quvvatlangan hamkor tanlovining oldini olish uchun etarli edi. Shu bilan epigenetik jihatdan o'xshash modifikatsiyalar juftlik bilan birgalikda birgalikda aniqlanganligi sababli, hamkorlar afzalligini uyg'unlashtiradigan muolajalar asosida ma'lumotlarimiz ijtimoiy xatti-harakatlarning epigenetik rejimi uchun modelni taqdim etdi. Derkak, TSA yoki juft bilan birga yashash sharoitida tezkor ravishda ma'lum bir histon H3 asetilatsiyasiga sabab bo'ladi. oxtr NAcc ning promoteri o'z transkripsiyasini kuchaytiradi, natijada yuqori OTR mRNA va protein darajasiga olib keladi, bu esa keyinchalik sheriklar uchun afzallik hosil qilishni osonlashtiradi.
Xotin-qizlar bilan birgalikda, 6 soatlik turmush o'rtog'i bilan juftlashmagan holda, xotin-qizlarning afzal ko'rilishiga sabab bo'lmaydi4, va bu qiziqishlariga paradigma sherik tanlov indüksiyonu ustida iqtisodiyot manipülasyonlarının ta'sirini o'rganish uchun ishlatilgan5. Bizning tadqiqotimizda sho'r yoki CSF bilan muomala qilingan nazoratchilar sheriklik holatini rivojlantirmagani holda, NaB yoki TSA bilan davolangan ayollarni qabul qildilar. NaB va TSA ham umumiy tarqalishni ta'sir qilmagani sababli, ularning sheriklik ustunligiga ta'siri lokomulyatsiya bo'yicha ikkinchi darajali ta'sirlardan ko'ra, xulq-atvorga o'xshash edi. TSA ning ushbu o'ziga xos ta'siri bizning molekulyar kuzatishlarimiz bilan yana tasdiqlandi. Haqiqatan ham, boshqariladigan bo'lsa-da icv. Biz NAccda gen ekspresyonunun ma'lum bir o'zgarishini aniqlay oldik, lekin u erda qo'shni strukturada emas, kaudat plyonkani topdik. Bundan tashqari, NAcc ichida, D1R va D2R mRNA va protein darajalariga ham ta'sir qilmagan. Bunday o'ziga xoslik TSA singari keng HDAC inhibitori uchun ham ajablanarli ko'rinadi, bu ham I va II sinflarga ta'sir ko'rsatadi. Shunga qaramay, TSA darrandalar genomida faqat kichik bir kichik guruhning ifodasini ta'sir ko'rsatishi haqida xabar berilgan30-32, shu jumladan sichqonlar20.
Bu erda, Lys3'teki histon H14'in asetilasyonunu oxtr promoter, kuchli gen transkripsiyasi bilan bog'liq bo'lgan o'zgarishlar, shu jumladan miya yarim plastisiyasida33, 34, yuqori OTR mRNA va protein darajasini ta'kidlaydi. TSA'ya javoban, oxtr promoter inson hujayra chizig'idagi transkripsiyani faollashtiradi va kuchaytiradi22, deb topdi oxtr epigenetik tarzda tartibga solinishi mumkin. NAccdagi OTR mahalliy blokadasi TSAning xatti-harakatlarining oldini olish uchun etarli bo'lganligi sababli, bizning ma'lumotlarimiz, TSHning uyg'unlashuv jarayonida NAQdagi OTR ning ifodalangan ifodasi sheriklar uchun afzalliklarni shakllantirishga yordam beradi. Bundan tashqari, 24 soatlik juftlik bilan birgalikda yashash vaqtida, xotin-qizlarning premer-dog'laridagi sheriklik holatini ishonchli tarzda uyg'unlashtirish uchun ma'lum bo'lgan protsedura ayol NAcc da OTR ifodasini shunga o'xshash tarzda ko'payishiga olib keldi. Oksitotsin va uning retseptorlari ma'lum darajada ayol roliklarida sheriklik holatini shakllantirishning neurobiologiyasida ishtirok etishi bilan to'la muvofiqdir. Mating NAccdagi hujayra tashqari oksitotsin darajasini oshiradi25, Va NAcc ichiga mahalliy oksitotsin infuzioni juftlik bo'lmasa sheriklik holatini shakllantirishga yordam beradi8. Bundan tashqari, OTR antagonistlari oksitotsinni qo'llash yoki juftlash orqali indüktilgan sherik tanlash imtiyozlarini blokirovka qiladi8, 35. Muhimki, ayol NAccdagi OTR ning virusli vositalaridan ortiqcha namoyon bo'lishi sherikning afzal ko'rilishiga yordam berish uchun etarli12, 13.
OTRning rolini kuchaytirishdan tashqari, natijalarimiz juftlik bo'lmasa erkak bilan birgalikda yashash davrida epigenetik mexanizmlar orqali OTR genining ifodasini faollashtirishga dalil ham beradi. Haqiqatan ham, sheriklik holatini uyg'unlashtirish uchun etarli bo'lmasa-da, qisqa muddatlarda juftlashmay turib, bunday turmush tarzi sheriklik imtiyozlarini shakllantiruvchi neyrobiologik jarayonlarni faollashtiradi. Misol uchun, erkakka ikki soatlik erkin ta'sir qilish, ayol NAcc da oksitotsin bilan ajralib turadigan engil, lekin noan'anaviy ko'tarilishlarni keltirib chiqarmaydi25. Shunga ko'ra, TSA yoki NaB erkak bilan birgalikda uyg'unlashtirilgan neyrokodatabatsiyalarni kuchaytiradi, bu esa sherikni rivojlantirishga yordam beradi. Qizig'i shundaki, bu turdagi potentsializatsiya, I va II sinflardagi HDAC inhibitörleri, shu jumladan NaB va TSA, nazorat hayvonlarida uzoq muddatli xotira shakllanishiga olib kelmaydigan o'rganish faoliyati konsolidasyonunu kolaylaştıran kemirgenlerde bildirilgan edi36, 37. Ushbu tushunchani qo'llab-quvvatlash uchun uzoq umr ko'rishMasalan,., 48hours) juftlik bo'lmasa ham, sheriklik holatini uyg'otishi mumkin4. Shuni ta'kidlash joizki, juftlar bilan birga yashashi NAcc-da OTR va V1aR ifodalarini yuqorida tartibga solish bilan bir xil epigenetik mexanizmlar orqali TSA bilan birgalikda kuzatilganidek tetiklasa ham, TSA va juftlik bir xil yo'llarni rivojlantirishga yordam beradi sherik tanlash tartibi. Muhimki, TSA erkaklar bilan birga yashamaslik sharti bilan ayol NAcc'ta OTR va V1aR regulyatsiyasini keltirib chiqarmaydi. Umuman olganda, TSA bu yoki turli xil neuroadaptations ustida faollashtirish o'rniga, erkak bilan birgalikda tabiiy ravishda tetiklenen endojen nörodejenerasyonların kuchayishi orqali sherik imtiyozlarni shakllanishiga yordam beradi farazini qo'llab-quvvatlaydi.
Our tadqiqotida shuningdek, ayolning sheriklar uchun imtiyozli shakllanishida NAcc V1aRning muhim rolini ta'kidlaydi, chunki TSA bilan ishlov berilgan hayvonlarning V1aR darajalari yuqori bo'lib, uning blokadasi TSA-ni osonlashtiradigan hamkor imtiyozlarini shakllantirishga to'sqinlik qildi. Bundan tashqari, bu ta'sirlar, yuqori darajada histon asetilasyonu bilan bog'liq edi avpr1a V1aR mRNA ning sezilarli darajada ko'tarilmasligiga qaramasdan, optimal bo'lmagan vaqt nuqtasi bo'lishi mumkin. Ammo biz histon bo'lmagan oqsillarni asetilatsiyalash orqali TSA tomonidan oqsil barqarorligini tartibga solishni bekor qila olmaymiz38, bu topilma, xuddi shunday oxtr Promouter, TSA rag'batlantirishi mumkin avpr1a mahalliy histon asetilasyonu orqali transkripsiya. AVP ning erkaklar juftligini bog'lab turadigan hissasi tasvirlangan5ayolning xatti-harakatlaridagi roli hali ham ziddiyatli. Bir tomondan, bir icv. AVP in'ektsiyasi ham erkaklarda ham, ayollarda ham V1aR yoki OTR ning blokadasi bilan bartaraf etilgan sheriklar uchun afzalliklarni shakllantirishga yordam beradi.39. Boshqa tomondan, bir icv. V1aR antagonistining in'ektsiyasi erkaklardagi juftlik bilan bog'liq bo'lgan sherik tanlashni bloklaydi, lekin ayollarda emas40. Biroq, bularning barchasi ishlatilgan icv. inyeksiyalar, shu bilan bog'liq bo'lgan tuzilmalar haqida batafsil ma'lumot olishni oldini oladi. Bu erda, NAcc ichidagi AVP nörotransmisyonunun, ayol ustidagi sherik imtiyozlarni shakllanishiga aralashishi mumkinligini ko'rsatadigan birinchi dalil taqdim etamiz, adabiyotning aksariyati, ventral pallidum, lateral septum, yotqiziq yadrosi kabi turli sohalarga aloqadorligini tasvirlaydi. stria terminalis va erkaklarda amigdala5. Shu sababli ayolning NAccdagi OTR yoki V1aR ning blokadasi TSA davolashdan keyin sherikni afzal ko'rishni shakllantirishni oldini olish uchun yetarli ekanligini ta'kidlab, shuni ta'kidlash kerakki, sherikning afzal ko'rilish shakllanishi V1aR va OTR. TUning topilishi, shuningdek, OSP va V1aR ning LS-da bir vaqtning o'zida kirish imkoniyati bo'lgan AVP-individdagi sheriklar uchun afzalliklarga ega bo'lgan erkaklar peshoblarining oldingi kuzatuvlariga mos keladi va qo'llab-quvvatlaydi6. Bundan tashqari, TSA bilan muomala qilingan hayvonlarda OTR va V1aR darajalarining ma'lum bir o'sishini kuzatish, juftlarni bog'lab turish uchun AVP va oksitotsin neyrotransziyalarini bir vaqtning o'zida faollashuvini qo'llab-quvvatlaydi.
Oksitotsin va AVP bilan birgalikda NAccdagi dopamin nörotransmisyonu, ayol ustunlaridagi sherik tanlash tartibini modul qiladi9. Juftlik NAccda dopamin salınımını indüklerse-da9, retseptorlari darajasidagi o'zgarishlar faqat uzoq vaqtdan keyin kuzatiladi - 24h-dan ko'proq juftlik bilan birga yashash, juftlarni bog'lash uchun muhimdir10. Ushbu kuzatishlar bo'yicha, TSA bilan davolangan ayol platelet dopamin D1R va D2R retseptorlarida sezilarli o'zgarishsiz hamkor tanlovini namoyish qildi. Shuning uchun, bu dopamin retseptorlari regulyatsiyasi yo'qligi TSAning o'ziga xosligini yana bir bor tasdiqlaydi.
Bizning ma'lumotimiz birinchi marta juft-bog'lanish nevrologiyasidagi epigenetik tarkibiy qism bo'lib, TSA "xotin-qizlar" jinslaridagi "ruxsat beruvchi holat" ni keltirib chiqaradi va bu bilan birgalikda yashash uchun tabiiy molekulyar javobni kuchaytiradi va kuchli ijtimoiy shovqinlarni shakllantirishga yordam beradi sheriklik holatiga olib keladi. Shu sababli, TSA tomonidan qo'llab-quvvatlangan sherikning afzalligi yanada mustahkamlanib, doimiy aloqaga olib kelishi mumkinligini taxmin qilish qiyin. Garchi tegishli HDAClar identifikatsiyalanadigan bo'lsa-da, TSA-ni selektiv tajovuz va ikkita ota-ona parvarishlash kabi monogam hayoti strategiyasiga aloqador boshqa xatti-harakatlarga ta'sirini tadqiq qilish qiziqarli bo'ladi. Odamlarda juftlik bilan bog'lashning neyrobiologik mexanizmlarini modellashtirishda pririya teshiklarining ahamiyatini hisobga olgan holda5, va klinik tadkikotlar allaqachon istiqbolli HDAC inhibitörleri24, 41, 42, bizning ma'lumotlarimiz yangi farmakologik imkoniyatlar ijtimoiy harakatlarga ta'sir o'tkazish uchun yo'l ochib beradi.
usullari
Mavzular
Jinsiy aloqa bilan shug'ullanadigan ayollarMikrotus ochrogaster) laboratoriya naslchilik koloniyasidan 21 kunida em-xashaklangan va bir jinsli jinsiy qardoshlar juftligida (12 × 28 × 16 sm) suv va oziq-ovqat bilan ta'minlangan ad libitum. Barcha hujayralar 14: 10 h nurli zulmat davrida saqlanib, harorat taxminan 20 ° C edi. Barcha hayvonlar 70-90 kunlik yoshga etganida tasodifiy eksperimental guruhlarga ajratildi. Foydalanilayotgan hayvonlarning soni bizning guruh va boshqalar tomonidan avvalgi tadkikotlar asoslangan bo'lib, kuch-tahlil bilan birlashtirildi. Tajriba protseduralari Florida Davlat Universitetida Institutsional Hayvon Qo'llab-quvvatlash va Foydalanish Qo'mitasi tomonidan tasdiqlangan.
Preparatlar
Sun'iy serebrospinal suyuqlik taşıyıcıda (CSF, BioFluids, Rockville, MD) eritilgan natriy bütirat (NaB), sho'r eritilgan va Trikostatin A (TSA) Sigma-Aldrich (St Louis, miloddan avvalgi) dan sotib olingan. NaBga intraperitoneal (ip) 600 mg / kg dozasida, sichqonchani bir necha miya tuzilmalarida histon asetilatsiyasini induktsiya qiladigan ma'lum43, 44. Xuddi shunday, TSA uchun foydalaniladigan dozani o'lchov oralig'i oldingi ishlarga asoslanib, mahalliy xiston atsetilatsiyasi voqealarini va kemiruvchilarda gen ekspresyonidagi o'zgarishlar19, 20. Selektiv V1aR retseptorlari antagonisti V1aRA, d(CH2)5[Tyr (Me)] AVP va OTR antagonisti OTA (B), [d(CH2)5, Tyr (Me)2, Thr4, Tyr-NH29] -OVT), Bachem (Torrance, KA) dan olingan. Ikkinchi, ko'proq tanlangan OTR antagonisti, OTA (T), dGly-NH2-d(CH2)5 [Tyr (Me))2, Thr4] OVT45, doktor Mauris Manning (Toledo universiteti, OH) tomonidan yaxshi ta'minlangan. Amaldagi bu antagonistlar va dozalar, oldingi tadkikotlar V1aR yoki OTR uchun selektivligini ko'rsatgan holda navbati bilan tanlangan35, 39, 46-49.
Stereotaksik kanülasyon va mikroenjeksiyon
Ayollar natriy pentobarbital (1mg / 10g tana vazniga) va 26 o'lchovli zanglamas po'latdan yasalgan yo'riqnomalar (Plastika One, Roanok, VA) natriy pentobarbital bilan behushlik bilan og'riydilar (lateral qorincha uchun mo'ljallangan, bir tomonlama ravishda, burunli satr -2.5 mm, 0.6 mm rostral, 1.0 mm lateral va 2.6 mm ventraldan bregma) yoki maxsus joyga NAcc (ikki tomonlama burunli satrda -2.5 mm, 1.7 mm rostral, ± 1.0 mm ikki tomonlama va 4.5 mm ventraldan bregma). 3 kunlik tiklanishdan so'ng, sub'ektlar CSA yoki CSA ning turli konsentrasiyalarini o'z ichiga olgan CSI mikroekrozyonlarini oldi. OTR yoki V1aR uchun selektiv antagonistlar qo'llanilganda ular TSAdan 30 daqiqa oldin AOK qilingan. 33 o'lchagichli igna yordamida 1 mm o'qi bo'ylab hidoyat kanülünden maqsad mintaqaga, 500 nL ning qarshi hajmida lateral qorincha ichiga (icv.) yoki NAcc ning har bir tomoni uchun 200 nL. Igna polietilen-20 quvurlari orqali Hamilton shpritsiga (Hamilton, Reno, NV) ulangan va punger tushishi asta-sekin bajarilgan bo'lib, u har bir 1 daqiqasiga to'g'ri keladi. Tajribaning oxirida barcha sub'ektlar tez dekapitatsiya bilan qurbon qilingan va miyani eksperimental sharoitlarda ko'r bo'lgan kuzatuvchining kanül joylashishini tekshirish uchun olingan. Yomon bo'lmagan kanula ega bo'lgan narsalar ma'lumotlarni tahlil qilishdan chiqarildi.
Birgalikda yashash va sherik tanlash imtihoni
Shundan so'ng ip., icvyoki giyohvand moddalarni in'ektsiya yo'li bilan qabul qilmasa, urg'ochi erkak bilan 6 soatlar orasida juftlashmasdan yashagan. Juftlikning yo'qligi videotasmaga qo'yilgan xatti-harakatni tekshirish orqali tekshirildi. Oila a'zolari bilan birgalikda yashashga olib keladigan neyrokaydartmalarni o'rganish uchun, ostrogen bilan bog'laydigan urg'ochi (kuniga 23g, ip, 3 kun) erkak bilan 6 yoki 24 soatda joylashtirilgan va juftlikning mavjudligi tekshirildi a posteriori video nusxada (birinchi 6 soatlik yashash vaqtida 11dan 6 guruxgacha).
Xotin-sherik tanlash imtihoni 6-soatlik yashash sharoitidan so'ng, ilgari aytib o'tilganidek, amalga oshirildi11. Qisqacha aytganda, uchta kamerali sinov apparati ikkita parallel bir xil katakka ulangan neytral katakdan iborat bo'lib, ularning har birida qo'zg'atuvchi hayvon - birgalikda yashash davrida ishlatilgan notanish erkak "begona" yoki tanish erkak "sherik" joylashgan. 3 soatlik sinov davomida ayol sub'ektlar butun apparat bo'ylab harakatlanishi mumkin edi va qo'zg'atuvchi erkaklar o'zlarining kataklariga bog'lanib, bir-biri bilan bevosita aloqada bo'lishga imkon bermadilar. Butun mashg'ulot videotasvirga olindi va mavzuning sherigi yoki begonasi bilan yonma-yon aloqasi davomiyligi keyinchalik biologik guruhlardan bexabar bo'lgan tajribali eksperiment tomonidan aniqlandi. Sherikning afzalligi, sherik bilan tanadagi aloqada ancha vaqt sarflaydigan sub'ektlar musofirga nisbatan, juftlashgan, ikki dumli t-test. Bundan tashqari, uch kamerali apparat fotobeym sensorlari bilan jihozlandi, bu esa lokomotorlar ta'sirini aniqlashga ayollarning kirib kelishi sonining stimulyator xonalariga joylashishiga imkon berdi. Bu lokomotiv skori bizning guruhimiz va boshqalar tomonidan keng qo'llanilganligi kabi, umumiy faoliyat, tashvish yoki yangi muhitni o'zgartirgan holda o'zgartirish kabi dori-darmonlarning ayollarga nisbatan xatti-12.
RNK va oqsillarni ajratish
Urg'ochilar tezda dekapitatsiya qilish orqali qurbon bo'lishgan va miyalar zudlik bilan chiqarilgan va quruq muz ustida muzlatilgan. Koronali bo'laklar (200 mm) mikroskop slaydlariga o'rnatilgan kriostat va sovuqda kesilgan. 1 mm diametrli ikki tomonlama to'qimalar zanjiri barcha NAcc va kaudat pusamadan olingan, ikkinchisi esa nazorat qilish maydoni bo'lib, qayta ishlangangacha -80 ° C da saqlanadi. Total RNK va oqsillar ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq TRI-Reaktiv protokoli yordamida chiqarildi (Molecular Research Center, Cincinnati, OH).
G'arb-blot tomonidan oqsillarni ifodalash tahlili
10% poliakrilamid jelida (histon uchun 15%) ajralib chiqqandan so'ng oqsillar nitroselulozaviy membranalarga o'tkazilib, quyidagi asosiy antijismlar bilan inkubatsiya qilindi: anti-OTR (sc-8102, 1: 1000), V1aR (sc-18096, (1: 500), -D1R (sc-33660, 1: 1000), -D2R (sc-9113, 1: 1000, Santa Cruz Biotexnology, Santa Cruz, CA), -actin (A2066, 1: 1000, Sigma Aldrich. St-Louis, MO) yoki anti-asetil-histon H3 (Lys14, # 06-911, 1: 1000) va umumiy H3 (# 05-928, 1: 1000, Millipore, Temecula, CA). Barcha antikorlar odamlarda, kalamushlarda va sichqonlarda ishlatish uchun tasdiqlangan, ular bilan homologlarning yuqori foizlarini (81dan 96% gacha) baham ko'radi. HRP konjugatsiyalangan ikkilamchi antikor bilan hibridizatsiyadan so'ng ECL (ECL SuperSignal West Dura substrat, Pierce Biotechnologies, Rockford, IL) bilan membranalar aniqlandi va Fuji XAR filmida (Fuji Film, Tokio, Yaponiya) namoyish etildi. Kantifikatsiya AIS 6.0 Image dasturi (Imaging Research, St. Catharines, Ontario, Canada) yordamida amalga oshirildi va barcha signallar bir xil membranada normal xossali H3 signaliga normalizatsiya qilingan asetil-H3 signalidan tashqari aktin qilish uchun normallashtirildi. Keyin normalizatsiya qilingan ma'lumotlar CSF bilan ishlov berilgan hayvonlarning foizi sifatida ifodalanadi.
Yarim-miqdoriy real vaqtda polimeraza zanjiri reaktsiyasi (RT-PCR)
0.5 migagacha bo'lgan umumiy RNK qo'shimcha DNK sintezi uchun qayta ishlangan va keyinchalik yuqorida ta'riflanganidek tahlil qilingan50 nikotinamid adenin dinükleotid dehidrogenaz (NADH) geni normallashtirildi. Barcha reaktsiyalar uch marta qilingan va ularning xarakteristikasi 2% Agarozli jelga egri tahlilini va ajratilishini eritib tekshirgan. OTR, 5'-GAGGTGAACAATGGCACTAAAACC-3 (For) va 5'-CCAGATGTGGTAGCAGATGAAGC-3 uchun '5'-TCCAAGGCCAAAATCCGCACGG-3 (Fwd) va 5'-GGCAGAAGCTTCCTTGGGCGC-3 (Rev) (Rev) uchun D1R, 5'-GTGAAGGCGCTGTAGAGGAC-3 (For) va 5'-CGGTGTGTTCATCATCTGCT-3 (Rev uchun) uchun AVP1aR, 5'- TTAACAACAATGGGGCTGTG-3 "(For) va 5'-GGCATGAGGGATCAGGTAAA-3 (Rev) ) uchun D2R va 5'-CTATTAATCCCCGCCTGACC-3 (For) va 5'-GGAGCTCGATTTGTTTCTGC-3 (Rev) uchun NADH. Normallashtirilgan ma'lumotlar CSF bilan ishlangan hayvonlarning nisbati sifatida ifodalanadi.
Kromatin immunoprecipitatsiyasi
NAcc va kaudat pusamen to'qimalarining zımbalarındaki histone H3 asetilasyonu (Lys14) ishlab chiqaruvchining yo'riqnomasidan kelib chiqqan holda Magna ChIP proteini G to'qimalarining vositasi (Millipore, Temecula, CA) yordamida tahlil qilindi. Qisqasi, 1% formaldegid bilan o'zaro bog'lashdan so'ng 2000-200 bp fragmentlari uchun Misonix XL-600 yordamida kromatin kesilgan. Asetilatsiyalangan histon H3 (Lys14) ning immunopretsizligi 10 ° Cda kechqurun 3uG anti-asetil-H14 (Lys4) antikor (Millipore) bilan amalga oshirildi. Yıkandıktan so'ng, boncuklardan elüsyon va o'zaro faoliyat aloqaning teskarisi, immünopresipitasyonlu DNK tozalangan va birlashtirilgan INPUT misollaridan olingan ichki standart eğrisi bilan iCycler platfromasida (yuqoriga qarang) RT-PCR tomonidan uch marta uchraydi. Primerlar 236 bp-uzunlikdagi hududni kuchaytirish uchun mo'ljallangan bo'lib, 128 bp yuqoridagi oqim uchun birinchi exon kodlashiga ega.oxtr, Genbankning ishtiroki #AF079980) yoki 192 bp-uzunlikdagi mintaqa, 141 bp yuqorida joylashgan bo'lib, birinchi exon kodlash uchun vodoprovod uchun V1aR (avpr1a, Genbankning ishtiroki #AF069304). Tartiblar quyidagicha edi: 5'-CTCCGGAGCCGGGGCTAAGT-3 (Fwd) va 5'-ACCGCTTCCCCGAGAGTAGGG-3 (Rev) oxtr, va 5'-GGTGGACCAGCCAGACCCCA-3 (Fwd) va 5'-TGCAGAGCCAGGCGCTTTCC-3 (Rev) avpr1a. Har bir namunadagi tegishli INPUT qiymati normallashtirildi va ma'lumotlar keyinchalik CSF bilan ishlangan hayvonlarning foizlari sifatida ifodalanadi.
Statistik tahlil va ma'lumotlarni qayta ishlash
Hamkorlik imtihonini tahlil qilish uchun birgalikda yashagan davrda juftakning yurish-turish jarayonini ko'rsatadigan hayvonlarga yo'l qo'yilmaydi. Boshqa barcha molekulyar tahlillar uchun, biologik guruhga ko'ra, maksimal bitta ma'lumotlar punkti tashqarida aniqlanganida chiqarildi. Ko'pgina tajribalar replikatsiya qilindi, natijalar juda aniq bo'lganidan tashqari. Ishtirok imtiyozi sinovi vaqtida rag'batlantiruvchi hayvon bilan yonma-yon aloqada o'tkaziladigan vaqt ikki zarracha juftlik bilan tahlil qilindi t-test. Lokomulyativ skorlar ikkita quyruq yordamida tahlil qilindi t(ikki guruh uchun) yoki bir tomonlama ANOVA (ikkitadan ortiq guruh uchun) va kerak bo'lganda Fisher PLSD post-hoc sinovlar muhim ahamiyatga ega P <0.05. Oddiylikni tekshirgandan so'ng, qolgan barcha ma'lumotlar ikki dumli bilan tahlil qilindi t- oldindan sinov qilingan teng yoki teng bo'lmagan variancesni taxmin qilish. Barcha statistik tahlillar StatView dasturiy ta'minot (SAS Institute) yordamida amalga oshirildi. Ma'lumotlar o'z nazorati bo'yicha standartlashtirilganda (CSF, Saline yoki Mating guruhlarining%) xom ma'lumotlar bo'yicha statistik tahlillar o'tkazildi.
rahmat
Ushbu ish Milliy ruh salomatligi instituti (NIMH) tomonidan MR va ZWga MHR21-083128, hamda ZWga MHR01-058616 tomonidan taqdim etilgan. Shuningdek, doktor Mauris Manning OTR antagonist OTA (T) ning saxiy sovg'asi uchun minnatdorchilik bildiramiz.
Izohlar
Qiziqishlik to'qnashuvi: Mualliflar hech qanday manfaatlar to'qnashuvini e'lon qilmaydi.
Muallif hissasi
HW, FD va YL eksperimentlarni amalga oshirdi. HW va FD ma'lumotlarni tahlil qildi. HW, FD, ZW va MK tadqiqotlarni ishlab chiqdi. FD, ZW va MK qog'ozni yozdi. Barcha mualliflar natijalarini muhokama qilib, qo'lyozma haqida fikr bildirdi.
Manbalar