内源性阿片类药物诱导的腹侧被盖区多巴胺能神经元的神经可塑性影响自然和鸦片剂奖励（2014）

每日交配会议。

为了研究VTA中多巴胺神经元体细胞大小变化的时间过程，在1，7或31 d处杀死有性生活和幼稚的动物（n 在交配的最后一天（经历过）或处理（幼稚）之后，每组5-8。 在最后一次交配期间，性经历的人群的性行为相匹配，以及五个疗程中的射精总数（每组的平均5），并且在性行为的任何参数上没有差异。

交配会议。

性天真的男性被分配到两种实验条件中的任何一种：性天真或性经历。 允许有性经验的动物在连续几天与接受的雌性在矩形测试笼中交配五次（60×45×50 cm）直至显示射精或高达1 h（以先到者为准）。 用70％乙醇溶液彻底清洁笼子，并在交配期间加入新鲜的垫料。 在黑暗阶段（黑暗发作后的2-6 h）进行性行为。 只有在五次交配期间至少四次射精的动物才被认为是性经验并包括在实验中。 观察所有交配期并记录性行为。 坐骑（M）插入（IM）的数量，安装潜伏期（ML;从女性引入到第一次安装的时间），插入潜伏期（IL;从引入女性到第一次插入的时间）和射精潜伏期（EL;记录从第一次插入到射精的时间（Agmo，1997）。 将幼稚动物放置在1 h的干净测试笼中，同时将性经验的雄性雄性交配在同一房间中，使得它们暴露于远处的女性气味，并且与经验丰富的雄性相似的干扰和环境新颖性。

免疫荧光标记。

用戊巴比妥钠（270 mg / kg，ip）深度麻醉动物，并用50 ml的0.9％盐水心脏内灌注，然后在500磷酸钠缓冲液（PB）中灌注4 ml的0.1％多聚甲醛。 取出脑并在室温（RT）下在相同的固定剂中后固定1 h，然后浸入20％PB中的0.01％蔗糖和0.1％叠氮化钠中，在4℃下储存。 在冷冻切片机（H35R，Microm）上以400μm切割冠状切片，并在冷冻保护剂溶液（30％蔗糖，30％乙二醇在0.1 m PB中）中以四个平行系列收集，然后在20℃下储存。 所有孵育均在室温下进行，温和搅拌并在孵育之间用0.1 m PBS，pH 7.35进行大量冲洗。 切片暴露于1％H₂O₂ 为了使10 min破坏内源性过氧化物酶，然后在温育溶液（PBS +：含有1％Triton X-0.4的PBS; Sigma-Aldrich）和100％牛血清白蛋白（Jackson Immuno Research Laboratories）中封闭0.1 h。 接下来，将切片在室温下在小鼠酪氨酸羟化酶（TH） - 抗体中孵育过夜（1：20 000; 密理博）。 在一抗孵育后，将切片在AlexaFluor 555-缀合的山羊抗小鼠抗体（1：100; Invitrogen，Eugene，OR）中孵育30 min。 最后，用0.1 m PB洗涤切片，将其固定在Superfrost Plus载玻片上，干燥，并盖上含有抗褪色剂1,4-二氮杂双环（2,2）辛烷的凝胶脲（DABCO; 50 mg / ml，Sigma-Aldrich; Lennette，1978).

数据分析：神经元体细胞大小。

VTA中TH-免疫反应性（IR）神经元的图像在40×放大三个嘴侧至尾侧水平取得（Balfour等人，2004）。 在不同水平的细胞之间没有检测到差异。 使用ImageJ（National Institutes of Health）分析TH-IR神经元的体细胞大小。 如下所述测量平均面积，周长和圆形度 Sklair-Tavron等。 （1996）。 分析每只动物的平均25细胞（组合所有3 VTA水平），并且仅包括具有清晰可见细胞核的细胞。 对于每只动物，计算平均面积，周长和圆形度。 对于统计分析，使用双向ANOVA [因素：性经验（性经历或性生活）和时间（1，7或31 d）]，然后 事后 使用具有0.05显着性水平的Holm-Sidak方法进行比较。

双周交配会议。

为了测试每日交配期间的性经验是否需要TH-IR神经元体细胞大小的减少，分析了在五个双周交配期间交配的动物的VTA多巴胺神经元。 交配会话如上所述，但是在2.5周期间。 在最后交配或处理后收集脑7 d。

免疫过氧化物酶标记。

此外，测试了使用免疫过氧化物酶和色原检测的敏感染色技术是否也允许TH-IR体细胞大小变化的可视化。 如上所述进行灌注和组织处理。 用1％H处理后₂O₂ 在PBS和PBS +中，将切片在室温下在小鼠多克隆酪氨酸羟化酶（TH） - 抗体中孵育过夜（1：20 000; 密理博）。 在一抗孵育后，将切片与生物素缀合的山羊抗兔IgG（1 h，1：500 in PBS +; Vector Laboratories），抗生物素蛋白 - 生物素 - 辣根过氧化物酶（1 h，ABC elite; 1：1 000 in PBS）一起孵育。 （Vector Laboratories）和3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐（10 min，0.02％，DAB; Sigma-Aldrich）用硫酸镍（0.02％在0.1 m PB中）用过氧化氢（0.015％）增强。 将切片在0.1 m PB中彻底洗涤以终止反应并安装到编码的Superfrost plus载玻片（Fisher）上，其中含有0.3％明胶的ddH₂O.脱水后，将所有载玻片用DPX封固剂（邻苯二甲酸二丁酯二甲苯; Sigma-Aldrich）盖上盖玻片。

数据分析：神经元体细胞大小。

如上所述，分析了TH-IR单元的面积，周长和圆形度。 另外，在用于VTA TH-IR细胞分析的相同部分中，分析了黑质（SN）中的TH-IR细胞。 最后，在分析VTA和SN TH-IR细胞之后，使用甲酚紫对切片复染色，并使用与上述相同的方法分析非TH-IR细胞。 使用两尾学生评分法比较了天真的和有经验的人群之间的差异。 t 显着性水平为0.05的测试。

实验设计。

此前， Russo等人。 （2007） 显示慢性吗啡诱导对吗啡奖赏的耐受性。 由于性经验和慢性吗啡引起VTA中多巴胺神经元的体细胞大小的类似减少，因此测试了性诱导的形态学变化的功能相关性的吗啡奖励。 性经验和幼稚动物分为六个不同的实验组（n =每组9-13）基于性行为（性生活或经历过）和吗啡剂量（0.5，5.0或10.0 mg / kg，ip）并测试吗啡诱导的条件性位置偏爱（CPP）。

吗啡CPP。

在最后的交配期后进行1 d调节，并且在最后一次交配期间对各组进行性表现匹配。 使用的CPP范例包括预测试，调节日和后测试，并且装置基于 Tenk等人。 （2009）。 简而言之，CPP设备（MED Associates）由三个不同的腔室组成。 在每个阶段之间，用70％的乙醇溶液彻底清洁设备，以最大程度地减少挥之不去的嗅觉提示。 为了确定个人喜好，进行了预测试，在此期间动物可以自由进入整个设备15分钟。 作为一组，动物对特定的房间没有显着的偏好，但是每只动物都有轻微的初始偏好。 预试验期间表现出对一个腔室的显着偏好（在每个腔室中花费的时间之间相差> 200 s； <5％的动物）的大鼠被排除在研究之外。 在调理过程中，使用无偏向范式将药物与最初优选或不优选的室配对（Tzschentke，2007并且将动物限制在30 min的室内。 早晨向动物注射盐水（ip）（9：00 AM至12：00 PM）并将其限制在盐水配对室（对照）中。 下午（1：00-4：00 PM），动物注射吗啡（ip，0.5 mg / kg，5.0 mg / kg或10.0 mg / kg;硫酸吗啡溶于0.9％生理盐水，Johnson Matthey）并限制到吗啡配对室。 对动物进行两个调理日。 第二天（交配的最后一天后的3 d）进行了后测试，在程序上与预测试相同。 对于统计分析，将后测试期间在吗啡配对室中花费的时间与在测试后在盐水配对室中花费的时间进行比较，对于每个剂量内的性天真或有经验的雄性，使用配对 t 测试。 p <0.05被认为具有统计学意义。 性幼稚和有经验的动物的其他对照组在成对和不成对的小室中接受盐水作为阴性对照。 两组均未检测到室之间花费的时间差异。

实验设计。

性经验导致性行为的促进至少维持在1个月（Pitchers等，2012）。 为了分析阻断MOR对经验诱导的性行为的影响，性经验的动物在连续五次交配之前接受纳洛酮或生理盐水（n 如上所述，每个12。 在最后一次交配后一周，进行最后的交配试验，在此期间允许所有动物交配直到一次射精或达到1 h。 在最后一个测试日交配前不给予纳洛酮或盐水治疗。 比较交配参数以确定纳洛酮是否影响性交经验诱导的交配促进（当天1与日5）或维持该促进（当天5对比试验）使用双向ANOVA [因素：治疗（盐水与纳洛酮） ）和日（1，日5，或测试）]和Holm-Sidak方法 事后 比较。 对于所有统计测试， p <0.05被认为具有统计学意义。

系统性纳洛酮在测试当天。

为了表明最后交配测试日的性行为改变不是由于没有纳洛酮，我们在最后交配测试当天给予接受交配与纳洛酮配对的动物的纳洛酮或盐水，同时他们获得了性经验。 具体地，所有动物在10连续天期间在一次射精之前接受纳洛酮注射（30 mg / kg，sc）5 min。 在测试当天7 d后，大约一半的动物接受了注射纳洛酮（10 mg / kg， n = 7）或生理盐水（n = 6）在引入接受性女性之前的30分钟。 观察并记录性行为。 比较交配参数以确定纳洛酮是否影响性交经验诱导的交配促进（当天1与日5）或维持该促进（当天5对比试验）使用双向ANOVA [因素：治疗（盐水与纳洛酮） ）和日（1，日5，或测试）]和Holm-Sidak方法 事后 比较。 对于所有统计测试， p <5％被认为具有统计学意义。

纳洛酮对促进性行为短期表达的影响。

交配期间纳洛酮（10 mg / kg，sc）治疗的效果在最后一次交配测试当天的性行为测试，最后一次交配后仅进行了1 d（生理盐水， n = 5; 纳洛酮， n 4）。

全身纳洛酮预处理。

为了确定单独使用纳洛酮的重复治疗是否会导致最后一次治疗后性行为受损7 d，性交幼体动物在最后一次纳洛酮交配试验前连续几天接受5次纳洛酮（10 mg / kg，sc）或盐水注射7 d或注射生理盐水。 在最后的测试日，动物没有接受任何注射。 如上所述观察并记录性行为。 使用未配对的组之间比较交配参数 t 试验。 对于所有统计测试， p <5％被认为具有统计学意义。

全身纳洛酮和性别奖励。

纳洛酮对维持性行为的维持作用的减弱作用的一种可能性是，纳洛酮阻断了性行为的奖励作用。 为了检验这种可能性，在没有先前性经历的男性中，在纳洛酮或生理盐水注射后立即对性行为进行了CPP范例。 CPP程序与上述关于吗啡-CPP的程序类似，包括前测，条件天和后测。

性行为与最初的非优先房室配对。 以平衡的方式，每只动物注射纳洛酮（n = 12）或生理盐水（n = 11）30 min在接受接受女性的访问权之前。 交配期的平均持续时间为〜13 min。 射精后一分钟，将动物置于成对腔室中，持续30 min。 在另一个调理日，动物接受纳洛酮或盐水注射（在交配前接收它们），并放入未配对的室中进行30分钟。 接下来，进行后测试，与预测试相同。 为了确定腔室偏好，比较了在预测试和测试后在配对腔室中花费的时间。 用于统计分析，配对 t 测试用于比较偏好和差异评分，以及在测试前和测试后配对室中的时间，以确定是否为性行为形成了显着的CPP。 p <0.05被认为是显着的。

实验设计。

为了确定VTA中特异性的EOP作用是否导致性经验引起的性行为改变的影响，动物在每天五次交配之前在VTA中局部输注纳洛酮或生理盐水。 行为范例与全身纳洛酮实验相似。 允许有性经验的动物在5连续几天内交配，直到一次射精或达到1 h。 在引入接受性雌性之前15分钟，雄性大鼠接受双侧输注纳洛酮（每个半球10μg/μl;0.5μl体积;溶于0.9％盐水中）或盐水（每个半球0.5μl）的双侧输注。 双侧显微注射以0.5μl/ min的流速在1 min间隔内施用，随后是另外的1 min，其中注射套管留在适当位置用于扩散。 然后用假套管和防尘帽替换注射套管。 在交配的最后一天（测试日）后一周，所有动物再次交配射精而不输注纳洛酮或盐水。 图3A 概述了实验设计。 如全身纳洛酮实验中所述进行数据分析。

插管手术。

用腹膜内注射（0.1 ml / kg）氯胺酮（0.87 mg / ml）和甲苯噻嗪（0.13 mg / ml）麻醉雄性大鼠，并置于立体定位装置（Kopf Instruments）中。 双侧21测量导管（Plastics One）通过颅骨中的小钻孔下降到大脑中朝向VTA-4.8 mm AP，来自前囟的±0.75 mm ML和来自头骨顶部的-7.8 mm DV根据 Paxinos和Watson（2013）。 套管用牙科丙烯酸固定，粘附在颅骨上的三个螺钉上。 给予动物2周恢复期，并且每天处理以适应行为测试期间使用的处理和注射程序。

套管放置验证。

使用TH-免疫染色检查插管的放置以确认VTA是精确靶向的。 分析中仅包括具有适当放置的动物（最终组大小：经验丰富的盐水 n = 8; 经验丰富的纳洛酮 n = 6）。 接受VTA外注射的VTA纳洛酮内注射的另外三只动物在“错过的”注射组中聚集在一起。 将错过的组分别进行分析以用作解剖对照和Mann-Whitney U 测试用于比较最终测试日的行为与纳洛酮和盐水处理的有经验的男性。

实验设计。

暴露于雄性获得交配经验的笼子已被证明在VTA和VTA和NAc的神经活动中引起MOR激活（Balfour等人，2004）。 因此，交配环境充当预测性奖励的条件线索。 目前的研究测试了性经验期间MOR激活是否是后续条件性线索诱导的神经激活所必需的。 纳洛酮或生理盐水全身给药（腹腔注射）30 min，然后放入交配区域并引入接受性雌性用于交配（经验丰富），或者在控制操作之前，包括放置在处理笼中而不显示雌性（中性）环境;天真）。 因此，创建了四个实验组：Naive Sal，Naive NLX，Exp Sal和Exp NLX。 最后一次交配后一周，每组动物的一半暴露于交配笼（Exp男性：与性有关的条件线索）或处理笼（天真的雄性：非常规/中性线索），而另一半未暴露于任何线索，而是留在家庭笼子里（以确定基线pERK表达）。 这个实验范例产生了8组：Naive Sal-No Cue，Naive Sal + Cue，Naive NLX-No Cue，Naive NLX + Cue，Exp Sal-No Cue，Exp Sal + Cue，Exp NLX-No Cue，Exp NLX + Cue （n =除了Naive NLX-No Cue之外的每个4， n = 3）。 在提示暴露后，动物灌注10-15 min。 将对照动物从其家笼中取出并同时灌注。

免疫组化。

如上所述进行切片和免疫组织化学。 这里，我们使用针对p42和p44 MAP激酶ERK1和ERK2的兔多克隆抗体（pERK; 1：4 000; Cell Signaling Technology）。 一抗已在文献中广泛表征（Roux和Blenis，2004; 墨菲和布莱尼斯，2006; Frohmader等，2010b）。 此外，遗漏一抗阻止了所有免疫反应性，并且大鼠脑组织的蛋白质印迹分析显示出具有适当分子量的两条带。

数据分析。

pERK免疫反应（-IR）细胞在许多大脑区域使用相机lucida绘图管计数附加到 徕卡 DMRD显微镜：NAc [核心（C）和壳（S）; 400×600μm; 内侧前额叶皮质; mPFC的; 前扣带区（ACA）; 前肢皮质（PL）; infralimbic cortex（IL）; 每个600×800μm，尾状壳核（CP; 800×800μm）和基底外侧杏仁核（BLA; 900×1200μm; Balfour等人，2004; Frohmader等，2010b; Pitchers等，2010b）。 每个脑区计数两个切片，然后计算标准分析区域中的细胞数，作为每毫米细胞数²。 对于每组动物的平均值，计算组均值。 使用双向ANOVA [因素：药物治疗（NLX或Sal）和提示（提示或不提示）]比较性经验或幼稚组内的组平均值，然后进行 事后 使用Holm-Sidak或Mann-Whitney和检验进行比较，适当时的显着性水平为 p <0.05。 在有性经验的动物的NAc外壳中，存在着一种显着的因素倾向性趋势，因此，进行了成对比较以仅比较生理盐水（Sal-No Cue）和生理盐水（Sal + Cue）组。

图像。

使用连接到a的CCD相机（Macrofire，Optronics）捕获数字图像 徕卡 显微镜（DM5000B），具有固定的相机设置。 图像被导入Adobe Photoshop 9.0软件。 除了调整亮度和对比度之外，图像没有任何改变。

内源性阿片类药物诱导的VTA多巴胺神经元的体细胞大小变化。 A来自有性幼稚和有经验的动物的VTA多巴胺神经元的代表性图像显示最终交配期后体细胞大小7 d的减少。 比例尺，5μm。 定量数据显示性经验（Exp，黑条）导致面积显着减少（B; 以μm为单位²）和周长（C; 以μm计的VTA多巴胺细胞，1 d（Naive，Exp; n = 6）和7 d（天真， n = 5; 精通， n = 6），但不是31 d（天真的， n = 6; 精通， n = 8）最后交配后，与性天真的对照（天真，白色条）比较。 与84或1 d的幼稚对照相比，经验丰富的男性的面积减少至7％。 与91.6和90 d的对照相比，经验组的周长减少到1和7％。 对圆形度没有影响（D）。 这种多巴胺细胞的可塑性（E）和周长（F纳洛酮（NLX， n = 8），但不是盐水（Sal， n 交配期间的7处理，最后交配后的7 d与性天真对照相比（Sal， n = 5; NLX， n = 6）。 数据代表平均值±SEM; *表示与同一天的性天真对照相比有显着差异（B, C）或与盐水治疗的性生活对照和纳洛酮治疗的性经验男性（或E, F).

性经验并未减少黑质多巴胺神经元或VTA非多巴胺神经元的体细胞大小。 VTA TH-IR神经元胞体区（A; 以μm为单位²）和周长（B; 在性能幼稚（白色）和经验丰富的（黑色）动物中，通过每周交配两次而不是连续几天获得经验。 Substantia nigra TH-IR体细胞区域（C）和VTA非TH-IR体细胞区域（D）在性天真（白色）和经验丰富的（黑色）动物中。 数据代表平均值±SEM; *表示与性天真对照相比有显着差异。 代表性图像显示性生活的VTA中的TH-IR（棕色）神经元（E），经验丰富（F）男性。 G, H，由箭头指示的神经元的更高放大率图像 E 和 F 分别。 在这些图像中，尼氏染色的神经元显示为蓝色。 代表性图像显示性生活SN的TH-IR神经元（I）和经验丰富（J）男性。 比例尺： E–J，20μm。

性经验对吗啡奖赏的影响。 在性生活后的测试中，在生理盐水（Sal）或吗啡配对（Mor; 0.5，5或10 mg / kg体重）室中花费的时间（Naive， n = 10-13）或经验丰富（Exp， n = 9-13）男性。 数据表示为平均值±SEM; *表示与同一动物中的​​Sal配对室相比有显着差异。 NS，不重要。

内源性阿片类药物在经验诱导的性行为促进中发挥关键作用。 A， 实验设计。 B–D，生理盐水治疗的男性的性行为参数（Sal，白色条， n = 11）或纳洛酮（NLX;黑条， n = 12）全身给药。 显示的数据是挂载延迟（B; 秒），插入（C; 秒）和射精（D; 在连续五天交配的1和5日。 此外，在第五次交配期后，显示了最终交配测试的数据，7 d。 数据表示为平均值±SEM; +表示治疗中1天数和5天数之间存在显着差异; *表示治疗期间测试日和5之间的显着差异; ＃表示纳洛酮和生理盐水组在一天内的显着差异。

在交配之前施用纳洛酮仅在交配的第一天增加潜伏期和插入

内源性阿片类药物在经验诱导的性行为促进的长期表达中是重要的。 A，实验设计实验NLX治疗对试验日的影响。 B，在盐水（灰色）或纳洛酮（黑色）注射后，在交配和最终交配测试日（测试）的连续五天的天1和5上安装潜伏期。 数据代表平均值±SEM。 *表示治疗期间1天和5天之间的显着差异。 ＃表示治疗中测试日和日5之间的显着差异。 C，实验设计实验，以测试单独的纳洛酮预处理没有性经验对交配行为的影响。 D，在没有交配的情况下，在最后交配测试日，7天后，在生理盐水或纳洛酮注射的5天后的潜伏期。 数据代表平均值±SEM。 E，实验设计用于测试纳洛酮治疗是否影响性经验动物中促进性行为的短期显示。 F，在生理盐水（灰色）或纳洛酮（黑色）注射的情况下，在交配和最终交配测试日连续5天，1日5的第1天和第5天的潜伏期。 数据代表平均值±SEM。 *表示治疗期间1天和5天之间的显着差异。 G，实验设计实验，以测试纳洛酮治疗是否阻止性行为的奖励效果。 H，在交配前接受纳洛酮或盐水的动物在预测试（白色）和测试后（黑色）期间用于交配成对腔室的时间（以秒为单位）。 数据代表平均值±SEM; *表示与预测试相比有显着差异。

所显示的数据是来自对照实验的插入和射精（秒）的延迟，以确定MOR阻断对性行为的长期强化丧失的影响发生独立于最后交配测试日缺乏纳洛酮给药

VTA中的内源性阿片类药物介导经验诱导的性行为及其长期维持。 生理盐水治疗的男性的性行为参数（Sal，白色条， n = 8）或NLX（黑条， n 具有VTA内管理的= 6）。 显示的数据是挂载延迟（A），inomission（B）和射精（C）连续五天交配日1和5。 此外，显示最终交配测试日的数据，在没有盐水或纳洛酮注射的情况下在7天后的5 d。 数据代表平均值±SEM; +表示治疗中1天数和5天数之间存在显着差异; *表示治疗期间测试日和5之间的显着差异; ＃表示纳洛酮和Sal组在一天内的显着差异。 冠状VTA切片（H，XXUMX; I，X4.60; J，来自前囟的5.00）的示意图显示实验5.25中所有动物的VTA内注射部位（盐水;白色;纳洛酮，黑色;错过，灰色），使用Swanson Brain Maps的模板图纸（Swanson，2004）。 套管是双侧的，但注射部位单方面代表易于呈现。 fr，Fasciculus retroflexus; ML，Medial lemniscus; SN，黑质。

内源性阿片类药物作用是性相关条件线索诱导的NAc神经活化所必需的。 每毫米pERK-IR细胞数² 在伏核核心（A）和壳（B在性交天然（白色）和经验丰富的（Exp;黑色）动物中，在交配期间（Exp男性）或处理期（Naive males）用系统性NLX或盐水（Sal）预处理。 群体暴露于情境线索（Cue），其是Exp雄性中的交配相关线索和Naive动物中的中性线索，或取自家笼（No Cue;缺少Cue标记表示）。 数据表示为平均值±SEM; *表示与盐水预处理的无提示物暴露的对照（Naive Sal-No Cue和Exp Sal-No Cue）相比有显着差异; ＃表示与Sal处理的Cue暴露的Exp组（Exp Sal + Cue）相比的显着差异。 每mm的pERK-IR细胞的代表性图像² 在具有Sal的性经验男性的NAc核心（C, D）或NLX（E, F）从家笼中取出（无提示，C，E），或暴露于交配相关的情境线索（Cue; D, F). N =除了Naive NLX（No Cue）之外的每个组的4， n = 3。 ac，前连合。 比例尺，100μm。

纳洛酮对其他VTA靶区域中交配线索诱导的pERK表达的影响。 每毫米pERK-IR细胞数² 在性交幼稚（白色）和经验丰富的（Exp;黑色）动物中，在交配期间用系统性NLX或盐水（Sal）预处理，并暴露于ACA中的情境线索（Cue）或家笼（无线索）（A），PL（B），IL（C）和BLA（D）。 数据代表平均值±SEM; *表示与盐水预处理的无提示物暴露的对照（Naive Sal-No Cue和Exp Sal-No Cue）相比有显着差异; ＃表示与Sal处理的线索暴露的性天真对照（Naive Sal + Cue）相比有显着差异。