DeltaFosB间接调节Cck启动子活性（2010）

Brain Res。 2010 May 6; 1329：10-20。

在线发布2010 March 11。 DOI： 10.1016 / j.brainres.2010.02.081

PMCID：PMC2876727

约翰F. Enwright，III,¹ 梅根沃尔德,¹ 麦迪逊围场,¹ 伊丽莎白霍夫曼,¹ 雷切尔阿雷,² 斯科特爱德华兹,² 萨德斯宾塞,² Eric J. Nestler,³ 和科琳·麦克朗^2，*

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抽象

慢性接触滥用药物引起的一些重要的生化，结构和行为变化似乎是由高度稳定的转录因子ΔFosB介导的。先前的工作已经表明，在2周的小鼠中ΔFosB过表达导致纹状体中许多基因的表达增加，其中大多数基因随后在ΔFosB表达的8周后下调。有趣的是，大量这些基因在过表达转录因子CREB的小鼠中也被上调。然而，从这项研究中不清楚，短期ΔFosB是否通过CREB调节这些基因。在这里，我们发现2周的ΔFosB过表达增加纹状体中CREB的表达，这种作用在8周消失。早期诱导与CREB与该脑区域中某些靶基因启动子的结合增加有关。令人惊讶的是，根据以前的报告，一个基因是可疑的CREB目标， 胆囊收缩素（Cck），不受CREB在纹状体中的控制。进一步调查 CCK 在ΔFosB过表达后，我们证实短期ΔFosB过表达均增加 CCK 启动子活性和基因表达。它还增加了假定的CREB结合位点（CRE）中的结合活性 CCK 子。然而，虽然CRE位点是正常基础表达所必需的 CCK，ΔFosB诱导不需要 CCK。总之，这些结果表明，虽然短期ΔFosB诱导增加CREB表达和某些基因启动子的活性，但这不是基因在这些条件下上调的唯一机制。

关键词： 伏隔核，转录，成瘾

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引言

慢性接触滥用药物会导致几个大脑区域的生化和结构变化。这些变化被认为涉及中脑边缘系统中基因表达谱的改变。该系统由多巴胺能神经元组成，其从中脑的腹侧被盖区域（VTA）突出到伏隔核（NAc）（腹侧纹状体）中的多刺神经元以及许多其他脑区域。已经提出改变两种转录因子cAMP反应元件结合蛋白（CREB）和ΔFosB（一种Fos家族蛋白）的活性，以介导长期接触滥用药物所见的许多生化，结构和行为变化（审查 Nestler，2005).

CREB是普遍表达的转录因子，是CREB / ATF家族的成员。 CREB同源二聚体与许多基因启动子中发现的CRE序列（共有序列：TGACGTCA）的变异结合。 CREB的磷酸化（主要在丝氨酸133，虽然已经鉴定了其他位点）可以被几种信号级联刺激，包括多巴胺受体下游的那些（Cole等，1995）。在丝氨酸133磷酸化后，CREB募集共激活因子CREB结合蛋白（CBP）或相关蛋白，导致基因表达增加（由 Johannessen等，2004). 慢性接触阿片类或精神兴奋剂滥用药物会导致伏核中CREB活性的短暂增加 (Barrot等，2002; Shaw-Lutchman等人，2002, 2003), 一种适应性思想，旨在降低这些药物的有益特性，并促成药物戒断的负面情绪状态 (Nestler，2005).

L对滥用药物的持久适应被认为部分由ΔFosB介导，ΔFosB是FosB的高度稳定的剪接变体 (Nestler等，1999; McClung等，2004; Nestler，2008）。 Fos家族成员与Jun家族的成员二聚化以形成激活蛋白1（AP-1）复合物。 AP-1转录复合物与AP-1反应元件（共识：TGACTCA）的变异结合以调节转录（由 Chinenov和Kerppola，2001）。虽然急性暴露于滥用药物会导致Fos家族成员的短暂诱导（hrs）（以及CREB活性增加），但反复接触药物会导致高度稳定的ΔFosB积聚（Hope等人，1994; Perrotti等，2008），其表达持续数周。

在成体纹状体中诱导性过表达ΔFosB或CREB的双转基因小鼠显示出在反复暴露于精神兴奋剂或其他滥用药物的动物中看到的许多生化和行为表型。一个对这些转基因动物中基因表达变化的分析鉴定了由ΔFosB的短期（2周）过表达上调的许多基因，这些变化与药物奖赏的伴随降低相关。短期ΔFosB的基因表达和行为反应的变化与在2或8周过表达CREB的动物中观察到的变化非常相似（McClung和Nestler，2003）。与之形成鲜明对比的是，ΔFosB的长期过表达（8周）降低了许多这些相同基因的表达，并导致药物奖励的增加（Kelz等人，1999; McClung和Nestler，2003).

这些研究中发现的一个基因是 胆囊收缩 (CCK），一种在几个大脑区域产生的神经肽，包括纹状体（Hokfelt等人，1980）。 CCK可以调节多巴胺能传递（Vaccarino，1992），参与药物奖励和强化（Josselyn等，1996; Josselyn等人，1997; Hamilton等人，2000; Beinfeld等，2002; Rotzinger等，2002），并由慢性可卡因在纹状体中诱导（丁和Mocchetti，1992）。另外 CCK 已显示启动子对CREB和AP-1复合物均有反应（Haun和Dixon，1990; Deavall等人，2000; 汉森，2001）。由于许多基因（包括 CCK）表明CREB和短期ΔFosB表达后表达增加的已知或疑似CREB靶基因（McClung和Nestler，2003），我们想确定短期ΔFosB表达是否导致这些基因的调控（重点是 CCK）通过CREB的调节或通过更复杂的基因调控机制。

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成果

ΔFosB过表达瞬时增加CREB水平

我们使用蛋白质印迹来研究ΔFosB过表达是否增加小鼠纹状体中的CREB蛋白水平。对于该研究，我们使用携带NSE-tTA转基因和TetOp-ΔFosB转基因的双转基因小鼠（品系11A）。在没有强力霉素的情况下，这些小鼠在纹状体中的强啡肽阳性神经元中表现出ΔFosB表达的强烈增加（Kelz等人，1999）。这种过度表达ΔFosB的方法已被广泛记录，并允许区域特异性过表达，这与暴露于慢性可卡因的动物中观察到的ΔFosB诱导相似（Hope等人，1994; Kelz等人，1999）。我们发现在过量表达ΔFosB的11A小鼠中，在表达2周后CREB蛋白水平显着上调，并且这些水平在8表达周后恢复到基线（图1A，n = 8）。为了确定短期ΔFosB过表达CREB水平的变化是否可以在另一个系统中复制，我们在PC12细胞中瞬时过表达ΔFosB，发现与对照相比CREB水平显着增加（p <0.05）（图1B，n = 4）。这些结果表明短期ΔFosB表达增加CREB蛋白水平。

图1

随着ΔFosB过表达，CREB水平增加。来自的裂解物的蛋白质印迹分析 （A） 来自11A小鼠的小鼠纹状体用于2或8周的dox或 （B） PC12细胞过度表达ΔFosB。数据输入 A 显示为off dox的百分比变化 ...

短期ΔFosB过表达后，ΔFosB和CREB均与纹状体中特定靶基因的启动子结合。

我们使用纹状体组织的ChIP（染色质免疫沉淀）测定来确定在某些靶基因启动子处是否发生ΔFosB或CREB结合，以及在短期ΔFosB过表达后该结合是否增加。我们分析了绑定 BDNF 和 CCK 启动子，因为这两个基因在短期ΔFosB过表达，CREB过表达或慢性可卡因治疗后高度上调（McClung和Nestler，2003）。我们还分析了绑定 CDK5 启动子，因为它是ΔFosB的已知直接目标（陈等人，2000; Bibb等，2001; Kumar等人，2005）。最后，我们测量了绑定 强啡肽原 启动子，因为以前的研究发现它可以在不同的条件下受到ΔFosB和CREB的约束（Andersson等，2001; Zachariou等，2006).

使用识别CREB或ΔFosB的抗体对来自11A小鼠的纹状体进行ChIP分析，所述小鼠过表达ΔFosB达2周。在正常条件下，我们发现ΔFosB与之结合 CDK5 和 强啡肽原 促进者，虽然没有可检测到的结合 BDNF or CCK 发起人（表1）。此外，ΔFosB过表达增加了ΔFosB的结合 CDK5 发起人，但不是 强啡肽原 子。我们接下来测量了这些启动子的CREB结合，发现CREB与这些启动子结合 CDK5，BDNF 和 强啡肽原 发起人，但不是 CCK 正常纹状体中的启动子，以及2周的ΔFosB过表达增加CREB结合 BDNF 和 强啡肽原 发起人，但不是 CDK5 子。总之，这些结果表明ΔFosB和CREB都可以结合某些基因启动子，如 强啡肽原 和 CDK5但是，CREB绑定特异于其他启动子，如 BDNF。此外，ΔFosB过表达导致某些启动子处ΔFosB结合的增加，如预期的，但也导致CREB与特异性启动子的结合，与在该时间点观察到的ΔFosB介导的CREB诱导一致。

表1

推定的调节蛋白与过表达ΔFosB两周的小鼠中的各种启动子的结合。

以前的研究表明，长期ΔFosB过表达诱导的基因表达变化与染色质修饰有关，特别是组蛋白H3的乙酰化，在特定的基因启动子上（Kumar等人，2005）。为了确定这是否可以解释短期ΔFosB过表达时基因表达的变化，我们测量了乙酰化组蛋白H3（与转录活性染色质相关的组蛋白修饰）或甲基化组蛋白H3（Lys9，与转录相关的组蛋白修饰）的结合。无活性的染色质）。我们发现，对于2周，ΔFosB的过表达导致乙酰化H3在所研究的任何基因启动子上的结合没有变化（表1）。我们确实发现甲基化组蛋白H3的结合显着降低 强啡肽原 启动子，但没有约束力 CCK 启动子和结合没有变化 CDK5 和 BDNF 启动子，表明这不是ΔFosB在短期内调节基因表达的一般机制。我们感到惊讶和感兴趣的是，我们发现我们的ChIP分析没有差异可以解释增加 CCK 在11周的ΔFosB表达后，2A小鼠中的mRNA表达，并决定进一步研究该机制。

短期ΔFosB增加 CCK 在多个系统中表达

在纹状体中过表达ΔFosB的双转基因11A小鼠的微阵列表征发现 CCK 表达水平在2周过表达后增加，然后随着ΔFosB表达的更长时间逐渐减少（图2A，n = 3）。我们验证了这种效果 CCK 在2和8周对单独的一组动物使用实时PCR，发现两个时间点的结果与微阵列分析相似（数据未显示）。

图2

ΔFosB的短期过表达增加 CCK 基因表达。（A) CCK 在11A小鼠中针对1，2，4或8周的ΔFosB过表达后纹状体中的mRNA表达。对纹状体样品进行微阵列分析 CCK 各级 ...

进一步研究ΔFosB调节的能力 CCK 表达，我们使用瞬时转染的PC12细胞 CCK - 荧光素酶报告质粒和ΔFosB表达质粒或等量的pCDNA。 ΔFosB过表达的两天（n = 5-9）和三天（n = 11-13）导致显着增加 CCK - 荧光素酶表达。此外，三天的ΔFosB过表达导致显着更多 CCK与两天的过表达相比，荧光素酶诱导（图2B）。 ΔFosB的过表达不诱导无启动子荧光素酶构建体的表达（数据未显示）。在没有处理条件下，减少了 CCK - 荧光素酶活性明显。这些结果表明，短期ΔFosB表达增加了活性 CCK 启动子，并且没有解释长期ΔFosB过表达抑制的机制 CCK 表达。

ΔFosB过表达增加了假定的CREB结合位点的结合 CCK 促进者

我们的分析发现了 CCK 短期ΔFosB表达后表达增加，但是，我们的ChIP分析发现CREB和ΔFosB都不能与 CCK 子。确定蛋白质结合是否有任何变化 CCK 在ΔFosB过表达后的启动子，我们使用电泳迁移率变动分析（EMSA）和探针，其中含有推定的CRE样位点。 CCK 子。使用过量表达ΔFosB的11A小鼠纹状体的核提取物进行2周，我们发现与假定的CRE位点的结合增加。 CCK 促进者（图3 A，C，n = 4）。有趣的是，11A小鼠在8周内过度表达ΔFosB，表明其减少了 CCK 表达，也表明该站点的结合增加（图3B，C，n = 4）。作为比较，我们检测了在过量表达ΔFosB的2周的小鼠中与共有CRE位点的结合，发现纹状体提取物中的CRE结合强烈，但ΔFosB诱导后结合没有增加（图3F，n = 4）。因此，尽管在此时间点观察到ΔFosB诱导的总CREB水平增加，但这些结果与我们的ChIP测定一致，其发现在ΔFosB过表达后启动子处CREB结合增加仅对某些基因特异并且不是全局现象。确定CREB是否绑定到 CCK 在我们的EMSA分析中，我们使用CREB特异性抗体进行超迁移试验。与我们的ChIP分析一致，我们没有发现CREB与a的任何结合 CCK 在EMSA分析中含有推定的CRE位点的探针，而CREB确实显着结合并超越了共有的CRE位点（图3D，E，n = 4）。 DNA的结合活性 CCK 在几个先前研究中显示的阻断ΔFosB与真正的AP-1位点结合的条件下，启动子也不受ΔFosB抗体（数据未显示）的影响（Hope等，1994a，1994b; 陈等人，1995, Hiroi等，1998）。我们还在11周的ΔFosB表达后对8A动物的纹状体进行了ChIP测定，并且仍未发现CREB或ΔFosB的结合。 CCK 启动子（数据未显示）。因此，ΔFosB表达确实导致蛋白质结合增加 CCK 2和8表达后的启动子; 然而，这些因素的身份仍然未知。

图3

蛋白质结合在 CCK 子。（A，B）电泳迁移率变动分析使用 CCK 具有来自过量表达ΔFosB的动物的纹状体组织的CRE样部位，持续2周（A）或8周（B）。在（A）中，与过剩的未标记竞争者竞争 ...

推定的CRE网站 CCK 启动子不是启动子活性增加的原因

因为我们确实发现蛋白质结合的增加使用了一个片段 CCK 在ΔFosB过表达后，含有推定的CRE位点的启动子，我们想确定这个位点是否有必要增加 CCK ΔFosB过表达后的表达。为了测试这种可能性，我们用a转染了PC12细胞 CCK - 含有完整CRE样位点的荧光素酶质粒或在该位点含有突变的质粒，其将消除与CREB的任何相互作用。有趣的是，CRE样位点的突变减少了基础 CCK 启动子活性32％（图4A，n = 9），但没有影响 CCK ΔFosB过表达启动子的诱导（图4B，n = 11-13）。这表明，虽然 CCK 启动子需要完整的CRE样位点以获得完全的基础活性，ΔFosB过表达诱导的启动子活性增加不需要CRE样序列。

图4

CCK类似的CRE站点不是必需的 CCK ΔFosB诱导。（A) CCK用正常方法转染后2天测量荧光素酶活性 CCK-萤光素酶或一种CRE样位点被突变的酶。 * p <0.05（B) CCK荧光素酶 ...

cFos绑定到 CCK 促进者

以前的研究发现 cFos的 mRNA随着短期ΔFosB表达而增加，然而，在延长ΔFosB表达后，可卡因处理在纹状体中诱导cFos的能力降低（McClung和Nestler，2003; Renthal等人，2008）。因此，cFos可能有助于增加 CCK 短期ΔFosB表达后的表达。我们用cFos特异性抗体进行了ChIP分析，并测量了cFos的结合 CCK 具有和不具有短期ΔFosB表达的启动子。虽然我们发现cFos确实绑定了 CCK 启动子，这种结合在ΔFosB过表达后没有显着增加（图5，n = 5）。这表明，因为cFos绑定了 CCK 启动子，它可能有助于一般的调节 CCK 表达，但它可能不参与调节 CCK ΔFosB的启动子。

图5

cFos绑定到 CCK 子。使用来自ΔFosB过表达小鼠的纹状体组织在dox上或在去除dox的2周后，用cFos的特异性抗体进行染色质免疫沉淀测定。实时PCR分析是 ...

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讨论

该研究证实并扩展了先前的研究结果，表明ΔFosB调节纹状体中的基因表达，我们发现它在短期表达后通过多种机制这样做。我们表明，在2周过表达后，ΔFosB直接与某些基因的启动子结合，导致表达变化（即 CDK5）。此外，它增加CREB蛋白水平，在培养细胞和纹状体中观察到的效应，导致其他基因启动子的CREB结合增加（即 强啡肽 和 BDNF）。在先前的一项研究中，我们发现纹状体中ΔFosB的短期过表达导致CREB过表达时发现的许多相同的基因表达变化，并且在可卡因偏好的测量中导致类似的行为反应（McClung和Nestler，2003）。因此，目前的发现ΔFosB导致CREB的诱导，以及CREB与某些基因启动子的结合，有助于解释为什么这两种转录因子共享这么多的基因表达变化。

ΔFosB诱导CREB是有意义的，因为已经证明滥用药物诱导丝氨酸133磷酸化CREB水平的变化（Mattson等，2005）并增加CRE介导的转录（Barrot等，2002; Shaw-Lutchman等人，2002, 2003），而不改变CREB的总体水平。 CREB水平的变化可能是短暂的，因此在其他研究中很容易遗漏。在我们的手中，我们已经看到特定实验中可卡因诱导的CREB mRNA增加，然而，这种影响是高度可变的（未发表的观察结果）。由于11A转基因小鼠和PC-12细胞在短期ΔFosB过表达后显示出CREB诱导，这表明CREB确实由ΔFosB（或ΔFosB的靶标）诱导，提供了另一种解释药物诱导的基因变化的机制。表达。

令人惊讶的是，我们发现CREB和ΔFosB都没有结合 CCK 尽管如此 CCK 在短期ΔFosB表达后，表达明显上调。 Cck是一种在VTA和NAc中均有表达的丰富神经肽（Hokfelt等人，1980并且可能涉及对滥用药物的行为反应（Josselyn等，1996; Josselyn等人，1997; Hamilton等人，2000; Beinfeld等，2002; Rotzinger等，2002）。在细胞培养试验中， CCK 启动子已被广泛表征，并显示出对CREB和AP-1家族成员的反应（综述汉森，2001). Haun和Dixon（1990）表明AP-1复合物可以与β-XNUMX复合物结合 CCK 类似CRE的网站 细胞/组织，后来显示，使用SK-N-MC神经母细胞瘤细胞，CRE样位点的突变降低了对过表达cFos / cJun的启动子反应性（Rourke等，1999）。的确，我们也发现了增加 CCK 启动子活动（图2并且在CRE样元素处或周围结合（图3）当另一个AP-1家族成员ΔFosB过表达时，我们发现ΔFosB没有直接结合到 CCK 促进者体内 or 细胞/组织即使它的过度表达。

许多工作证明了CREB在监管方面的作用 CCK 启动子活动。该 CCK 类似CRE的位点在脊椎动物中是保守的（汉森，2001并且，在一些细胞培养测定中，CREB和AP-1复合物都与该位点结合并且是必需的 CCK 启动子活动（Haun和Dixon，1990; Deavall等人，2000; 汉森，2001）。另外，几种已知的活化剂 CCK 表达（包括bFGF，PACAP，蛋白胨和去极化）已被证明通过CREB起作用（Hansen等，1999; Deavall等，2000; Bernard等人，2001; Gevrey等人，2002; Hansen等，2004）。我们的 CCK-luciferase报告基因数据支持CRE样位点在调节中的重要作用 CCK 启动子活性，因为这个位点的突变减少了基础 CCK 启动子活动和 CCK当该位点发生突变时，由VP16-CREB（一种组成型活性形式的CREB）诱导的荧光素酶表达丧失（未发表的观察结果）。因此，我们惊讶地发现CREB似乎没有绑定到 CCK 当CREB水平增加时，在基线或短期ΔFosB过表达时纹状体提取物中的启动子。这证明了CREB的水平本身不是确定本网站绑定量的唯一因素，这是其他人的工作支持的（Cha-Molstad等，2004）。自其他先前确定的CREB靶基因的启动子，如 BDNF 和 强啡肽原，确实绑定了CREB，我们相信我们发现CREB没有绑定到 CCK 纹状体核提取物中的启动子。而且，诱导 CCKΔFosB的荧光素酶活性不依赖于完整的CRE样位点，表明ΔFosB不调节 CCK 通过调节CREB与细胞的直接结合来表达 CCK 子。

我们无法检测CREB与之相互作用 CCK 启动者得到支持 Renthal等。（2009），他们使用ChIP芯片方法来观察慢性可卡因暴露后磷酸化CREB（pCREB）和纹状体中ΔFosB结合的全局变化。在这些实验中，DNA-蛋白质复合物用ΔFosB或pCREB抗体免疫沉淀，标记后沉淀的DNA与启动子微阵列杂交。虽然许多先前表征的CREB靶基因用这种方法鉴定（例如， BDNF，prodynorphin), CCK 没有确定。此外，已经证明CREB与共有CRE位点的结合在培养的细胞系之间变化很大（Cha-Molstad等，2004）。所有先前的研究发现CREB与之相互作用 CCK 启动子在细胞培养物（不是我们的EMSA和ChIP样品来源的脑）中进行，并使用凝胶迁移试验来研究蛋白质-DNA相互作用。虽然EMSA可以评估结合DNA序列的因子的潜力，但ChIP分析提供了这些相互作用的新颖外观体内。此外，大部分数据表明要么归纳 CCK 启动子活性或CREB结合 CCK 启动子来自受蛋白胨等因子刺激的细胞（Bernard等人，2001），去极化（Hansen等，2004），或细胞内信号级联的多种激活剂，包括cAMP和ERK（Hansen等，1999）。在我们的实验中，使用的唯一“刺激”是ΔFosB的过表达，其足以诱导 CCK 表达。总之，这表明CREB结合（并可能调节）的能力 CCK 启动子高度依赖于细胞类型和特定信号传导途径的激活。另外， CCK CRE样启动子元件（至少在未诱导的PC12细胞和小鼠纹状体中）不是CREB或ΔFosB的直接靶标。有趣的是，监管 FOSB CREB的表达也特异于细胞类型和刺激类型。安德森的一项研究等。发现将CREB反义寡核苷酸注射到小鼠纹状体中可部分抑制其诱导 FOSB 跟随可卡因管理（Andersson等，2001）。然而，他们还发现L-多巴诱导的能力 FOSB 在6-OHDA-损伤的纹状体中的表达不受CREB反义寡核苷酸的存在的影响。

由于CREB和ΔFosB似乎间接调节了 CCK 已经记录了启动子和染色质结构的变化，以响应诱导ΔFosB的各种刺激（Tsankova等，2004; Kumar等人，2005; Renthal等人，2008），我们推断ΔFosB可能通过改变染色质结构间接调节启动子活性。然而，在2周过度表达ΔFosB的小鼠中，组蛋白H3乙酰化没有变化。 CCK 促进者（表1）。这得到了ChIP芯片数据的支持 Renthal等。（2009），他报道乙酰化H3结合没有变化 CCK 暴露于慢性可卡因的小鼠中的启动子。自从 CCK 启动子在纹状体中具有活性，没有预期或观察到抑制性甲基化组蛋白H3结合。有趣的是，我们也看到由于ΔFosB在乙酰化H3结合中过表达而没有变化。 BDNF 启动子（确实显示增加的CREB结合）或在 CDK5 和 强啡肽原 启动子（显示ΔFosB结合增加）。由于有大量的组蛋白修饰与启动子活性的变化相关（综述于 Rando和Chang，2009），可能还有其他染色质修饰与这些基因的诱导有关。任何单个染色质修饰虽然经常预测启动子活性水平，但在特定基因的激活过程中可能不会改变。在未来的工作中，看看周围的染色质结构的其他潜在变化将是有趣的 CCK ΔFosB过表达后的启动子。有趣的是，慢性可卡因（可能是通过 ΔFosB诱导）已经显示诱导sirtuin 1和2，III类组蛋白脱乙酰酶的表达，其似乎改变神经元生理学，ERK信号传导和对可卡因的行为反应（Renthal等人，2009）。组蛋白脱乙酰酶的诱导将具有同时调节大量基因表达的能力通过染色质结构的全局变化。

一个可能的候选人参与 CCK ΔFosB过表达后的调节是AP-1家族成员cFos。 cFos的表达受CREB调节（Sheng等，1990; Impey等人，2004）和cFos过表达（与其结合配偶体cJun的过表达一致）增加 CCK 启动子活动（Rourke等，1999）。因此，由于短期ΔFosB过表达导致的CREB水平增加可能会增加cFos水平并导致与cFos结合的增加 CCK 类似CRE的网站。 首席财务官 在ΔFosB过表达两周后，在小鼠中诱导mRNA（McClung和Nestler，2003暴露于慢性可卡因或长期ΔFosB过表达的小鼠体重下降（Renthal等人，2008）。在这里，我们发现cFos直接绑定到 CCK 然而，纹状体组织中的启动子ΔFosB过表达不会显着增加结合。这表明虽然cFos可能涉及调节 CCK 通常，单独的cFos结合的变化不太可能是ΔFosB调节的机制 CCK 表达。然而，ΔFosB可能诱导cFos的翻译后变化（例如改变的磷酸化）或诱导结合配偶体（例如cJun）或共激活蛋白的表达。然而，由于完整的CRE样位点（之前已被证明是AP-1复合物的结合位点，请参阅 Haun和Dixon，1990）不需要增加 CCK 在ΔFosB过表达中观察到的启动子活性（如我们的报告基因实验中所评估的），理所当然其他反式作用因子也受ΔFosB调节。

CCK 在我们的荧光素酶报告基因实验中使用的启动子片段含有保守的Sp1结合位点和E-box（由Hansen，2002评论）。特别是，已显示E-box序列结合许多转录因子（综述于 Forrest和McNamara，2004）。使用PC12细胞，我们已经看到E-box的突变减少了 CCK 启动子活性，但不改变启动子对ΔFosB的反应（数据未显示）。有趣的是，一个 CCK含有CRE位点和E-box突变的荧光素酶报告基因没有可检测的基础活性，并且对ΔFosB过表达没有反应（未发表的观察结果）。另一种潜在的ΔFosB作用调节剂 CCK 启动子是ATF，已知其某些形式通过慢性精神兴奋剂暴露在纹状体中诱导（Green等，2008）。然而，我们没有发现ΔFosB诱导这些ATF的证据（数据未显示），并且预计ATF不会与突变的CRE样结合位点结合。 CCK 子。

这项研究的一个警告是，我们正在使用双转基因系统来过度表达ΔFosB，因此必须保守这种范式与慢性可卡因给药之间的相似之处。然而，11A转基因小鼠确实提供了独特的机会来观察ΔFosB在纹状体中的特定作用，因为过表达仅限于这个大脑区域（陈等人，1998），同时给予可卡因诱导多种其他大脑区域的变化，然后间接影响纹状体。此外，一些研究表明，与用慢性可卡因治疗的非转基因动物相比，11A小鼠具有相似的行为和分子表型（Kelz等人，1999; McClung和Nestler，2003; Renthal等人，2009）。另外， Bibb等人。（2001）报道类似的纹状体水平 Cdk5 与可卡因处理的非转基因同窝小鼠相比，该相同11A菌株中的mRNA和蛋白质诱导，以及CDK5靶标，p35和DARPP-32中的类似变化。

总之，我们发现短期ΔFosB表达导致通过多种机制诱导纹状体中的基因。这些包括直接启动子结合，CREB蛋白和活性的诱导，染色质修饰，以及尚未确定的途径。

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实验步骤

动物

雄性双转基因11A动物（NSE-tTA x TetOP-ΔFosB）用于本研究，其特征在于： Kelz等人，1999。为了过表达ΔFosB，在3和6周龄之间从强力霉素中除去小鼠，而对照小鼠维持在多西环素上。将所有小鼠分组饲养并保持在12：12光/暗循环中，在7 am点亮并在7 pm点亮， ad lib 获得食物和水。所有小鼠实验均符合达拉斯德克萨斯大学西南医学中心动物护理和使用委员会批准的方案。

报告和表达质粒

野生型（WT） CCK 通过将大约200 bp PCR片段插入pGL3-luc载体（Promega）中来制备启动子 - 荧光素酶报道分子。该片段获自小鼠基因组DNA（引物：5'TATCCTCATTCACTGGGACGC 3'上游，和5'TACCTTTGGATGGGGAAATCG 3'下游）并最初插入pGEM-T Easy载体（Promega，＃A1360）。然后将启动子片段克隆到pGL1-luc的Kpn1 / Xho3限制酶位点。

在。中创建CRE点变异 CCK 启动子，针对先前报道的CRE样位点的诱变引物（有义引物：5'CGTGTCCTGCTGGACTGAGCTCGCACTGGGTAAACA 3'，反义引物：5'CTGTTTACCCAGTGCGCGCTGAGTCCAGCAGGACACG 3'）与Stratagene Quik Change II诱变试剂盒结合使用（每个制造商的指示）。这会将报道的CRE样位点（ACTGCGTCAGC）转换为ACTGAGCTCC。通过DNA测序确认所有报告质粒。 ΔFosB表达质粒包含一个全长ΔFosB序列，该序列插入到pCDNA 3.1的多克隆位点中，先前已有描述（Ulery和Nestler，2007).

细胞培养和DNA转染

将大鼠嗜铬细胞瘤（PC12）细胞保存在Dulbecco改良的Eagle培养基F-12中，并在10°C和5％CO下补充1％马血清，37％胎牛血清和5％青霉素/链霉素₂。使用BTX 360电穿孔仪（350V，0 ohms和850μF）在800 mm Dulbecco's磷酸盐缓冲液中在4 mm间隙比色皿中用10μg报告基因和5μg表达构建体进行电穿孔来转染细胞。空载体质粒（pCDNA）用于标准化DNA总量。转染后，将细胞在35 mm胶原蛋白包被的培养皿中生长指定的时间。

荧光素酶测定

转染两三天后，将细胞在Dulbecco's磷酸盐缓冲液中洗涤3次，然后裂解（使用25 mM甘氨酰甘氨酸，15 mM MgSO₄，4 mM EGTA，1％Triton X-100，pH 7.8，1 mM DTT），收集并通过离心澄清。将30μL裂解物与140μL荧光素酶测定缓冲液（25 mM甘氨酰甘氨酸，15 mM MgSO）组合。₄，4 mM EGTA，1 mM DTT，1 mM ATP，1 mM磷酸钾，1 mM辅酶A，pH 7.8）。在每孔自动注射800μL40mM荧光素后，使用FLx-1微板荧光读数器测量发光活性。通过BioRad蛋白质测定法测定荧光素酶活性相对于总蛋白质含量标准化。

电泳迁移率变动分析

来自双转基因11A小鼠的双侧纹状体切片的核提取物（在2或8周内维持在多西环素上或下的维生素）（McClung和Nestler，2003）按照准备黄和沃尔特斯（1996）. ³²使用Promega Gel Shift Assay系统方案（#E3300）制备P标记的双链寡核苷酸探针，并使用Roche Quick Spin Columns纯化探针。一致的CRE和AP-1探针序列来自Promega（分别为#E328A和E320B）和 CCK CRE序列为（Cck-CRE sense：CTAGCGAGCTCTGGACTGCGTCAGCACTGGGTGCA; Cck-CRE反义：CCCAGTGCTGACGCAGTCCAGAGCTCGCTAGCTTT）。

使用Promega Gel Shift Assay系统程序（#E3300）的修改进行结合反应和电泳。标记探针的50,000 CPM与10μg纹状体核提取物组合。在引入放射性标记的探针之前加入冷的竞争物DNA或抗体。对于超迁移实验，使用2μgCREB抗体（Upstate Biotechnology＃06-083）。将反应物在4％聚丙烯酰胺凝胶上电泳，干燥，并暴露于膜（使用增感屏，1小时至2天）。

免疫印迹

对于PC12细胞，在冰冷的Dulbecco磷酸盐缓冲液中洗涤35毫米转染的细胞板，并在冰冷的RIPA裂解缓冲液（50 mM Tris pH 7.4、5 mM NaCl，5 mM EDTA，1％脱氧胆酸盐，1％裂解液）中制备裂解物。％的Triton X-100，0.1％的十二烷基硫酸钠）含有蛋白酶抑制剂。超声处理，清除并进行Bradford蛋白分析后，将裂解物完全变性，并在50％SDS聚丙烯酰胺凝胶上对每种样品10μg进行电泳。将蛋白质转移到PVDF膜上，在含有1％Tween-3的Tris缓冲盐水中的0.1％脱脂奶粉中封闭20小时，然后在4°C下用一抗（CREB-用TBS-T牛奶稀释的Upstate Biotechnology＃06-083，以1：1,000的比例使用； GAPDH- Sigma＃G8795，以1：80,000的比例稀释）。在TBS-T中多次洗涤后，使用在TBS-T牛奶中以1：5,000稀释的碱性磷酸酶偶联的二抗（Sigma）在室温下将印迹检测一小时。在Tris缓冲盐水中多次洗涤后，根据BioRad（＃170-6432）的说明进行显色反应。将膜干燥过夜，在平板扫描仪上扫描，并使用ImageJ进行光密度测定（见下文）。

对于纹状体提取物，蛋白质印迹分析如先前公布的那样进行（Hope等人，1994）。从断头小鼠中取出组织，置于冰上，切成厚度为1 mm的脑基质。然后取出组织冲头并在-80℃冷冻直至使用。在含有磷酸酶和蛋白酶抑制剂（Roche，Sigma）的改良的洗涤剂基缓冲液中将组织在冰上超声处理。超声处理后，将样品在沸水中变性，并在15,000xg下离心15分钟; 随后收集并处理上清液; 然后使用Bradford测定法（Bio-Rad）定量蛋白质浓度量。将样品在10％丙烯酰胺/双丙烯酰胺凝胶上电泳，转移至PVDF膜，在5％乳中封闭并与一抗（Anti-CREB，Upstate，Lake Placid，NY）一起温育。随后使用化学发光系统（Pierce）使印迹可视化。将所有样品标准化为GAPDH（Fitzgerald，Concord，MA）。运行标准曲线以确保我们处于测定的线性范围内。

密度测定分析

对于PC12免疫印迹，使用具有rodbard校准的ImageJ进行光密度分析。从每次测量中减去平均背景信号，并计算每个样品的CREB与GAPDH信号的比率。对于纹状体免疫印迹和EMSA分析，Scion Image 1.62c与背景扣除一起使用。

染色质免疫沉淀（ChIP）

根据方法进行ChIP测定 Tsankova等。（2004）和库马尔等人。（2005）。简而言之，用11％甲醛将保持在多西环素上或不使用多西环素的1A小鼠的双侧纹状体样品交联，并用甘氨酸淬灭交联（终浓度0.125M）。这些样本取自整个大脑切片，取自伏隔核水平，并去除了皮质。通过超声将染色质剪切成大约0.2到1 kb的片段，用Protein G珠粒（Thermo Scientific＃22852）清除，然后将输入样品冷冻在-80°C。每次沉淀使用60至100μg的染色质。使用了每种抗体的5-10μg（CREB：Upstate Biotechnology＃06-863，ΔFosB：Santa Cruz Biotechnology＃SC-48x，乙酰化H3：Upstate Biotechnology＃06-599，甲基化H3（LYS9）：Cell Signaling Technology， cFos：圣克鲁斯生物技术＃SC-7202x）。根据制造商的说明（Thermo Scientific＃22852），用Protein G plus珠粒对抗体-染色质复合物进行免疫沉淀。在输入和沉淀的样品反向交联之后，对每个样品进行定量PCR（qPCR）。所有这些抗体在ChIP中的使用已得到广泛验证（Tsankova等，2004; Kumar等人，2005; Renthal等人，2009).

通过qPCR（Applied Biosystems（ABI）Prism 7700，Foster City，CA）测量相关DNA的量来确定每个目的基因启动子的蛋白质结合水平。在SYBR Green（Applied Biosystems，CA）存在下，一式三份扩增输入或总DNA（非免疫沉淀的）和免疫沉淀的DNA。使用Sequence Detector 1.1软件获得每个样品的Ct值。使用ΔΔCt方法进行模板DNA的相对定量（Tsankova等，2004）。使用的引物：BDNF启动子4：CTTCTGTGTGCGTGAATTTGCT; AGTCCACGAGAGGGCTCCA CDK5启动子：GCTGAAGCTGTCAGGAGGTC; GTGCCCCGCTCTTGTTATTA Cck发起人：CTTGGGCTAGCCTCATTCACTG; TTAAATAGCTCCTCCCGGTTCG Prodynorphin启动子：GGCTTCCTTGTGCTTCAGAC; GCGCTGTTTGTCACTTTCAA。

统计分析

所有数据均以平均值±平均值的标准误表示。通过Student的两尾t检验确定统计学差异（p <0.05）。进行多次比较时，使用Bonferroni校正调整p值。

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致谢

我们要感谢Will Renthal和Arvind Kumar的有益讨论。我们还要感谢NIDA为这些实验提供资金。

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脚注

发布者的免责声明： 这是未经编辑的手稿的PDF文件，已被接受发布。作为对我们客户的服务，我们正在提供该手稿的早期版本。在以最终的可引用形式发布之前，稿件将进行复制，排版和审查。请注意，在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误，以及适用于该期刊的所有法律免责声明。

分类术语：

部分：#1神经系统的细胞和分子生物学

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抽象

引言

成果