多巴胺受体的表达和分布在从可卡因自我给药中撤出后在伏隔核中动态变化。 （2010）

蛋白质交联

之前已经详细描述了这种方法（Boudreau和Wolf，2005; Ferrario等，2010）。 将大鼠断头，迅速取出大脑，并在冰上从使用脑基质获得的2mm冠状切片解剖整个NAc（或核心和壳子区域）。 使用McIllwain组织切碎机（Vibratome，St.Louis，MO）立即将整个NAc组织切成400μm切片，而使用解剖刀手动切碎较小的核心和壳子区域。 然后将组织加入含有冰冷的人工CSF的Eppendorf管中，该人用CSF掺有2 mM双（磺基琥珀酰亚胺基）辛二酸酯（BS）³; Pierce Biotechnology，Rockford，IL）。 在温和搅拌下使交联反应在30℃下进行4 min，然后通过加入100mM甘氨酸（10 min，4℃）终止。 通过短暂离心沉淀组织，重悬于含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的冰冷裂解缓冲液中，超声处理5秒，并再次离心。 将等份的上清液储存在-80℃直至通过Western印迹分析。

交联组织中DAR的Western印迹分析

将样品（20-30μg总蛋白/裂解物）在4-15％Tris-HCl凝胶（Biorad，Hercules，CA）上电泳。 将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上，使用恒定电流（1.15mA）对1.5 h进行免疫印迹。 使用冷却盘管来防止过度加热。 通过用考马斯蓝转移后染色凝胶证实了高分子量聚集体的完全转移。 此外，我们证实在堆积凝胶中未检测到交联的DAR蛋白（数据未显示）。 转移后，将膜在ddH中洗涤₂O，在室温（RT）下空气干燥1小时，用100％MeOH再水合，在1x Tris缓冲盐水（TBS）中洗涤，并在室温下浸入0.1M NaOH，pH 10中15 min。 然后，将它们在TBS中洗涤，用TBS-Tween-3（TBS-T），pH 20中的7.4％牛血清白蛋白（Sigma-Aldrich，St.Louis，MO）在室温下封闭1小时，并孵育过夜。在4°C，用识别D1 DAR的抗体（1：1000; Millipore; Cat＃AB1765P），D2 DAR（1：1000; Millipore，Billercia，CA; Cat＃AB5084P）和D3 DAR（1：1000; Millipore;猫＃AB1786P）。 由于缺乏识别交联和细胞内受体的抗体，未分析D4和D5 DAR。 应注意，在这些实验中使用的DAR抗体批次购自2005-06; 目前许多这些抗体（2009-10）显示出不同的条带模式，这些模式在DAR敲除小鼠的组织中没有改变（未发表的观察结果）。 一抗孵育后，用TBS-T溶液洗涤膜，用HRP缀合的抗兔IgG或抗小鼠IgG（60：1; Upstate Biotechnology，Lake Placid，NY）孵育10,000 min，用TBS-洗涤。 T，用ddH冲洗₂O，并浸入化学发光检测基质（Amersham GE，Piscataway，NJ）中。 在开发印迹后，使用Versa Doc Imaging Software（Bio-Rad）捕获图像。 使用Quantity One软件（Bio-Rad）测定表面和细胞内条带的扩散密度。 将表面，细胞内和总（表面+细胞内）蛋白质水平的值标准化为使用Ponceau S（Sigma-Aldrich）测定的泳道中的总蛋白质，并用TotalLab（Nonlinear Dynamics，Newcastle，UK）分析。 表面/细胞内比率不需要归一化，因为两个值都在同一泳道中确定。 为了检查抗体特异性，对用于产生每种抗体的肽的DAR抗体进行预吸收研究。 将D1，D2或D3 DAR抗体与10μlTBS中的500倍过量浓度的肽组合，在4℃下混合4小时，稀释至最终体积20ml，加入膜中，并在37℃温育过夜。 4°℃。

D1 DAR

在WD45上未发现可卡因和生理盐水组之间的显着差异。 然而，可卡因自我管理的效果在WD1上很明显。 对整个NAc的分析表明，与自我给予生理盐水的组相比，WD1-Coc组的D1 DAR表面/细胞内比率显着更高（图2a）。 这可归因于表面D1 DAR的适度增加以及细胞内D1 DAR的适度降低（后两种效应均无统计学意义），总D1 DAR水平（表面+细胞内）没有任何变化（图2a）。 在NAc核心内，没有发现任何D1 DAR指标的显着影响（图2b）。 但是，NAc shell显示的变化与整个NAc中观察到的变化相似，但略强一些（图2c）。 由于表面D1 DAR表达的显着增加，WD1-Coc组的表面/细胞内D1 DAR比率增加。 细胞内水平没有变化，但总体D1 DAR水平有增加的趋势。 总之，与WD1-Sal大鼠相比，更大部分的D1 DAR蛋白在WD1-Coc大鼠的NAc壳中表面表达。 在从可卡因自我管理中撤出1天后，D45 DAR分布恢复到对照状态。

图。 2

在从可卡因自我戒断中撤出1天后，NAN壳中的D1 DAR表面表达增加

D2 DAR

在整个NAc中，与盐水对照相比，观察到的主要影响是自我给予可卡因的大鼠D2 DAR表达降低（图3a）。 这在WD45上最明显，当在表面条带中观察到减少时，所有三个细胞内条带（~55，75和100kDa）以及与盐水对照相比的总D2 DAR水平。 WD2-Coc组的表面/细胞内D45 DAR比率略有增加，但由于细胞内比表面D2 DAR的减少更多，这可能表明细胞通过分配更多的可用细胞来补偿D2 DAR表达的减少。 D2 DAR到表面。 重要的是要记住，在这种特定情况下，升高的表面/细胞内比率并不表明D2 DAR传递增加，因为表面表达的D2 DAR的绝对水平降低。 在WD1-Coc组中，与WD2-Sal和WD55-Sal组相比，唯一显着的效果是D45 DAR单体（~1kDa）的细胞内水平降低，尽管其他一些措施也趋于减少（图3a).

图。 3

从可卡因自我戒断中撤出2天后，NAc中的细胞内和表面D45 DAR水平降低

在NAc的核心和壳子亚区域，D2 DAR表达的总体下降也很明显（图3b和3c尽管在壳中效果往往更明显。 因此，可卡因大鼠的表面D2 DAR水平仅在核心中的WD45上降低，而在壳中的WD1和WD45上降低。 总D2 DAR仅在壳中显着下降。 细胞内D2 DAR条带的减少在核心和壳体的两个停药日均发生，尽管在细胞内条带显示出统计学上显着的作用方面存在戒断和区域特异性差异。 总之，在可卡因自我给药后，NAc中D2 DAR表面和细胞内蛋白质水平降低。 WD1已经明显减少了一些。

在停止可卡因自我给药后，D1 DAR表面表达在NAc壳中瞬时增加

在可卡因自我施用后，WD1上的NAc壳中D1 DAR表面表达增加，但是通过WD45标准化，而在核心中未观察到变化，表明局限于壳的瞬时增加。 在先前使用受体放射自显影的研究中已经获得了类似的结果。 本沙哈尔等人。 （2007） 发现在停止延长通路（1小时/天）可卡因自我给药后，大鼠的NAc壳中20 min（但不是14或60天）的D6 DAR密度增加，而在核心或短途可卡因自身后没有观察到变化 - 管理（2小时/天）。 纳德等人。 （2002） 观察到在最后一次1可卡因自我给药期后死亡的恒河猴的D100 DAR密度略有增加。 猴子在停止相同方案后的30天数评估显示，在更多尾部水平的头部NAc以及核心和壳体中D1 DAR密度增加，但是D1 DAR密度在90天后正常化（Beveridge等，2009）。 所有这些结果，如我们的结果，表明在停止可卡因自我给药后，D1 DAR水平短暂增加，特别是在壳中。 然而，该组早期的一项研究表明，恒河猴的NAc（壳中最强壮）的D1 DAR密度降低，这些恒河猴自我施用可卡因的时间更长（18个月; Moore等，1998a）。 尽管在本研究中总可卡因摄入量高于上述大鼠研究中的可卡因摄入量，但在NAc中D1 DAR结合减少也在18 hr中被发现。De Montis等人，1998）。 这些结果表明，D1 DAR适应性取决于可卡因暴露的许多方面。 另一个考虑因素是受体放射自显影测量总细胞受体，而我们的蛋白质交联实验可以区分表面和细胞内受体。 有趣的是，免疫印迹研究发现人类可卡因使用者的NAc中D1 DAR水平增加的趋势（Worsley等，2000).

我们在NAc壳中观察到的D1 DAR表面表达的瞬时增加是否对培养诱导的可卡因渴望的孵化很重要？ 这很难评估，因为没有研究测试过NAc内注射D1 DAR激动剂或拮抗剂对家庭笼停药后诱导的可卡因寻求的影响（或灭绝训练后提取的可卡因恢复原状）。 然而，内侧NAc（壳和内侧核心）中的D1受体与灭绝后可卡因的可能性恢复有关，显然是通过需要合作激活D1和D2 DAR的机制（Anderson等，2003; 2008; Bachtell等，2005; 施密特和皮尔斯，2006; 施密特等人，2006）。 与我们的结果一起，这可能表明NAc壳中的神经元对D1 DAR介导的可卡因在由于瞬时D1R上调引起的早期戒断中的反应更敏感。 然而，从恢复到孵化研究的推断必须谨慎，因为灭绝训练和家笼撤离与NAc中不同的神经适应有关（Sutton等，2003; Ghasemzadeh等，2009; Wolf和Ferrario，2010）。 值得注意的是，基底外侧杏仁核和前额叶皮质中的D1 DAR对于线索诱导的可卡因寻找恢复也很重要（例如， Ciccocioppo等，2001; Alleweireldt等，2006; Berglind等，2006).

在细胞水平上，突触前和突触后DAR都可以调节中型多刺神经元的兴奋性，这是NAc的主要细胞类型和输出神经元（Nicola等人，2000; O'Donnell，2003）。 已知重复的非偶然可卡因施用增强了NAc中D1 DAR活化的一些作用。 因此，在停止可卡因治疗后一天至一个月，在整个NAc中观察到D1 DAR激动剂抑制中型多刺神经元活性（由离子电渗谷氨酸盐驱动）的增强能力（亨利和怀特，1991; 1995）。 但是，此处报告的增加的D1 DAR表面表达不太可能解释这些先前的结果，因为它仅限于shell并且仅在WD1上进行了演示。 服用可卡因后一天，在停止重复注射可卡因后数天内服用10-14， Beurrier和Maleka（2002） 观察到NA介导的多刺神经元中DA介导的兴奋性突触反应抑制的增强，这显然是由谷氨酸神经末梢上的突触前D1样DAR介导的。 但是，挑战注射的可能影响（例如，见 Boudreau等，2007 和 Kourrich等，2007），结合物种差异和核心记录不足，很难将他们的发现与我们自己的发现进行比较。 还应该注意到DAR激动剂和拮抗剂所使用的 亨利和怀特（1991; 1995） 和 Beurrier和Malenka（2002） 没有区分D1和D5 DAR。

停止可卡因自我给药后，NAN中的D2 DAR水平降低

在我们的研究中观察到的主要效果是相对于盐水对照，在停止可卡因自我给药后NAc核心和壳中的D2 DAR蛋白质减少。 这在壳中更明显，其中WD1和WD45的细胞内，表面和总带减少。 在核心中，D2 DAR表面表达仅在WD45上降低，并且总D2 DAR水平没有显着降低。 其他几项研究同样发现停用可卡因自我给药后D2 DAR表达下降。 在具有广泛可卡因自我管理经验的恒河猴中，当在最后一次治疗后立即获得组织时，在受体放射自显影测量的D2 DAR密度在许多纹状体区域（包括NAc核心和壳）中减少（Moore等，1998b; Nader等，2002）。 使用PET，在开始可卡因自我给药的1周内检测到基底神经节中的这种效应（Nader等，2006）。 戒断期间D2 DAR水平恢复的速率可能取决于可卡因的总摄入量。 在放射自显影研究中，NAN中的D2 DAR水平在30或90天从100可卡因自我给药期后恢复到控制值（Beveridge等，2009）。 然而，在长期接触猴子（1年）并因此摄入更多可卡因的猴子的PET研究中，3猴子的5显示2天后D90 DAR水平恢复，而2猴子即使在12月后也没有恢复（Nader等，2006）。 总的来说，这些结果与我们在整个戒断过程中降低D2 DAR水平的结果非常吻合。

人体可卡因成瘾者的PET研究还发现，许多纹状体区域（包括腹侧纹状体）的D2 DAR水平降低，这在早期戒断以及3-4解毒月后是明显的（Volkow等人，1990, 1993, 1997）。 然而，行为的重要性尚不清楚，因为D2 DAR的可用性与可卡因的积极主观影响或启动剂量后服用更多可卡因的决定无关（Martinez等人，2004）。 值得注意的是，虽然提示诱导的可卡因渴望在戒断期间显示出时间依赖性的增加（“孵化”），但对于可卡因引发的可卡因寻求，这种情况并不会发生（Lu等人，2004a）。 因此，结果 Martinez等人。 （2004） 留下D2 DAR可用性可能与提示诱导的可卡因寻求相关的可能性，这是本文研究的孵化模型的焦点。 人体可卡因使用者的低D2 DAR可用性与额叶皮质代谢减少有关（Volkow等人，1993）。 与其他变化一起，这可能导致成瘾者接触药物或药物配对线索时失去控制，并且与非药物奖励相比，药物更有显着性（Volkow等人，2007; Volkow等人，2009）。 值得注意的是，PET研究中D2 DAR水平的降低可以表明DA释放升高而不是降低D2 DAR水平，但最近的结果反驳了可卡因依赖患者的这种解释（Martinez等人，2009）。 此外，对人类可卡因使用者的尸检研究发现NAc中使用免疫印迹降低D2 DAR水平的趋势（Worsley等，2000).

对人类可卡因成瘾者的研究无法确定D2 DAR的可用性是否是诱发性状或可卡因暴露的结果，但其他结果表明两者都是正确的。 一方面，非药物滥用人类的实验发现D2 DAR可用性与施用哌醋甲酯时“药物喜好”的报告之间呈负相关（Volkow等人，1999; 2002）。 这些研究结果表明，低D2 DAR可用性可能会增加成瘾的可能性。 恒河猴的研究支持了类似的结论。 在社会居住的猴子中，社会优势的实现增加了纹状体中D2 DAR的可用性，这与可卡因与下属猴子相比对增强效应的敏感性降低（Morgan等人。，2002）。 社交状态也与无毒人类志愿者的纹状体D2 DAR可用性相关（Martinez等人，2010）。 另一方面，PET和受体放射自显影研究表明，如上所述，长期可卡因自我给药会减少单独饲养的猴子的纹状体D2 DAR受体的可用性（Moore等，1998b; Nader等，2002; Nader等，2006）。 慢性可卡因自我管理似乎也降低了占主导地位的社会圈养猴子的D2 DAR可用性（Czoty等人，2004）。 因此，在长期可卡因自我给药后，D2受体的可用性或主要和从属猴子之间可卡因的增强作用不再存在显着差异（Czoty等人，2004）。 然而，禁欲期间，优势猴子的D2 DAR水平重新出现，这与对新奇反应的潜伏期较长有关，这种特征预示着对可卡因增强作用的敏感性降低（Czoty等人，2010).

与人类和猴子一样，大鼠研究表明，低D2 DAR可用性是可卡因易感性的风险因素。 因此，对具有高冲动性（与可卡因自我给药增加相关的性状）的大鼠的PET研究显示腹侧纹状体中D2 / D3 DAR的可用性降低（Dalley等，2007）。 NAc中的D2 DAR水平也在显示出对新奇性的高运动反应的大鼠中降低，这是与成瘾易感性相关的另一个特征（Hooks等，1994）。 我们在大鼠中的结果表明，NAc中D2 DAR水平的降低也可能是重复可卡因暴露的结果，与猴子和人类的研究一致（上图）。 然而，在大鼠中进行的两项受体放射自显影研究发现了与我们不同的结果。 本沙哈尔等人。 （2007） 没有观察到撤离后的NAN中D2 DAR水平降低（20分钟，14天60天数）与类似于我们自己（6小时/天）的延长可卡因自我给药方案，尽管在NAc壳中观察到减少在限制进入方案（2小时/天）和14天数后（Ben-Shahar等人，2007). Stéfanski等。 （2007） 在停止限制进入可卡因自我给药（2 hr /天）后，发现核心或壳体24 h中的D2 DAR水平没有变化，尽管D2 DAR水平确实在可卡因控制中降低。 如上所述，受体放射自显影测量总细胞受体，而PET和蛋白质交联研究测量细胞表面受体。

总体而言，关于D2 DAR水平与可卡因自我管理之间关系的研究支持D2 DAR通常限制可卡因自我管理的模型。 因此，我们建议在我们的实验中观察到的D2 DAR水平降低可能有助于在可卡因戒断后寻找诱导可卡因。 特别是，在NAX核心中D2 DAR表面表达在WD45而不是WD1上降低，加上NAc核心在线索诱导的可卡因寻找中的关键作用这一事实表明，NAc核心中的时间依赖性D2 DAR下调可能有助于提示诱导可卡因的时间依赖性强化。 这将预测在戒断期间输注D2激动剂的NAc内将减少线索诱导的可卡因寻求。 不幸的是，没有研究检查过NAc D2 DAR药物在孵化模型中的作用。 另一方面，可卡因引发的恢复研究表明，壳和内侧核心的D1和D2 DAR合作促进可卡因寻求（Anderson等，2003; Bachtell等，2005; 施密特和皮尔斯，2006; 施密特等人，2006）。 基于这些发现，在我们的实验中观察到的D2 DAR表达减少可能被预测为减少可卡因寻求，即产生与实际观察到的依赖于戒断的强化相反的效果。 这种差异可能反映了在灭绝训练之后将可卡因引发的恢复原状推广到戒断后提取可卡因的问题。

在停止可卡因自我给药后，在NAc核心中发生D3 DAR表面表达的时间依赖性增加

D3 DAR优选药物在可卡因自我给药和恢复范例中的研究表明，D3 DAR拮抗剂可用于治疗可卡因成瘾，特别是降低对可卡因相关线索的反应性（Heidbreder等，2005; 2008; Le Foll等，2005; Xi和Gardner，2007）。 这些结果意味着内源性DA激活D3 DAR可能参与介导线索诱导的可卡因寻找。 我们的结果显示，在延伸的可卡因自我给药的WD3中，NAc核心中的D1 DAR表面表达没有变化，但是与可卡因渴望的孵育有关，WD45的表达增加。 D3 DAR表面表达在壳中没有显着增加，尽管表面/细胞内比例有小但显着的增加。 鉴于D3 DAR传递在响应可卡因相关线索中的作用以及核心对线索诱导可卡因寻求的重要性，很有可能推测NAc核心中D3 DAR表面表达的增加有助于线索诱导的可卡因的孵化。在WD45上观察到的渴望。 然而，D3 DAR拮抗剂用于减少可卡因寻求的神经部位尚未建立。 具体而言，没有研究检查过NAc内注射D3 DAR优选药物对提示诱导可卡因的影响。 在不同的模型中， 施密特等人。 （2006） 发现将D3优选的激动剂PD 128,907注射到核心或壳中并不会在灭绝训练后产生可卡因的恢复。

我们的结果通常与受体放射自显影研究一致，该研究测量了可卡因暴露后NAc中的总D3 DAR水平。 Staley和Mash（1996） 据报道，与年龄匹配的对照组相比，可卡因过量受害者的NAc中D3 DAR结合率更高。 在条件性位置偏好范例中暴露于可卡因并且戒断三天后，小鼠在NAc核心和壳中表现出增加的D3 DAR结合（Le Foll等，2002). Neisewander等。 （2004） 在具有广泛可卡因自我管理经验的大鼠中测量D3 DAR结合，在各种停药期后测试可卡因引发的恢复，然后在之后杀死24。 NAX中的D3 DAR结合在WD1上没有变化，但在较长时间后增加（WD31-32），与我们观察到的时间依赖性增加一致。 此外，戒断期间减少可卡因寻求的药物治疗也减弱了D3 DAR结合的增加，表明D3 DAR上调在功能上与可卡因寻求有关。 应该注意的是，D3 DAR增加了 Neisewander等。 （2004） 在核心中显着，而在壳中仅观察到趋势，但是在NAc的嘴部分中分析了子区域，其中核和壳不太明显。 我们的分析是在NAc的嘴侧和尾侧部分的核心和壳上进行的。

这项工作得到了DA009621，DA00453和NARSAD杰出研究员奖，MEW，DA020654到MM以及国家研究服务奖DA021488到KLC的支持。