青春期和自愿饮酒后多巴胺释放动力学变化（2014）

青春期与高冲动性和冒险有关，使青少年更倾向于使用药物。 早期药物使用与生命后期物质使用障碍的风险增加有关，但神经生物学基础尚不清楚。 大脑在青春期经历了广泛的发展，此时的干扰被假设为导致脆弱性增加。 从控制药物到强迫性药物使用和成瘾的过渡涉及神经网络的长期变化，包括伏隔核的转变，介导急性增强效应，以及背侧纹状体的募集和习惯形成。 该研究旨在检验青春期大鼠药理学挑战后多巴胺释放增加的假设。 使用计时电流多巴胺记录结合苯丙胺在早期和晚期青春期大鼠和成年大鼠中的攻击来研究钾诱发的多巴胺释放和摄取。 此外，还研究了青春期自愿饮酒对这些影响的影响。 数据显示诱发的多巴胺释放随着年龄逐渐增加，支持先前的研究表明可释放的多巴胺池随着年龄增加。 相比之下，随着年龄的增长，诱发释放的逐渐减少是对安非他明的反应，在较年轻的动物中支持比例较大的多巴胺储存库。 自愿饮酒后多巴胺测量结果导致氯化钾响应释放幅度降低，表明酒精影响可释放的多巴胺库，这可能会影响成瘾的脆弱性和其他涉及背侧纹状体多巴胺的精神病诊断。

材料和方法

道德声明

所有动物实验均在乌普萨拉动物伦理委员会批准的方案下进行，并遵循瑞典动物实验立法（动物福利法案SFS1998：56）和欧洲共同体理事会指令（86 / 609 / EEC）的指导原则。

动物

妊娠Wistar大鼠（RccHan：WI，Harlan Laboratories BV，Horst，The Netherlands）在妊娠日16到达动物设施。 为了适应计时电流记录的时间安排，这些动物分批抵达数周。 这些水坝单独饲养在macrolon笼中（59 cm×38 cm×20 cm），含有颗粒食物（R36型;Lantmännen，Kimstad，瑞典）和自来水 随意。 笼子里装有木片床上用品和纸张（40×60 cm; Cellstoff，Papyrus），动物护理人员每周更换一次。 动物室在常规22 h光/暗循环下保持恒定温度（1±50℃）和湿度（10±12％），在06：00 am处开灯。 所有房间都有掩蔽的背景噪音，以尽量减少可能扰乱动物的意外声音。

可以在中找到实验大纲的概述 图1。 出生于同一天（出生后一天（PND）0）的小窝被交叉培养以包括6雄性和4雌性以控制母体运输压力，母体行为和遗传。 当进行计时电流记录时，幼仔在PND 22上断奶并且每笼饲养3直至PND 28（±1天）或PND 42（±1天）。 本研究中仅进一步使用雄性幼崽。 在从PND20到PND28的两瓶自由选择范例中，给一组30只雄性大鼠提供了对65％乙醇的自愿狂欢。 每周给动物24小时连续三天，即周二至周四，连续六周，共18次。 对于乙醇摄入量的测量，在每个阶段之前和之后对瓶子进行称重，并计算每千克体重的克纯乙醇。 会话之间的瓶位变化以避免排名偏好。 将饮用乙醇的动物分别从PND 28饲养至PND 70。 选择具有最高累积乙醇摄入量（g / kg）的动物，然后在PND 70（±2天）进行电化学记录。 年龄匹配的饮水控制也在同一时期单独饲养。

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图1。 实验大纲。

E =乙醇饮用，PND =出生后一天，W =饮水。

DOI：10.1371 / journal.pone.0096337.g001

多巴胺的计时电流记录 In 体内

材料。

Inactin，Nafion 5％溶液，多巴胺盐酸盐，L-抗坏血酸，氯化钾，氯化钠，磷酸钠，氯化钙和d-苯丙胺硫酸盐得自Sigma-Aldrich，LLC（St Louis，MO，USA）。 克尔粘性蜡得自DAB LAB AB（UpplandsVäsby，Sweden）。 碳纤维微电极（SF1A;30μm外径×150μm长度）购自Quanteon，LLC（Nicholasville，KY，USA），参比电极银线（200μm，Teflon绝缘）购自AM Systems Inc.（美国华盛顿州Carlborg）和用于微量移液管的玻璃毛细管（0.58 mm内径）购自World Precision Instruments Ltd（Stevenage，UK）。

手术。

多巴胺记录在PND 28（±1天），PND 42（±1天）或PND 70（±2天）进行。 在电化学记录之前立即进行手术。 使用水循环加热垫（Gaymar Industries，Inc.，Orchard Park，New York）来维持体温。 用Inactin 125 mg / kg腹膜内（ip）麻醉动物并置于立体定位框架（Stoelting Co.，Wood Dale，IL，USA）中。 在电极的记录部位上钻出颅骨中的孔，并且远离记录部位钻出另一个孔以放置Ag / AgCl参比电极。

多巴胺释放和摄取的高速计时电流记录。

根据先前描述的程序，使用FAST1-mkII记录系统（Fast Analytical Sensing Technology，Quanteon，LLC，Nicholasville，KY，USA）进行高速计时电流测量（200 Hz采样率，16 ms总计）。 [16]。 碳纤维微电极（SF1A）涂有三层Nafion涂层，在第一次涂层之前和每次涂层之后在5°C下进行200最小加热 [17]。 然后校准电极 细胞/组织 在0.05 M磷酸盐缓冲盐水中测定选择性，检出限（LOD）和使用前的斜率 体内 [16]。 微电极显示对多巴胺的连续添加（2-6μM）的线性响应，具有2±0.999的平均相关系数（R0.0003）。 本研究中使用的所有电极的平均选择性是多巴胺相对于抗坏血酸的14482±3005μM。 平均LOD为0.026±0.004μM多巴胺，平均斜率为-1.00±0.03 nA /μM多巴胺。 在多巴胺的参考峰值响应期间测量的平均还原/氧化比率是0.67±0.02，这表明主要检测到多巴胺 [17]。 镀银线并用作 体内 Ag / AgCl参比电极 [18].

体内实验方案。

用等渗氯化钾溶液（10 mM KCl，15 mM NaCl，120 mM CaCl）填充微量移液管（29-2.5μm内径）₂·2H₂O）（pH 7.2-7.4）使用移液管填充针（28G，World Precision Instruments，Aston，UK）。 使用粘性蜡将微量移液管从碳纤维尖端固定约150-200μm。 电极立体定位于背侧纹状体，AP：+ 1.0 mm，L：+ 3.0 mm来自前囟，切牙条根据年龄和体重进行调整 [19], [20]。 最初将电极背侧（-3.0 mm）放置到记录部位，使用显微操纵器（Narishige International Ltd，London，UK）降低它，并允许达到约45-60 min的稳定基线，然后降低到来自前囟的-4.0 mm深度。 然后在确定单次注射氯化钾对多巴胺释放的影响之前，使电极另一个5-10 min稳定在记录位点。 使用由PicoSpritzer III（Parker Hannifin Corporation，Pine Brook，NJ，USA）控制的压力喷射局部施加钾溶液，并调节压力（10-20 psi）和时间（0.5-1.0 s）以递送100 nl。用装有目镜标线的手术显微镜测量钾溶液 [21].

钾诱发释放与皮下注射苯丙胺或盐水联合使用。 产生三个幅度相似的参考峰，10分开。 在最后一个参考峰值后5分钟，给予大鼠2 mg / kg苯丙胺或等量的盐水（1 ml / kg），并且在每5 min后再次诱发10 min释放，在5，15，25处产生峰值。 ，全身注射后，35，45，55和65 min，见 图2A 代表性的痕迹。 基于运动和自我给药研究中的行为效应选择苯丙胺的剂量 [22]–[24].

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图2。 代表性痕迹。

A）在出生后28接受安非他明的大鼠的氧化电流的代表性痕迹和B）同一动物的第二参考峰的特写，显示如何计算振幅和T80。 Amp =幅度，Base =基线，Ref =参考。

DOI：10.1371 / journal.pone.0096337.g002

验证电极放置和排除。

切断电极并在完成实验后将其留在原位并冷冻脑。 通过冷冻脑的切片验证了放置。 来自PND12的28动物，1由于错误放置而被排除，而2因记录错误而被排除。 对于PND 12的42动物，1动物由于错误放置而被排除。 对于PND 16的70动物，由于记录错误而排除了3。 对于PND 16的70乙醇饮用动物，由于记录错误而排除了2。 记录错误包括移液管堵塞和电气干扰，例如断电和对记录单元的一般电源的干扰。

数据分析。

使用FAST Analysis软件版本80（Quanteon，LLC，Nicholasville，KY，USA）计算诱发峰的最大振幅和峰降至其振幅的80％的时间（T4.4），参见 图2B 以获得代表性的痕迹。 将三个参考峰取平均值，并为进样后的峰计算这些峰的百分比。 为了进行统计分析，使用重复测量方差分析（ANOVA）来比较年龄或饮酒组与治疗（盐水或苯丙胺）之间随时间变化的计时电流数据，然后进行Fisher事后检验进行最小显着性差异（LSD）。 对于非正态分布的乙醇摄入数据，使用了Friedman ANOVA。 使用Statistica 10（StatSoft Inc.，塔尔萨，俄克拉荷马州，美国）进行统计分析。 差异被认为具有统计学显着性，p <0.05。

成果

与年龄有关的影响

年龄组间参考振幅的差异如图所示 图3。 比较年龄和时间的重复测量方差分析显示年龄的主要影响[F（2,22）= 5.81; p = 0.009]，但没有时间的影响[F（2,44）= 1.43; p = 0.25]或时间与年龄之间的任何相互作用[F（4,44）= 1.70; p = 0.17]。

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图3。 参考不同年龄段的峰值幅度。

在三个年龄组中，在用苯丙胺或生理盐水治疗之前，三个参考峰的振幅（µM）（平均值±SEM）； 产后一天（PND）28、42和70。** p <0.01。

DOI：10.1371 / journal.pone.0096337.g003

没有年龄的影响[F（2,24）= 1.02; p = 0.38]，时间[F（2,48）= 0.94; p = 0.40]或时间和年龄[F（4,48）= 0.22; 找到参考T0.93值的p = 80]。 平均值（SEM）参考T80值的平均值±标准误差为PND 17.3的1.3±28，PND 19.5的0.9±42和PND20.5的1.0±70。

年龄组对安非他明的振幅反应之间的差异显示在 图4A-C。 苯丙胺治疗导致年龄的主要影响[F（2,26）= 3.95; p = 0.03]，处理[F（1,26）= 10.77; p = 0.003]，时间[F（6,156）= 3.32; p = 0.004]，以及时间与年龄之间的相互作用[F（12,156）= 2.23； p = 0.01]，时间和治疗[F（6,156）= 4.20； p <0.001]，但年龄与治疗之间没有相互作用[F（2,26）= 2.37； p = 0.11]或时间，年龄和治疗[F（12,156）= 0.77; p ＝ 0.68]。

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图4。 不同年龄段的振幅和T80随时间的响应。

皮下（sc）注射盐水或苯丙胺后随时间的变化，以参考值（平均值±SEM）的百分比表示，其中包括A）出生后一天（PND）28，B）PND 42和C）PND 70的振幅D）PND 80，E）PND 28和F）PND 42的T70值。与生理盐水对照组相比，* p <0.05，** p <0.01，*** p <0.001， ^#与PND 0.05的等效时间点相比，p <42，与PND 0.05的等效时间点相比，p <0.01，°°p <0.001，°°p <70， ^§p <0.05， ^§§p <0.01， ^§§§与PND 0.001的等效时间点相比，p <28。

DOI：10.1371 / journal.pone.0096337.g004

T80对安非他明的反应如下所示 图4D-E。 没有年龄的主要影响[F（2,25）= 1.87; p = 0.17]，但有治疗效果[F（1,25）= 26.52; p <0.001]，时间[F（6,150）= 7.70； p <0.001]和时间与治疗的相互作用[F（6,150）= 12.29; p ＜0.001]。 年龄与治疗之间没有相互作用[F（2,25）= 1.29; p = 0.29]，时间和年龄[F（12,150）= 0.66； p = 0.78]，以及时间，年龄和治疗之间相互作用的趋势[F（12,150）= 1.60; p ＝ 0.098]。

自愿青少年酒精摄入量

用于计时电流记录的14大鼠的乙醇摄入量数据显示在 表1。 弗里德曼方差分析表明，随着时间的推移，摄入量没有显着差异，尽管存在趋势[χ² = 9.80; p = 0.08]由第二周摄入量引起的差异（PND 35-37），略高于随后的几周。 偏好的弗里德曼方差分析显示随时间增加[χ² = 19.7; p = 0.001]，主要是因为前三周的增加，见 表1.

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表1。 六个星期的酒精访问的中位数，最小和最大酒精摄入量（g / kg / 24 h）和偏好（％）以及18会话后的中位数，最小和最大累积摄入量（g）。

DOI：10.1371 / journal.pone.0096337.t001

乙醇和饮水组之间参考振幅的差异如图所示 图5。 重复测量方差分析比较饮酒组和饮酒时间，显示饮酒组的主要作用[F（1,17）= 16.22; p <0.001]，但不受时间影响[F（2,34）= 1.76； p = 0.19]或时间与饮酒组之间的任何相互作用[F（4,44）= 1.32； p ＝ 0.28]。

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图5。 参考饮用水或乙醇的动物的峰值振幅。

在水和乙醇饮用组中，在用苯丙胺或盐水处理之前，这三个参考峰的振幅（µM）（平均值±SEM）。 ** p <0.01，*** p <0.001。

DOI：10.1371 / journal.pone.0096337.g005

饮酒组没有影响[F（1,18）= 0.04; p = 0.85]，时间[F（2,36）= 1.96; p = 0.16]或时间和饮酒组[F（2,36）= 0.22; 找到参考T0.81值的p = 80]。 饮水大鼠的平均值±SEM参考值T80值为20.5±1.0，饮用乙醇的大鼠的平均值±SEM参考值T19.1值为1.3±XNUMX。

乙醇和饮水组对安非他明的反应如下所示 图6。 对于振幅，如图所示 图6A，有一种治疗效果的趋势[F（1,19）= 3.01; p = 0.099]并且存在时间的主要影响[F（6,114）= 2.30; p = 0.04]，但没有饮酒组的影响[F（1,19）= 0.39; p = 0.54]或治疗组与饮酒组之间的任何相互作用[F（1,19）= 0.83; p = 0.37]或时间和治疗[F（6,114）= 1.13; p = 0.35]，时间和饮酒组[F（6,114）= 0.44; p = 0.85]或时间，治疗和饮酒组[F（6,114）= 0.27; p = 0.95]。

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图6。 在饮用水或乙醇的动物中随时间的振幅和T80响应。

水（W）-或乙醇（E）-饮用组中的A）振幅和B）T80值的皮下（sc）注射盐水或苯丙胺后随时间的变化，以参考值的百分比（平均值±SEM）为准。 与盐水对照相比，* p <0.05，** p <0.01，*** p <0.001。

DOI：10.1371 / journal.pone.0096337.g006

对于T80值， 图6B，这是治疗的主要效果[F（1,19）= 17.35; p <0.001]，时间[F（6,114）= 2.42； p = 0.03]，时间与治疗之间的相互作用[F（6,114）= 10.28; p ＜0.001]。 饮酒组没有影响[F（1,19）= 0.33; p = 0.57]，或治疗与饮酒组之间的任何相互作用[F（1,19）= 0.76; p = 0.40]，时间和饮酒组[F（6,114）= 1.66； p = 0.14]，或时间，治疗和饮酒组[F（6,114）= 1.75； p ＝ 0.12]。

讨论

在基础条件下和在早期和晚期青少年以及成年大鼠中对苯丙胺的响应研究了对多巴胺释放和摄取的年龄依赖性影响。 还研究了青春期饮酒的影响，据我们所知，这是第一项用计时电流法测定自愿饮酒青春期大鼠的释放和摄取的研究。

与年龄有关的影响

参考振幅的年龄依赖性差异与先前使用伏安法结合电刺激的研究一致，这表明成年大鼠在刺激后比幼鼠释放更多的多巴胺 [12]。 Stamford（1989）使用的青春期的时间点大约是PND 30，但从那时起研究表明，在PND 40-45周围，多巴胺的基底细胞外水平存在峰值 [25]–[27] 和多巴胺受体D.₂ 密度 [28]而酪氨酸羟化酶水平低于早期青春期和成年期 [29]。 因此，目前的研究包括青春期的两个时间点，PND 28和PND 42，相当于青春期早期和晚期 [11]。 青春期晚期动物的振幅在青春期早期和成年期的振幅中间，表明从青春期到成年期的发育涉及多巴胺在背侧纹状体中响应氯化钾的释放能力的逐渐增加。 与青春期相比，成年期伏核中多巴胺细胞外水平增加的报道与此相符 [30], [31]。 如前所述，一些研究也显示PND 45的峰值水平 [25]–[27] 并且他们可以通过有关同一PND周围增加的射击率的报告与当前的研究相协调 [32], [33]。 目前的研究没有测量基础细胞外水平，并且增加的放电率可能导致基础水平增加，而钾诱导的释放没有任何峰值。 此外，其中一项研究显示伏核中钾诱导的细胞外水平达到PND 42附近的峰值 [25] 与来自Stamford（1989）的背侧纹状体和当前研究的数据形成对比，这些数据表明区域差异。

摄取量测量值T80未显示当前研究中年龄之间的任何差异，而Stamford（1989）发现成年大鼠的摄取率更高。 这可能是由于摄取量的方法学差异造成的; T80包括曲线的线性和曲线部分，而斯坦福使用曲线的线性部分 [34]。 在该研究中达到的浓度仅为先前研究中浓度的十分之一和V_最大 因此不应该达成。 使用峰值曲线的线性部分来计算在这些条件下的摄取率将仅产生取决于幅度的摄取速率 [35]。 选择T80是因为它还考虑了曲线的曲线部分，其中多巴胺浓度较低，对多巴胺摄取阻滞剂更敏感 [35], [36]。 当然，T80也取决于振幅，但是在本研究中可以看出，振幅的差异不会自动导致T80的差异，这表明摄取与释放的比率向年轻动物的摄取转移。 支持目前的研究结果是一项使用定量微透析的研究，发现在PND 35，45和60的大鼠伏隔核中，提取分数（间接测量摄取率）没有差异。 [26].

成年期钾诱发的释放量增加可能是由于多巴胺的释放量较大 [12] 并且可能涉及许多因素，例如酪氨酸羟化酶对多巴胺合成的年龄依赖性差异 [29], [37]，囊泡单胺转运蛋白-2（VMAT-2） - 含有囊泡 [38]和VMAT-2的动力学 [39]，以及D2受体修剪 [28] 和功能 [40]。 这些因素也可以帮助解释早期青少年动物安非他明后的增加幅度。 同样，目前的数据与数据显示，与成年动物相比，年轻的多巴胺释放增加更多，以响应诺米芬辛 [12] 表明早期青春期大鼠具有比例较大的储存池，其可在精神活性物质刺激后释放。 数据显示，青少年动物中安非他明后刺激的细胞外多巴胺增加更多，这进一步证实了这一点 [22]。 然而，有微透析研究表明，与成人相比，青少年安非他明后多巴胺的细胞外水平较低 [30], [37]，再次强调刺激释放增加的可能性并不一定意味着细胞外水平的增加，并且不同的技术可以增加补充信息。

在发现安非他明后，对T80没有年龄依赖性影响，这表明安非他明对所有年龄段的多巴胺摄取都产生类似的影响。 斯坦福德（1989）的结果再次证实了这一点，表明在年龄组之间的诺米芬辛后，摄取阻滞程度没有差异。 还有研究表明多巴胺转运蛋白结构和功能的年龄相关差异与转运蛋白上的可卡因结合位点有关，但与苯丙胺结合位点无关。 [22] 这表明苯丙胺对摄取的年龄依赖性影响不存在。 然而，时间，年龄和治疗之间存在相互作用的趋势，这表明他们随着时间的推移对安非他明的反应取决于年龄。 通过应用外源性多巴胺来研究摄取的进一步研究也可以帮助将幅度依赖性摄取与转运蛋白功能分开 [41]–[43]。 对清醒大鼠的研究也很重要，因为目前的研究是在麻醉的动物中进行的。 使用的麻醉剂是巴比妥盐硫代巴比妥（Inactin），一种γ-氨基丁酸（GABA）A受体的正变构调节剂，可在大鼠中产生持久稳定的麻醉效果。 [44]。 根据年龄和饮酒史，GABA可能会产生不同的效果 [45] 因此，麻醉可能与年龄或治疗相互作用并产生混淆效应。 然而，戊巴比妥（另一种巴比妥类药物）对纹状体中的多巴胺水平几乎没有影响。 [46]。 此外，在目前的研究中，使用氯化钾诱导释放并且不依赖于自发事件，这应该降低GABA能神经张力对释放的重要性。 至于多巴胺摄取，有报道称巴比妥类药物可能特异性地影响多巴胺摄取 [47]，但是否也可能与年龄或治疗相互作用尚不清楚。

自愿青少年酒精摄入量

与饮水对照相比，自愿青少年饮酒六周导致参考振幅降低。 振幅与早期青春期大鼠的振幅相似。 由于可以观察到振幅而不是摄取时间的影响，可以想象酒精影响控制多巴胺可释放池的因素而不是多巴胺转运蛋白，并且有数据支持青少年酒精后不受影响的摄取 [14]。 还有微透析数据显示青少年接触腹腔注射酒精后多巴胺细胞外水平增加 [14], [27], [48]这与目前可释放多巴胺减少的发现有些矛盾。 如前所述，增加的燃烧速率可能是微透析数据与当前数据协调的一种方式，但没有研究支持这一点。 此外，有研究表明，酒精暴露模式，即自愿或强迫，可能对神经生物学产生不同的影响 [49].

当用安非他明治疗时，酒精和饮水组之间在幅度或T80方面没有显着差异。 然而，由于酒精饮酒组的增加，有一种趋势对幅度产生影响。 酒精饮用组对安非他明的反应也有更多变化，这可能是由于酒精摄入量的变化，尽管这种变化与反应无关（数据未显示）。 这也表明该研究存在局限性，即未测量血液中的酒精含量。 该研究基于对24 h的不受干扰的访问，并且要测量血液酒精水平，必须限制进入，并且血液采样中涉及的压力将有风险扰乱动物的摄入模式。 因此，不能排除反应和个体血液酒精水平之间的相关性。 然而，本研究中提供的摄入数据与其他研究相似，显示了酒精的神经生物学效应，使用类似年龄或摄入范例的Wistar大鼠[50]–[52]。 这表明，在一般人群的横断面上，不仅容易摄入大量的人，而且还有适度的饮酒者，在自愿青少年摄入酒精后，他们面临着神经生物学变化的风险。

安非他明后摄取时间没有差异表明青少年酒精对安非他明的多巴胺转运蛋白功能没有影响，但也可通过应用外源性多巴胺进行调查获益 [41]–[43].

此外，还做了两个有趣的观察。 首先，酒精摄入后的参考振幅与酒精摄入期开始时动物中观察到的参考振幅相似，即PND 28。 其次，饮酒动物中安非他明后振幅增加的大小与晚期青春期大鼠相似，即PND 42。 这些发现是否与可释放池的改变发展和神经元中多巴胺的储存池有关仍有待阐明。 目前的研究没有包括一组成年酒精饮酒大鼠，因此无法得出关于年龄特异性影响可能性的结论。 然而，年龄特异性影响的迹象可以在显示未受影响的多巴胺摄取的青少年酒精暴露大鼠的研究之间的差异中找到。 [14] 成年酒精暴露的大鼠和猴子的研究显示摄取增加，但对诱发的多巴胺溢出没有影响 [53], [54]。 因此，对于未来的研究，研究酒精暴露及其在不同年龄段的影响机制将是非常有意义的。 对酪氨酸羟化酶，多巴胺受体密度和功能以及囊泡单胺转运蛋白等因素的进一步研究有助于揭示可释放的池和多巴胺储存池可能存在的年龄特异性酒精效应。 据我们所知，这些因素尚未在青少年饮酒后进行调查。

结论

数据显示诱发的多巴胺溢出随着年龄逐渐增加，支持先前的研究表明可释放的多巴胺池随着年龄增加。 相比之下，随着年龄的增长，诱发的溢出随着年龄的增长而逐渐减少，在较年轻的动物中支持比例较大的多巴胺储存池，使得它们对多巴胺释放药物可能更敏感。 青少年饮酒导致溢出低于饮水对照组，表明酒精会影响可释放的多巴胺池，这可能会影响成瘾的脆弱性以及涉及背侧纹状体多巴胺系统的其他精神病诊断。

致谢

作者希望感谢Marita Berg女士提供技术援助，感谢Martin Lundblad博士进行方法论讨论。

作者贡献

构思并设计了实验：SP IN。 进行实验：SP。 分析数据：SP IN。 写了这篇论文：SP。