自然奖励经验改变AMPA和NMDA受体在伏隔核中的分布和功能(2012)

公共科学图书馆之一。 2012; 7(4):e34700。 doi:10.1371 / journal.pone.0034700。 Epub 2012 Apr 18。

投手KK, 施密德S., Di Sebastiano AR, 王X, Laviolette SR, 雷曼MN, Coolen LM.

来源

解剖学和细胞生物学系,Schulich医学和牙科学院,西安大略大学,伦敦,安大略省,加拿大。

抽象

自然奖励和滥用药物汇集在中脑边缘系统上,该系统介导动机和奖励行为。 药物在该系统中诱导神经适应,包括转录,形态和突触变化,这些变化有助于药物相关记忆和成瘾的发展和表达。 以前,据报道,雄性大鼠的性经历,一种自然的奖励行为,在中脑边缘系统中诱导相似的神经可塑性,并影响自然奖励和与药物相关的行为。

目前的研究确定,在3不同的奖励禁欲期后,性经验是否会引起交配或离子型谷氨酸受体运输或伏隔核(NAc)功能的长期变化:1天,1周或最后交配期后的1月.

雄性Sprague Dawley大鼠在5连续日(性经历)期间交配或保持性生活以作为对照。 性经验丰富的男性在每个时间点都表现出促进起始和交配的表现。 接下来,细胞内和膜表面表达 N-甲基d天冬氨酸 (NMDA:NR1亚基),而 α-氨基-3-羟基-5-甲基异恶唑-4-丙酸酯(AMPA:GluA1,GluA2亚基)受体 使用双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯(BS(3))蛋白质交联测定,然后进行蛋白质印迹分析,测定NAc中的NAc。

NR1表达在1天禁食时在表面和细胞内增加,但在禁欲的1周时在表面减少。 GluNNUMX在2周时在细胞内增加,并且在1禁欲月后在表面增加。 最后,确定了全细胞膜片钳电生理记录 在所有奖励戒烟期后,在性经验丰富的男性中刺激皮质传入后,NAc壳神经元中突触电流的AMPA / NMDA比率降低.

总之,这些数据表明性经验导致NAc中谷氨酸受体表达和功能的长期改变。 虽然不相同,但这种性经验诱发的神经可塑性与精神兴奋剂引起的相似,提示了加强自然和药物奖励的共同机制。

介绍

中脑边缘系统由相互连接的脑区组成,包括腹侧被盖区,内侧前额叶皮层(mPFC)和伏隔核(NAc) [1]. 这些大脑区域共同调节自然有益的行为,包括喂养 [2], [3], [4], [5], 喝 [6],母性行为 [7], 社会纽带 [8], [9] 和性行为r [10], [11], [12], [13], [14]。 行为研究表明,雄性大鼠的性行为是有益的,因为雄性大鼠形成了交配的条件性位置偏好 [15], [16], [17],在T-mazes中开发更快的运行速度 [18],直臂跑道 [19] 或者跨栏攀登 [20]并执行操作任务以获得性接纳女性的访问权限 [21], [22]。 此外, 性经验会促进随后的性行为,包括性动机和表现的增加 [23] 影响条件性位置偏爱对交配的表达 [15]. 这些行为变化表明自然奖励相关学习和记忆的发生,这被假设是由交配行为经验诱导的中脑边缘系统的改变所介导的。 [11].

为了支持这一假设,我们之前已经证明性经验导致NAc中deltafosB的上调,这反过来对促进性经历后性行为的启动和表现至关重要。 [23].

此外,性经验导致NAc中树突树枝化和刺的数量增加 [11]. 精神兴奋剂诱导转录和形态的类似变化 [24], [25], [26]. 性经验已被证明可以改变对滥用药物的反应,包括对精神兴奋剂诱导的运动活动(交叉致敏)的敏感性和增强的精神兴奋剂奖励 [10], [11], [27]. 已经证明,药物暴露后的戒断或禁欲期对于增加对药物的渴望至关重要,称为渴望孵化 [28]. 同样,性经验后的交配禁欲期对于性经验诱导的精神兴奋剂奖励的增强以及NAc中增加的树突分枝和刺刺是至关重要的。 [11]. 因此,性经验和随后对这种自然奖励的禁欲导致中脑边缘系统的长期改变,类似于精神兴奋剂引起的改变,并影响对自然和药物奖励的行为反应。

据报道,精神兴奋剂会引起NAc的许多其他改变,其中一些改变取决于戒毒期。 这些改变包括谷氨酸受体运输和功能的改变 [29], [30]。 反复的可卡因 随后是长期禁欲期(3-7周),导致增加 表面表达α-氨基-3-羟基-5-甲基异恶唑-4-丙酸酯(AMPA)受体亚基和N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体亚单位,而a后没有观察到变化 禁欲期短(1日).

此外,AMPA和NMDA受体的不同亚基受药物暴露和随后的禁欲期的不同影响,因为缺乏戒毒期后GluA2缺乏AMPAR的表面表达上调(5-7周) [31], [32]。 PFC为NAc提供了主要的谷氨酸能输入 [33] 和电生理学研究表明,重复的可卡因引起PFC反应NAc壳神经元中AMPA / NMDA比率的改变和NAc神经元内在兴奋性的变化,这可能取决于戒毒期和NAc亚区 [34], [35], [36], [37], [38], [39], [40], [41]。 这种药物诱导的神经可塑性有助于精神兴奋剂行为致敏的变化 [42], [43], [44], [45] 和寻求毒品 [31], [46], [47].

目前尚不清楚谷氨酸受体运输和功能的类似适应是否发生在自然奖励经历和随后的自然奖励禁欲之后。 因此,本研究的目的是检验性经验导致NAc中AMPA或NMDA受体运输的变化以及PFC响应NAc壳神经元的突触强度变化的假设。 此外,这些测量是在3最后一次交配后的不同时间确定的,以调查自然奖励(1周或最后交配后1月)的禁欲期对NAc的可塑性与无禁欲期的影响(1)最后交配后的第二天)。

成果

实验1:性促进

实验1的目的是确定促进性经历后性行为的时间过程。 以前,在最后的交配期后,在1周内已经检测到性行为的促进 [23]但是,如果在长期禁欲期后保持性行为导致的性行为促进,则以前没有进行过调查。 在这里,对两组雄性大鼠进行了性行为促进的长期表达测试,1周或最后一次交配后的1月。 首先,两组人员在五次每日交配期间都表现出性行为的促进作用,这显示出明显更短的潜伏期 (图1A; 1周,p=0.028; 1月,p=0.019),插入(图1B; 1月,p=0.016; 1周的趋势,p=0.078)和射精(图1C; 1周,p=0.016; 1月,p=0.008日5与性经验日1比较。 此外, 1周和上次交配后1月维持了性行为的促进, 与交配日1相比,在测试当天(1周或5月经性别1)后,交配参数的延迟较短(图1A:挂载延迟,1月,p=0.016; 图1B:插入延迟,1月,p=0.046; 图1C:射精潜伏期,1周,p=0.016; 1月,p=0.008)并且在任何时间任何行为参数的交配日5和测试日之间都没有显着差异(除了1月的装载潜伏期; p=0.016)。 因此,在1月交配禁欲期间,经验诱导的性行为促进得以维持。

图1    

长期维持促进性行为。

实验2:离子型谷氨酸受体亚单位重新分布/表达

实验2的目的是确定不同交配禁欲期后性经历和幼稚男性中离子型谷氨酸受体亚单位的表达。 使用膜非渗透性交联剂(BS)定量AMPAR和NMDAR亚基表面和细胞内库3),它可以选择性修饰表面表达的蛋白质,从而可以使用SDS-PAGE和Western Blot分析与未修饰的细胞内蛋白质区分开。 代表性的印迹显示了表面(高分子量,> 250 kDa)和细胞内条带 图2M.

图2  
谷氨酸受体亚基在NAc中的表达和分布。

性经验后一天,NR1亚基在表面(S),细胞内(I)和总(S + I)中的表达显着增加(S, 图2A=0.025; 一世, 图2D=0.035; S + I, 图2J=与性生活对照相比,性经验动物中的0.023)图2N)。 最后一次交配后一周,NR1的表面与细胞内比率表达显着下降(S / I比值; 图2G,P=与性初始的动物相比,0.024)表面或细胞内表达没有显着变化。 GluA2的表达在最后一次交配后一周显着增加,细胞内和总表达,表面表达没有变化(I, 图2E=0.026; S + I, 图2K=与天真相比,性经验动物中的0.014(图2O)。 然而,在最后一次交配后一个月,GluA2的S / I比显着增加(图2H,P=0.046)伴随着表面表达增加的统计趋势(图2B,P=与幼稚对照相比,性经验动物中的0.055)。 在最后一次交配后的1天或1周未检测到GluA1的变化。 1月后,与初次接种的对照组相比,有性经验的动物的GluA1表面和S / I比率表达增加,尽管仅检测到统计学趋势(S, 图2C=0.098; S / I, 图2I=0.083)。 因此,总之,最初在禁欲的1天,检测到NR1的总表达增加,然后在禁欲2周后GluA1的细胞内表达增加,并且在禁欲2月后增加GluA1和GluA1的表面表达(仅后者)作为统计趋势)。

实验3:电生理学

实验3的目的是确定性经验是否会改变PFC响应NAc壳神经元的突触强度。 在假定来自PFC的纤维刺激后,在性经历和幼稚的男性的NAc壳中的中型多刺神经元中记录突触电流。 有性经验的动物1日AMPA / NMDA比率显着降低(p=0.005),1周(p=0.016)和1月(p=0.005)在最后交配期后与性初始对照组相比(图3A,B,C)。 为了确定突触前发射器释放概率是否有变化,研究了成对脉冲比率。 在任何时间间隔,性交经历和幼稚动物之间发生响应配对脉冲刺激的发射器释放促进的程度没有差异(图3D).

图3    

在1天,1周或最后一次交配或处理后1月的性经历和幼稚男性的AMPA / NMDA比率。

讨论

目前的研究表明,性经验引起雄性大鼠NAc中离子型谷氨酸受体分布和功能的变化,并且这些变化中的一些随着性行为的禁欲期的长短而变化。 与性天真的男性相比,由于表面和细胞内受体库的增加,性经验的男性表现出总NR1亚基表达的短期增加。 在2周和1月份的奖励戒烟后,GluA1表达分别在细胞内和表面增加。 最后,GluA1表达在任何时候都没有显着改变。 此外,与幼稚对照相比,经历过性经验的动物具有立即且持久的降低的AMPA / NMDA比率,其从PFC响应的NAc壳神经元记录。 我们的研究结果表明谷氨酸受体运输取决于性行为禁欲期的长度,而前额皮质传入神经对NAc壳形成的突触突触强度的改变则不然。 这些主要研究结果类似于重复可卡因后长期戒毒后AMPAR亚基表面表达增加和AMPA / NMDA比率立即下降的报告,但短期NMDAR亚基表达不同,AMPA持续减少/ NMDA比率。

性行为是非常有益的和强化的。 因此,当雄性大鼠获得性经验时,它表现出增加的性动机和表现,这通过较短的延迟来启动交配和显示射精以及提高交配效率来证明 [10], [23]。 在这里,证实了这种促进性行为在交配后的1周存在,并且确定在交配禁欲的1月内维持促进的性行为。 性经验诱导的性行为促进的时间特征与我们先前的研究相对应,该研究显示在相同的交配禁欲期测试时对安非他明的运动诱导效应的交叉敏化。 [11]。 以前的研究表明,NAc是维持促进性行为的中介。 NAc核心和壳神经元都通过交配或与交配相关的线索激活 [48]并且在交配后一周,性经验导致NAc核心和壳中的树突分枝和刺增加 [11]. 此外,通过病毒载体介导的基因转移降低NAc中转录因子deltaFosB的活性减弱了经验诱导的性行为促进 [23], [49]。 ţ这些研究结果表明NAc与性行为的强化特别相关,并且对于性经验的交叉敏感药物效应具有潜在的关键作用。 [23].

目前的研究表明,性经验导致AMPAR合成和/或贩运的变化取决于性禁欲期的长短。 首先,在2周时,GluA1表达的细胞内表达增加是明显的,这可能表明GluA2受体合成增加和/或内吞作用增加。 然后,在最后一次交配后的2月检测到GluA1表面/细胞内比例增加(主要是由于表面增加),表明受体重新分布到细胞表面。 接触可卡因后AMPAR贩运的变化也取决于戒毒期的长短 [50]。 一般来说,细胞表面和突触体GluA1和GluA2 / 3水平在从可卡因戒烟一周后增加,并且在最后一次注射可卡因后持续高达3周的水平 [51], [52], [53], [54], [55]。 经过更长时间的戒毒(5周)后,GluA1表面表达仍然升高,GluA2表面/细胞内比例略有下降,因此缺乏GluA2的AMPARs被上调 [31], [56]。 在长期停用可卡因自我给药后长时间停药(2-5周)后检测到表面缺乏GluA7受体的表达增加,但在非偶然可卡因长期停药后未检测到 [32]。 此外,阻断GluA2缺乏AMPAR阻止了寻求药物 [31], [57]. 性经验和禁欲后AMPA受体贩运的变化与可卡因诱导的变化略有不同。 就增加的GluA1表面表达而言,目前的数据表明,在性表现后的1月,膜表面GluA1受体的适度增加未能达到统计学显着性,因此表明GluA1表面表达可能需要更长的禁欲期以进一步提高 - 调节,类似于5禁欲数周后可卡因引起的变化 [31]。 此外,目前的数据在GluA2方面不同,其在5后经历少量减少或在没有可卡因的情况下经历更多周,而性经验和1禁欲月导致GluA2表面表达增加。 我们假设NAA中的AMPA受体上调可能对性经验对随后的奖赏行为和增加的安非他明奖励的长期影响至关重要。 [11] 遵循当前研究中测试的延长禁欲期。 相反,AMPA受体表达或运输的改变对性经验对奖赏行为的短期影响并不重要。 在支持方面,许多报告表明,药物诱导的精神兴奋剂行为敏感性不需要改变AMPAR传播(供审查) [30])。 在1奖励禁欲日后观察到致敏和交叉敏化,而AMPAR上调没有变化 [11], [53]。 此外,反复接触精神兴奋剂安非他明已经证明行为致敏,这与AMPAR传播的任何变化无关。 [50], [53], [58].

在行为致敏和受体贩运方面,NMDARs的作用比AMPAR的研究要少得多。 非选择性NMDAR拮抗剂(MK-801)可阻止可卡因或苯丙胺引起的运动致敏,但未能阻止这种致敏作用的表达 [59], [60]。 NMDAR在性行为中的作用通过全身或内侧视前区域施用MK-801进行了最低限度的检查,这种行为会影响幼稚和经验丰富的雄性大鼠的性行为。 [61], [62], [63]。 NMDAR还调节其他自然奖励,因为NMDAR拮抗剂减少了狒狒的食物摄入量 [64] 和增强对大鼠的食物渴望 [65]。 NAc中的NMDAR表达被可卡因暴露改变,并且重复可卡因的更长时间(3周)但不短(1天)禁欲期增加NMDAR亚基的表达(NR1,NR2A,NR2B) [55], [60]。 目前的结果表明,除了在1周禁欲期后降低的表面/细胞内比率之外,由于表面和细胞内受体库中的水平增加,性经验导致在1天的总NR1表达增加。 因此,我们假设NMDAR传播的初始增加可能对性经验对随后的奖励行为的短期影响至关重要。

此外,性经验后NR1亚基的短期增加可能表明性经验诱导的沉默突触形成。 黄等人 [66] 证明重复的可卡因在NAc壳中产生沉默的突触,其中突触后新NMDAR的募集是关键。 在没有AMPAR介导的电流的情况下,无声的谷氨酸能突触表达功能性NMDAR介导的电流 [67], [68], [69]。 已经表明,先前的可卡因暴露可以在整个大脑中产生沉默的突触,并且这些新产生的突触为后续经验提供了基质。 [66], [70]。 NMDAR由至少一个NR1亚基与一个或多个NR2亚基(A-D)组合组成。 NR1是形成功能通道所必需的; 因此,NR1表达的变化可以提供功能性NMDA受体数量变化的指标。 重复的可卡因驱动含有NR1和NR2B的NMDAR的插入,并在NAc壳中产生沉默的突触。 这些含有NR2B的沉默突触在可卡因给药期间被抑制,这减弱了随后可卡因的运动致敏作用 [71]。 经过几天的可卡因戒断后,沉默突触的数量减少,而运动致敏持续存在,这表明过早的突触可能会形成新的塑料回路,可以改变(可能通过奖励戒烟)来调解这些持续行为。 因此,我们假设在性经历后不久NR1总表达的上调可能是由于新形成的沉默突触中NMDAR的数量增加。 此外,性经验随后延长禁欲可能导致沉默突触减少,解释NR1表面/细胞内比率下降和AMPAR亚单位延长禁欲期延长,因为突触未消失。

目前的研究结果表明,性经验和奖励戒烟期引起谷氨酸受体运输和表达的改变,这表明NAc中兴奋性突触的突触强度发生了改变。 因此,基于托马斯及其同事先前的研究的电生理学程序 [72] 用于研究NAc壳神经元中谷氨酸受体功能的相同禁欲期显示导致致敏性和药物行为,以及谷氨酸受体再分布。 与先前可卡因暴露后的研究相似,在对PFC输入有反应的NAc壳突触中确定可塑性。 PFC在强迫行为和药物滥用方面发挥着关键作用 [73], [74]。 同样,PFC对于强迫性行为的发展或表达至关重要,因为PFC病变导致雄性大鼠性行为的适应不良寻求 [75]。 目前的数据显示,性经验导致PFC反应NAc壳神经元中AMPA / NMDA比率立即和持久下降。

以前,假设自然奖励和药物奖励之间的主要区别在于自然奖励后AMPA / NMDA比率的变化是暂时的,并且会随着时间的推移而消失,而药物引起的变化将持续存在 [76]. 这一假设是基于可卡因,但不是食物或蔗糖导致VT中AMPA / NMDA长期持续增加的研究结果。A [76]. 相比之下,目前的研究表明,性经验的确导致了NAc中AMPA / NMDA比率的长期变化。

然而,性诱导的NAc壳可塑性与可卡因暴露后的可塑性不同,已证明其与AMPAR介导的兴奋性的双向变化有关。。 接触可卡因和禁药一天后,AMPA / NMDA比率下降 [72] 射击能力下降 [34] 被发现,类似于性经验短期效果的结果。 然而,在从可卡因开始14天禁药后,NAc壳神经元的AMPA / NMDA比率增加,这表明禁止使用可卡因可增强NAc的突触强度。 [54]。 H因此,可卡因暴露导致突触可塑性的双向变化,并且在药物暴露后不久AMPA介导的反应减少,但AMPAR介导的兴奋性随着长期戒毒而增加。 相比之下,尽管在禁欲期间观察到运动活动的敏感性和苯丙胺的相关奖励,但长期禁欲性行为导致AMPAR介导的NAc壳体兴奋性降低。 [11]. 然而,其他报告显示,在可卡因接触后的短期和长期禁欲期内,核心和壳体的内在膜兴奋性降低。 [35], [36], [37], [38], [39], [40], [41],表现出缺乏双向变化,类似于性经验的影响。 此外,目前的结果显示性经验不会引起突触前谷氨酸释放概率的变化,这是基于成对脉冲比率组之间缺乏差异。 Kalivas及其同事已经证明,重复的可卡因诱导NAc中细胞外非突触谷氨酸池介质的变化,无论这种改变是否与性经验发生仍有待确定(供审查) [77]).

对于来自其他大脑区域的NAc的谷氨酸能输入可能比PFC在性经验对随后的奖励行为的影响中发挥作用。. TNAc接受基底外侧杏仁核(BLA)和海马腹侧下丘脑的谷氨酸能输入 [78]。 BLA在自然奖励寻求行为中发挥作用 [79], [80],对于环境刺激与性回报的关联至关重要 [81] 并且用于启动交配的仪器行为 [82]。 因此,很有可能推测性经验引起BLA反应突触的突触强度的改变。

NAc壳中PFC突触的AMPA / NMDA比率下降与性经验后不久NR1的表达增加一致,但与长时间禁欲后GluA2和GluA1的增加不一致。 一种解释是受体运输发生在接受除PFC之外的其他脑区引起的谷氨酸能输入的突触。 此外,在蛋白质样品中除NAc壳外还包含NAc核心排除了在蛋白质表达和突触强度数据之间进行准确相关的可能性。 尽管如此,目前的研究结果清楚地表明,自然奖励行为和随后的奖励禁欲导致NAc中的突触可塑性与精神兴奋剂诱发的相似性和差异性。

I结论,性行为和随后的雄性大鼠的戒烟显示会导致性行为立即和持久的促进,类似于性经验对对运动诱导的安非他明致敏作用的影响ne [11]并且与NAc壳中突触中AMPA / NMDA比率的立即和持久降低有关。 此外,性经验导致NMDAR的快速上调和缓慢发展的AMPAR重新分布到NAc神经元的表面。 因此,类似于精神兴奋剂的作用,自然奖励行为可导致谷氨酸受体表达,运输和兴奋性的长期改变。 但是与可卡因不同,对性经验的长期禁欲导致NAc壳中AMPA / NMDA比例持续下降。 针对这种差异的潜在潜在因素提出了许多可检验的假设,包括根据自然奖励经验改变BLA反应突触。 这些数据再次显示了自然和药物奖励暴露的长期后果之间的相似性和差异,并可能有助于更好地理解药物如何作用于这种自然奖励途径。

方法

道德声明

所有程序均经西安大略大学动物护理和使用委员会批准,并符合加拿大动物护理委员会的指导,涉及研究中的脊椎动物。

动物

成年雄性Sprague Dawley大鼠(实验1和2:10-12周;实验开始时的实验3,8-10周)获自Charles River Laboratories(Senneville,QC,Canada)。 将同性动物配对饲养在有机玻璃笼中,在温度调节的室内保持隧道管,在12 / 12 hr光暗循环中维持食物和水 随意 除了在行为测试期间。 用于交配的刺激雌性(210-220克)在双侧卵巢切除术后接受含有5%苯甲酸雌二醇和95%胆固醇的皮下植入物。 在测试前约500小时,通过在0.1 mL芝麻油中施用4μg孕酮诱导性接受性。

性经验

在实验开始之前,所有雄性大鼠都是性天真的。 在昏暗的红光照射下,在暗期早期(在暗期开始后的2-6小时之间)发生交配期。 在每次交配期间,允许雄性大鼠交配至射精或直至1小时,并且记录性行为的参数,包括:安装潜伏期(ML;从女性引入至第一次安装的时间),插入潜伏期(IL;引入时间)直到第一次穿着阴道穿刺的女性,和射精潜伏期(EL;从第一次插入到射精的时间) [83]。 性交天真的控制被处理,与交配动物在同一房间内进行处理,因此暴露于相同水平的噪音,一般干扰和发情雌性的远处气味,但不允许与接受性雌性相互作用或交配。

实验1:性促进

Sprague Dawley雄性大鼠在其家笼中交配,连续5交配。 将动物分成2实验组,并在最后一次交配期后(测试日; n)进行1周或1月的性行为测试。=每组7)。 在性行为的参数上匹配组,并且在获得性经历期间在任何交配期间针对任何性行为测量没有在组之间检测到显着差异。

数据分析

在小组比较中,评估了性经验的第1天和5,以确定性行为的性行为促进,第1天和测试日之间,以及第5天和测试日之间(1周或1之后的5月) ,使用Wilcoxin Signed Rank检验,其显着性水平为5%,插入和射精潜伏期。

实验2:离子型谷氨酸受体亚单位重新分布/表达

为了检查离子型受体再分布,使用了类似于实验1的范例。 性天真的雄性Sprague Dawley大鼠分为性经验组和幼稚组。 对于性经验丰富的群体,通过5连续,每日交配会话(如上所述)获得性经验。 然后将性经验的男性分成用于组织收集的3实验组(匹配性行为参数),1天,1周或最后一次交配期后的1月。 在最终处理后的相同时间点收集来自性天真对照的脑(如上所述处理)。 这些小组包括:性经验(AMPAR:1D,n=9; 1W,n=12; 1M,n=12; NMDAR:1D,n=9,1W或1M,n=6)或性天真(AMPAR:1D,n=9; 1W,n=12; 1M,n=12; NMDAR:1D,n=9,1W或1M,n=6)。

表面受体交联

用戊巴比妥钠(270 mg / kg; ip)对动物实施安乐死,然后斩首。 断头后,将每个大脑迅速移出,并立即放入冰冷的盐水中。 根据Paxinos&Watson(1998)定义的NAc边界,使用大鼠脑基质(ASI Instruments,Warren,MI,美国)解剖双侧NAc。 接着,使用McIlwain组织切碎器(Vibratome,St.Louis,MO,USA)将NAc组织切成400×400μm的立方体。 AMPA和NMDA受体亚基交联的方法学基于Boudreau&Wolf [53]。 切碎后立即将脑组织迅速转移到含有1 mL冰冷的aCSF的Eppendorf管中,加入蛋白质交联试剂双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯(BS)3,2 mM; Pierce Biotechnology,Rockford,IL,USA)并在30°C的摇杆上孵育4分钟。 BS3 不会穿过细胞膜,使其能够选择性地将表面表达的蛋白质与硫化物键交联,从而形成高分子量聚集体,而细胞内蛋白质保持不变。 该反应使得能够基于MW使用十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹分析来区分表面和细胞内蛋白质库。 通过在100℃下加入1μL的10 M甘氨酸使4 min淬灭交联反应。 通过在14 000 rpm下在2℃下离心4分钟沉淀组织,弃去上清液。 将沉淀重悬于400μL冰冷裂解缓冲液[25 mM Hepes(pH 7.4),500 mM NaCl,2 mM EDTA,1 mM DTT,1 mM PMSF,20 mM NaF,0.1%Nonidet P-40(0.1)中%),蛋白酶抑制剂混合物(Ministop,Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,Germany)和1×磷酸酶抑制剂混合物(Phosstop,Roche Diagnostics GmbH,)]。 将样品超声处理5秒以破坏组织,然后在14 X℃下以000 2 rpm离心4 min并立即放回冰块中。 将上清液转移到新的Eppendorf管中,将30μL样品放在冰上,将剩余的上清液保存在-80℃进行蛋白质印迹分析。 对于每个样品,使用BCA测定法(ThermoFisher Scientific Inc.,Waltham,MA)和NanoDrop ND-1000分光光度计(ThermoFisher Scientific Inc.,Waltham,MA)测定交联裂解物的蛋白质浓度。

蛋白质印迹分析

加载蛋白质样品(20μg)并使用Mini Trans-Blot Cell系统(Bio-Rad Laboratories Ltd.)在4-15%梯度Tris-HCl凝胶(Bio-Rad Laboratories Ltd.,Mississauga,Ontario,Canada)上电泳。和Tris-甘氨酸-SDS电泳缓冲液[25 mM Tris,192 mM Glycine,0.1%SDS(pH8.3)]。 使用Precision Plus蛋白质All Blue标准品(Bio-Rad Laboratories Ltd.)作为分子量标记物。 分离后,使用Trans-Blot Cell湿印迹系统(Bio-Rad Laboratories Ltd.)将蛋白质转移至Millipore Immobilon-FL聚偏二氟乙烯膜(PVDF; Millipore,Billerica,MA,USA)进行免疫印迹。 蛋白质转移在转移缓冲液(20%甲醇和0.037%SDS在Tris-甘氨酸[25 mM Tris,192 mM Glycine(pH 8.3)]中在82 V下在室温(RT)下进行1 hr。所有样品运行至少重复,跨群体平衡,以及个别凝胶。

接下来,将膜在2中孵育[比]在室温下在振荡器盘上3小时的50封闭缓冲液(LI-COR Biosciences,Lincoln,NE)和Tris缓冲盐水(TBS; 150 mM Tris和8.0 mM NaCl(pH1))的16溶液。 然后将膜在4℃下在振荡器上与兔多克隆抗GluA1(〜106 kDa; 1)分别孵育XNUMX小时。[比]1K; Millipore,Cat#AB1504)和GluA2(〜100 kDa; 1[比]4K; Millipore,Cat#AB1768),或小鼠单克隆抗NR1(〜130 kDa; 1[比]2K; Upstate(Millipore),Cat#05-432)。 这些一抗已经在以前使用和验证过 [84], [85]并且产生了具有适当分子量的单一条带,当用于非交联组织时,该条带通过用肽预先吸附抗体来防止。 所有抗体均在2中稀释[比]3混合Odyssey阻断缓冲液与TBS-T(TBS + 0.05%Tween-20(pH8.0)。在TBS-T中洗涤三次10-min后,将膜在用2稀释的二抗中孵育[比]3混合Odyssey阻断缓冲液和TBS-T在室温下1小时。 二抗包括Alexa-680缀合的山羊抗兔(1[比]5K; Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)或IR Dye800 CW-缀合的山羊抗小鼠(1)[比]10K; LI-COR Biosciences)。 使用Odyssey 2.1扫描仪(LI-COR Biosciences)观察荧光免疫反应性并捕获图像。

量化和统计分析

对于每种蛋白质样品,使用Odyssey软件确定每个条带的荧光强度水平(高分子量,表面表达> 250 kDa,上面列出的特定MW的条带用于细胞内表达),并计算每只动物的平均值。 将表面(S),细胞内(I),比率(S / I,受体亚基分布的量度)和总(S + I,受体亚基总表达量)的带密度值归一化为相应的未接受过性行为控制的平均值组。 每个样品(装载在不同的凝胶中)的重复样品之间的荧光强度没有差异,这证实了蛋白样品的装载量缺乏变异性。 使用未配对的t检验,同时比较性经验和性行为正常对照在同一时间点的所有Western Blot数据,显着性水平为0.05

实验3:电生理学

使用与上述实验1和2相同的实验设计。 性经验的男性被分为3实验组,根据性行为表现进行匹配,并根据组织采集时间1天,1周或1月后的最后一次交配(1天,n=7; 1周,n=9; 1月,n=10)。 在实验1和2中,这些年轻雄性大鼠的性行为与老年雄性大鼠的性行为没有差异。 用戊巴比妥钠(270 mg / kg; ip)麻醉大鼠,然后用冰冷氧化的心脏灌注(95%O)2,5%CO2)含有[250 mM蔗糖,2.5 mM KCl,1.25 mM NaH的制备溶液2PO4,4 mM MgCl2,0.1 mM CaCl2,26 mM NaHCO3,10 mM葡萄糖,3 mM肌醇,2 mM丙酮酸钠和0.5 mM抗坏血酸]。 切除脑并置于冰冷的含氧制剂溶液中。 使用振动切片机(Microm,Walldorf,Germany)从每只动物获得400μm厚的矢状脑切片。 每个脑的总共4切片被转移到具有人工脑脊液(aCSF)的保持室[125 mM NaCl,2.5 mM KCl,1.25 mM NaH2PO4,1.3 mM MgCl2,2.5 mM CaCl2,26.2 mM NaHCO3 将10加热至32℃,持续30 min,然后使其恢复至室温至少1小时,然后将单个切片置于记录室中。 该室用氧化的aCSF在22℃下进行过灌注。 对于任何性行为参数,组间没有差异。 在最终处理后的每个3时间点从性天真的对照中收集脑(n=每个3-4)。

在不含背侧纹状体的内侧NAc切片中检查壳神经元 [72]。 将不锈钢双极微电极放置在前额皮质-NAc边界中,与记录电极相连,用于突触前刺激皮质传入纤维。 通过它们的体细胞大小(大约30-35μM直径)和相对负的静息膜电位-75至-85 mV在视觉上鉴定重要的中型多刺神经元。 使用Axopatch 200A放大器和采样率20 kHz(Digidata 1340)和10 kHz低通滤波器进行记录。 PClamp 9.0用于实验方案和分析。 使用50 Hz的成对脉冲(0.1 ms ISI)和使用双极同心钨电极的神经元刺激传入物。 将细胞电压钳制在-80 mV,并且在突触刺激之前将40 m消偏振至+ 500 mV,以减轻NMDA电流的镁阻断。 在不存在或存在NMDAR拮抗剂AP40(5μM;在AP50存在下的全细胞电流30×对照和30×)下,取平均值为+ 5 mV的EPSC测定AMPA / NMDA比率。 通过从对照中减去AP5记录来计算NMDA响应。 将AMPAR EPSC的峰值除以NMDAR EPSC的峰值,得到AMPA / NMDA比率。 为了确定成对脉冲比,在-80 mV下进行突触前刺激(30×)的测量。

数据分析

来自性天真对照的数据组合形成一个对照组(n=10动物中的10神经元)因为在对照内的时间点之间未检测到统计学差异。 有性经验的团体(1日,n=7; 1周,n=9; 1月,n=10神经元; 通常使用单向ANOVA(因子:时间间隔),然后使用Fisher LSD,将每只动物的一个神经元与性初始对照组进行比较 事后 比较显着性水平为5%。

致谢

我们感谢Rosalind Franklin University of Medicine and Science的Marina E. Wolf博士和Mike Milovanovic博士的技术建议。

脚注

利益争夺: 作者宣称没有竞争利益存在。

资金: 加拿大LMC和ARD健康研究所,以及LMC和KKP的自然科学和工程研究委员会。 资助者在研究设计,数据收集和分析,决定发表或准备手稿方面没有任何作用。

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