自然奖励经验改变AMPA和NMDA受体在伏隔核中的分布和功能（2012）

公共科学图书馆之一。 2012; 7（4）：e34700。 doi：10.1371 / journal.pone.0034700。 Epub 2012 Apr 18。

投手KK, 施密德S., Di Sebastiano AR, 王X, Laviolette SR, 雷曼MN, Coolen LM.

来源

解剖学和细胞生物学系，Schulich医学和牙科学院，西安大略大学，伦敦，安大略省，加拿大。

抽象

自然奖赏和药物滥用会汇聚在介导动机和奖赏行为的中脑边缘系统。药物会诱发该系统的神经适应，包括转录、形态和突触变化，从而促进与药物有关的记忆和成瘾的形成和表达。 此前有报道称，雄性大鼠的性经验是一种自然的奖励行为，它会在中脑边缘系统中诱发类似的神经可塑性，并影响自然奖励和药物相关行为。

本研究确定了在 3 个不同的奖赏禁欲期（最后一次交配后 1 天、1 周或 1 个月）之后，性经验是否会导致交配或伏隔核 (NAc) 中离子型谷氨酸受体运输或功能的长期变化.

雄性 Sprague Dawley 大鼠连续 5 天交配（性经验）或保持性成熟以作为对照。 有性经验的雄性在每个时间点都表现出促进交配的开始和表现。接下来，细胞内和膜表面表达 N-甲基-D-天冬氨酸 (NMDA：NR1亚基) 以及 α-氨基-3-羟基-5-甲基异恶唑-4-丙酸酯 (AMPA: GluA1、GluA2 亚基) 受体 采用双（磺化琥珀酰亚胺基）辛二酸酯（BS（3））蛋白交联试验，再进行蛋白质印迹分析，测定NAc中的含量。

禁欲 1 天后，细胞表面和细胞内的 NR1 表达均增加，但禁欲 1 周后，细胞表面的 NRXNUMX 表达降低。 戒断 2 周后，细胞内 GluA1 增加，戒断 1 个月后，细胞表面 GluAXNUMX 增加。 最后，全细胞膜片钳电生理记录确定 在所有奖赏禁欲期之后，刺激有性经验的男性的皮质传入神经元后，NAc 壳神经元中突触电流的 AMPA/NMDA 比率降低.

总之，这些数据表明性经验导致NAc中谷氨酸受体表达和功能的长期改变。虽然不相同，但这种性经验诱发的神经可塑性与精神兴奋剂引起的相似，提示了加强自然和药物奖励的共同机制。

介绍

中脑边缘系统由相互连接的大脑区域组成，包括腹侧被盖区、内侧前额皮质 (mPFC) 和伏隔核 (NAc) [1]. 这些大脑区域共同调节自然奖励行为，包括进食 [2], [3], [4], [5]，喝 [6]、母性行为 [7]、社会联系 [8], [9] 和性行为r [10], [11], [12], [13], [14]行为研究表明，雄性大鼠的性行为具有奖励和强化作用，因为雄性大鼠形成了交配的条件性位置偏好 [15], [16], [17]提高在 T 型迷宫中的奔跑速度 [18]、直臂跑道 [19] 或跨栏 [20]并执行操作任务来获得性接受的雌性 [21], [22]。此外， 性经验会促进后续性行为，包括增强性动机和性能力 [23]及 影响交配条件位置偏好的表达 [15]. 这些行为变化表明自然奖励相关学习和记忆的发生，据推测这是由交配行为经历引起的中脑边缘系统改变所介导的 [11].

为了支持这一假设，我们之前已经证明，性经验导致 NAc 中 deltafosB 的上调，而这反过来对于促进性经验后性行为的启动和执行至关重要 [23].

此外，性经验导致 NAc 中树突分枝和棘突数量增加 [11]. 精神兴奋剂会引起转录和形态的类似变化 [24], [25], [26]. 性经验已被证明会改变对滥用药物的反应，包括对精神兴奋剂引起的运动活动的敏感化（交叉敏感化）和增强精神兴奋剂的奖励 [10], [11], [27]. 已经证明，接触毒品后的戒断期或禁欲期对于增加对毒品的渴望至关重要，这被称为渴望的潜伏期 [28]. 同样，性经验后的禁欲期对于性经验引起的精神兴奋剂奖励的增强以及 NAc 中树突分支和棘突的增加至关重要 [11]. 因此，性经验以及随后对这种自然奖励的禁欲会导致中脑边缘系统发生长期改变，类似于精神兴奋剂引起的改变，并影响对自然和药物奖励的行为反应。

据报道，精神兴奋剂会引起 NAc 的许多其他改变，其中一些改变取决于药物戒断期。 这些改变包括谷氨酸受体运输和功能的变化 [29], [30]. 反复吸食可卡因 随后是一段较长的禁欲期（3-7 周），导致 α-氨基-3-羟基-5-甲基异恶唑-4-丙酸 (AMPA) 受体亚基和 N-甲基-D-天冬氨酸的表面表达（NMDA) 受体亚基，而 短暂禁欲期（1 天）.

此外，AMPA 和 NMDA 受体的不同亚基会受到药物暴露和随后的禁欲期的不同影响，因为在长期禁欲期（2-5 周）后，缺乏 GluA7 的 AMPAR 的表面表达会上调 [31], [32]. PFC 为 NAc 提供主要的谷氨酸能输入 [33] 和电生理学研究表明，反复服用可卡因会导致 PFC 反应性 NAc 壳神经元中 AMPA/NMDA 比率发生改变，并导致 NAc 神经元内在兴奋性发生变化，这可能取决于药物戒断期和 NAc 亚区 [34], [35], [36], [37], [38], [39], [40], [41]. 此类药物诱导的神经可塑性导致精神兴奋剂行为敏感化的变化 [42], [43], [44], [45] 以及寻毒 [31], [46], [47].

目前尚不清楚在自然奖励体验和随后的禁欲之后，谷氨酸受体运输和功能是否会发生类似的适应。因此，本研究的目的是检验以下假设：性经验会导致 NAc 中的 AMPA 或 NMDA 受体运输发生变化，并导致 PFC 响应 NAc 壳神经元的突触强度改变。此外，在最后一次交配后的 3 个不同时间确定了这些测量值，以研究与无禁欲期（最后一次交配后 1 天）相比，禁欲自然奖励期（最后一次交配后 1 周或 1 个月）对 NAc 可塑性的影响。

结果演示

实验一：性促进

实验 1 的目的是确定性经验后促进性行为的时间过程。此前，在最后一次交配后长达 1 周的时间内，性行为的促进作用已被检测到 [23]，但此前尚未研究过性经验引起的性行为促进在长期禁欲期后是否仍能维持。本文对两组雄性大鼠进行了长期性行为促进表现测试，测试时间分别为最后一次交配后 1 周或 1 个月。 首先，两组小鼠在每天五次的交配过程中都表现出了性行为的促进，表现为交配延迟时间明显缩短 (图1A; 1周，p=0.028；1个月，p=0.019)、插入（图1B; 1个月，p=0.016；1 周趋势，p=0.078）和射精（图1C; 1周，p=0.016；1个月，p=0.008)，与性经验第一天相比。此外， 在最后一次交配后 1 周和 1 个月内，性行为仍然保持着促进作用， 与交配第一天相比，测试当天（性经验第 1 天后 1 周或 5 个月）的交配参数延迟时间较短（图1A：挂载延迟，1个月，p=0.016; 图1B: 插入潜伏期，1个月，p=0.046; 图1C: 射精潜伏期，1周，p=0.016；1个月，p=0.008)，并且交配第 5 天和测试日之间任何时间的行为参数均不存在显著差异（除 1 个月时的爬升潜伏期；p=0.016）。因此，在1个月的禁欲期内，经验诱导的性行为促进得以维持。

长期维持便利的性行为。

实验 2：离子型谷氨酸受体亚基重分布/表达

实验 2 的目的是确定不同交配禁欲期后有性经验和未性经验的雄性的离子型谷氨酸受体亚基的表达。使用膜不透性交联试剂 (BS) 定量 AMPAR 和 NMDAR 亚基表面和细胞内池³)，选择性修饰表面表达蛋白，可使用 SDS-PAGE 和 Western Blot 分析将其与未修饰的细胞内蛋白区分开来。代表性印迹图显示了表面 (高分子量，>250 kDa) 和细胞内条带图 2M.

谷氨酸受体亚基在 NAc 中的表达和分布。

性经验后一天，表面（S）、细胞内（I）和总（S+I）中 NR1 亚基的表达显著增加（S，图2A页=0.025；我，图2D页=0.035；S+I，图2J页=0.023)，与未进行过性行为的对照组相比（图 2N最后一次交配后一周，NR1 的表面与细胞内比率表达 (S/I 比率) 显著下降；图2G，P=0.024)，与性成熟动物相比，细胞表面或细胞内表达均无明显变化。最后一次交配后一周，GluA2 的表达显著增加，细胞内和总表达量均增加，而细胞表面表达无变化 (I, 图2E页=0.026；S+I，图 2K页=0.014)，相比之下，有过性经验的动物则较少 (图2O而在最后一次交配后一个月，GluA2 的 S/I 比值显著增加（图2H，P=0.046)，同时表面表达量呈统计趋势增加（图2B，P=0.055)，相比未进行过性交的对照组，在进行过性交的动物中。在最后一次交配后 1 天或 1 周，未检测到 GluA1 的变化。1 个月后，与未进行过性交的对照组相比，在进行过性交的动物中，GluA1 表面和 S/I 比率表达似乎有所增加，尽管只检测到统计趋势（S、图2C页=0.098；S/I，图2I页=0.083）。总之，最初在戒断1天时检测到NR1表达总量增加，随后在戒断2周后检测到GluA1细胞内表达增加，在戒断2个月后检测到GluA1和GluA1表面表达增加（后者仅作为统计趋势）。

实验三：电生理学

实验 3 的目的是确定性经验是否会改变 PFC 反应性 NAc 壳神经元的突触强度。在刺激推测源自 PFC 的纤维后，记录了有性经验和未性经验的雄性 NAc 壳中中等棘状神经元的突触电流。有性经验的动物 1 天后 AMPA/NMDA 比率显著降低（p=0.005)、1周(p=0.016)，以及 1 个月 (p=0.005)，与性成熟对照组相比 (图 3A、B、C)。为了确定突触前递质释放概率是否发生变化，研究了成对脉冲比。在任何时间间隔内，有性经验的动物和未有过性经验的动物在成对脉冲刺激下发生的递质释放促进程度没有差异（图3D).

最后一次交配或处理后 1 天、1 周或 1 个月，有性经验和未有过性经验的雄性的 AMPA/NMDA 比率。

讨论

本研究表明，性经验会导致雄性大鼠 NAc 中离子型谷氨酸受体分布和功能发生变化，其中一些变化会随着性行为禁欲期的长短而变化。与性经验不足的雄性相比，由于表面和细胞内受体池的增加，有性经验的雄性的 NR1 亚基总表达在短期内有所增加。在禁欲 2 周和 1 个月后，GluA1 在细胞内和表面的表达分别增加。最后，GluA1 表达在任何时候都没有显著变化。 此外，与未进行过性交的动物相比，有过性交经历的动物的 PFC 反应 NAc 壳神经元记录到的 AMPA/NMDA 比率立即且持久地降低。 我们的结果表明，谷氨酸受体的运输取决于性行为禁欲期的长短，而前额叶皮质传入 NAc 壳形成的突触的突触强度的改变则不取决于性行为禁欲期的长短。这些主要发现与重复吸食可卡因后的报告相似，即长期戒毒后 AMPAR 亚基表面表达增加以及 AMPA/NMDA 比率立即下降，但在短期 NMDAR 亚基表达和 AMPA/NMDA 比率持续下降方面有所不同。

性行为具有高度的奖励和强化作用。因此，随着雄性大鼠获得性经验，其性动机和性能力会增强，表现为交配和射精的延迟时间缩短，交配效率提高 [10], [23]。这里证实了这种性行为促进在交配后 1 周内存在，并且确定促进性行为在禁欲后长达 1 个月内仍能维持。性经验诱导的性行为促进的时间曲线与我们之前的研究相符，该研究显示，在相同的禁欲期内测试时，对安非他明的运动诱导作用存在交叉敏感 [11]。先前的研究表明 NAc 是维持促进性行为的介质。NAc 核心和壳神经元均由交配或与交配相关的线索激活 [48]并且性经验会导致交配一周后 NAc 核心和外壳中的树突分支和棘突增多 [11]. 此外，通过病毒载体介导的基因转移降低 NAc 中转录因子 deltaFosB 的活性，可减弱经验诱导的性行为促进作用 [23], [49]。 ţ这些发现表明，NAc 与性行为的强化有密切关系，并且对性经验的交叉致敏药物效应可能至关重要 [23].

当前的研究表明，性经验会导致 AMPAR 合成和/或运输的变化，而这种变化取决于性禁欲期的长短。首先，GluA2 的细胞内表达在 1 周时明显增加，这可能表明 GluA2 受体合成和/或内吞作用增加。 然后，在最后一次交配后 2 个月检测到 GluA1 表面/细胞内比率增加（主要是由于表面增加），表明受体重新分布到细胞表面。 可卡因暴露后 AMPAR 贩运的变化也取决于戒毒期的长短 [50]. 一般而言，在戒除可卡因一周后，细胞表面和突触体 GluA1 和 GluA2/3 水平会升高，并且在最后一次注射可卡因后最多 3 周内维持在高水平 [51], [52], [53], [54], [55]经过更长时间的药物戒断（5 周）后，GluA1 表面表达仍然升高，而 GluA2 表面/细胞内比率略有下降，因此缺乏 GluA2 的 AMPAR 上调 [31], [56]. 在长期戒断（2-5 周）长期自我给药可卡因后，检测到了表面 GluA7 缺乏受体表达的增加，但在长期戒断非依存性可卡因后没有检测到 [32]. 此外，阻断 GluA2 缺乏的 AMPAR 可阻止药物寻求 [31], [57]. 性经验和禁欲之后 AMPA 受体运输的变化与可卡因引起的变化略有不同。 就 GluA1 表面表达增加而言，目前的数据表明，膜表面的 GluA1 受体略有增加，但在性经历后 1 个月未达到统计学意义，因此表明 GluA1 表面表达可能需要更长的禁欲期才能进一步上调，类似于可卡因禁欲 5 周后引起的变化 [31]。此外，目前的数据在 GluA2 方面有所不同，GluA5 在 1 周或更长时间不服用可卡因后会略有下降，而性经验和 2 个月禁欲会导致 GluAXNUMX 表面表达增加。我们假设 NAc 中的 AMPA 受体上调可能对于性经验对后续奖励行为和增加安非他明奖励的长期影响至关重要 [11] 在本研究中测试的长期禁欲期之后。相反，AMPA 受体表达或运输的改变对于性经验对奖励行为的短期影响并不重要。为了支持这一观点，许多报告表明，改变 AMPAR 传输对于药物诱导的精神兴奋剂行为敏感化不是必要的（供审查 [30]). 1 天的奖赏禁欲后观察到敏感化和交叉敏感化，而 AMPAR 上调没有变化 [11], [53]。此外，反复接触精神兴奋剂安非他明已证实会导致行为敏感化，而这种行为与 AMPAR 传输的任何变化无关 [50], [53], [58].

在行为敏化和受体运输方面，NMDAR 的作用研究得比 AMPAR 少得多。非选择性 NMDAR 拮抗剂 (MK-801) 可阻止可卡因或安非他明产生运动敏化，但无法阻止这种敏化的表达 [59], [60]. NMDAR 在性行为中的作用已通过全身或内侧视前区注射 MK-801 进行了最低限度的检查，这种注射会损害幼稚和经验丰富的雄性大鼠的性行为 [61], [62], [63]. NMDAR 还介导其他自然奖励，因为 NMDAR 拮抗剂减少了狒狒的食物摄入量 [64] 并增强了老鼠的食物渴望 [65]. NAc 中的 NMDAR 表达会因可卡因暴露而改变，并且长期（3 周）而非短时间（1 天）反复使用可卡因的禁欲期会增加 NMDAR 亚基（NR1、NR2A、NR2B）的表达 [55], [60]. 目前的结果表明，性经验导致 1 天内总 NR1 表达增加，这是由于表面和细胞内受体池中的水平增加，此外 1 周禁欲期后表面/细胞内比率降低。 因此，我们假设 NMDAR 传输的初始增加可能对于性经验对后续奖励行为的短期影响至关重要。

此外，性经验后 NR1 亚基的短期增加可能表明性经验诱发了静默突触的形成。Huang et al [66] 证明反复服用可卡因会在 NAc 壳中产生静默突触，其中新 NMDAR 的突触后募集是关键。静默谷氨酸能突触在没有 AMPAR 介导电流的情况下表达功能性 NMDAR 介导电流 [67], [68], [69]研究表明，先前的可卡因暴露可以在整个大脑中产生静默突触，而这些新产生的突触为后续体验提供了基础 [66], [70]。NMDAR 由至少一个 NR1 亚基与一个或多个 NR2 亚基 (A–D) 组合而成。NR1 是功能性通道形成所必需的；因此，NR1 表达的变化可能为功能性 NMDA 受体数量的变化提供指标。反复服用可卡因会驱动含有 NR1 和 NR2B 的 NMDAR 插入，并在 NAc 壳中产生静默突触。这些含有 NR2B 的静默突触在服用可卡因期间受到抑制，从而减弱了随后的可卡因运动敏化作用 [71]。可卡因戒断几天后，沉默突触的数量减少，而运动敏化持续存在，这表明过早的突触可能参与形成新的塑性电路，这些电路可以改变（可能通过奖励戒断）以介导这些持续行为。因此，我们假设性经验后不久 NR1 总表达的上调可能是由于新形成的沉默突触中 NMDAR 数量增加。此外，性经验后长期禁欲可能导致沉默突触减少，这既解释了 NR1 表面/细胞内比率降低，也解释了长期禁欲期间 AMPAR 亚基增加的原因，因为突触未沉默。

目前的研究表明，性经验和奖励禁欲期会引起谷氨酸受体运输和表达的改变，这表明 NAc 中兴奋性突触的突触强度发生了改变。 因此，基于 Thomas 及其同事先前研究的电生理学程序 [72] 用于研究在禁欲期后 NAc 壳神经元中谷氨酸受体的功能，禁欲期会导致敏感的性行为和药物行为，以及谷氨酸受体重新分布。与之前可卡因暴露后的研究类似，在对 PFC 输入有反应的 NAc 壳突触中确定了可塑性。PFC 在强迫行为和药物滥用中发挥着关键作用 [73], [74]. 同样，PFC 对于强迫性性行为的发展或表现至关重要，因为 PFC 损伤会导致雄性大鼠寻求性行为不适应 [75]。目前的数据显示，性经验会导致 PFC 反应 NAc 壳神经元中 AMPA/NMDA 比率立即且持久地下降。

此前，人们假设自然奖励和药物奖励之间的主要区别在于，自然奖励导致的 AMPA/NMDA 比率变化是暂时的，会随着时间的推移而消散，而药物引起的变化则会持续存在 [76]. 这一假设是基于以下发现：可卡因（而非食物或蔗糖）可导致室性心动过速 (VT) 中 AMPA/NMDA 比率的长期增加A [76]. 相比之下，目前的研究表明，性经验确实导致了 NAc 中 AMPA/NMDA 比率的长期变化。

然而，性诱发的 NAc 壳可塑性与可卡因暴露后的可塑性不同，后者已被证明与 AMPAR 介导的兴奋性的双向变化有关. 吸食可卡因并戒毒一天后，AMPA/NMDA 比率降低 [72] 以及射击能力下降 [34] 发现，这与性经验的短期影响的结果相似。然而，在戒除可卡因 14 天后，NAc 壳神经元的 AMPA/NMDA 比率增加，这表明戒除可卡因增强了 NAc 中的突触强度 [54]。 H因此，可卡因暴露会导致突触可塑性的双向变化，在暴露于药物后不久，AMPA 介导的反应会降低，但随着药物戒断时间的延长，AMPAR 介导的兴奋性会增加。相反，长期禁欲会导致 NAc 壳中 AMPAR 介导的兴奋性降低，即使在禁欲期间观察到与安非他明相关的运动活动和奖励的敏感化 [11]. 然而，其他报告显示，在可卡因暴露后的短期和长期戒断期内，核心和外壳的内在膜兴奋性均降低 [35], [36], [37], [38], [39], [40], [41]，缺乏双向变化，类似于性经验的影响。此外，目前的结果表明，性经验不会导致突触前谷氨酸释放概率的变化，因为各组之间对成对脉冲比率没有差异。Kalivas 及其同事已经证明，反复服用可卡因会诱发 NAc 中细胞外非突触谷氨酸池介质的变化，但这种改变是否会随着性经验而发生仍有待确定（待审查） [77]).

来自 PFC 以外的其他大脑区域对 NAc 的谷氨酸能输入很可能在性经验对随后的奖励行为的影响中发挥功能性作用. TNAc 从基底外侧杏仁核 (BLA) 和海马腹侧下托接收谷氨酸能输入 [78]. BLA 在自然的寻求奖励行为中发挥作用 [79], [80]，对于环境刺激与性奖励的关联至关重要 [81] 以及启动交配的工具行为 [82]。因此，我们很容易推测性经验也会引起 BLA 反应突触的突触强度的改变。

NAc 外壳中 PFC 突触的 AMPA/NMDA 比率降低与性经验后不久 NR1 表达增加相一致，但与长期禁欲后 GluA2 和 GluA1 表达增加不一致。一种解释是，受体运输发生在接收来自 PFC 以外的其他脑区谷氨酸能输入的突触中。此外，蛋白质样本中除了 NAc 外壳外还包含 NAc 核心，这排除了在蛋白质表达和突触强度数据之间建立准确关联的可能性。尽管如此，目前的研究结果清楚地表明，自然的奖励行为和随后的奖励禁欲会导致 NAc 中的突触可塑性，与精神兴奋剂引起的突触可塑性有相似之处，也有不同之处。

I综上所述，雄性大鼠的性经验和随后的奖赏禁欲被证实可立即且持久地促进性行为，类似于性经验对安非他明的运动诱导作用的敏感化作用ne [11]，并与 NAc 壳层突触中 AMPA/NMDA 比率的立即和长期下降有关。此外，性经验导致 NMDAR 快速上调，并缓慢地将 AMPAR 重新分布到 NAc 神经元表面。 因此，与精神兴奋剂的效果类似，自然奖励行为可以导致谷氨酸受体表达、运输和兴奋性的长期改变。 但是，与可卡因不同，长期禁欲会导致 NAc 壳中的 AMPA/NMDA 比率持续下降。提出了许多可测试的假设来解释这种差异的潜在潜在因素，包括在自然奖励体验之后 BLA 反应突触的改变。 这些数据再次显示了自然和药物奖励暴露的长期后果之间的相似性和差异性，并可能有助于更好地理解药物如何作用于这种自然奖励通路。

方法

道德声明

所有程序均经西安大略大学动物护理和使用委员会批准，并符合加拿大动物护理委员会涉及脊椎动物研究的指导方针。

动物

成年雄性 Sprague Dawley 大鼠（实验 1 和 2：10-12 周；实验 3，实验开始时 8-10 周）来自 Charles River Laboratories（加拿大魁北克省 Senneville）。同性动物成对饲养在装有隧道管的有机玻璃笼中，饲养在温度调节室中，保持 12/12 小时明暗循环，并提供食物和水随意除了行为测试期间。交配阶段的刺激雌性（210-220 克）在双侧卵巢切除后接受含有 5% 苯甲酸雌二醇和 95% 胆固醇的皮下植入。在测试前约 500 小时，通过在 0.1 mL 芝麻油中施用 4 µg 孕酮来诱导性接受。

性经验

在实验开始前，所有雄性大鼠都性经验不足。交配阶段发生在黑暗期初期（黑暗期开始后 2-6 小时之间），在昏暗的红色照明下进行。在每次交配期间，雄性大鼠被允许交配至射精或直到 1 小时，并记录性行为参数，包括：交配潜伏期 (ML；从雌性进入到第一次交配的时间)、插入潜伏期 (IL；从雌性进入到第一次插入阴道交配的时间) 和射精潜伏期 (EL；从第一次插入到射精的时间) [83]. 对未进行性交的对照组进行处理，将其安置在与交配动物相同的房间，从而暴露于相同程度的噪音、一般干扰和发情雌性的遥远气味，但不允许其与受孕雌性互动或交配。

实验一：性促进

Sprague Dawley 雄性大鼠每天在笼子里连续交配 5 次。实验动物被分成 2 个实验组，并在最后一次交配后 1 周或 1 个月进行性行为测试（测试日；n=每组 7 只）。各组根据性行为参数进行匹配，在获得性经验的任何交配过程中，各组之间在任何性行为指标上均未发现显著差异。

数据分析

通过对第 1 天和第 5 天的性经验进行评估来确定性经验对性行为的促进作用，在第 1 天和测试日之间以及第 5 天和测试日之间（第 1 天后 1 周或 5 个月）的性交、插入和射精延迟进行组内比较，使用 Wilcoxin 符号秩检验，显著性水平为 5％。

实验 2：离子型谷氨酸受体亚基重分布/表达

为了检查离子型受体的重新分布，我们采用了与实验 1 类似的范例。将性经验不足的雄性 Sprague Dawley 大鼠分为有性经验组和未性经验组。对于有性经验组，性经验是通过连续 5 次、每天的交配获得（如上所述）。然后将有性经验的雄性大鼠分为 3 个实验组（性行为参数匹配）进行组织收集，收集时间为最后一次交配后 1 天、1 周或 1 个月。在最后一次处理后，在相同的时间点收集了性经验不足对照组的大脑（处理方式如上所述）。这些组包括：有性经验（AMPAR：1D，n=9；1W，n=12；1M，n=12；NMDAR：1D，n=9、1W 或 1M，n=6）或性幼稚（AMPAR：1D，n=9；1W，n=12；1M，n=12；NMDAR：1D，n=9、1W 或 1M，n=6）。

表面受体交联

使用戊巴比妥钠 (270 mg/kg; ip) 对动物实施安乐死，然后斩首。斩首后，迅速取出每个大脑并立即放入冰冷的盐水中。使用大鼠脑基质 (ASI Instruments, Warren, MI, USA) 和手术刀片根据 Paxinos & Watson (1998) 定义的 NAc 边界解剖双侧 NAc。接下来，使用 McIlwain 组织切碎机 (Vibratome, St. Louis, MO, USA) 将 NAc 组织切成 400×400 µm 立方体。AMPA 和 NMDA 受体亚基交联的方法基于 Boudreau & Wolf [53]切碎后，立即将脑组织快速转移到含有 1 mL 冰冷 aCSF 的 Eppendorf 管中，该管中加入了蛋白质交联试剂双（磺基琥珀酰亚胺基）辛二酸酯 (BS³，2 mM；Pierce Biotechnology，美国伊利诺伊州罗克福德）并在 30°C 的摇床上孵育 4 分钟。BS³ 不会穿过细胞膜，因此它能够选择性地交联表面表达的蛋白质与硫键，从而形成高分子量聚集体，而细胞内蛋白质则保持未修饰状态。该反应使得能够使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 和蛋白质印迹分析根据分子量区分表面和细胞内蛋白质池。通过在 100°C 下加入 1 µL 10 M 甘氨酸 4 分钟来淬灭交联反应。在 14°C 下以 000 2 rpm 离心 4 分钟，使组织沉淀，并弃去上清液。将沉淀物悬浮于 400 µL 冰冷裂解缓冲液中 [25 mM Hepes (pH 7.4)、500 mM NaCl、2 mM EDTA、1 mM DTT、1 mM PMSF、20 mM NaF、0.1% Nonidet P-40 (0.1%)、蛋白酶抑制剂混合物 (Ministop, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) 和 1× 磷酸酶抑制剂混合物 (Phosstop, Roche Diagnostics GmbH,)]。将样品超声处理 5 秒钟以破坏组织，然后在 14°C 下以 000 2 rpm 离心 4 分钟，然后立即放回冰块中。将上清液转移至新的 Eppendorf 管中，从中将 30 µL 样品放在冰上，剩余上清液储存在 −80°C 下进行 Western Blot 分析。对于每个样本，使用 BCA 分析法（ThermoFisher Scientific Inc.，马萨诸塞州沃尔瑟姆）和 NanoDrop ND-1000 分光光度计（ThermoFisher Scientific Inc.，马萨诸塞州沃尔瑟姆）测定交联裂解物的蛋白质浓度。

蛋白质印迹分析

将蛋白质样品 (20 µg) 上样，使用 Mini Trans-Blot Cell 系统 (Bio-Rad Laboratories Ltd.) 和 Tris-Glycine-SDS 电泳缓冲液 [4 mM Tris、15 mM 甘氨酸、25% SDS (pH192)] 在 0.1–8.3% 梯度 Tris-HCl 凝胶 (Bio-Rad Laboratories Ltd., Mississauga, Ontario, Canada) 上进行电泳。使用 Precision Plus 蛋白质 All Blue 标准品 (Bio-Rad Laboratories Ltd.) 作为分子量标记。分离后，使用 Trans-Blot Cell 湿印迹系统 (Bio-Rad Laboratories Ltd.) 将蛋白质转移到 Millipore Immobilon-FL 聚偏二氟乙烯膜 (PVDF; Millipore, Billerica, MA, USA) 进行免疫印迹。蛋白质转移在转移缓冲液（Tris-甘氨酸中的 20% 甲醇和 0.037% SDS [25 mM Tris、192 mM 甘氨酸（pH 8.3）]）中以 82 V 的温度在室温（RT）下进行 1 小时。所有样品至少重复运行一次，在各组之间和各个凝胶之间保持平衡。

接下来，将膜放入 2 [比] 3 溶液的 Odyssey 阻断缓冲液 (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) 和 Tris 缓冲盐水 (TBS; 50 mM Tris 和 150 mM NaCl (pH8.0)) 在室温下在振荡器托盘上孵育 1 小时。然后将膜单独在振荡器上在 16°C 下与兔多克隆抗 GluA4 (∼1 kDa; 106 [比] 1K; Millipore，目录号 AB1504) 和 GluA2 (∼100 kDa; 1 [比] 4K； Millipore，目录号 AB1768），或小鼠单克隆抗 NR1（∼130 kDa；1 [比] 2K；Upstate (Millipore)，目录号 05-432）。这些一抗之前已使用并验证 [84], [85]，并在适当的分子量下产生单一条带，当用于非交联组织时，抗体与肽的预吸收可防止这种情况发生。所有抗体均在 2 [比] 3 Odyssey 封闭缓冲液与 TBS-T 的混合物（TBS+0.05% Tween-20（pH8.0））。在 TBS-T 中洗涤三次，每次 10 分钟，然后将膜放入用 2 [比] 3 Odyssey 封闭缓冲液和 TBS-T 混合物在室温下孵育 1 小时。二抗包括 Alexa-680 偶联山羊抗兔 (1 [比] 5K; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 或 IR Dye800 CW 偶联的山羊抗鼠 (1 [比] 10K；LI-COR Biosciences）。使用 Odyssey 2.1 扫描仪（LI-COR Biosciences）可视化荧光免疫反应性并捕获图像。

量化和统计分析

对于每个蛋白质样品，使用 Odyssey 软件确定每个条带（高分子量，>250 kDa 用于表面表达，以及上述特定分子量的条带用于细胞内表达）的荧光强度水平，并计算每只动物的平均值。表面（S）、细胞内（I）、比率（S/I，受体亚基分布的测量值）和总（S+I，总受体亚基表达的测量值）条带密度值被标准化为相应性幼稚对照组的平均值。每个样品的重复样品（加载在不同凝胶中）之间的荧光强度没有差异，证实蛋白质样品的加载缺乏变化。使用非配对 t 检验在同一时间点对有性经验和性幼稚对照组的所有蛋白质印迹数据进行分析，显着性水平为 0.05

实验三：电生理学

实验 1 和 2 采用与上述实验设计相同的实验设计。将有性经验的雄性分成 3 个实验组，根据性行为表现进行匹配，并根据最后一次交配后 1 天、1 周或 1 个月的组织采集时间进行分组（1 天，n=7；1周，n=9；1个月，n=10)。这些年轻雄性大鼠的性行为与实验 1 和 2 中的年长雄性大鼠的性行为并无差异。大鼠用戊巴比妥钠 (270 mg/kg; ip) 麻醉，然后用冰冷的含氧 (95% O₂，5％CO₂) 制备溶液含有 [250 mM 蔗糖、2.5 mM KCl、1.25 mM NaH₂PO₄，4 mM MgCl₂，0.1 mM CaCl₂，26 mM NaHCO₃、10 mM 葡萄糖、3 mM 肌醇、2 mM 丙酮酸钠和 0.5 mM 抗坏血酸]。切除大脑并放入冰冷的含氧制备溶液中。使用振动切片机 (Microm, Walldorf, 德国) 从每只动物身上获取 400 µm 厚的矢状脑切片。将每个大脑总共 4 个切片转移到装有人工脑脊液 (aCSF) [125 mM NaCl、2.5 mM KCl、1.25 mM NaH₂PO₄，1.3 mM MgCl₂，2.5 mM CaCl₂，26.2 mM NaHCO₃ 和 10 mM 葡萄糖]，加热至 32°C 30 分钟，然后让其恢复至室温至少 1 小时，然后将单个切片放入记录室。该室在 22°C 下用含氧 aCSF 进行超灌注。各组之间在任何性行为参数上均无差异。在最后一次处理后的 3 个时间点（n=各 3–4 个）。

在不含背侧纹状体的内侧 NAc 切片中检查壳神经元 [72]. 将不锈钢双极微电极放置在前边缘皮层-NAc 边界，位于记录电极前端，用于对皮层传入纤维进行突触前刺激。通过其胞体大小（直径约 30–35 µ M）和相对负的静息膜电位 fo −75 至 −85 mV 来目视识别重要的中等棘状神经元。使用 Axopatch 200A 放大器和 20 kHz 采样率（Digidata 1340）以及 10 kHz 低通滤波器进行记录。PClamp 9.0 用于实验方案和分析。使用 50 Hz 的成对脉冲（0.1 ms ISI）刺激传入神经，并使用双极同心钨电极刺激神经元。将细胞电压钳制在 −80 mV，并在突触刺激前去极化至 +40 mV 持续 500 毫秒，以缓解 NMDA 电流的镁阻滞。AMPA/NMDA 比率是通过在没有或存在 NMDAR 拮抗剂 AP40（5 µM；全细胞电流 50 倍对照和 30 倍 AP30 存在）的情况下取 +5 mV 下 EPSC 的平均值来确定的。NMDA 反应是通过从对照中减去 AP5 记录来计算的。将 AMPAR EPSC 的峰值除以 NMDAR EPSC 的峰值以得出 AMPA/NMDA 比率。为了确定成对脉冲比率，在 −80 mV 下进行测量，并进行突触前刺激（30 倍）。

数据分析

将性生活未成熟的对照组的数据合并起来，形成一个对照组（n=10 只动物中的 10 个神经元），因为对照组中各个时间点之间没有检测到统计学差异。性经验组（1 天，n=7；1周，n=9；1个月，n=10 个神经元（通常每只动物一个神经元）与性幼稚对照组进行比较，使用单因素方差分析（因素：时间间隔），然后使用 Fisher LSD 进行事后比较显著性水平为 5%。

致谢

我们感谢罗莎琳德富兰克林医学与科学大学的 Marina E. Wolf 博士和 Mike Milovanovic 提供的技术建议。

脚注

利益争夺： 作者宣称没有竞争利益存在。

资金： 加拿大卫生研究院向 LMC 和 ARD 提供资助，自然科学与工程研究委员会向 LMC 和 KKP 提供资助。资助者未参与研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备。

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