D1中可卡因诱导的树突棘形成和伏隔核中含有D2多巴胺受体的中型多刺神经元（2006）

Proc Natl Acad Sci US A. Feb 28，2006; 103（9）：3399-3404。
在线发布Feb 21，2006。 DOI：  10.1073 / pnas.0511244103
PMCID：PMC1413917
神经
这篇文章已经 被引用 PMC的其他文章。

抽象

精神兴奋剂诱导的伏隔核多巴胺神经元上的树突棘改变已被假设为与长期成瘾行为相关的适应性神经元反应。 NAcc主要由两个不同的中型多刺神经元亚群组成，表达高水平的多巴胺D1或D2受体。 在本研究中，我们分析了在NAcc中不同的D1或含D2受体的中型多刺神经元中慢性可卡因治疗后的树突棘密度。 这些研究利用在D1或D2受体启动子（Drd1-EGFP或Drd2-EGFP）控制下表达EGFP的转基因小鼠。 在28天可卡因治疗和2天停药后，Drd1-EGFP-和Drd2-EGFP阳性神经元的脊柱密度增加。 然而，仅在停药后1天的Drd30-EGFP阳性神经元中维持脊柱密度的增加。 值得注意的是，在停药1天后，在Drd2-EGFP-和Drd2-EGFP阳性神经元中也观察到ΔFosB表达增加，但仅在停药1天后在Drd30-EGFP阳性神经元中观察到。 这些结果表明慢性可卡因治疗后观察到的脊柱密度增加仅在含D1受体的神经元中稳定，并且ΔFosB表达与D1中的树突棘的形成和/或维持以及含D2受体的神经元相关。在NAcc。

中脑边缘多巴胺能通路由腹侧被盖区域的神经元组成，其支配伏隔核（NAcc），嗅结节，前额叶皮层和杏仁核（1），而黑质（圆锥形）中的黑质纹状体多巴胺能神经元向背侧纹状体提供上升投射（2）。 精神兴奋剂通过促进多巴胺从神经末梢释放，通过阻断突触间隙和安非他明的多巴胺摄取，提高NAcc：可卡因中多巴胺的突触浓度（3–5）。 精神兴奋剂的反复，间歇性给药导致对这些药物的急性刺激作用的增强的行为反应（致敏）（6–8）。 大多数证据表明，腹侧被盖区域的适应性变化 - NAcc多巴胺能系统对于依赖于经验的可塑性的改变至关重要，这种可塑性是药物诱导行为的基础。

除多巴胺外，谷氨酸还是对精神兴奋剂产生行为致敏作用的必要条件（9, 10）。 腹侧纹状体中的中型多刺神经元（MSN）从前额叶皮层接受兴奋性谷氨酸能突出，其突触到树突棘的头部。 MSN也是突触到脊柱颈部的多巴胺能轴突的主要靶点（1, 11, 12）。 因此，MSN中的树突棘代表最初整合多巴胺能和谷氨酸能传递的细胞区室。

多巴胺作用于两个主要的受体亚家族，D1亚家族（D1和D5亚型）和D2亚家族（D2，D3和D4亚型）（13）。 在纹状体背侧，解剖学研究表明，纹状体神经元MSNs含有高水平的D1受体（与P物质和强啡肽一起），而纹状体感染的MSNs主要表达D2受体（与脑啡肽一起）（14–17）。 来自NAcc的投射比背侧纹状体更复杂，NAcc的壳和核心部分突出到腹侧苍白球和腹侧被盖区域和黑质的不同子区域（18）。 尽管D2受体和脑啡肽在腹侧苍白球的投射中高度表达，但发现D1受体和P物质均匀分布于腹侧苍白球和腹侧被盖区的投影中（19）。 对D1或D2受体具有选择性的激动剂和拮抗剂的研究表明，D1和D2受体都是精神兴奋剂依赖性行为改变所必需的（20–25）。 然而，这些受体的作用似乎不同。 例如，D1受体的刺激减弱了由可卡因引发注射和可卡因相关环境线索诱导的可卡因寻求，而D2受体的刺激促进了可卡因诱导的恢复（26–28).

与精神兴奋剂成瘾相关的行为异常是非常长寿的。 因此，人们对在多巴胺和谷氨酸调节的神经元回路中在分子和结构水平上鉴定长期药物诱导的变化有相当大的兴趣（29–32）。 值得注意的是，已发现长期接触可卡因或安非他明会增加NAcc中树突分支点和MSN刺的数量（33–35）。 在最后一次接触药物后，这些结构变化已显示持续至≈1-3.5个月（30, 35并且有人建议将与精神兴奋剂暴露相关的突触可塑性的长期改变作为基础。

本研究的目的是检测表达D1或D2受体的累积MSN亚群中可卡因诱导的树突棘结构改变。 在这些研究中，我们使用细菌人工染色体（BAC）转基因小鼠，其在D1（Drd1-EGFP）或D2（Drd2-EGFP）多巴胺受体启动子的控制下表达EGFP（36）。 结果表明，虽然增加的脊柱密度最初发生在含有D1受体的MSN和含有D2受体的MSN中，但改变的脊柱密度仅在含有D1受体的神经元中是稳定的。 此外，我们发现转录因子ΔFosB的表达有类似的变化，表明ΔFosB可能参与D1中的树突棘的形成和/或维持以及NAcc中的含D2受体的神经元。

成果

Drd1-EGFP和Drd2-EGFP BAC转基因小鼠中的MSN分析。

通过分析GFP表达，已经表征了Drd1-EGFP或Drd2-EGFP BAC转基因小鼠中背侧和腹侧纹状体的MSN的投射模式（36）。 GFP在背侧纹状体MSN中的差异表达通常分别对应于内源性D1或D2受体的表达（36）。 我们进一步分析了Drd1-EGFP或Drd2-EGFP小鼠中NAFP中GFP的差异表达（图。 1a 和 b）。 虽然NAcc中的≈58％神经元在Drd1-EGFP小鼠中表达GFP（图。 1a），NAX中神经元的≈48％在Drd-2-EGFP小鼠中表达GFP（图。 1b）。 MSN代表NAcc中所有神经元的90-95％（12, 37）。 D1受体仅在MSN中表达，D2受体在MSNs和胆碱能中间神经元中表达，其代表纹状体神经元的1-3％（37）。 考虑到这些因素，结果表明，最低限度地，NAcc中的≈10-15％的MSN可能表达D1和D2受体。

图。 1。 

在Drd1-EGFP和Drd2-EGFP小鼠中分析MSN。 （a 和 b修复了来自Drd1-EGFP的NAcc的脑片（a）或Drd2-EGFP（b）对BAC转基因小鼠进行GFP和NeuN免疫染色（作为一般神经元标记物）。 合并后的图像以黄色显示共定位 ...

Drd1-EGFP和Drd2-EGFP小鼠中树突棘的分析。

Drd1-EGFP和Drd2-EGFP小鼠中的GFP表达可用于染色神经元细胞体。 然而，树突和树突棘中的GFP信号太弱而不能在用抗GFP抗体免疫染色后进行分析。 粒子介导的荧光染料弹道传递最近被用于快速有效地标记神经元群体（38）。 可以使用该技术标记整个神经元，并且该方法似乎与高尔基体 - Cox染色相当。 为了分析NAcc中神经元的树突形态，使用基因枪用亲脂荧光染料1,1'-二十六烷基-3,3,3'，3'-四甲基吲哚菁高氯酸盐（DiI）标记固定的累积切片。 DiI染色的MSN的一个例子如图所示 图。 1c。 在所使用的条件下，我们通常观察到标记的神经元而没有任何与其他标记的神经元重叠的树突。 在更高的放大倍数下，可以观察到详细的树枝状形态，包括树突棘（图。 1d).

然后我们在Drd1-EGFP或Drd2-EGFP转基因小鼠中使用DiI标记和免疫组织化学对GFP的组合，这通过使用低浓度的洗涤剂进行组织透化而成为可能（参见 方法）。 通过仔细比较MSNs细胞体中的DiI染色和GFP表达，我们可以鉴定Drd1-EGFP中的DiI和GFP阳性或DiI阳性和GFP阴性神经元（图。 2a）或Drd2-EGFP（图。 2b） 老鼠。 对于以下研究，我们仅分析来自Drd1-EGFP或Drd2-EGFP小鼠的DiI-和GFP-阳性神经元中的树突形态。

图。 2。 

在Drd1-EGFP和Drd2-EGFP小鼠中分析树突棘。 Drd1-EGFP小鼠的NAcc中的神经元（a）或Drd2-EGFP小鼠（b首先用DiI（红色）标记，然后使用抗GFP抗体（EGFP，绿色）进行免疫组织化学。 只要 ...

慢性可卡因治疗导致表达Drd1-EGFP或Drd2-EGFP的Accumbal MSN中脊柱密度增加。

Drd1-EGFP或Drd2-EGFP小鼠连续四周反复注射可卡因（30 mg / kg）或生理盐水（见 方法）。 在最后一次药物治疗后两天（2WD）或30天（30WD），如上所述处理脑用于DiI标记和免疫组织化学。 之前的一项研究报道，安非他明的慢性治疗增加了NAcc中MSNs远端而非近端树突的脊柱密度（35）。 因此，我们将分析局限于远端树突（即具有二级或三级分支的树突），包括末端区域。 在2WD分析时，发现Drd1-EGFP阳性MSNs（盐水组的128％）的脊柱密度增加（图。 3a 和 c并且在较小程度上在Drd2-EGFP阳性神经元中（盐水组的115％）（图。 3 b 和 d）。 在30WD后，Drd1-EGFP阳性神经元（生理盐水对照的118％）维持脊柱密度增加（图。 3 a 和 c）但不是Drd2-EGFP阳性神经元（图。 3 b 和 d).

图。 3。 

慢性可卡因诱导的NAcc中Drd1-EGFP-或Drd2-EGFP阳性MSN中脊柱密度的增加。 （a 和 b）Drd1-EGFP（a）或Drd2-EGFP（b）用盐水（Sal）或可卡因（Coc，30 mg / kg）处理小鼠4周。 处理了鼠标大脑2WD或30WD ...

树突棘的形态在其长度和脊柱头部的宽度方面是可变的。 因此，我们将来自可卡因的2WD的树突状突起分为四种脊柱类（粗短，蘑菇，薄和丝状伪足）（数据未显示）。 蘑菇型的密度（119.7±4.0％， P <0.01）和细刺（120.0±3.4％， P 可卡因治疗使Drd0.01-EGFP阳性MSN中的<1）增加，而粗短（182.4±21.6％， P <0.05）和蘑菇刺（122.5±5.0％， P <0.01）在Drd2-EGFP阳性MSN中增加。 在Drd1-EGFP阳性神经元中，粗短刺或Drd2-EGFP阳性神经元中的细刺均无明显增加。

慢性可卡因诱导NAcc中Drd1-EGFP-或Drd2-EGFP-阳性MSN中的ΔFosB表达。

ΔFosB是转录因子Fos家族的成员。 尽管急性给予可卡因诱导NAcc中几种Fos同种型的快速和瞬时诱导，但重复暴露于可卡因会增加ΔFosB的水平。 此外，在终止药物暴露后，ΔFosB表达在NAcc中持续数周至数月持续存在，并且有人建议参与基因表达的长期调节，即使停药后也是如此（29, 39, 40).

为了检测可卡因处理后来自Drd1-EGFP或Drd2-EGFP小鼠的NAcc中ΔFosB的诱导，我们通过双标记分析了FosB和GFP表达（图。 4 和 表1）抗FosB抗体识别所有形式的FosB，但我们假设增加的免疫染色代表ΔFosB（见 方法 进一步讨论）。 在盐水处理的小鼠中，16％的Drd1-EGFP阳性神经元和15％的Drd2-EGFP阳性神经元表达FosB免疫反应性，强度相对较弱（图。 4 a 和 b 和 表1）。 重复可卡因治疗随后2WD导致共表达ΔFosB的Drd1-EGFP阳性神经元数量显着增加（GFP阳性神经元的55％）（图。 4c 和 表1）。 在Drd2-EGFP阳性神经元中发现ΔFosB表达的较小但仍显着增加（GFP阳性神经元的25％）（图。 4d 和 表1）。 与脊柱密度的变化一样，ΔFosB的表达在Drd1-EGFP阳性神经元（GFP阳性神经元的46％）中保持不变，但在Drd2-EGFP阳性神经元（GFP阳性神经元的15％）中没有。 30WD（图。 4 e 和 f 和 表1）。 注意观察到的ΔFosB表达增加 图。 4f 存在于Drd2-EGFP阴性神经元中。

图。 4。 

慢性可卡因诱导NAcc中Drd1-EGFP-或Drd2-EGFP阳性MSN中的ΔFosB表达。 Drd1-EGFP（a, c及 e）或Drd2-EGFP（b, d及 f）如上所述，用盐水或慢性可卡因处理小鼠 图。 3。 2WD（c 和 d）或30WD（e 和 ...
表1。 

表达Δ的EGFP阳性神经元的定量FOSB

讨论

多巴胺能神经传递的持久适应被认为是与精神兴奋药物相关的成瘾行为的基础。 特别是，已经假设精神兴奋剂引起的NAcc中MSN树突棘密度的增加与突触连接的重组有关（30）。 NAcc主要由两个不同的MSN亚群组成，表达高水平的D1或D2多巴胺受体。 在本研究中，我们分析了慢性可卡因治疗后NAcc中不同D1或D2受体的MSN的脊柱密度。 获得的结果表明，尽管脊柱密度增加最初发生在含有D1受体的MSN和含D2受体的MSN中，但改变的脊柱密度仅在含有D1受体的神经元中稳定。 此外，我们发现D1和含有D2受体的MSN中转录因子ΔFosB表达的类似变化模式。

这些研究利用BAC转基因小鼠，其在D1或D2受体启动子的控制下在MSN的特定亚群中表达GFP。 此外，我们开发了一种双标记方法，将GFP的免疫组织化学与使用DiI的神经元弹道标记相结合。 以前的研究使用Golgi-Cox方法分析精神兴奋剂对脊柱密度的影响（34），这里使用的DiI方法给出了定量可比的结果。 我们开发了双标记方法，因为高尔基染色与免疫组织化学不相容。 免疫染色通常需要使用去污剂进行组织透化，这一过程通常会导致亲脂性染料从膜中溶解（38）。 然而，在我们目前的研究中，GFP免疫染色不需要高浓度的去污剂用于组织透化，因此可以与亲脂性染料标记结合使用。 我们的双标记方法通常可用于树突棘结构变化的研究，例如用于分析BAC转基因小鼠系，其中GFP在皮质中的特定神经元群体中表达（36).

虽然仍有一些争议，但据信D1和D2受体在很大程度上在解剖学上分别与直接（纹状体）和间接（纹状体）纹状体投射神经元分开（17, 41）。 在Drd1-EGFP和Drd2-EGFP小鼠中GFP定位的初步表征与该结论一致（36）。 此外，我们对来自Drd1-EGFP和Drd2-EGFP小鼠的NAcc中GFP阳性神经元的数量的分析与以下结论一致：≈50％的MSN仅表达D1受体，即≈35-40％仅表达D2受体，并且≈10-15％共同表达D1和D2受体。 这种共表达的值类似于背侧纹状体的研究所暗示的，其结合了单个纹状体神经元的膜片钳分析和RT-PCR技术来分离和扩增mRNA（≈17％共表达脑啡肽和P物质）（42）。 应该注意的是，我们目前的研究没有解决D3，D4和D5受体的表达问题，也没有解决表达高水平D1受体的MSN中D2受体低水平表达的问题，反之亦然。

以前的几项研究已经检查了精神兴奋剂诱导的Fos表达的神经元定位以及D1和D2受体的作用（43–45）。 这些研究支持Fos和ΔFosB诱导由D1受体激活介导的结论。 然而，Fos表达的细胞定位受到施用精神兴奋药物的环境背景的影响（46, 47）。 例如，在家笼中给予的苯丙胺或可卡因优先诱导立即早期基因（包括Fos）在共表达D1受体的物质P-阳性细胞中。 相反，当在新环境中施用时，这些药物可以在D1和含有D2受体的MSN中诱导Fos表达。 我们目前研究中使用的方案不包括将药物注射与暴露于新环境中配对。 然而，我们不能排除某种依赖于背景的应激，这种应激导致含有D2受体的MSN中ΔFosB的表达。

本结果的显着特征是增加的脊柱密度和ΔFosB表达的平行模式。 增加的脊柱密度和ΔFosB表达最初发生在表达Drd1-EGFP和Drd2-EGFP的MSN中。 然而，这些变化仅在含有D1受体的神经元中是稳定的。 对含有D2受体的神经元中瞬时发现的脊柱密度和ΔFosB表达增加的观察结果的一种可能解释是，这种情况发生在共表达D1和D2多巴胺受体的小部分MSN中。 因此，这些增加的短暂性质可能与D2受体激活对D1依赖性信号通路的拮抗作用有关（48）。 令人感兴趣的是，脊柱密度和ΔFosB表达的变化是可逆的，这可能反映了D2受体依赖性信号传导途径影响ΔFosB稳定性的能力。

观察到ΔFosB和脊柱密度的表达存在平行变化，这与ΔFosB参与NAcc中含有D1受体的神经元中的树突棘的初始形成和随后维持的观点一致。 ΔFosB的表达受MSN中D1 / DARPP-32 / PP1依赖性信号传导途径的控制（49）。 一些研究表明，ΔFosB在精神兴奋剂的奖励和运动激活作用中起着重要作用（39），可能通过影响多种基因的表达，包括神经递质受体，信号蛋白和参与调节神经元形态的蛋白质（50）。 然而，目前还不知道慢性可卡因诱导的脊柱形成中涉及的特定分子机制。 我们之前的研究表明，Cdk5抑制剂roscovitine的室内输注减少了可卡因诱导的脊柱密度增加（51）。 此外，Cdk5是ΔFosB的下游靶基因，并且与慢性可卡因治疗相关的代偿性适应性变化有关（52）。 因此，Cdk5依赖性磷酸化的改变是可卡因诱导的脊柱形成和/或脊柱稳定性的合理机制。 PAK（53），β-​​连环蛋白（54），PSD-95（55）和spinophilin（56）是Cdk5的底物，并且都参与脊柱形态发生的调节（57–60）。 进一步表征脊柱中的这些和其他Cdk5底物将有望阐明精神兴奋剂调节脊柱形成的机制。

方法

动物。

在Gensat BAC转基因项目中产生携带在D1或D2多巴胺受体控制下的EGFP转基因的小鼠（36）。 在该研究中使用的转基因小鼠是4-5周龄，并且在Swiss-Webster背景上。 将小鼠维持在12：12-h光/暗循环中并饲养在2-5组中，随意获得食物和水。 所有动物方案均符合美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南，并获得洛克菲勒大学机构动物护理和使用委员会的批准。

药物治疗。

据报道，慢性可卡因治疗（30 mg / kg，每日）可使大鼠NAcc的核心和壳中MSN的脊柱密度大幅增加，但较低剂量（15 mg / kg）仅增加脊柱密度。贝壳 （61）。 因此，我们使用较高剂量的可卡因来诱导NAcc两部分的结构修饰。 小鼠每天接受一次（ip）30 mg / kg可卡因-HCl（或盐水）连续5天，然后是2无注射天，并且该过程连续几周重复4。 在家笼中进行注射。 处理2WD或30WD，小鼠脑用于DiI标记和/或免疫组织化学。

用荧光染料DiI进行弹道贴标。

用80 mg / kg戊巴比妥钠麻醉小鼠，并用5 ml PBS经心脏灌注，然后用40 ml的4％多聚甲醛的PBS溶液（20 ml / min）快速灌注。 将脑迅速从颅骨中取出并在4％多聚甲醛中后固定10 min。 如参考文献1中所述，通过弹道染料DiI（Molecular Probes）的弹道递送来标记脑切片（100μm）。 38。 使用低浓度的去污剂开发了组合的DiI标记 - 免疫组织化学方法。 将DiI标记的切片用PBS中的0.01％Triton X-100透化15 min，然后在PBS中的0.01％Triton X-100和10％正常山羊血清中孵育1 h以使非特异性标记最小化。 然后将组织切片与1％正常山羊血清/ 0.01％Triton X-100和抗GFP抗体（Abcam，Cambridge，MA）在室温下孵育2 h，洗涤，并在FITC-的1：1,000稀释液中孵育。缀合的二抗（Molecular Probes）。 将切片置于显微镜载玻片上并用封固剂盖上盖玻片。 弹道标记方法允许详细分析树突棘结构，并且获得的结果在定性和定量上与先前使用Golgi-Cox浸渍法在大鼠脑切片中的研究相当（34）。 然而，与之前的研究相反，我们很少在DiI染色的神经元中观察到双头刺。 这种差异可能是由染色方法的敏感性或小鼠（本研究）与大鼠组织的变异性引起的（34).

免疫组化。

如上所述将动物麻醉并灌注。 取出脑并在4°C下在4％多聚甲醛中储存过夜。 将脑转移至PBS溶液中的30％蔗糖中用于冷冻保护。 在冷冻切片机（Leica）上切割冠状切片（12μm），然后进行免疫组织化学处理。 然后将脑切片在PBS中的0.3％Triton X-100中透化，持续15 min，并在PBS中漂洗两次。 将切片在PBS中的10％正常山羊血清中在1℃下预孵育37 h，暴露于一抗（在PBS中的1％正常山羊血清中稀释）在4℃过夜，然后在PBS中漂洗并与二次孵育1抗体在37°C时的抗体。 使用以下抗体：兔抗pan-FosB（SC-48，1：500; Santa Cruz Biotechnology），小鼠抗NeuN（Chemicon），兔抗GFP，FITC缀合的抗兔IgG和罗丹明 - 缀合的抗小鼠IgG（Molecular Probes）。 对于三重标记（ΔFosB，NeuN和GFP），首先用抗pan FosB抗体和抗NeuN抗体对脑切片进行免疫染色，然后与二抗（罗丹明缀合的抗兔IgG和青色缀合的抗小鼠IgG）一起孵育。 ）。 使用Zenon标记技术（Zenon Alexa Fluor 488，Molecular Probes）进一步处理双染色的脑切片用于GFP免疫染色。 将抗泛FosB抗体培养至FosB的N末端并识别ΔFosB和全长FosB（62）。 基于以前的研究表明，在慢性可卡因治疗后，ΔFosB而非FosB或其他Fos相关抗原稳定表达，我们认为免疫反应性的持久增加代表ΔFosB的稳定表达。 然而，在盐水处理的小鼠中观察到的免疫反应性FosB信号的身份是未知的。 统计分析 表1 使用了学生的 t 测试。

树突棘分析。

根据几个标准选择NAcc中的个体MSN进行脊柱分析。 （i）与其他标记细胞的重叠很少或没有重叠，以确保不会混淆来自不同细胞的过程。 （ii）对于用于分析的细胞，至少需要三个初级树突。 （三）检查了远端树枝状晶体（末端树枝状晶体或接近末端树枝状晶体）。 分析了来自NAcc核和壳中MSN的枝晶。 尽管我们观察到了稀疏旋转的MSN（多刺II型），但我们仅分析了密集旋转的MSN（多刺I型）。 为了计算脊柱密度，通过使用带油浸透镜（×20）的共焦显微镜（Zeiss LSM 510）跟踪树突的长度（> 40μm长）。 树突的所有图像均在不同的位置拍摄 z 水平（0.5-1μm深度间隔）检查树突棘的形态。 所有测量均使用变质图像分析软件（Universal Imaging，Downingtown，PA）进行。 统计分析使用Kolmogorov-Smirnov检验。

来自枝晶的突起根据其长度分为四种类型，如参考文献中所述。 63 和 64。 1类突起（也称为短突）的长度小于0.5μm，没有大的脊柱头，并且似乎没有脖子。 2级或蘑菇状的棘长在0.5至1.25μm之间，特征是脖子短，脊柱头大； 3级或细刺，范围在1.25至3.0μm之间，脊柱颈细长，头部较小； 4级，或丝状伸展，是长的丝状突起，缺少可辨认的脊柱头。

致谢

这项工作得到了美国公共卫生服务机构DA10044（PG和ACN）以及西蒙斯基金会，Peter J. Sharp基金会，Picower基金会和FM Kirby基金会的支持。

缩略语

  • NACC
  • 伏隔核
  • 的MSN
  • 中型多刺神经元
  • BAC
  • 细菌人工染色体
  • Drd1
  • 多巴胺受体D1启动子驱动
  • Drd2
  • 多巴胺受体D2启动子驱动
  • 的DiI
  • 1,1'-二十八烷基-3,3,3'，3'-四甲基吲哚菁高氯酸盐
  • 2WD
  • 最后一次药物治疗后的2天数
  • 30WD
  • 最后一次药物治疗后的30天数。

脚注

 

利益冲突声明：未声明冲突。

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