DeltaFosB介导慢性安非他明暴露后c-fos基因的表观遗传脱敏（2008）

威廉·伦塔尔,¹ 蒂芙尼L.卡尔,¹ 伊恩迷宫,¹ Herbert E. Covington，III,¹ Hoang-Trang Truong,¹ Imran Alibhai,¹ Arvind Kumar,¹ Rusty L. Montgomery,² 埃里克·奥尔森N.,² 和 Eric J. Nestler^1,*

从娱乐性药物使用到慢性成瘾的过渡的分子机制仍然知之甚少。 涉及该过程的一个分子是ΔFosB，其是在重复药物暴露后在纹状体中累积的转录因子，并且介导对精神兴奋剂和其他滥用药物的敏感行为反应。 ΔFosB调节药物诱导行为的下游转录机制尚不完全清楚。 我们以前报道了ΔFosB激活某些基因表达的染色质重塑机制，然而，ΔFosB介导的基因抑制的机制仍然未知。 在这里，我们确定 的c-fos，一种在精神兴奋剂暴露后在纹状体中快速诱导的即刻早期基因，作为被ΔFosB抑制的新型下游靶标。 我们显示慢性安非他明治疗后纹状体中ΔFosB的积累脱敏 的c-fos mRNA诱导至随后的药物剂量。 ΔFosB脱敏 的c-fos 通过募集组蛋白去乙酰化酶1（HDAC1）来表达 的c-fos 基因启动子，其反过来使组蛋白去乙酰化并减弱基因活性。 因此，纹状体中HDAC1的局部敲除消除了苯丙胺诱导的脱敏作用。 的c-fos 基因。 同时，慢性安非他明增加组蛋白H3甲基化 的c-fos 启动子，已知抑制基因活性的染色质修饰，以及H3组蛋白甲基转移酶KMT1A / SUV39H1的表达水平。 该研究揭示了一种新的表观遗传途径，ΔFosB通过该途径介导不同的转录程序，并最终介导慢性安非他明暴露的行为可塑性。

RNA分离和定量

将冷冻的脑组织在TriZol（Invitrogen，Carlsbad，CA）中解冻，并根据制造商的方案进行处理。 用RNAesy Micro柱（Qiagen，Valencia，CA）纯化RNA。 使用Superscript III（Invitrogen）逆转录总RNA。 然后使用SYBR Green（ABI，Foster City，CA）进行实时PCR，并使用ΔΔCt方法定量。 看到 补充表 有关完整的引物列表。

染色质免疫沉淀（ChIP）

对染色质进行超声处理，然后进行免疫沉淀（参见 补充方法）使用来自Abcam（Cambridge，UK）的乙酰化组蛋白抗体（Millipore，Billerica，MA），抗HDAC1或抗-H3K9me2，抗FosB（C-末端）（Kumar等人，2005），抗FosB（N-末端）（Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA，State），或兔IgG对照（Millipore）。 使用来自Millipore的蛋白A珠收集IP。 洗涤后，从珠子中洗脱染色质并在蛋白酶K存在下反向交联。然后使用实时PCR纯化DNA并定量。

免疫沉淀

PC12细胞用V5标记的HDAC1转染（Montgomery等，2007），FosB或ΔFosB如前所述（Carle等，2007）。 将细胞裂解物分开并与非免疫IgG（Sigma）或抗FosB抗体（sc-48，Santa Cruz）在4℃下孵育过夜。 用蛋白G珠（Sigma）进行免疫沉淀。 用SDS-PAGE进行免疫沉淀的蛋白质，并使用定制的多克隆抗FosB（N-末端）抗体通过蛋白质印迹分析（Carle等，2007）和抗V5抗体（Abcam）。 确定HDAC1和ΔFosB是否是结合配偶体 体内，我们使用反复的电惊厥性癫痫发作诱导高水平的ΔFosB蛋白（Hope等人，1994）。 从慢性（7每日）癫痫发作或假处理的大鼠解剖皮层组织，裂解，并如上所述用抗HDAC1抗体（Abcam）免疫沉淀。

激光捕获显微切割

使用立体定向手术，用在腺体相对侧表达指定基因或GFP的腺相关病毒（AAV）感染小鼠的腹侧纹状体。 在苯丙胺处理后，将冷冻的脑加工成8μm厚的冠状切片并固定在膜载玻片（Lieca，Wetzlar，Germany）上。 对AAV感染的区域进行激光解剖（Leica）以排除未感染的细胞并用PicoPure RNA提取试剂盒（MDS，Sunnyvale，CA）处理。 用RiboAmp HS试剂盒（MDS）扩增RNA并如上所述进行逆转录。 看到 补充方法 完整的详细信息。

ΔFosB脱敏 的c-fos 慢性安非他明暴露后纹状体mRNA的诱导

探讨是否脱敏 的c-fos mRNA表达是由ΔFosB控制的细胞适应，我们用盐水或急性或慢性安非他明治疗大鼠，并让它们在其家笼中撤回1至10天。 然后在盐水或苯丙胺攻击剂量后1小时分析大鼠。 如前所述（见 介绍), 的c-fos 通过急性苯丙胺给药，mRNA在纹状体中诱导4倍。 然而，在先前暴露于慢性安非他明的大鼠中，表达为 的c-fos 在药物戒断的5天内，对药物攻击的反应显着减弱（图1A），ΔFosB在这个大脑区域保持升高的点（Hope等人，1994）。 此外，在从5天退出慢性安非他明的大鼠中，我们发现基础 的c-fos mRNA表达降低至盐水处理对照组中的水平（图1A）。 重要的是，的大小 的c-fos 与盐水处理的动物相比，在停药的第1天，对苯丙胺攻击的诱导显着减弱。 总之，这些发现证明了慢性安非他明对基础和诱导的影响 的c-fos mRNA水平，尽管这两种效应发生在复杂的时间过程中。

  

图1

ΔFosB脱敏 的c-fos 慢性安非他明暴露后纹状体mRNA的诱导

确定慢性安非他明后ΔFosB积累是否直接导致脱敏 的c-fos 表达式，我们首先对ΔFosB进行了ChIP 的c-fos 纹状体中的基因启动子。 如图所示 图1B是， 的c-fos 在慢性苯丙胺暴露后，启动子具有显着更多的ΔFosB结合，这种作用在药物戒断的至少5天中看到。 这些数据与ΔFosB占用率相关 的c-fos 启动子具有降低的动力学 的c-fos 基因活动。 接下来，直接测试ΔFosB是否导致减少 的c-fos 为了响应苯丙胺攻击，我们使用AAV载体在纹状体中过表达ΔFosB或GFP作为对照。 然后我们通过激光显微切割分离感染的纹状体（图1C并进行qRT-PCR 的c-fos mRNA的表达。 我们观察得少得多 的c-fos 与感染AAV-GFP的对侧相比，AAV-ΔFosB感染的纹状体组织中急性剂量的安非他明后诱导的mRNA水平 β微管蛋白 mRNA保持不变（图1D）。 这些数据表明 的c-fos 脱敏是由慢性安非他明暴露后ΔFosB在其启动子上的积累介导的。

ΔFosB招募HDAC1到 的c-fos 促进者调解 的c-fos 基因压抑

探讨ΔFosB介导的机制 的c-fos 脱敏，我们专注于时间点 的c-fos 被抑制最严重的是：从慢性安非他明中戒除5天数。 涉及的关键机制 的c-fos 激活以响应各种刺激，包括可卡因（Kumar等人，2005），是组蛋白乙酰化。 因此我们有兴趣确定是否对组蛋白进行乙酰化 的c-fos 急性苯丙胺也诱导基因启动子，反复接触药物是否会减弱这种反应。 事实上，急性安非他明增加了组蛋白H4的乙酰化作用 的c-fos 启动子，慢性安非他明治疗后，不再观察到这种诱导（图2A）。 H4的乙酰化是特异性的，因为没有观察到对H3的影响（未显示）。 这些数据表明，组蛋白乙酰化程度降低，与更紧凑和无活性的染色质结构相关（Kouzarides，2007），有助于脱敏 的c-fos 慢性安非他明暴露后的基因。 为了直接测试该假设，我们用慢性安非他明治疗大鼠，并且在停药5天后，给予HDAC抑制剂，丁酸钠或其载体。 我们发现丁酸钠逆转苯丙胺诱导的抑制作用 的c-fos 表达（图2B），直接支持对低乙酰化的想法 的c-fos 启动子是基因脱敏的关键机制。

  

图2

招募HDAC1介导ΔFosB作用 的c-fos

了解ΔFosB如何抑制组蛋白乙酰化 的c-fos 我们研究了ΔFosB是否与降低组蛋白乙酰化的酶（即HDAC）相互作用。 我们首先探索了HDAC1和HDAC2，因为这些酶与多种转录因子形成复合物以抑制基因表达（Grozinger和Schreiber，2002）。 由于初步的ChIP研究确定了显着的HDAC1结合 的c-fos 启动子（见下文），但没有可检测的HDAC2（未显示），我们进行共免疫沉淀实验以确定ΔFosB是否与HDAC1物理相互作用。 实际上，我们发现ΔFosB的免疫沉淀也降低了PC1细胞中的HDAC12（图2D）。 重要的是，这种相互作用特异于ΔFosB，如全长FosB，在慢性精神兴奋剂给药后不会累积（Hope等人，1994），没有与HDAC1交互。 我们进行了反向实验 体内 通过诱导大量具有电惊厥性癫痫发作的ΔFosB。 与我们的细胞培养数据一致，用抗HDAC1抗体的免疫沉淀从脑组织中拉下ΔFosB（图2E).

基于这些发现，ΔFosB和HDAC1在物理上相互作用 细胞/组织 和 体内，我们假设，慢性安非他明后，ΔFosB招募HDAC1 的c-fos 基因启动子。 实际上，纹状体裂解物的ChIP发现HDAC1的水平明显更高 的c-fos 慢性安非他明暴露后的启动子（图2C）而安非他明并没有改变HDAC1的结合 β肌动蛋白 基因启动子。 直接确定HDAC1是否足以衰减 的c-fos 诱导后，我们用HDAC293或GFP转染HEK1T细胞，并用5％血清刺激它们（见 补充方法）。 我们发现血清诱导 的c-fos 在过表达HDAC1的细胞中，表达显着减弱（图2F）。 这些研究得到了延伸 体内 通过在纹状体的一侧使用感染了AAV-GFP的floxed HDAC1小鼠和AAV-CreGFP诱导局部敲除 hdac1 基因在对侧纹状体。 AAV-CreGFP减少了 Hdac1 与AAV-GFP注射的对照组相比，感染组织中的mRNA表达（通过激光显微切割法分离）> 75％，而 Hdac2 表达保持不变（图2G）。 然后用慢性苯丙胺处理小鼠，然后停药5天。 在苯丙胺攻击后分钟对30小鼠进行分析，并将感染的纹状体区域显微切割。 我们发现安非他明诱导的更多 的c-fos 与AAV-GFP相比，AAV-CreGFP感染的纹状体组织中的mRNA（图2G），证明HDAC1是慢性安非他明诱导的抑制所必需的 的c-fos 表达。 这些数据表明，慢性安非他明治疗后大鼠的ΔFosB积累导致更多的ΔFosB结合 的c-fos 启动子，HDAC1的募集，较少的组蛋白乙酰化，以及最终较少的基因活性。

组蛋白甲基化升高 的c-fos 慢性安非他明暴露后的启动子

抑制基因活动通常涉及并行发生的几种表观遗传修饰（Kouzarides，2007; Tsankova等，2007）。 与降低的基因活性相关的最佳表征的组蛋白修饰之一是组蛋白H3在赖氨酸9（H3K9）的甲基化。 当在启动子区域发现时，这种组蛋白修饰通过募集共抑制因子如HP1（异染色质蛋白1）与转录抑制相关（Kouzarides，2007）。 因此，我们分析了是否过乙酰化了 的c-fos 在慢性安非他明给药后观察到的基因也与H3K9甲基化的改变有关。 与此假设一致，对用慢性安非他明治疗的大鼠的纹状体组织进行的ChIP显示，二甲基化的H3K9（H3K9me2）显着增加。 的c-fos 促进者（图3A），没有观察到的影响 β肌动蛋白 基因启动子。 介导H3K9甲基化的关键酶之一是KMT1A / SUV39H1，这提出了这种酶的表达是否受慢性苯丙胺暴露调节的问题。 我们对用慢性安非他明治疗的大鼠的纹状体进行了qRT-PCR，并观察到显着的上调 Kmt1a / Suv39h1 mRNA，而独特的染色质修饰酶， Hdac5，保持不受影响（图3B）。 然而，与HDAC1不同，共免疫沉淀实验未发现ΔFosB和KMT1A / SUV39H1之间存在任何可检测的相互作用，我们也无法鉴定甲基转移酶在甲基转移酶上的显着富集。 的c-fos ChIP的启动子（未显示）。 无论如何，这些研究结果表明KMT1A / SUV39H1的上调可能使H3高度甲基化 的c-fos 并有助于减少机制 的c-fos 慢性安非他明暴露后的基因活性。

  

图3

慢性安非他明暴露后的组蛋白甲基化

Supp1

这项工作得到了NIDA的资助

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