PMCID： PMC2820240
NIHMSID： NIHMS174679
抽象
可卡因诱导的基因表达改变引起可能导致可卡因成瘾的神经元形态和行为的变化。 我们确定了组蛋白3赖氨酸9（H3K9）二甲基化和赖氨酸二甲基转移酶G9a在可卡因诱导的结构和行为可塑性中的重要作用。 重复的可卡因给药降低了伏隔核中H3K9二甲基化的全球水平。 Ť他在组蛋白甲基化中的减少是通过在该脑区抑制G9a介导的，其受可卡因诱导的转录因子ΔFosB的调节。 使用条件诱变和病毒介导的基因转移，我们发现G9a下调增加伏隔核神经元的树突棘可塑性和增强对可卡因的偏好，从而在可卡因的长期作用中建立组蛋白甲基化的关键作用。
介绍
重复的可卡因暴露的特征是基底表达的持续变化和伏隔核（NAc）内神经元形态的改变，这是大脑奖赏回路的关键组成部分（1–2). 染色质重塑在这个大脑区域的异常转录变化中很重要，这可能是可卡因成瘾的基础 (3–9）。 NAc中染色质结构的可卡因调节部分来自直接可卡因诱导的染色质酶机制修饰，导致组蛋白乙酰化和磷酸化的变化（4, 7–9）; 然而，尚未研究控制组蛋白甲基化的酶的作用。
使用与微阵列（ChIP-Chip）偶联的染色质免疫沉淀的最近全基因组启动子分析鉴定了在重复可卡因处理后NAc中特定基因启动子处的抑制性组蛋白H3赖氨酸9（H3K9）和27（H3K27）甲基化的改变模式（6）。 因此，我们分析了众多已知可控制H3K9或H3K27甲基化的赖氨酸甲基转移酶（KMTs）和去甲基化酶（KDM）（图1A). 只有两种酶，G9a和GLP，在重复使用可卡因后数小时内显示出持续的转录调节，当两种基因的表达显着下调时. 因为G9a和GLP特异性地催化H3K9（H3K9me2）的二甲基化，所以它们对可卡因的下调与在此时间点观察到的常染色体H3K9me2的总体水平降低一致（图1B）。 相反，异染色质H3K27甲基化的全球水平保持不变，反复可卡因暴露（图.S1支持在线资料）。 由于其高水平的催化活性 细胞/组织 和 体内 (10），我们开始进一步研究在NAc中重复可卡因暴露后G9a抑制的功能意义。 G9a蛋白的水平，如其mRNA的水平，在重复可卡因给药后24小时显着降低（图.S2）。 尽管GXNUMXa mRNA表达在NAc中降低了9％，但免疫组织化学分析显示G35a蛋白水平的15％降低更为适度，与在重复使用可卡因后观察到的H9K21me3的9％降低一致（图1B）。 在重复自我给予可卡因后，G9a mRNA表达在20％中也在该脑区域中被下调（图.S3).
为了确定常染色体H3K9me2的变化是否与NAc中基因组表达的全基因变化相关，我们采用微阵列分析来检查在有或没有可卡因暴露史的动物中由可卡因挑战剂量诱导的基因表达谱（参见补充剂）基因列表 表S1-S3）。 与急性治疗的动物相比，接受过重复可卡因的动物在可卡因攻击后1小时显示出显着增加的基因表达（图1C）。 这种增加的基因表达仍然是在从重复可卡因戒断1周后给予可卡因攻击时发生的。 与先前的报道一致，一小部分基因（~10％）在重复使用可卡因后表现出脱敏转录反应（图1C; 看到 表S1）（5）。 为了直接研究G9a下调在重复可卡因后观察到的增强基因表达中的作用，小鼠接受NAc内注射表达GFP或G9a的单纯疱疹病毒（HSV）载体，并用盐水或重复可卡因处理以确定G9a是否过表达足以阻止重复的可卡因诱导的基因表达增强。 从一组12随机选择的基因显示重复可卡因后表达水平升高，我们观察到G9a显着降低了这些基因中50％的增强表达（表S4).
为了鉴定介导重复可卡因诱导的G9a表达抑制的上游转录事件，我们研究了ΔFosB的可能作用，ΔFosB是一种高度稳定的早期基因剪接产物。 FOSB。 ΔFosB在反复接触可卡因后累积在NAc中，与可卡因奖励增加有关（11）。 ΔFosB可以作为转录激活因子或抑制因子，具体取决于所涉及的靶基因（3, 5, 6, 12）。 使用转基因NSE-的tTA ×tetOP-ΔFOSB 小鼠，其中ΔFosB表达可在成年动物的NAc和背侧纹状体中选择性诱导（13），我们检测了ΔFosB表达对NAX中H3K9me2和KMTs的可卡因调节的影响。 ΔFosB过表达足以降低H3K9me2的水平（图1D）和G9a表达式（图.1E），从而模仿重复可卡因的影响。 相反，ΔFosB并未降低该脑区的GLP表达，并且对SUX39H1和EZH2（H3K9和H3K27的主要三甲基化酶）没有影响（图.S4）。 为了使用独立的ΔFosB过表达系统确认这些数据，野生型成体小鼠接受双侧NAc内注射表达GFP或ΔFosB的腺相关病毒（AAV）载体。 病毒介导的ΔFosB过表达降低了该脑区G9a表达水平（图.1E).
G9a的这种显着和特异性调节促使我们研究在NAc神经元中特异性地改变G9a表达是否调节对可卡因的行为反应。 野生型小鼠接受NAc内注射表达GFP或G9a的HSV载体，然后使用无偏的可卡因条件性位置偏爱范例进行分析，其提供药物奖赏的间接测量。 在行为测试后证实了G9a在NAc神经元中的病毒过表达（图2A）。 与过表达GFP的动物相比，G9a过表达显着降低了对可卡因的偏好（图2B），并增加NAc中的H3K9me2水平（图2C）。 过量表达G9a（G9aH1093K）的催化死亡突变体（14）不影响可卡因偏好（图2B）并且对这个大脑区域的H3K9me2水平没有影响（图2C).
为了进一步研究G9a在可卡因的行为影响中的作用，更具体地说是模仿可卡因诱导的NAX中G9a表达的重复抑制，成人G9aFL / FL 老鼠 （14）接受NAc内注射表达Cre重组酶或GFP的AAV载体作为对照。 NAX中G9a的AAV-Cre敲低，经免疫组织化学证实（图.S5），显着增加可卡因在调理实验中的作用，并降低NAc中的H3K9me2水平（图2D，E）。 市售药物抑制剂G9a和GLP，BIX01294（15–16），用于确定酶抑制是否同样影响对可卡因的行为反应。 实际上，G9a和GLP的药理学抑制显着增加了对可卡因的偏爱并降低了NAc中的H3K9me2（图2F，G).
重复给予可卡因可增加NAc中型多刺神经元上树突棘的密度（17），与兴奋性谷氨酸能突触到这些神经元的功能变化相关的过程（18–19）和敏感的药物行为反应（17, 20). 因此，我们假设重复可卡因对NAc中G9a活性的下调可能介导可卡因调节NAc神经元树突棘密度的能力。 使用染色质免疫沉淀（ChIP）和抗G9a抗体，我们在NAc中鉴定了几个推定的G9a基因靶标，每个靶标都与可卡因诱导的树突可塑性有关（图3A）（20–26）。 我们发现重复使用可卡因可显着降低这些基因启动子的G9a结合以及H3K9me2的水平（图3B）。 相反，急性可卡因给药迅速将G9a募集到这些相同的基因启动子中，与急性剂量可卡因后NAc 9小时内观察到的G1a表达增加一致（图.S6）。 尽管GXNUMXa在特定基因启动子上的结合与其表达的变化相关，但仍然不清楚这些事件是否由NAc中G9a的全球水平改变和/或急性后G9a募集的差异介导。 与 重复的可卡因管理。
基于G9a对NAc中许多可塑性相关基因的调节，我们直接检查了在重复可卡因治疗后维持G9a在该脑区域中的表达是否足以阻断可卡因诱导的树突棘形成。 使用之前证明的可卡因治疗方案促进NAc中的树突棘诱导（20），我们检查了注射HSV-GFP或HSV-G9a的动物的脊柱密度。 与先前的研究结果一致，我们观察到可卡因治疗后NAc中树突棘密度显着增加，这种效应被G9a过度表达完全阻断（图3C）。 单独的G9a过表达不足以在不存在可卡因的情况下降低NAc树突棘密度。 为了补充这些数据，G9aFL / FL 小鼠接受NAV内注射HSV-Cre并定量脊柱密度，并与不存在可卡因的接受HSV-GFP的动物进行比较。 敲除G9a表达显着增加NAc中型多刺神经元的脊柱密度（图3C).
鉴于有证据表明重复可卡因后NAX中的G9a下调是由ΔFosB介导的，我们接下来检查了这种转录因子是否同样参与了NAc树突棘的调节。. 虽然ΔFosB以前没有与这种树突可塑性因果关联，但它的一些靶标，包括Cdk5和NFκB亚基，已经如此牵连 (20–23), 并且ΔFosB在NAc神经元中的持续表达与重复可卡因治疗后增加的树突棘密度相关 (27）。 首先，我们发现在没有可卡因的情况下诱导转基因小鼠中的ΔFosB，其下调G9a和H3K9me2的表达（图1D，E），G9a与许多可塑性相关基因的结合减少，其中许多基因也被证明是ΔFosB本身的直接靶标（图3D）（3, 6). 我们接下来表明，在基础条件下，NAc中ΔFosB的病毒过表达显着增加了树突棘密度， 与重复使用可卡因后观察到的相似（图.3E). 相反，ΔJunD（一种拮抗ΔFosB转录活性的显性失活突变蛋白）在NAc中的过表达阻断了重复可卡因增加NAc中树突棘形成的能力。 (图3C).
我们观察到ΔFosB调节NAc中的G9a表达，并且ΔFosB和G9a调节一些相同的靶基因，导致我们检查ΔFosB和G9a之间的其他相互作用。 急性可卡因后，当G9a水平升高时，G9a与细胞结合 FOSB 基因增加，而在反复可卡因后，当G9a表达被抑制时，G9a与之结合 FOSB 基因减少（图3A）。 没有观察到重复可卡因后这种降低的G9a结合 的c-fos， 重复可卡因增加G9a结合的地方（图.S7）。 这与以下事实是一致的 FOSB, 的c-fos 被慢性精神兴奋剂暴露抑制而非诱导（5）。 在转基因小鼠中ΔFosB过表达足以显着降低G9a与细胞的结合 FOSB 基因 （图3D）。 此外，G9a过表达足以减少重复可卡因给药后ΔFosB表达的增加（表S4). 这些数据表明自动调节环，其中G9a最初通过急性可卡因给药限制ΔFosB的诱导。 然而，当ΔFosB在重复药物暴露下累积时，它抑制G9a，从而加强其自身的进一步诱导。
总之，我们已经证明NAc中的组蛋白赖氨酸甲基化在调节响应可卡因的神经元基因表达中起关键作用。 重复使用可卡因后抑制G9a和H3K9me2可部分地通过已知调节树突可塑性异常形式的众多基因的转录激活来促进可卡因偏好。 通过这些机制更好地了解受调控的基因将提高我们对药物成瘾的复杂生物学基础的认识，并有助于开发更有效的成瘾性疾病治疗方法。
材料和方法
动物和治疗
除非另有说明，否则在恒定温度（12℃）下，将小鼠每笼饲养4至5只，每个笼子具有7小时光/暗循环（从00开灯：7 AM至00：23 PM）。 随意 获得水和食物。 所有动物方案均由IACUC在UT西南医学中心和西奈山医学院批准。
对于可卡因实验[免疫组织化学，蛋白质印迹，定量PCR（qPCR），微阵列分析和染色质免疫沉淀（ChIP）]，使用8-至10-周龄雄性C57BL / 6J小鼠。 动物每天注射“生理盐水”（7治疗生理盐水，腹腔注射），“急性”可卡因（6治疗生理盐水+一种治疗20 mg / kg可卡因-HCl，ip）或“重复”可卡因（7治疗20 mg / kg）可卡因-HCl，ip）。 在最终处理后的1小时或24小时处死小鼠。 对于微阵列研究，动物每天用“生理盐水”（15治疗生理盐水，腹腔注射），“急性”可卡因（14治疗生理盐水+ 1治疗20 mg / kg可卡因-HCl，ip），“重复+急性”可卡因（ 7治疗生理盐水+ 8治疗20 mg / kg可卡因-HCl，ip）或'反复停药+急性'可卡因（7治疗20 mg / kg可卡因-HCl + 7治疗生理盐水+ 1攻击治疗20 mg / kg可卡因-HCl， ip）并在最终处理后1小时处死。 在行为实验中，小鼠在手术后单独饲养，并如下所述用10 mg / kg可卡因-HCl进行ip处理。 对于HSV-GFP和HSV-G9a-GFP感染后的树突棘分析和微阵列验证，小鼠用“生理盐水”（5治疗盐水，ip）或“重复可卡因”（5治疗20 mg / kg可卡因-HCl，ip）治疗）在3天的过程中，因为此注射方案先前已证明在单纯疱疹病毒（HSV）转基因表达的时间范围内增加伏隔核（NAc）神经元的脊柱密度（补充参考S1）。 在最后一次治疗后4小时处死用于树突棘分析的小鼠。
为了诱导限制于NAc神经元的G9a转录物的局部缺失，我们使用了对于floxed G9a等位基因纯合的突变小鼠，其已在别处详细描述（S2）。 Cre诱导的重组产生外显子22至25框外剪接，导致无义介导的突变转录物的衰变。 我们使用与C9BL / 57J小鼠完全回交的G6a floxed小鼠。 在2年龄和7周之间用表达GFP或Cre-GFP的腺相关病毒（AAV）载体（血清型10）将小鼠立体定位注射到NAc中。 免疫组织化学分析用于验证Cre介导的重组的效率（参见 补充图S5）。 我们在手术后使用AAV注射的动物21天，因为在此时间点G9a floxed小鼠中的重组是稳定的和最大的，与已发表的报道一致（S3–S4）。 使用表达GFP，野生型G9a-GFP，催化死亡的G9aH9K-GFP或ΔJunD-GFP的HSV病毒载体类似地进行G1093a和ΔJunD过表达实验（参见 S2 有关G9a构造的开发的详细信息）。 如通过免疫组织化学观察到的那样，在手术后3天使用HSV过表达小鼠，因为在该时间点过表达是最大的。 由于HSV表达的瞬时性质和AAV表达的相当稳定的性质，HSV载体用于需要快速，短期转基因表达的实验中，而AAV载体用于需要延长转基因表达时间的实验中。 在广泛的先前研究中，已经显示两种载体仅感染注射脑区域内的神经元细胞体，而没有任何传入或传出神经元的感染。
对于使用药理学G9a / GLP抑制剂BIX01294（25 ng /μl）的行为实验，将小鼠立体植入两个皮下微型泵以及双侧引导插管到NAc中。 在植入前12小时激活小型泵，开始连续递送（0.25μl/小时）的任一载体（5羟丙基β-环糊精）或药物用于14天，在此期间进行行为评估。
对于ΔFosB过表达实验[western blotting，qPCR和ChIP]，雄性转基因NSE-的tTA ×tetOP–ΔFOSB 使用小鼠（10一周龄），由此在不存在四环素衍生物多西环素（8周除多西环素）的情况下，动物显示出强烈的纹状体限制性ΔFosB的组成型表达（S5）。 通过qPCR确认这些小鼠中的ΔFosB过表达。 使用NSE-确认结果的tTA ×tetOP–ΔFOSB 小鼠，野生型8-一周龄的C57BL / 6J雄性小鼠在NAc内用表达GFP或ΔFosB-GFP的AAV载体进行立体定位注射。 在这种情况下，使用AAV载体以确保在手术后8周的最大ΔFosB表达，允许在病毒感染的和转基因ΔFosB过表达小鼠之间进行直接比较。 在手术后8周使用qPCR确认病毒过表达（在注射部位解剖15-gauge NAc穿孔）。 过表达未用于qPCR的小鼠的AAV-GFP和AAV-ΔFosB-GFP用盐水（14处理盐水，ip）或重复可卡因（14处理30 mg / kg可卡因-HCl，ip）开始，在6周后开始手术。 最后一次治疗后的4天，用4％多聚甲醛固定脑，在振动切片机上切片并用于树突棘分析。
Western印迹分析
从使用不锈钢小鼠脑基质获得的14 mm冠状切片中取出1-gauge NAc穿孔，并在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的1 M HEPES裂解缓冲液（1％SDS）中超声处理。 10–在30％SDS凝胶上电泳18μg总蛋白质样品。 将蛋白质转移至PVDF膜并与抗-H3K9me2（小鼠单克隆，1：500），抗β-微管蛋白（小鼠单克隆，1：60,000），抗总组蛋白H3（兔多克隆，1：5,000）孵育，抗GFP（用于验证穿孔组织中的相同病毒表达）（兔多克隆，1：1000），抗H3K27me3（兔多克隆，1：500）或抗肌动蛋白抗体（小鼠单克隆，1：60,000）过夜4°C（所有膜都在5％乳或5％牛血清白蛋白中封闭）。 然后将膜与过氧化物酶标记的第二抗体（1：15,000）一起温育–1：取决于所用的一抗的60,000）并使用SuperSignal West Dura底物显现条带。 用NIH Image J软件对条带进行定量，并将H3K9me2条带标准化为肌动蛋白或β-微管蛋白和总组蛋白H3以控制相等的加载。 重复的可卡因对肌动蛋白水平没有影响（图.S8）或总组织3（图.S1）在NAc。 此外，HSV-G9a-GFP和HSV-G9aH1093K-GFP感染对NAc中β-微管蛋白的总水平没有影响（图.S8).
免疫组化
将小鼠用致死剂量的水合氯醛镇静并用4％多聚甲醛灌注，然后如前所述通过单或双免疫组织化学分析（S6）。 简而言之，将固定后的脑在室温下在30％蔗糖中孵育过夜，然后以35μm切片（用于树突棘分析的脑在不存在100％蔗糖的30μm切片上在振动切片机上切片）。 自由漂浮的NAc切片用1X PBS洗涤，封闭（3％正常驴血清，0.1％tritonX，1X PBS），然后与抗GFP（鸡多克隆，1：8000）和/或抗G9a（兔多克隆）一起孵育。 ，1：500）抗体在封闭溶液中。 将分析的树突棘的切片与兔多克隆抗GFP抗体在1：200温育。 孵育过夜后，用3X PBS将NAc切片用10分钟冲洗1分钟，然后在2X PBS封闭溶液中与Cy3和/或Cy1荧光偶联的第二抗体孵育2小时。 将用于形态学研究的切片在二抗中在室温下孵育过夜。 通过在含有DAPI（1：1）的50,000X PBS中孵育切片10分钟来实现核共染色。 再次洗涤切片，然后用乙醇脱水并用DPX固定。 所有切片均使用共聚焦显微镜成像。
RNA分离和qPCR
在Trizol中将双侧14号NAc冲头均质化，并根据制造商的说明进行处理。 用RNAesy Micro柱纯化RNA，光谱分析证实RNA 260/280和260/230配比> 1.8。 然后使用Bio-Rad iScript Kit反转录RNA。 使用SYBR Green通过qPCR定量cDNA。 每个反应均一式两份或一式三份进行，并按照之前所述的ΔΔCt方法进行分析，使用3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）作为标准化对照（S7）。 看到 补充表S5 用于mRNA引物序列。
DNA微阵列分析
将四组（每组3独立的生物学重复）用于微阵列研究，总计12微阵列。 在最后一次注射可卡因后1小时，将动物快速断头并取出脑并置于冰上。 使用15-gauge针刺取出NAc的解剖，并在干冰上快速冷冻直至提取RNA。 从每个重复的四只动物合并双侧拳，每组总共12小鼠。 如前所述进行RNA分离，微阵列处理和数据分析（S8）。 简而言之，如上所述分离和纯化RNA，并使用安捷伦生物分析仪检查其质量。 使用UT Southwestern微阵列核心的标准程序，对Illumina MouseWG-6 v2.0阵列进行反转录，扩增，标记和杂交。 将原始数据减去背景，并使用Beadstudio软件将分位数标准化。 使用GeneSpring软件分析归一化数据，并使用1.3倍变化临界值和p <0.05的严格p值临界值的显着性标准生成基因表。
出于若干原因，我们对这些数据保持高度信任。 首先，在相同条件下同时处理，处理和杀死所有动物。 同样，所有RNA和阵列处理都是同时进行的。 其次，我们对每个阵列样本进行了三次重复阵列并汇集了多个动物，从而最大限度地减少了由于个体差异和提高统计功效而产生的差异（S9）。 第三，MicroArray质量控制项目推荐用于我们研究的数据分析标准，因为这些标准已经过验证，可提供高度的站点间重现性和平台内和平台内重现性（（S10）–（S11）).
构建病毒载体
由于病毒载体插入大小的限制，将野生型G9a（G9a）或催化死亡的G9a（G9aH1093K）的编码序列亚克隆到在人类即刻早期巨细胞病毒启动子（CMV）（G1005a）控制下表达GFP的双顺反子p9 + HSV质粒中。插入大小为~3.96 kb，超过AAV-2载体的最大插入大小）。 IE4 / 5启动子驱动G9a表达式。 在EcoRI消化后，通过Klenow处理的PmeI和EcoRI消化的G1005a（来自pcDNA9）和CIP处理的p3.1 +，通过平端连接将片段亚克隆到双顺反子p1005 + HSV质粒中。 为了产生HSV-ΔJunD-GFP，使用含有EcoRI位点的引物寡核苷酸通过PCR产生侧翼为EcoRI限制性位点的ΔJunD的编码序列。 然后将PCR产物连接到p1005 +载体的EcoRI位点。 使用如所述的AAV载体通过病毒介导的基因递送实现Cre重组酶在NAc神经元中的局部表达（（S12））。 将GFP或GFP与Cre的N-末端融合物亚克隆到含有具有剪接供体受体序列和多腺苷酸化信号的CMV启动子的重组AAV-2载体中。 通过双脱氧测序确认所有载体插入。 如前所述，使用三重转染，无辅助方法产生病毒载体（（S13））。 将纯化的病毒储存在-80℃。 通过在HEK293细胞中评估的感染滴度评估病毒质量。 类似地制备AAV-ΔFosB-GFP病毒。 对于HSV-Cre，Cre表达由IRES启动子驱动，与IE4 / 5启动子相反，以最小化Cre表达并防止神经元毒性（参见 （S14） 用于病毒构建）。 在所有情况下，病毒过度表达都得到了验证 细胞/组织 和 体内， 通过qPCR，免疫组织化学证实病毒在手术后显示NAc限制性表达。
立体定向手术
在氯胺酮（100 mg / kg）/甲苯噻嗪（10 mg / kg）麻醉下，将小鼠置于小动物立体定位仪器中，并暴露颅表面。 使用三十三号注射器针以0.5μl/ min的速率将10μl病毒以1.6°角（AP + 1.5; ML + 4.4; DV-0.1）双侧输注到NAc中。 接受HSV注射的动物在手术后允许恢复2天，而用于接受AAV载体的行为测试的小鼠在进行位置调节之前允许恢复20天。 这些时间与两种载体的最大病毒介导的转基因表达的周期一致。 对于BIX01294输液，将两个迷你泵中的每一个皮下放置在鼠标背部。 通过在NAc上方钻两个小颅孔并通过从前囟输送套管（AP + 1.5; ML + 1.0; DV-5.4）来实现套管放置。 如下所述，在开始将位置调节程序开始至可卡因之前，允许小鼠从手术中恢复4至5天。
条件的地方偏好
如前所述进行地点调节程序，具有以下修改（S7）。 简而言之，在NAc内输注HSV-G3a-GFP，HSV-G9aH9K-GFP或HSV-GFP的三天后，将小鼠置于条件调节室中，该条件室由三个不同的环境组成。 对这两个条件调节室中的任何一个均表现出明显偏好的小鼠被排除在研究之外（所有动物的<1093％）。 然后平衡条件组以调整可能仍然存在的任何腔室偏压。 在随后的几天中，给动物注射盐水，并在下午限制在一个房间中10分钟，然后注射可卡因（30 mg / kg，腹腔注射），并在晚上10分钟限制在另一房间中，持续30天（两天）盐水和两个可卡因配对）。 在测试当天，将小鼠未经处理放回设备中2分钟，并进行测试以评估它们偏爱哪一边。 通过可卡因配对室中的光束中断评估对可卡因的运动反应，以确保药物治疗的有效性。 对于AAV和BIX20 CPP实验，使用了稍微修改的协议。 再次给动物注射生理盐水或可卡因（01294 mg / kg，腹膜内），并限制在特定的隔室中进行10分钟的治疗，但每天只进行一次适应30天的条件，然后在第4天进行测试（对动物进行适应性在晚上和调理治疗交替进行）。 对于所有组，评估对盐水的基线运动，以确保运动不受病毒或抑制剂治疗的影响。
静脉注射可卡因自我管理
获得在实验开始时称重230-250 g的雄性青少年Long-Evans大鼠。 将它们放置在湿度和温度受控的环境中，在12小时光照/黑暗循环中逆转（在9：00 am点亮） 随意 获得食物和水。 允许大鼠在其新环境中适应环境并在实验开始前每周处理1周。 所有程序均按照美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南进行，并获西奈山动物护理和使用委员会批准。 自我管理设备配有红外光束以测量运动行为。 如前所述进行自我管理（S15-S16），在异氟烷（2.4–2.7％）麻醉下将导管植入右颈静脉。 用0.1 ml的含10 U肝素和氨苄青霉素（50 mg / kg）的盐溶液冲洗导管。 从手术中恢复一周后，在明/暗周期的黑暗阶段开始了自我管理培训。 每天以固定的比例3（FR0.75）强化方案让动物每天1小时接触可卡因（1 mg / kg /输液），其中1次主动杠杆操作导致一次输注药物。 大鼠在6天后稳定了其可卡因的摄入量（连续15天的响应率变化小于3％，其中至少75％的患者对增强型杠杆做出了响应）。 在最后一次自我给药后24小时，大鼠迅速被斩首，大脑迅速移出并进行RNA分离和qPCR处理。
染色质免疫沉淀（ChIP）
新鲜的NAc冲头是甲醛交联的，如前所述为ChIP制备（S17-S18）稍加修改。 简言之，收集每只动物的4 14-gauge NAc穿孔（每个样品合并的5动物），用1％甲醛交联并用2 M甘氨酸猝灭，然后在-80℃冷冻。 样品超声前一天1，绵羊抗兔/小鼠（取决于沉淀抗体）通过将适当的磁珠与抗G9a（兔多克隆ChIP级）或抗H3K9me2（小鼠单克隆ChIP级）一起孵育来制备IgG磁珠。抗体在4℃下在块溶液中恒定旋转过夜。 如前所述进行组织超声和染色质剪切（（S17））。 超声处理后，将等浓度的染色质转移到新管中，并保存~5％的最终产物作为“输入”对照。 在彻底洗涤并重新悬浮缀合的珠子/抗体混合物后，向每个染色质样品中加入等体积的抗体/珠子混合物（~7.5μg抗体/样品），并在16℃下恒定旋转孵育~4小时。 进一步洗涤样品并在65℃下反向交联过夜，然后使用PCR纯化试剂盒进行DNA纯化。 DNA纯化后，对样品进行qPCR，并如前所述将其标准化为适当的“输入”对照（（S17））。 还使用小鼠多克隆抗-IgG抗体进行正常小鼠IgG免疫沉淀以控制信号放大的适当富集。 腺嘌呤磷酸核糖转移酶（APRT）用作可卡因和ΔFosB过表达实验的阴性对照。 看到 补充表S5 用于启动子引物序列。
树突棘分析
为了研究G9a在体内神经元形态调节中的作用，我们使用先前描述的方法进行以下修改（S1）。 注射HSV-GFP，HSV-G9a-GFP，HSV-ΔJunD-GFP（所有病毒用于野生型C57B1 / 6J小鼠）或HSV-Cre-GFP（用于G9a）后3天FL / FL 小鼠，当病毒表达最大时，灌注小鼠，将大脑冷冻保护，然后在振动切片机上以100μm切片。 然后如上所述使用针对GFP的抗体对切片进行免疫染色（参见免疫组织化学）。 为了评估G9a过表达和敲除对脊柱数量的影响，以及ΔJunD过表达的影响，我们测量了每个神经元的大约1-2神经突上的刺的数量，其等于来自表达GFP的NAc培养基的二级树突的至少299μm。多刺神经元（MSNs）。 鉴于MSN在形态学上与NAc中的其他神经元群体不同，以及先前的报道表明HSV主要感染在该脑区域中表达DARPP-32的神经元（（S19）），我们相信MSN在这些研究中是专门评估的。 对于每只动物，我们检查每组6-8动物中的~3-4神经元（7组），之后获得每只动物的平均值用于统计分析。 设计用于检查ΔFosB过表达对NAc脊柱密度的影响的实验与上述类似地进行，除了AAV载体用于长时间表达GFP或ΔFosB-GFP（8周）。 使用具有100X油浸物镜的共聚焦显微镜捕获所有HSV图像（用63X油浸物镜捕获AAV图像）。 使用设置为1任意单位的针孔和1024×1024帧尺寸获取图像。 使用NIH Image J软件测量树突长度，并且主要实验者盲目地计算脊柱数，因为载玻片在实验扫描之前被编码。 计算每10μm树突的平均脊柱数。
脚注
我保证手稿中没有包含任何材料 组蛋白甲基转移酶G9a在可卡因诱导的可塑性中的重要作用 以前已在其他地方出版或正在考虑中，包括在互联网上。
所有涉及动物使用的工作都是根据德克萨斯大学西南医学中心和西奈山医学院的机构和IACUC指南进行的。
参考文献和注释
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