糖皮质激素调节慢性阿片暴露在脑应激系统中引起的FosB /ΔFosB表达（2012）

公共科学图书馆之一。 2012；7(11)：e50264。 doi：10.1371/journal.pone.0050264。电子版 2012 年 21 月 XNUMX 日。

加西亚-佩雷斯 D, Laorden ML, 米兰内斯 MV, NúñezC.

来源

西班牙穆尔西亚大学医学院药理学系细胞和分子药理学组。

抽象

长期滥用药物会深刻改变压力反应系统。反复接触吗啡会导致转录因子 ΔFosB 积累，特别是在与奖赏和压力相关的大脑区域。 ΔFosB 对靶基因的持续影响可能在滥用药物引起的可塑性中发挥重要作用。 最近的证据表明，与压力相关的激素（例如糖皮质激素、GC）可能会诱导大脑压力系统的适应，这可能涉及基因表达和转录因子的改变。 本研究探讨了吗啡依赖过程中 GC 在下丘脑和下丘脑外脑应激系统中 FosB/ΔFosB 调节中的作用。为此，在对照（假手术）和肾上腺切除（ADX）大鼠中测量了 FosB/ΔFosB 的表达，这些大鼠在吗啡治疗十天后产生阿片依赖。在假手术大鼠中，慢性吗啡给药后，在所有研究的脑应激区域诱导 FosB/ΔFosB：伏核（壳）（NAc）、终纹床核（BNST）、中央杏仁核（CeA）、下丘脑室旁核核（PVN）和孤束去甲肾上腺素能细胞群（NTS-A（2））的核。肾上腺切除术减弱了在 NAc、CeA 和 NTS 中长期暴露于吗啡后观察到的 FosB/ΔFosB 产生的增加。此外，ADX 降低了 BNST、PVN 和 CeA 的 CRH 阳性神经元内 FosB/ΔFosB 的表达。在 NTS-A(2) TH 阳性神经元和 NAc 强啡肽原阳性神经元中也获得了类似的结果。这些数据表明，与压力相关的大脑区域对阿片类药物的神经适应（估计为 FosB/ΔFosB 的积累）受到 GC 的调节，支持了大脑应激激素与成瘾之间存在联系的证据。

介绍

阿片类药物，例如吗啡，是有效的镇痛剂，用于治疗多种形式的急性和慢性疼痛。然而，严重的副作用，如耐受性和戒断，会导致阿片类药物依赖并限制其使用。此外，阿片类药物（海洛因、吗啡）的非医疗用途在过去几年有所增加。越来越多的证据表明滥用药物在大脑中引起的变化涉及多种基因调控机制（包括表观遗传、分子、细胞和电路水平效应），这表明成瘾治疗的潜在治疗策略 [1]–[4].

药物滥用领域的一个核心问题是识别介导这些药物从急性作用到长期作用转变的蛋白质。 成瘾研究中特别令人感兴趣的是 Fos 转录因子家族。该家族包括 c-Fos、Fra-1 和 Fra-2、FosB 和 ΔFosB（全长 FosB 的截短剪接变体） [5]。与 Fos 家族的其他成员相比，ΔFosB 在急性给药后会在大脑中适度诱导，但由于其异常长的半衰期，它在停止用药后仍会持续数周甚至数月。因此，随着药物的反复暴露，ΔFosB 水平逐渐积累 [6], [7]，表明 ΔFosB 可能代表了一种机制，通过该机制，滥用药物在停药后很长时间内会产生基因表达模式的持久变化 [8].

据报道，反复接触可卡因、安非他明、大麻素或吗啡会导致与药物的正强化作用相关的大脑区域（例如伏隔核（NAc）、前额皮质和背侧纹状体）ΔFosB增加。这种增加被认为是一种神经适应，导致对滥用药物的敏感性增加以及容易形成成瘾特征行为 [9]–[13]。我们最近表明，长期吗啡给药后FosB/ΔFosB水平的增强不仅限于奖赏系统，还发生在大脑应激系统中（这与药物的负强化作用有关）， 以及孤束核-A₂ 去甲肾上腺素能细胞群（NTS-A₂，支配应激神经回路的主要去甲肾上腺素能系统） [14]。与这些发现一致的是，几种形式的慢性压力也会在 NAc 和其他大脑区域诱导 ΔFosB [15], [16].

成瘾是一种复杂的疾病，因为许多因素导致这种神经系统疾病的发展和维持。其中一个因素是压力，它与毒瘾的特定方面有关 [17]–[21]。下丘脑-垂体-肾上腺（HPA，主要内分泌应激通路）轴和下丘脑外应激系统（包括扩展的杏仁核和 NTS-A）₂）因长期服用具有依赖性潜力的药物而失调 [14], [22]. 此外，在压力刺激和急性接触滥用药物后，HPA 轴反应相似 [23], [24], 促肾上腺皮质激素释放激素 (CRH)、促肾上腺皮质激素 (ACTH) 和糖皮质激素 (GC) 释放升高. T他的反应有助于适应急性环境变化，但也可能导致慢性压力条件下的行为病理，例如成瘾和抑郁 [25]。研究尚未检验 GC 与吗啡依赖诱导的脑应激系统中 FosB/ΔFosB 诱导之间的关系。因此，我们评估了连续给予吗啡后脑应激相关区域GC对FosB/ΔFosB表达的影响。为了解决这个问题，我们首先检查了双侧肾上腺切除术 (ADX) 对吗啡依赖大鼠应激系统主核中 FosB/ΔFosB 免疫反应性 (IR) 的影响。

大脑应激系统的活动是由许多神经递质/神经调节剂介导的。 CRH 是调节应激系统活动的主要神经肽，人们推测它对先前存在的吸毒成瘾脆弱性和后来的复发脆弱性都有贡献 [26]。该此外，大量的工作支持了 NTS-A 的重要性₂ 药物成瘾过程中大脑应激系统的神经支配以及去甲肾上腺素 (NA) 作为调节该神经回路的神经递质的关键作用 [27]。最后，大量证据表明，在急性和慢性给药过程中，纹状体和杏仁核中的强啡肽表达被激活 [28]。鉴于这些事实，本研究的以下目的是确定 GC 对吗啡依赖期间大脑应激系统特定人群中 FosB/ΔFosB 表达的作用。

结果演示

肾上腺切除术对吗啡依赖大鼠体重增加以及血浆 ACTH 和皮质酮浓度的影响

在进行免疫检测分析之前，我们评估了吗啡长期治疗的功效。为此目的，在颗粒植入当天和宰杀当天（第10天）记录动物的重量。双向方差分析揭示了肾上腺切除术对体重增加的显着主效应 [F(1,47)=13.24，p=0.0007), 吗啡治疗 [F(1,47)=281.05，p<0.0001] 以及 ADX 和吗啡治疗之间的相互作用 [F(1,47)=4.13，p=0.0479]。根据之前的调查结果 [29], [30], 事后分析表明，假手术组和 ADX 组对吗啡的依赖均表现出显着的 (p<0.001) 较低的体重增加 (−13.75±5.0 g, n=12； 3.84±2.45克，n=13，分别）比在接受安慰剂颗粒的假手术和 ADX 动物中观察到的结果（44.58±1.7 g，n=12； 49.57±2.4克，n=12，分别），这是由于在这些动物中观察到的食物摄入量减少 [29].

为了检查肾上腺切除术的效果，测量了血浆中的激素浓度。双向方差分析检查肾上腺切除术和吗啡对 ACTH 和皮质酮血浆浓度的影响显示肾上腺切除术的显着主效应 [ACTH: F(1,18)=68.12，p<0.0001；皮质酮：F(1,45)=10.42，p=0.0023）。正如纽曼所预料的那样事后测试表明（图.S1) 安慰剂 (n=6)- 和吗啡 (n=4)-ADX大鼠血浆ACTH浓度较高(p<0.001）与评估的两种治疗的假手术动物（安慰剂，n=6；和吗啡，n=6). ADX-安慰剂之间的血浆皮质酮浓度没有观察到变化（n=14) 和 ADX-吗啡 (n=13) 治疗大鼠。 ADX-吗啡治疗大鼠的皮质酮浓度显着（p<0.01) 低于假吗啡组 (n=10) 治疗大鼠。与假安慰剂组相比，假吗啡组没有观察到显着变化（n=12）。

肾上腺切除术不同程度地减弱吗啡依赖引起的脑应激系统子区域中的 FosB/ΔFosB

在对照动物（植入安慰剂的大鼠）中，在与压力相关的大脑系统的所有区域中都发现了 FosB/ΔFosB-IR 的弱组成型表达。长期吗啡治疗导致所有研究的大脑区域都出现 FosB/ΔFosB。在 NAc(shell) 中，双向方差分析显示肾上腺切除术的显着主效应 [F(1,16)=6.44，p=0.0220]和长期吗啡治疗[F(1,16)=19.98，p=0.0004]。纽曼-科伊尔斯的事后测试表明（图2A-E）在吗啡治疗的大鼠中，FosB/ΔFosB 表达显着增加（p<0.01）。在吗啡依赖性 ADX 大鼠中，NAc 中 FosB/ΔFosB 蛋白表达显着降低（p<0.05）。 BNST 的双向方差分析显示长期吗啡治疗的主效应显着 [F(1,16)=48.92，p<0.0001]。事后分析显示增加 (p<0.001）在假和 ADX 吗啡依赖性动物中的 FosB/ΔFosB 中，表明 FosB/ΔFosB 的调节与慢性吗啡暴露有关，与 GC 浓度无关（图2F-J）。 CeA 中 FosB/ΔFosB 的双向方差分析显示肾上腺切除术的显着影响 [F(1,15)=20.51，p=0.0004]和吗啡预处理[F(1,15)=27.52，p<0.0001]。事后测试显示，与假安慰剂大鼠相比，假吗啡大鼠的 FosB/ΔFosB 水平显着增加 (p<0.01)，而 ADX 吗啡依赖组的 FosB/ΔFosB 水平减弱 (p<0.01)。图2K-O）。此外，ADX 安慰剂颗粒大鼠的 FosB/ΔFosB 水平低于假安慰剂组 (p<0.01)。

肾上腺切除术差异性地调节大脑应激系统中 FosB/ΔFosB 蛋白的表达。

双向方差分析检查肾上腺切除术和吗啡对 PVN（小细胞细分）中 FosB/ΔFosB 表达的影响，揭示吗啡治疗的显着效果 [F(1,16)=16.31，p<0.0001]。事后分析表明显着（图3A-E) 增加 (p<0.05）在来自假手术和 ADX 吗啡治疗的大鼠的 PVN 中的 FosB/ΔFosB-IR。在 NTS-A 中₂ 儿茶酚胺能细胞组，双向方差分析揭示吗啡治疗的主要作用[F(1,11)=76.33，p<0.0001]。事后分析表明显着（图3F-J) 与假安慰剂组相比，假吗啡组大鼠的 FosB/ΔFosB-IR 增加 (p<0.001），在 ADX 吗啡依赖组中减弱（p<0.05）。

肾上腺切除术对 PVN 和 NTS-A 中 FosB/ΔFosB 蛋白表达的影响₂ 来自吗啡依赖的大鼠。

慢性吗啡暴露会诱导 PVN、BNST 和 CeA 中的 CRH 神经元表达 FosB/ΔFosB。糖皮质激素的影响

BNST 中 FosB/ΔFosB 阳性/CRH 阳性神经元的双向方差分析显示肾上腺切除术的主要影响 [F(1,20)=64.43，p<0.0001] 以及肾上腺切除术和吗啡治疗之间的显着相互作用 [F(1,20)=6.80，p=0.0169]。在 PVN 中，双向方差分析显示肾上腺切除术的显着主效应 [F(1,19)=11.35，p=0.0032]。 CeA 中 FosB/ΔFosB 阳性/CRH 阳性神经元的双向方差分析显示肾上腺切除术的显着主效应 [F(1,20)=106.85，p<0.0001]，吗啡治疗 [F(1,20)=7.33，p=0.0136]以及肾上腺切除术和药物预处理之间的显着相互作用[F(1,20)=7.07，p=0.0151]。数字4, ，5，5, ,66 显示来自假手术或 ADX 对照和吗啡依赖大鼠的 BNST、PVN 和 CeA 切片的代表性图像。事后分析表明，在 BNST 中发现大量 FosB/ΔFosB 阳性神经元共同表达 CRH（p<0.01; 图.4E), PVN (p<0.05; 图.6E) 和 CeA (p<0.01; 图.6E）在假吗啡大鼠中与假安慰剂组相比。此外，与假手术动物中的相应治疗相比，ADX 安慰剂颗粒大鼠和吗啡依赖大鼠中共表达 CRH 的 FosB/ΔFosB 阳性神经元数量在三个细胞核中显着较低，如图所示数字4, ，5，5, ,66 （BNST：p<0.01 与假手术加安慰剂相比； p<0.001 vs. 假手术加吗啡； PVN：p<0.05 与假手术加安慰剂相比； p<0.001 vs. 假手术加吗啡； CeA：p<0.001 对比假手术加安慰剂和对比假手术加吗啡）。

肾上腺切除术减弱了 BNST CRH 阳性神经元中 FosB/ΔFosB 蛋白的表达。

肾上腺切除术减弱了 PVN CRH 阳性神经元中 FosB/ΔFosB 蛋白的表达。

肾上腺切除术拮抗 CeA CRH 阳性神经元中的 FosB/ΔFosB 蛋白表达。

在 BNST 水平上，CRH 阳性神经元数量的双向方差分析表明 ADX 具有主效应 [F(1,20)=103.92，p<0.0001] 以及慢性吗啡 [F(1,20)=4.35，p<0.05]。如图所示表1, 纽曼-科伊尔斯事后测试显示，ADX 安慰剂组和吗啡颗粒组大鼠的 CRH 神经元含量低于假安慰剂组或吗啡依赖组（p<0.001）。在 PVN，双向方差分析显示肾上腺切除术具有显着效果 [F(1,19)=11.35，p=0.0032]。 CeA 水平上总 CRH 神经元的双向方差分析揭示了 ADX 的显着影响 [F(1,20)=240.09，p<0.0001] 以及 ADX 和慢性吗啡之间的主要相互作用 [F(1,20)=4.49，p=0.0467]。表1 描绘了 ADX 安慰剂或吗啡治疗的大鼠 CeA 处的 CRH 神经元显着减少。表1 还表明，慢性吗啡暴露会导致 CRH 阳性神经元 BNST 和 CeA 水平升高（p<0.05）。

表 1. 在安慰剂或吗啡颗粒动物中，肾上腺切除术对 BNST、PVN 和 CeA 中的 CRH 阳性神经元、NAc 中的 pro-DYN 阳性神经元和 NTS 中的 TH 阳性神经元数量的影响。

肾上腺切除术对 NAc(Shell) 中 DYN 阳性神经元 FosB/ΔFosB 的影响

我们观察到慢性吗啡暴露后，NAc（壳）中共表达 FosB/ΔFosB 的 pro-DYN 阳性细胞数量没有显着变化（图。 7）关于安慰剂组。 NAc（壳）中 FosB/ΔFosB 阳性/pro-DYN 阳性神经元的双向方差分析显示 ADX 的主要影响 [F(1,19)=10.11，p=0.0049]。如图所示图7C，在 ADX 吗啡依赖性大鼠中共表达 pro-DYN 的 FosB/ΔFosB 阳性神经元数量显着（p<0.05) 低于假手术动物的相应治疗。如图所示表1, ADX 未诱导 NAc(壳) 的总 pro-DYN 细胞发生变化。

肾上腺切除术对吗啡依赖大鼠的 NAc(shell) pro-DYN 阳性神经元和 NTS TH 阳性神经元中 FosB/ΔFosB 蛋白表达的影响。

肾上腺切除术抑制吗啡依赖性诱导的 FosB/ΔFosB 进入 NTS-A 中的 TH 阳性神经元₂ 去甲肾上腺素能细胞群

NTS-A 中 FosB/ΔFosB 阳性/TH 阳性神经元的双向方差分析₂ 显示 ADX 的主效应 [F(1,15)=64.86，p<0.0001]，吗啡治疗 [F(1,15)=29.62，p<0.0001]，肾上腺切除术和吗啡治疗之间存在显着的相互作用[F(1,15)=19.24，p=0.0005]。纽曼-科伊尔斯事后测试表明，发现大量 FosB/ΔFosB 阳性神经元在 NTS 中共表达 TH（p<0.001; 图7F）在假吗啡大鼠中。此外，ADX 吗啡依赖大鼠中共表达 TH 的 FosB/ΔFosB 阳性神经元数量显着降低（p<0.001）与假手术动物中的相应治疗相比，如图所示图7F。另一方面，如图所示表1, ADX 没有诱导 NTS 中总 TH 阳性神经元的变化。

讨论

目前的结果首次表明，大脑 GC 信号以区域特异性方式调节慢性吗啡给药诱导的大脑应激系统中的 FosB/ΔFosB 表达。

综合证据表明，压力会增加成瘾行为的风险 [18]。持续的应激刺激会改变应激相关途径（例如CRH、GC、NA等）的合成、表达和信号传导。此外，滥用药物会影响应激途径，从而导致基因表达的改变，并对奖励和应激相关分子产生信号传导作用 [31]。压力和滥用药物都有能力触发中枢神经系统内神经元激活的重叠模式，从而导致立即基因表达的激活。

据广泛描述，成瘾物质和慢性应激刺激会增加参与其正强化作用的主核中转录因子 ΔFosB 的表达 [12], [13], [32], [33]，并且有人提出，ΔFosB 对靶基因的持续影响可能在成瘾特征适应的发展中发挥重要作用 [9], [34]。然而，对于长期滥用药物后大脑应激系统中 ΔFosB 的表达或吗啡引起的 ΔFosB 在应激相关区域积累的分子机制知之甚少。

在本研究中，我们研究了 GC 对吗啡诱导的激素应激系统（HPA 轴）中 FosB/ΔFosB 表达的参与，该系统由 PVN 中的 CRH 以及下丘脑外应激系统（包括扩展的杏仁核； [35]），由 CRH 和其他应激相关系统（包括 NA 和强啡肽）介导； [19]).

我们最近证明，长期吗啡给药 7 天会增加扩展杏仁核、PVN 和 NTS-A 中的 FosB/ΔFosB 表达₂ [14]。与这些数据一致，目前的结果表明，长期吗啡给药引起 CeA、BNST 和 NAc（壳）以及 PVN 和 NTS-A 中 FosB/ΔFosB 的增加₂。杏仁核的扩展与药物奖励有关。事实上，所有主要的滥用药物都会激活从 VTA 到 NAc（壳）和 CeA 的多巴胺能传递。滥用物质的这种激活和随之而来的积极强化作用已被证明与 GC 对位于 VTA 的 GR 的作用有关 [28]。我们的结果支持了这一假设，表明 NAc（壳）和 CeA 中的 FosB/ΔFosB-IR 在 ADX 动物中减弱，这可能表明吗啡依赖过程中 AP-1 转录因子和 GR 之间存在串扰 [36]。与观察到的 ADX 对 NAc 和 CeA 中 FosB 表达的影响相反，目前的结果表明，长期吗啡以不依赖 GC 的方式增加 PVN 和 BNST 中 Fos/ΔFosB 的表达。

大脑应激系统的几种神经递质，如 CRH、NA 和 DYN，与成瘾过程的厌恶状态特征有关 [35], [37]–[39]。目前的研究结果表明，慢性吗啡暴露会引起 BNST、CeA 和 PVN 中含有 CRH 的神经元内 Fos/ΔFosB 表达显着增加。 Fos 转录因子家族可以作用于环 AMP 响应元件 (CRE) 位点 [40]. 大量证据表明 ΔFosB 可以充当转录抑制子或激活子 [40], [41]。 ĝ鉴于 CRH 基因在其启动子序列中具有 CRE 基序，因此可能提出 CRH 神经元中 FosB/ΔFosB 的积累可以介导吗啡诱导的 CRH 水平变化，正如可卡因效应所报道的那样 [42]，特别是在 CeA 和 BNST 中，我们首次报告吗啡依赖期间 CRH 阳性神经元数量增加。长期服用吗啡后，CeA 中 CRH mRNA 水平增加支持了这一假设 [43]。然而，长期吗啡治疗后，PVN 中 CRH 阳性神经元的数量没有变化。这些结果与之前的研究结果一致，即慢性吗啡暴露不会引起 PVN CRH hnRNA 的变化 [44]。由于 PVN CRH 表达被 GC 下调 [45]，并鉴于目前的工作和其他 [29], [44] 研究表明，长期阿片类药物暴露不会改变皮质酮的释放，因此长期服用吗啡不会改变 CRH 细胞的数量似乎是合乎逻辑的。

外周给予皮质酮可增加 CeA 和 BNST 中 CRH mRNA 的表达 [46], [47]。此外，ADX 降低了 CeA 中的 CRH 表达 [48], [49]。因此，我们观察到吗啡依赖期间 BNST 和 CeA 中 CRH 神经元数量的增加在肾上腺切除后被消除。鉴于 ADX 动物中吗啡依赖性期间 CRH 神经元内 Fos/ΔFosB 的增加减弱，这可能表明 Fos/ΔFosB 在扩展杏仁核中 GC 调节 CRH 表达中发挥作用。另一方面，众所周知GC负向调节PVN中CRH基因的表达 [45]。与此一致的是，目前的数据清楚地表明，肾上腺切除术消除了含有 CRH 的神经元在吗啡依赖性过程中 Fos/ΔFosB-IR 的增加。

在这项研究中，免疫化学数据显示，长期吗啡治疗显着增加了 NTS-A 中 Fos/ΔFosB 的染色₂，随着 ADX 的增加而减少。当我们检查表达 FosB/ΔFosB 的特定神经群体时，我们发现 TH（儿茶酚胺合成中的限速酶）阳性神经元内 Fos/ΔFosB-IR 急剧增加。 NA 已被证明在成瘾中起主要作用 [50]。在之前的工作中，慢性吗啡暴露引起 NTS-A 中 TH 水平的增强₂ [14], [29]。已知TH基因的启动子中有一个AP-1位点 [51]。我们的结果可能表明 FosB/ΔFosB 参与阿片类药物诱导的 NTS-A 中 TH 水平的增加₂。脑干去甲肾上腺素能细胞群表达高水平的GC受体（GR）。研究表明，GC 在去甲肾上腺素能神经传递中具有许可作用 [29], [30], [52]。因此，GR拮抗剂的施用影响NA活性的几个方面，包括TH激活和神经元活性 [30]。目前的结果表明，ADX 后，NTS-A 中表达 FosB/ΔFosB 的 TH 阳性细胞减少₂。考虑到肾上腺切除术阻止了 NTS-A 中 TH 蛋白水平的增加₂ 吗啡依赖期间 [29]，并且在 TH 基因启动子中描述了 GRE/AP-1 位点 [53]，我们的数据可能指出 ΔFosB 作为 GC 对 NTS-A 去甲肾上腺素能活性影响的调节剂₂ 在鸦片依赖期间。

DYN 被认为是 ΔFosB 的可能靶基因 [54], [55]。我们的结果表明，慢性吗啡暴露并没有显着改变 NAc(shell) 中表达 pro-DYN 的神经元内的 FosB/ΔFosB 表达。）。关于 DYN 表达的 ΔFosB 调节，Zachariou 等人 [33] 据报道，ΔFosB 过度表达小鼠的 NAc 中 DYN mRNA 水平小幅但显着降低，因此推测该转录因子抑制 DYN 表达。鉴于我们的结果是在蛋白质水平获得的，根据我们的数据，不能得出结论：慢性吗啡通过 FosB/ΔFosB 活性改变 DYN 表达。

据推测，DYN/kappa 阿片类药物系统似乎会诱发涉及厌恶因素的促抑郁状态。 这种厌恶反应可能涉及与 NAc、DA 和下丘脑外 CRH 系统的相互作用 [35]。然而，对于 GC 对 NAc 中 DYN 表达的可能调节知之甚少。 有人提出，NAc 中的 ΔFosB 部分通过抑制 DYN 表达，增加对吗啡和可卡因奖励效应的敏感性，并导致对压力的恢复 [9], [33]。鉴于 ADX 大鼠 NAc 中 FosB/ΔFosB/pro-DYN 阳性神经元的数量减少，我们的数据支持 GC 在调节中皮质边缘 DA 系统介导的吗啡的正增强作用中的作用。这些效应可能由 GR 直接介导，GR 存在于整个中脑边缘奖赏通路中，或者通过 CRH 投射间接介导，CRH 投射由 CeA 和/或 BNST 向 VTA 和 NAc 产生，而 ADX 大鼠在吗啡依赖期间这些作用未激活。

总之，本研究提供的证据表明，慢性吗啡暴露后，GC 关键参与大脑应激系统中 FosB/ΔFosB 的积累，这可能导致应激相关区域基因表达模式的持久变化。目前的研究结果还表明，FosB/ΔFosB 可能导致阿片依赖期间大脑应激系统可塑性的 GC 依赖性变化。需要进一步的研究来确定慢性阿片类药物在选定的应激相关区域诱导 FosB/ΔFosB 的细胞内机制，以及 GC 抑制吗啡诱导的 FosB/ΔFosB 表达的机制。

方法

材料

皮质酮和胆固醇购自 Sigma Chemical Co.（美国密苏里州圣路易斯）。皮质酮颗粒由 Márton Vajna 博士（匈牙利布达佩斯 Semmelweis 大学药房管理系）制作。吗啡碱（Alcaliber Laboratories，马德里，西班牙）或乳糖（对照）的丸剂在药剂学和制药技术系（西班牙格拉纳达药学院）制备。戊巴比妥购自 Hospira（Hoofddorp，荷兰）。盐酸氯胺酮和赛拉嗪购自 Labs。梅里亚（法国里昂）和实验室。 Calier（西班牙巴塞罗那）。

动物

雄性 Sprague-Dawley 大鼠（实验开始时体重为 220-240 克；Harlan，巴塞罗那，西班牙）在到达房间后被成对圈养在笼子中（长，45 厘米；宽，24 厘米；高，20 厘米）控制温度 (22±2°C) 和湿度 (50±10%)，可自由获取水和食物（Harlan Teklad 标准啮齿动物饲料；Harlan Interfauna Ibérica，西班牙巴塞罗那）。在实验开始前 12 天，动物适应标准的 08 小时明暗周期（开灯：00 小时 20 分钟 – 00 小时 7 分钟）。所有手术和实验程序均按照 24 年 1986 月 86 日欧洲共同体理事会指令 (609/300305440012/EEC) 进行，并得到当地动物研究委员会的批准 (REGA ES1201)。该研究得到了穆尔西亚大学生物伦理委员会 (RD 2005/2009) 和西班牙科学与技术部 (SAF/FEDER 07178-XNUMX) 的批准。

肾上腺切除术

对大鼠进行双侧肾上腺切除术并植入皮质酮颗粒以确保低但稳定的 GC 水平 [29]。在 90 mg/kg 盐酸氯胺酮和 8 mg/kg 赛拉嗪 (ip) 麻醉下，通过背侧途径对大鼠进行双侧肾上腺切除术 (ADX)，并在手术时皮下 (sc) 植入缓释皮质酮颗粒。选择类固醇颗粒的成分（25 毫克皮质酮加 75 毫克胆固醇），以在植入后 20 天内提供与昼夜节律最低点相对应的稳定皮质酮浓度 [56]。使用皮质酮替代（ADX 加皮质酮）的 ADX 大鼠不会出现攻击诱导的血浆皮质酮增加 [56]。手术后，ADX加皮质酮大鼠可以自由选择饮用等渗盐水（0.9% NaCl），以补充因肾上腺切除术而导致醛固酮损失的钠消耗。对照大鼠接受相同的手术程序（假手术），但不摘除肾上腺。假手术组和 ADX 加皮质酮大鼠在吗啡依赖手术前允许从手术中恢复 5 天。通过皮质酮和 ACTH 的血浆浓度以及 ADX 动物的尸检证实双侧肾上腺切除术成功。

药物治疗和实验程序

手术后五天，在乙醚轻度麻醉下，给大鼠皮下植入两颗 75 毫克吗啡颗粒。对照大鼠接受含有乳糖的安慰剂颗粒。该程序已被证明可以在植入颗粒后几小时开始产生一致的血浆吗啡浓度，并在急性注射阿片拮抗剂后产生完全戒断综合征 [57]。植入颗粒后 24 小时即可产生对吗啡的依赖性，并在 15 天内保持稳定 [58]。植入吗啡或安慰剂丸剂十天后，处死大鼠。研究 HPA 轴活性（皮质酮和 ACTH 的血浆浓度）、FosB/ΔFosB 表达、CRH 表达、DYN 表达、TH 表达以及 CRH-、DYN- 和 TH 阳性神经元中 FosB/ΔFosB 表达的四个实验条件是： (i) 假安慰剂； (ii) 假吗啡； (iii) ADX-安慰剂； (iv) ADX-吗啡。在治疗期间检查大鼠的体重增加，以确保吗啡从颗粒中正确释放，因为众所周知，长期吗啡治疗会因热量摄入减少而导致体重增加减少 [29].

脑灌注和切片

用过量的戊巴比妥（100 mg/kg ip）深度麻醉大鼠，并用盐水经心灌注，然后用含有多聚甲醛的固定剂（4 M 硼酸盐缓冲液中的 0.1% 多聚甲醛，pH 9.5）进行灌注。取出灌注的大脑后，将它们在相同的固定剂中后固定 3 小时，并在 4°C 下保存在含有 10% 蔗糖的 PBS 中，直到在冷冻切片机（Leica，Nussloch）上切下冠状切片（30 µm 厚）。，德国）。 Paxinos 和 Watson 的地图集 (2007) [59] 用于识别大鼠不同脑区：NAc(shell)、BNST、PVN、CeA 和 NTS-A₂ (图1）。将切片冷冻保护并保存在-20°C直至使用。

冠状切片示意图，显示 NAc（壳）、BNST、CeA、PVN 和 NTS 中计算 FosB/ΔFosB 阳性核的脑区域（矩形） [59].

FosB/ΔFosB 免疫组织化学

按照 Núñez 等人的描述，对切片进行免疫组织化学处理 [29]。简而言之，用 0.3% H 封闭后₂O₂ 和 2% 正常山羊血清（Sigma，美国）组织切片在初级抗 FosB/ΔFosB 抗血清（兔多克隆，#sc-48，Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA，USA；1 [比] 1000）。本研究中使用的一抗不区分 FosB 及其稳定剪接变体 ΔFosB。重复暴露于 FosB 诱导刺激已被证明可使急性 FosB 诱导性脱敏 [15], [40], [60]. 因此，吗啡预处理和未预处理大鼠中 FosB/ΔFosB 染色之间的差异可以解释为主要反映了 ΔFosB 积累的差异。通过传统的抗生物素蛋白-生物素-免疫过氧化物酶方案（Vectastain ABC Elite Kit；Vector Laboratories，Burlingame，CA，USA）对抗原进行可视化。 3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB；Sigma，美国）用硫酸镍铵强化反应。将切片固定在铬明胶包被的载玻片上，脱水并盖上盖玻片。

FosB/ΔFosB 免疫反应性细胞核和 CRH、TH 和 DYN 阳性神经元的双标记免疫组织化学

对于 FosB/ΔFosB-TH 双标记，使用 DAB 镍强化处理来自每个治疗组中每只大鼠的组织切片以检测 FosB/ΔFosB 免疫反应性，然后仅使用 DAB 显色剂显示 TH。如前所述进行 FosB/ΔFosB 免疫染色。 FosB/ΔFosB 染色后，切片在 PBS 中漂洗，用 2% 正常山羊血清处理，然后与兔多克隆抗 TH 抗体（AB152，Chemicon，USA；1 [比] 6000）在室温下。遵循上述相同的免疫组织化学程序。 TH 抗体-过氧化物酶复合物是在 DAB 中开发的。将切片安装在铬明胶包被的载玻片上并盖上盖玻片。

对于 FosB/ΔFosB-CRH 和 FosB/ΔFosB-pro-DYN 双标记，过程与之前针对 FosB/ΔFosB-TH 描述的过程相同。为了检测 NAc 中表达 DYN 的神经元，应用抗原修复程序，在封闭程序之前将脑切片在柠檬酸盐缓冲液（10 mM 柠檬酸，0.05% Tween 20，pH 6.0）中于 60°C 孵育 20 分钟。初级抗 CRH 兔抗血清由 Wylie W. Vale（The Salk Institute，La Jolla，CA，USA）友情提供，并在 1 时使用。 [比] 500°C 72 稀释 4 小时。 pro-DYN 一抗购自 Neuromics（# GP10110, Neuromics, Edina, MN, USA）并稀释 1 [比] 2000（72 小时，4°C）。

图像分析

通过连接至摄像机（DFC4000，Leica）的 Leica 显微镜（DM 290B；Leica）捕获图像。使用计算机辅助图像分析系统（QWIN，Leica）对 FosB/ΔFosB 阳性细胞核进行计数。 NTS-A 的边界₂、BNST、CeA、NAc（壳）和 PVN 的小细胞细分被勾画出来，并记录了阳性剖面的数量。在每只大鼠的四到五个切片中对感兴趣的细胞组范围内的 FosB/ΔFosB 核分布的数量进行双边计数，并取平均值以获得每只大鼠的单个值。为了避免观察者偏差，所有切片均由盲法研究者进行量化。不同大脑区域的总计数表示为平均值±SEM。

TH、CRH 和 DYN 阳性细胞的定量以及 FosB/ΔFosB 双染色图谱

使用与上述相同的常规光学显微镜检测 FosB/ΔFosB 免疫反应性的阳性核，并在 x40 放大倍数下计数。 FosB/ΔFosB 阳性 CRH、TH 或 DYN 细胞被鉴定为具有棕色胞质沉积物的细胞，其 CRH 阳性、TH 阳性和 DYN 阳性染色，以及 FosB/ΔFosB 的蓝色/深色核染色。将方形区域 (195 µm) 叠加在捕获的图像上以用作参考区域。在每只动物的 PVN、BNST 和 CeA（CRH 神经元）、NTS（TH 神经元）和 NAc（DYN 神经元）中的四到五个切片中，对双边观察到的双标记神经元的数量进行计数。没有可见细胞核的 CRH、TH 和 DYN 阳性细胞（FosB/ΔFosB 阴性 CRH、TH 或 DYN 细胞）也包括在分析中。

放射免疫分析

将血液收集到含有 5% EDTA 的冰冷管中，然后离心（500 g; 4℃； 15 分钟）。分离血浆，分成两等份并储存在-80°C直至检测皮质酮或ACTH。使用大鼠特异性皮质酮和 ACTH 抗体对皮质酮和 ACTH 的血浆浓度进行定量（[¹²⁵I]-CORT 和 [¹²⁵I]-ACTH RIA； MP Biomedicals，奥兰治堡，纽约州，美国）。该测定的皮质酮灵敏度为 7.7 ng/mL，ACTH 灵敏度为 5.7 pg/mL。

统计分析

数据以平均值±SEM 表示，并使用 GraphPad Prism 统计软件包（美国加利福尼亚州圣地亚哥）进行分析。通过以治疗（安慰剂、吗啡）和手术（假手术、ADX）作为自变量的双向方差分析（ANOVA）对数据进行分析。纽曼-科伊尔斯事后测试用于个体组比较。 ap<0.05 的差异被认为是显着的。

支持信息

图S1

肾上腺切除术 (ADX) 对对照组和吗啡治疗动物血浆 ACTH (A) 和皮质酮 (B) 浓度的影响。 手术 ADX 增加了安慰剂和吗啡治疗大鼠的 ACTH 水平，而吗啡治疗大鼠的血浆皮质酮浓度则降低。数据代表用安慰剂或吗啡预处理10天的大鼠血浆ACTH和皮质酮水平的平均值±SEM。 ***p<0.001 与假安慰剂相比； ⁺⁺p< ^{+ + + +}p<0.001 与假吗啡相比。

（TIF）

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致谢

我们感谢 Semmelweis 大学（匈牙利布达佩斯）的 Márton Vajna 博士和 Anna Földes 博士准备皮质酮颗粒。

资金声明

这项工作得到了以下赠款的支持：Ministryio de Ciencia e Imnovación (SAF/FEDER 2009-07178 和 SAF/FEDER 2010-17907)，西班牙； Red de Trastornos Adictivos（RD06/0001/1006 和 RD06/0001/1001），西班牙； Fundación Séneca，Agencia Regional de Ciencia y Tecnología Región de Murcia (15405/PI10)，西班牙。 DG-P 得到科学与创新部 (AP2009-2379) 奖学金的支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备中没有任何作用。

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