伏隔核中DeltaFosB的过度表达模仿了保护性成瘾表型,但没有模仿环境富集的保护性抑郁表型(2014)

PMCID:PMC4148937

抽象

环境富集在大鼠中产生保护性成瘾和抑郁表型。 ΔFosB是一种调节大脑奖赏的转录因子,由心理压力和滥用药物诱导。 然而,ΔFosB在环境富集的保护性表型中所起的作用尚未得到很好的研究。 在这里,我们证明ΔFosB在分离条件(IC)饲养的大鼠中与富集条件(EC)中响应束缚应激或可卡因的大鼠相比受到差异调节。

慢性应激或慢性可卡因治疗均提高了IC大鼠伏隔核(NAc)中的ΔFosB蛋白水平,但由于在EC条件下已经观察到ΔFosB的基础积累已经升高,因此不会提高EC大鼠的ΔFosB蛋白水平.

病毒介导的ΔFosB在配对大鼠的NAc壳中的过表达(即,独立于环境富集/分离)增加了在饥饿驱动下对蔗糖的操作响应,但在饱食动物中降低了响应。 此外,ΔFosB过表达减少可卡因自我给药,增加可卡因寻求的消退,并减少可卡因诱导的静脉注射可卡因自我给药的恢复; 所有行为发现均与富集表型一致.

然而,相反,在几种焦虑和抑郁相关行为的测试中,ΔFosB过表达并未改变配对大鼠的反应。

因此,ΔFosB在 NAc shell模仿 保护性成瘾表型,而不是环境富集的保护性抑郁表型。

关键词: [增量]FosB,环境富集,抑郁症,可卡因自我管理,腺相关病毒(AAV),过度表达

介绍

生活经历,特别是在生命的早期阶段,对整个生命中的动物行为产生深远的影响。 环境在人类的脆弱性和对精神障碍的抵抗中起着至关重要的作用(Elisei等, 2013; Akdeniz等人, 2014; 加藤和岩本, 2014; van Winkel等人, 2014). 在啮齿动物模型中,据报道,从断奶到成年期的年轻人生活在一个丰富的环境中会产生保护性成瘾和抑郁表型 (格林等人, 2002, 2003, 2010; 拉维奥拉等人, 2008; Solinas等人, 2008, 2009; El Rawas等人, 2009; Thiel等人, 2009, 2010)。 在这种范例中,动物被分配到富集条件(EC),其中动物被分组饲养并且每天可以获得新物体,或者分离动物被单独饲养而没有新奇或社交接触的孤立条件(IC)。 在富含条件下饲养的动物,包括社会接触,运动和新奇,在静脉注射药物自我管理范例中表现出较少的强化和寻求可卡因或安非他明 (格林等人, 2002, 2010). 除了成瘾表型之外,这种暴露于富集在抑郁症的动物模型中产生抗抑郁样作用 (格林等人, 2010; Jha等人, 2011)。 具体而言,富集动物在蔗糖偏好测试中表现出减少的快感缺乏样行为,在社交相互作用测试中减少社交退缩,并且在强迫游泳测试(FST)中表现出较少的不动性。 尽管富集具有抗成瘾和抗抑郁作用,但这些保护环境富集表型的机制仍未得到充分了解,尽管我们之前的研究已经暗示转录因子CREB在伏核中的活性降低(NAc)。 )调解环境富集的一些影响 (格林等人, 2010; 拉森等人, 2011)。 因此,这些差别饲养研究的目标是使用基础科学方法来确定弹性的分子机制,以后可以将其转化为临床。 这种方法在环境上等同于完善的遗传策略,如选择性育种(McBride等, 2014).

在这里,我们关注另一种转录因子ΔFosB,它通过某些形式的应激或几乎所有滥用药物(包括可卡因,吗啡,酒精,尼古丁和安非他明)在NAc中显着诱导(Hope等, 1992; Kelz和Nestler, 2000; Perrotti等人, 2004, 2008)。 作为转录因子,ΔFosB与Jun家族蛋白(优选JunD)二聚化,形成活性AP-1复合物,其与AP-1反应元件结合以增强或抑制其靶基因的转录(Nestler, 2001虽然新的研究表明ΔFosB也可以作为同型二聚体(Wang等, 2012)。 ΔFosB蛋白是截短的剪接方差 FOSB 基因,导致ΔFosB蛋白缺乏两个C末端degron结构域,阻止ΔFosB蛋白快速降解FosB和所有其他Fos家族蛋白。 因为ΔFosB在NAc中非常稳定,所以与其他Fos蛋白相比,ΔFosB对急性与慢性刺激的反应的作用非常不同。 随着反复暴露于滥用或应激的药物,ΔFosB蛋白逐渐积累并持续数天至数周,而FosB和其他Fos蛋白仅在短时间内(小时)被诱导并在随后暴露时产生减毒诱导(Nestler等, 2001; 内斯特勒, 2008).

ΔFosB的重要性不仅在于它被滥用和压力的药物高度诱导,而且已经证明对大脑中ΔFosB的操纵会影响动物的行为。 在成年小鼠的强啡肽中型刺状神经元中选择性诱导ΔFosB可增加对急性和重复可卡因的反应的运动敏感性,以及在条件性位置偏好范例中对可卡因的有益响应以及自我管理范例中的强化 (Kelz等人, 1999; Kelz和Nestler, 2000; 科尔比等人, 2003).

尽管已经对环境富集的大鼠详细描述了保护性成瘾和抑郁表型,但ΔFosB在介导这些保护性表型中的可能作用尚未得到充分评估。 先前对环境富集的研究表明,与标准环境(SE)相比,富集环境增加小鼠纹状体区D1和D2中型多刺神经元的基础ΔFosB水平。 (Solinas等, 2009; Lobo等人, 2013). 此外,与SE大鼠相比,富集的Wistar大鼠在NAc和前额叶皮质中显示ΔFosB阳性细胞升高,提示ΔFosB可能在尼古丁的保护性成瘾表型中起作用。 (Venebra-Muñoz等人, 2014). 此外,在整个小鼠纹状体中过度表达ΔFosB会增加每日轮的运行,这可能类似于富集环境中大鼠活动的增加。 (Werme等, 2002).

在目前的研究中,我们假设:(1)环境富集会增加NAc中基础ΔFosB水平的积累; 和(2)ΔFosB的这种积累将有助于环境富集的保护作用。

材料和方法

动物

为了环境富集,将雄性Sprague-Dawley大鼠(Harlan,Houston,TX,USA)从出生后第21天至51随机分配至EC或IC壳。 将EC大鼠分组饲养(每笼20)在大型金属笼(70×70×70 cm)中,其具有几个硬塑料物体(儿童玩具,塑料容器,PVC管等)。 这些对象被新对象替换,并且每天重新排列成新的配置。 将IC大鼠单独圈养在标准聚碳酸酯笼中。 在整个实验期间大鼠保持在这些条件下,并且在51天龄之后(即,至少30天的富集/分离)开始所有行为测试和生化测试。 对于ΔFosB的过表达,获得雄性Sprague-Dawley大鼠(Harlan,Houston,TX,USA),大小为225-250 g,并且在用立体定向注射腺相关病毒载体(AAV2)之前配对饲养在标准聚碳酸酯笼中。用绿色荧光蛋白(GFP)过表达ΔFosB或仅用GFP作为对照(见下文)。 除行为测试和食物调节外,所有大鼠均可自由获得标准大鼠食物和水。 在实验动物护理评估和认可协会(AAALAC)批准的菌落中,将所有大鼠维持在受控环境(温度,22°C;相对湿度,50%;和12 h光/暗循环,在600 h上点亮)中。 。 所有实验均符合NIH实验动物护理和使用指南以及德克萨斯大学医学分会机构动物护理和使用委员会。

环境丰富是一种复合操纵,包括新奇,社会接触和锻炼。 配对住房提供社交联系,因此代表EC(参见NIH指南)。 因此,对于具有新颖性,社交接触和锻炼的病症的适当对照组将是没有新颖性,社交接触或锻炼的组,IC条件。 IC大鼠显示出比EC大鼠更少的慢性应激迹象。 具体而言,EC大鼠肾上腺增大(Mlynarik等, 2004),CORT反应迟钝(Stairs et al。, 2011),减弱立即早期基因诱导(Zhang等,准备中的手稿)和ΔFosB积累(Solinas等, 2009; Lobo等人, 2013),所有慢性压力的迹象(Crofton等,综述)。

心理压力

将富集和分离的大鼠置于60分钟的1分钟的一次性软塑料啮齿动物抑制剂(DecapiCone,Braintree Scientific Inc.,MA,USA)中9天(急性)或30天(重复)。 对于短期暴露mRNA测试,在最后一段约束应激开始后,将5大鼠(每组30大鼠)断头12 min,提取大鼠脑并解剖NAc用于mRNA分析。 对于免疫组织化学,用盐水和4%多聚甲醛灌注4大鼠,提取脑,在20%多聚甲醛中后固定,并在1xPBS中以4℃储存在40%甘油中。 用冷冻切片机以24μm切割大鼠脑。 在最终应激后收获脑XNUMX h以使全长FosB蛋白降解(Perrotti等, 2008).

静脉注射可卡因自我管理与环境富集

静脉导管植入

使用氯胺酮(100 mg / kg IP)和甲苯噻嗪(10 mg / kg IP)麻醉大鼠,并插入Silastic导管并固定在颈静脉中,离开动物背部的皮肤。 每天导管注入0.1 ml含有肝素(30.0 U / ml),青霉素G钾(250,000 U / ml)和链激酶(8000 IU / ml)的无菌盐水溶液,以防止感染并在整个持续时间内保持导管通畅。实验。

可卡因自我管理与环境丰富

将20只富集的和20分离的大鼠置于操作室30×24×21 cm(Med-Associates,St。Albans,VT)中,并允许按压杠杆输注可卡因(0.5 mg / kg /输注,NIDA药物供应,美国北卡罗来纳州研究三角研究所(National Triangle Institute,NC,USA)或生理盐水,固定比率为1(FR1),每天2 h,总共14天。 为了维持EC和IC组之间相似的可卡因摄入量,每次会话最多输注30。 组织处理能力仅限于30样本,因此来自每组的最低响应大鼠未进行处理,留下8的Ns用于可卡因,7用于盐水组。 因此,EC和IC大鼠之间的总可卡因摄入量或输注时间没有EC / IC差异。 在最后一次自我给药期开始后,将大鼠脑提取3 h,并解剖NAc用于mRNA和蛋白质分析。 NAc的一侧用于Western印迹,另一侧用于qPCR。

非特遣队可卡因管理与环境浓缩

与以前发表的文献直接比较(Hope et al。, 1994; 陈等人, 1995),EC(N = 12)和IC大鼠(N 对于12天(急性)或20天(重复),腹膜内(IP)注射生理盐水或1 mg / kg可卡因= 9)。 在处理过程中丢失了一个EC样本。 急性组在8天接受盐水注射和在9天注射一次可卡因,以便所有大鼠接受相同数量的注射。 在最后一次注射后脑中提取30 min并解剖NAc用于mRNA分析。

使用qPCR定量mRNA

通过在RNA STAT-60(Teltest,Friendswood,TX)中匀浆提取RNA,使用氯仿从DNA和蛋白质中分离RNA,并用异丙醇沉淀总RNA。 除去污染的DNA(TURBO DNA-Free,Life Technologies,CA,USA),将纯化的RNA的5 ug逆转录成cDNA(SuperScript III First Strand Synthesis:Invitrogen目录号#18080051)。 使用定量实时PCR(SYBR Green:Applied Biosystems,Foster City,CA)在Applied Biosystems 7500快速热循环仪上定量ΔFosBmRNA,其中引物设计为仅检测ΔFosB(正向:AGGCAGAGCTGGAGTCGGAGAT;反向:GCCGAGGACTTGAACTTCACTCG)并归一化至设计的引物。检测大鼠GAPDH(正向:AACGACCCCTTCATTGAC;反向:TCCACGACATACTCAGCAC)。 在实验之前验证所有引物并分析其特异性和线性(Alibhai等, 2007).

免疫印迹

将来自可卡因或盐水自我给药的EC和IC大鼠的NAc的右侧在含有蔗糖,Hepes缓冲液,氟化钠,10%SDS和蛋白酶和磷酸酶抑制剂的缓冲液中均质化(Sigma-Aldrich:P-8340,P) -2850,P-5726)。 使用Pierce BCA Protein Assay Kit(Thermo Scientific,IL,USA)评估蛋白质浓度。 因为从一只大鼠提取的蛋白质不足以进行分析,所以将来自相同组的2样品合并在一起,产生每组的4样品。 将蛋白质样品在95°下变性5 min并在10-20%聚丙烯酰胺梯度凝胶(Criterion TGX,Bio-Rad Laboratories,CA,USA)上运行,然后转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Millipore,MA,USA)。 )。 用印迹级阻断剂(脱脂奶粉)封闭膜,与ΔFosB一抗(兔,1:1000,#2251,Cell Signaling Technology,MA,USA)和β-肌动蛋白一抗(小鼠,1:1000)一起孵育。 ,Cell Signaling Technology,MA,USA),用TBST洗涤,然后与荧光二抗(驴抗兔(780 nm),驴抗小鼠(680 nm),1:15000,Li-Cor Biosciences,NE一起孵育,美国)。 然后对Western印迹进行成像(Odyssey,Li-Cor Biosciences,NE,USA),并用Odyssey软件定量蛋白质水平。

免疫组化

对于图 Figure11 (N = 3),观察含有ΔFosB的细胞,并通过用DAB(DAB过氧化物酶底物试剂盒,Vector Laboratories,CA,USA)染色的NAc切片中的ΔFosB的免疫组织化学标记计数。 提取大脑,固定后,冷冻保护并在滑动冷冻切片机(Leica Biosystems,IL,USA)上切片成含有NAc的40μm切片。 在用1%正常山羊血清(Jackson ImmunoResearch,PA,USA)用3%triton和抗生物素蛋白D(Vector Laboratories,CA,USA)封闭之前,切片保持漂浮并用内源过氧化物酶猝灭之前用0.3xPBS漂洗。 将NAc切片与FosB一抗孵育过夜(1:1000,Santa Cruz Biotechnology,Dallas,TX,USA),其具有3%山羊血清,0.3%triton,1xPBS和生物素溶液(Vector Laboratories,CA,USA)。 尽管该抗体同时识别FosB和ΔFosB,但先前的Western印迹研究表明,在刺激后的24 h,绝大多数免疫组化信号由ΔFosB组成,因为FosB在24 h之前很好地降解(Perrotti等, 2008)。 洗涤后,将切片与生物素化的山羊抗兔二抗IgG(Vector Laboratories,CA,USA),山羊血清和1xPBS一起温育。 然后,将切片与抗生物素蛋白 - 生物素复合物(ABC)过氧化物酶染色剂一起孵育15 min(Thermo Scientific,IL,USA)。 最后,安装切片,使用乙醇和CitriSolv(Fischer Scientific,MA,USA)脱水,并用DPX(Fisher Scientific)盖上盖玻片。 对于细胞计数,从每只动物的Bregma + 1.80至+ 1.44取样切片。 从每只大鼠的核心和壳的四个NAc切片计数ΔFosB免疫阳性细胞的总数。

图1  

压力和 [增量]EC和IC大鼠的FosB。 (广告) 代表性免疫组织化学DAB染色的ΔFosB在NAc壳和IC的核心(AB)和EC(CD)老鼠(BD)和没有(AC)重复压力(N 3)。 (E) 定量 ...

腺病毒相关病毒过度表达 [增量]FOSB

基于AAV2的载体,表达ΔFosB和人源化海肾GFP(hrGFP; Winstanley等, 2007, 2009a,b)或hrGFP控制载体(N 每只10 =双侧注射到大鼠NAc中。 由于没有IC人类,因此通过证明ΔFosB的作用,使用配对饲养的大鼠代替IC大鼠进行本研究以增加与科学界的相关性 独立 EC / IC范例。 表达hrGFP但不过表达ΔFosB的AAV用作对照。 ΔFosB的表达 体内 通过用FosB一抗(1:200,Rabbit,Cell Signaling Technology,MA,USA)进行免疫荧光染色来验证。 使用坐标将AAV载体双侧注射到NAc壳中(1μl/侧超过10 min)(AP = 1.7, L = 2.0, D = -6.5)。 在立体定向手术后数周,行为测试开始了3。 在行为测试结束后,通过免疫组织化学确定准确放置。

蔗糖新恐怖症

ΔFosB过表达大鼠(N = 10)和对照大鼠(N = 8)在行为测试开始前一周处理1。 为了测试焦虑样行为,评估大鼠的新恐怖症至新味(蔗糖)。 将大鼠分成单独的笼子,并在1600 h下除去水。 在大鼠的正常“自来水”水中用标准大鼠水瓶装填1%w / v蔗糖溶液并称重,然后在1800 h下放置在每个笼子上。 在30分钟后,取出瓶子并重新称重,并计算试验前后蔗糖瓶重量的差异。 然后,在笼子上更换蔗糖另外的2天,以使大鼠在蔗糖偏好测试之前熟悉蔗糖的风味。

高架加迷宫

在蔗糖新恐怖症后2天测试了焦虑样行为的另一个测试,即高架十字迷宫(EPM)。 EPM在一个新颖和焦虑的环境中测量载体修饰的探索行为(Green等, 2008)。 测量12×50 cm的两个闭合臂和两个开放臂(Med Associates Inc.,VT,USA)在地板上方75 cm并且在每个臂的入口处具有光束。 使用Med-PC软件通过光束破裂监测在开放臂上花费的时间为5 min。

冷应激引起的排便

在EPM后的第二天,使用了第三次焦虑测试:对轻度压力环境(冷)的排便。 将聚碳酸酯小鼠笼(33×17×13 cm)在冰上预冷却10 min。 将大鼠置于冰上的笼中30 min,并且每5 min记录粪便boli的数量。

社交联系

在第二天,使用社交互动测试测量抑郁样行为。 在测试之前将大鼠分离24 h。 在测试当天,将大鼠置于具有其笼子配偶的新环境(塑料容器,45×40×45 cm)中,并且行为被记录为30 min的视频。 由对大鼠状况无视的研究者测量这对大鼠彼此相互梳理的时间量。

蔗糖偏好

在社交接触后,蔗糖偏好测试被用作快感缺乏的模型。 配对饲养的大鼠在1600小时与食物分离但不允许在2 h下接触水。 在1800 h,将两个预先称重的水瓶放在每个笼子上,一个装有水,另一个装有1%蔗糖水溶液。 将水瓶置于正常位置,同时将蔗糖放置在大约10 cm处。 取出瓶子并在15分钟后重新称重。

运动活动

在蔗糖偏好后三天,通过将大鼠置于透明的有机玻璃室(40×40×40 cm)中,用一层薄层床垫,在两个4×4光束基质周围放置一个4 cm,在正常光照条件下评估自发活动。地面和地面上方一个16厘米记录水平行走和垂直(饲养)活动。 通过改进的开放场活动系统(San Diego Instruments,CA,USA)监测光束断裂的2 h。

强迫游泳测试

最后一次自发行为测试是FST,一种对抗抑郁药敏感的模型。 将大鼠置于填充有约14 L室温(24±0.5°)水的Plexiglas圆筒中,在会话15上1 min,并在第二天在5会话上2 min。 将大鼠干燥并放回其家笼中。 记录游泳活动并且由不知道条件的研究者确定会话1的第一个不动期(2 s)和总时间不动的潜伏期。

蔗糖操作反应

对照AAV大鼠和ΔFosB过表达大鼠在85天内调节至自由进食体重的7%。 所有大鼠在1连续几天的FRNNUMX强化训练计划中训练以压制蔗糖颗粒(Bio-Serv,NJ,USA)。 然后在15天给大鼠自由获取食物,并再次以FR5方案对3分钟进行棒压制备蔗糖颗粒,这次是1%游离饲料重量。

可卡因自我管理

获得

导管手术后一周(如上所述),将所有大鼠(7对照大鼠和10ΔFosB过表达大鼠,一只对照大鼠从导管手术中丢失)置于操作室30×24×21 cm(Med-Associates,St。 Albans,VT)并允许在0.2天内每次2 h自行施用4 mg / kg /输注单位剂量的可卡因; 然后按照FR0.5计划,3 mg / kg /输注1天。 每次输注通过0.01以5.8 ml的体积静脉内递送。 通过照射20的两个提示灯发出输液信号,这标志着超时时间,在此期间不能再进行输注。

灭绝

因为慢性可卡因暴露可能会诱导对照大鼠ΔFosB的积累,这会导致两种载体条件下的大鼠在脑中都具有高水平的ΔFosB,大鼠被限制在其家笼中4天而没有自我给药以允许ΔFosB蛋白水平在对照载体大鼠中降低。 在4天禁欲后,将大鼠置于操作室中并允许在FR1方案下自行给予盐水而不是可卡因,连续1天3时间。

固定比例剂量反应

允许每只大鼠(对照和ΔFosB过表达)每天以FR0.00325方案以递增的顺序自我施用0.0075,0.015,0.03,0.06,0.125,0.25,0.5,1mg / kg /输注可卡因,连续5天。 大鼠自我给予每剂可卡因30分钟。

可卡因诱导的复原

大鼠经历了会话内恢复程序。 大鼠在FR0.5方案中接受1 mg / kg /输注60 min,然后消除3 h(具有可能的可卡因提示)。 接下来他们接受了IP注射(Green等, 2010)对于每只大鼠的0恢复期,随机顺序的五种剂量之一(2.5,5,10,20或5 mg / kg)的可卡因。 会议的最后一个3 h阶段是恢复响应,再次使用可卡因提示,但仍然没有可卡因输注。 在每次可卡因诱导的恢复期后,大鼠在FR2时间表上接受0.5干预天数的高剂量(1 mg / kg /输注)可卡因,用于2 h,以维持跨疗程的高响应率。 在可卡因自我管理过程中,一些大鼠的导管逐渐失去通畅; 因此,在该分析中使用6对照大鼠和7ΔFosB过表达大鼠的数据。

统计分析

进行双向方差分析(ANOVA)和双向重复测量方差分析以比较四个治疗组,并使用计划的比较来比较条件之间的差异。 使用学生分析仅两个条件之间的显着性 t-测试。 所有 t测试数据通过了Shapiro-Wilk的常态测试。 所有数据均表示为平均值±SEM。 统计显着性设定为 p <0.05。 所有用于单个实验的富集大鼠都被关在一个笼子里,但被当作单独的对象对待,这暗示了潜在的假复制问题。

成果

EC大鼠显示出更高的基础水平 [增量]NAc中的FosB比IC大鼠

与IC大鼠相比,EC大鼠在NAc核心中具有显着更高数量的ΔFosB阳性细胞(t(4) = -3.31, p <0.05)和外壳 (t(4) = -6.84, p <0.05)(数字 1A,C,E,F), 表明与IC大鼠相比,EC大鼠的ΔFosB基础音高。 此外,Western印迹结果显示,与IC盐水大鼠相比,NAc中具有更高基础水平的ΔFosB蛋白的EC盐水大鼠具有强烈趋势(t(6) = -2.03, p = 0.089; 数字 Figure2A)2A)使用双尾测试。 然而,鉴于图中表达的增加 1A-F 和其他论文中的增加(Solinas等, 2009),我们对此有信心。 Western印迹结果也证实,通过免疫组织化学检测的几乎所有FosB样免疫反应性都是ΔFosB而不是FosB,这在24 h时是不可检测的。

图2  

可卡因和 [增量]EC和IC大鼠的FosB。 (A-B) 平均ΔFosB蛋白 (A) 和mRNA (B) IC和EC大鼠在生理盐水或可卡因自我给药14天后的NAc水平(±SEM)(N = 7-8)。 面板a中的红色条带表示 ...

[增量]通过应激在EC和IC大鼠中差异诱导FosB

两种壳体中重复的束缚应力具有显着的主要影响(F(1,8) = 16.6, P <0.005)和核心(F(1,8) = 7.9, P <0.05)的NAc和壳中环境富集的主要作用(F(1,8) = 22.3, P <0.005; 数字 1A-F)。 更重要的是,应力和环境富集之间的相互作用在两个壳中也是显着的(F(1,8) = 25.6, P <0.01)和核心(F(1,8) = 6.7, P <0.05)。 这种相互作用使得在反复施加约束压力后,IC大鼠的ΔFosB阳性细胞数量显着增加,而在反复应力后的EC大鼠中,该数量没有变化。

为了进一步研究ΔFosB如何通过急性与重复应激动态调节,并与之前的研究进行比较(Alibhai等, 2007),诱导ΔFosB 基因 研究了急性和反复的束缚应激(图 (Figure1G).1G)。 压力有显着的主要影响(F(2,24) = 31.9, P <0.001)和环境富集(F(1,24) = 5.1, P <0.05)。 在IC大鼠中,急性束缚应激后强烈诱导了ΔFosBmRNA。 然而,在反复的压力下,与急性诱导相比,ΔFosBmRNA的诱导显着减弱。 也有重大的互动(F(2,24) = 4.6, P <0.05),表明与IC大鼠相比,EC大鼠的ΔFosBmRNA急性诱导程度更低。 因此,EC大鼠具有较高的ΔFosB基础水平 蛋白质 在NAc中,但ΔFosB较少 基因 诱导响应急性应激源。

[增量]在EC和IC大鼠的NAc中,可卡因差异诱导FosB

为了确定EC和IC大鼠对可卡因的反应是否不同,我们研究了可卡因自我给药后大鼠NAc中ΔFosB蛋白和mRNA的调节(图 2A,B 分别)。 Western blot显示可卡因具有显着的主要作用(F(1,12) = 24.9, P <0.001)和显着的相互作用(F(1,12) = 5.5, P <0.05)。 相互作用使得IC大鼠的ΔFosB增加幅度大于EC大鼠(图 (Figure2A).2A). 事实上,可卡因自我给药后ΔFosB蛋白水平显着升高 仅由 在IC大鼠中。 关于mRNA水平,qPCR结果也显示可卡因的显着主要作用(F(1,26) = 47.1, P <0.001)和环境富集的主要作用(F(1,26) = 13.8, P <0.005)。 尽管EC大鼠的总体水平较低,但两组均增加了ΔFosBmRNA(图 (Figure2B2B).

尽管蛋白质数据支持最初的假设,但它是从图中假设的 Figure1G1G EC老鼠表现得更少 基因 诱导比上述可卡因实验中的分离大鼠,这没有发生,可能是因为图 Figure1G1G 利用30最小时间点,可卡因实验使用3 h时间点。 为了进一步询问mRNA假说,30最小时间点用于探索急性和重复可卡因治疗,作为与图的更好比较 Figure1G.1G。 因为急性可卡因自我给药本质上是有问题的(即,获得性学习),EC和IC大鼠被给予重复的非偶然可卡因IP注射的急性或9天(20 mg / kg)。 正如假设的那样,环境富集具有显着的主要影响(F(1,17) = 14.3, P <0.005),但可卡因治疗的主要作用(F(2,17) = 3.4, P = 0.057)和互动(F(2,17) = 3.4, P = 0.055)仅通过双尾测试显示出强劲的趋势。 但是,鉴于我们有图中的方向假设 Figure1G,1G我们认为EC大鼠比IC大鼠表现出更少的诱导,我们感到非常舒服(图 (Figure2C2C).

过度表达 [增量]NAc壳中的FosB模拟保护性富集诱导的成瘾表型

为了研究ΔFosB对大鼠行为的影响而不依赖于环境富集/分离(即,使这些结果与非EC / IC研究更相关),使用腺相关病毒(AAV)在NAc中双侧过表达ΔFosB。非富集的双圈大鼠。 根据我们之前的研究,NAc壳对控制抑郁症和药物摄取/寻找行为最敏感,因此在本研究中将AAV载体注射到NAc壳中(Green等, 2006, 2008, 2010)。 数据 3A,B 图1显示了ΔFosB的代表性免疫组织荧光,其中对照载体(图A;即内源ΔFosB表达)和NAc壳中的ΔFosB过表达载体(图B)。

图3  

过度表达 [增量]NAc壳中的FosB模拟环境富集的保护性成瘾表型。 (A-B) 用于hrGFP对照的ΔFosB的代表性免疫组织化学 (A) 和ΔFosB-过表达 (B) AAV矢量。 ...

验证滴度后, 体内 表达和病毒载体的一般放置,我们首先研究了ΔFosB在焦虑模型中的过表达的影响。 NAc壳中ΔFosB的过度表达不足以再现蔗糖新恐怖症和冷应激诱导的排便范例中环境富集的致焦虑作用。 (数据未显示)。 另外,对EPM没有影响(数据未显示)。 因为环境富集在大鼠中产生抗抑郁样作用,我们接下来对ΔFosB过表达的大鼠进行抑郁相关测试。 与焦虑模型类似,结果显示在蔗糖偏好测试,社会交互测试或FST中过量表达NAc壳中的ΔFosB不足以减少抑郁样行为。 (数据未显示)。

在环境富集范例中,EC大鼠表现出比IC大鼠更低的基础运动活性(Bowling等, 1993; 保龄球和巴尔多, 1994; 史密斯等人, 1997; 格林等人, 2003, 2010)。 为了研究过表达ΔFosB在NAc壳中的作用,测试了120 min的自发运动活性。 使用双尾检验结果显示NAc壳中过量表达ΔFosB导致大鼠基础运动活性降低的强烈趋势(图 (Figure3C; 3C; t(16) = 1.84, p = 0.084)。 尽管双尾检验不具有统计学意义,但这些数据仍然很有趣,因为它们符合我们基于Green等人的明确定向假设。 (2010),这与环境浓缩的效果是一致的。

I与抑郁和焦虑模型相反,NAc壳中ΔFosB的过表达能够在多种成瘾/强化范例中产生类似EC的表型。 一世在蔗糖颗粒操作自我试验中,ΔFosB过表达与大鼠饥饿动机之间存在显着的相互作用(F(1,16) = 7.4, P <0.01)。 在NAc壳中过表达ΔFosB的大鼠明显摄取 更多 蔗糖颗粒在饥饿动机条件下(即85%游离饲料体重),但在低动力条件下颗粒较少(即100%游离饲料重量;图 Figure3D),3D),完全模仿EC表型(Green等, 2010).

在环境富集范例中,EC大鼠在消退和可卡因诱导的恢复中表现出减少的可卡因寻求行为 (格林等人, 2010). 因此,使用静脉内可卡因自我给药范例在表达ΔFosB的大鼠中测量可卡因摄取和寻求行为。 作为一种渴望的模型,可卡因灭绝范例揭示了NAc壳中ΔFosB的过度表达减少了寻求药物的行为r(F(1,15) = 6.7, P <0.05; 数字 Figure3E).3E)。 会话也有重要的主要影响(F(2,30) = 74.0, P <0.001)。 对于根据FR1时间表进行的维护响应,剂量有很大的主要影响(F(7,105) = 222.6, P <0.001)和显着的相互作用(F(7,105) = 2.3, P <0.05)的可卡因累积摄入量。 相互作用的性质是,仅在较高剂量的可卡因上差异才明显(图 (Figure3F).3F)。 最后,在可卡因诱导的恢复中,剂量有显着的主要影响(F(4,44) = 15.5, P <0.001)和使用双尾检验(ΔFosB过表达的主要效应的趋势)(F(1,11) = 4.1, P = 0.067)。 然而,考虑到Green等人的定向假设。 (2010)和图中统计上显着和一致的结果 3D,E,F,ΔFosB可能会减少恢复(图 (Figure3G).3G)。 对于表达ΔFosB的大鼠,10 mg / kg剂量的响应显着较低。 结果总体上表明,大鼠NAc壳中过量表达ΔFosB会降低可卡因摄取和寻找行为,这与环境富集的行为影响一致。

讨论

个人对成瘾和抑郁的脆弱性受到环境因素的严重影响。 环境富集是一种操纵动物生存环境的范例,对许多精神疾病产生保护作用。 ΔFosB在调节多个脑区的奖赏功能中起关键作用,包括NAc和背侧纹状体(Koob等, 1998; 明智的, 1998; 华莱士等人, 2008; Grueter等人, 2013; Pitchers等人, 2013). 在这个项目中,我们研究了富集和分离大鼠中约束应激和可卡因对ΔFosB的动态调节。 该项目的主要发现是:

(与IC大鼠相比,1)EC大鼠在基线时NAc中具有升高的ΔFosB水平;

(2)只有IC大鼠在重复应激下积累额外的ΔFosB蛋白;

(3)EC大鼠在应激或可卡因后显示ΔFosBmRNA的减弱诱导; 和

(4)在对大鼠的NAc中过表达ΔFosB模拟保护性成瘾表型,但不模仿保护性抑郁表型。

人们可能对已发表的文献有所期待,这些文献表明转基因ΔFosB过表达小鼠对低剂量药物的可卡因奖励和自我给药的敏感性增加(Kelz等人, 1999; 科尔比等人, 2003; Vialou等人, 2010; Robison等人, 2013), 在当前实验中ΔFosB过表达的大鼠将显示出增加的可卡因自我施用和寻求的倾向。 I然而,在目前的实验中,在NAc壳中过量表达ΔFosB减少了在消退和恢复期间可卡因的摄入和可卡因寻求,表明可卡因的动机减少。 差异可能是由于转基因小鼠在整个纹状体中表达ΔFosB,但仅在强啡肽+细胞中表达。 (Colby等, 2003). 在目前的实验中,ΔFosB通过AAV载体过表达,该载体感染强啡肽+和脑啡肽+神经元。 其次,目前的研究主要集中在NAc壳而不是整个纹状体区域。

除了成瘾表型外,环境富集还在大鼠中产生抗抑郁和致焦虑样的特征 (格林等人, 2010; Vialou等人, 2010). 在目前的研究中,NAc中ΔFosB的过度表达未能在三次抑郁或三次焦虑测试中产生任何效果。 虽然有许多可能的因素可能导致ΔFosB模仿富集成瘾但不影响抑郁表型,但NAc壳可能更适合成瘾相关行为,而抑郁相关行为可能由其他地区更强有力地介导。 目前的研究结果与研究结果不一致 小鼠 其中ΔFosB在NAc中的过表达(无法可靠地区分壳与核心)在几种行为测定中产生强烈的抗抑郁样作用(Vialou等, 2010). 一个可能的原因是,可能更容易看到ΔFosB对严重压力行为模型(如社交失败压力)的影响。 目前的过度表达研究调查了在没有严重压力源的情况下的抑郁样行为。

在整个研究中始终如一地,ΔFosB的高基础水平(例如,来自富集,重复应激或可卡因)与随后诱导的ΔFosB相关。 这可能代表天花板效应,在蛋白质的基础水平升高的基础上不可能进一步诱导。 在应激或可卡因作为负反馈环之后,ΔFosB的累积水平可能反馈以抑制ΔFosBmRNA的进一步诱导。 例如, EC大鼠具有高水平的ΔFosB并且在应激或可卡因后显示出ΔFosB的诱导减弱。 这强调了ΔFosB蛋白水平与其mRNA诱导之间的负相关性。 累积ΔFosB的负反馈也是IC大鼠反复应激时ΔFosB的减弱诱导的原因。

需要明确的是,我们并未声称环境丰富范式具有直接的转化相关性,因为在真正的贫困中养育的儿童很少(应该指出的是,社会经济剥夺并不等同于环境剥夺)。 这种范例的实用性在于它是一种非药物,非手术,非遗传操作,可产生成瘾和抑郁的保护性行为表型,可在实验室控制的环境中利用,作为识别分子机制的基本科学工具。对精神疾病的潜在抵御能力。 之前的研究已经详细描述了行为表型(Bowling et al。, 1993; 保龄球和巴尔多, 1994; Bardo等人, 1995; 格林等人, 2002, 2003; El Rawas等人, 2009)和最近的研究(Solinas等, 2009; 格林等人, 2010; Lobo等人, 2013),与目前的研究一起,提供了关于这些行为表型的转录机制的线索。 目前正在研究产生保护性表型的下游转录靶基因/蛋白质(Fan等, 2013a,b; Lichti等人, 2014).

我们对环境富集的概念化认为,浓缩是低端隔离和高端充分富集的连续体。 “在这种情况下,充分“丰富”被定义为一个环境,在这种环境中,受试者接触到具有新鲜感,无威胁的社会接触,并且允许空间和物体进行锻炼。 T这三个因素都代表了“浓缩”的复合条件,因为它们都是有益的,并且每个都在NAc释放多巴胺,因此激活了一个共同的神经生物学电路 (Louilot等, 1986; Calcagnetti和Schechter, 1992; 克劳德和胡托, 1992; Rebec等人, 1997; Bevins等人, 2002)。 在这种概念化中,隔离被认为是对照组,因为它代表缺乏操作(即富集; Crofton等,在评论中)。 但是,其他概念化也是可能的。 在一个替代概念中,连续体是相同的,但隔离组是实验组,而富集组是对照。 一世在这个模型中,剥夺了受试者正常的充实 is 实际的操纵。 I在这种情况下,人们会说隔离赋予易感性,而不是说浓缩是保护性的。 还有第三种概念化假定没有连续统一体,而富集和孤立是两种根本不同的操纵。 在这种观点中,应该分离富集和隔离,并将其与成对的对照进行比较。 缺乏关于浓缩性质的普遍共识代表了范式的局限性,但为未来的研究提供了方向。 无论如何,无论后续解释如何,这些实验的结果都是坚定的。

环境和生活经历对许多精神疾病的发展和表达有很大影响。 了解环境富集的保护性成瘾和抑郁表型的机制解决了精神障碍研究中的一个基本问题 - 即环境对易感性或对精神病症的恢复能力的贡献。 该研究强调了ΔFosB在调节成瘾相关行为中的重要性。 在未来的研究中,需要在环境富集模型中进一步探索ΔFosB的作用及其对特定靶基因的激活和抑制作用。

资金和披露

张亚芳,没有; 伊丽莎白J.克罗夫顿,没有; 李丁歌,没有; Mary Kay Lobo,没有; 修秀范,没有; Eric J. Nestler, R37DA007359; Thomas A. Green, DA029091.

利益冲突声明

作者声明,研究是在没有任何可被解释为潜在利益冲突的商业或金融关系的情况下进行的。

致谢

这些实验由国家药物滥用研究所,DA029091和R37DA007359资助。 可卡因由国家药物滥用研究所提供。

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